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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere eine stabilisierte, bivalente Hepatitis A/Flecktyphus (HA-Vi)-Vakzinzusammensetzung, in der die Vi-Valenz ihre immunogene Wirkung während wenigstens ungefähr 24 Monaten behält.
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Hepatitis A und Flecktyphus sind zwei Krankheiten, für die man bereits ein Vakzin zur Verfügung hat. Sie treten beide in den Regionen der Welt auf, in denen die Hygienezustände weit davon entfernt sind, optimal zu sein. In dem Maße, in dem die entsprechenden infektiösen Mittel denselben Übertragungsweg (oraler, fäkaler Weg) gemeinsam haben, und in dem Maße, in dem die endemischen Zonen dieser Krankheiten sich in großem Umfang decken, scheint es interessant zu sein, die zwei Valenzen in einem Produkt zu kombinieren. Es ist insbesondere leicht einzusehen, dass eine HA-Vi-Kombination auf dem Gebiet der Vakzine für Reisende attraktiver wäre als die zwei monovalenten Vakzine Ha und Vi, die getrennt verabreicht werden müssen.
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Es wurden bereits Untersuchungen durchgeführt, um zu beweisen, dass die Valenzen HA und Vi insbesondere bezüglich Unschädlichkeit, immunogener Wirkung und Stabilität kompatibel sind. Diese Studien verwenden HA-Vi-Kombinationen, die ausgehend von monovalenten Vakzinen, die es bereits auf dem Markt gibt, hergestellt wurden; diese sind insbesondere zwei an der Zahl:
einerseits die Untersuchungen, die unter Kombination der monovalenten Produkte HavrixTM (HA) und TypherixTM (Vi) von SmithKline Beecham Biologicals (Rixensart, Belgien) durchgeführt wurden, und andererseits die Untersuchungen, die unter Kombination der monovalenten Produkte AvaximTM (HA) und Typhim ViTM (Vi) von Aventis Pasteur (Lyon, Frankreich) durchgeführt wurden.
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In den zwei Untersuchungsreihen wird das monovalente HA-Vakzin durch das inaktivierte und an Aluminiumhydroxid adsorbierte Hepatitis-A-Virus gebildet. Das monovalente Flecktyphus-Vakzin besteht aus dem Polysaccharid der Kapsel von Salmonella typhi, das ohne Adjuvans bleibt. Schließlich werden die bivalenten Kombinationen in identischer Weise produziert, indem nur die entsprechenden monovalenten Vakzine (diese monovalenten Vakzine werden in flüssiger Form vertrieben) vermischt werden. So werden eine Dosis AvaximTM und eine Dosis Typhim ViTM zusammengemischt, um eine Dose der bivalenten HA-Vi-Kombination zu ergeben.
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Die zwei Untersuchungsreihen wurden mit Kombinationen durchgeführt, die weniger als 20 Monate vor ihrer Verwendung als Injektionen im Rahmen der klinischen Versuche hergestellt worden waren. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass die bivalenten Kombinationen insbesondere bezüglich der immunogenen Wirkung den entsprechenden monovalenten äquivalent waren. Demnach hat die bivalente Kombination von SmithKline Beecham Biologicals den behördlichen Anforderungen von Großbritannien genügt und bereits eine Zulassung für den Markt in diesem Land erhalten. Diese Zulassung hat allerdings als Beschränkung ein Verfallsdatum, das auf 12 Monate nach der Herstellung festgesetzt ist.
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Auf dem Gebiet der Vakzine kann ein Verfallsdatum von 12 Monaten nach Herstellung als nicht ausreichend angesehen werden, wenn man insbesondere die Zeit berücksichtigt, die für die Kontrollen der Chargen vor der Verteilung notwendig ist. Ein Verfallsdatum, das auf 24 oder noch besser 36 Monate festgelegt ist, erleichtert die Kommerzialisierung der Chargen sehr.
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Die Anmelderin hat im Fall der HA-Vi-Kombinationen bemerkt, dass die Vi-Valenz ab 16 bis 18 Monate, die ab dem Herstellungsdatum vergangen waren, progressiv ihre immunogene Wirkung verlor und hat eine Hypothese bezüglich der Ursache für diese Instabilität aufgestellt. In der Tat hydrolysieren die 0-Acetyl-Gruppierungen des Polysaccharids Vi, die für die Immunogenität von Vi charakteristisch sind, im Laufe der Zeit, vor allem unter alkalischen Bedingungen. Diese Hydrolyse wird als für die Verringerung der immunogenen Wirkung des Polysaccharids Vi verantwortlich gehalten und basiert auf der Adsorption der Verbindung Vi auf Aluminiumhydroxid, das in der bivalenten Kombination als Adjuvans der HA-Valenz vorhanden ist. Die Vi-Valenz adsorbiert unverzüglich an das Aluminiumgel, sobald die monovalenten Vakzine miteinander vermischt sind. Diese Adsorption bringt das Halten des Polysaccharids Vi in alkalischer Umgebung mit sich. In der Tat ist Aluminiumhydroxid positiv geladen, zieht die OH-Ionen des Mediums an, das Gelegenheit für die pH-Erhöhung in der Mikroumgebung des Aluminiumgels gibt, in dem sich Vi nach seiner Adsorption befindet. Was die Hydrolyse der 0-Acetyl-Gruppierungen angeht, so ist sie ein sehr langsames Phänomen, deren Wirkungen in der Tat nach etwa 16 bis 18 Monaten wahrnehmbar sind.
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Die Anmelderin hat nicht nur das Problem der Instabilität der Vi-Valenz im Lauf der Zeit bewiesen, sondern sie schlägt auch eine Lösung vor, die darin besteht, der bivalenten Kombination ein Anion wie ein Phosphat- oder Citration zuzusetzen, welches die Adsorption der Vi-Valenz an dem Aluminiumgel verhindert, während die HA-Valenz in Form ohne Adjuvans gehalten wird.
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In ihrer allgemeinsten Lehre bezieht sich die Erfindung auf eine Vakzinzusammensetzung, die wenigstens zwei Valenzen umfasst: (i) eine erste Valenz, welche die Valenz Hepatitis A ist und die als Adjuvans Aluminiumhydroxid zugesetzt enthält, und (ii) eine zweite Valenz, welche die Valenz von Flecktyphus ist, bestehend aus dem Polysaccharid Vi der Kapsel von Salmonella typhi, das ein Bakterienkapsel-Polysaccharid enthält, das eine oder mehrere 0-Acetylgruppierung(en) umfasst und die nicht an Aluminiumhydroxid adsorbiert ist, das der ersten Valenz als Adjuvans zugesetzt wird, und zwar infolge des Vorliegens einer zusätzlichen Verbindung, die die Adsorption der zweiten Valenz an dem Aluminiumhydroxid verhindert, ohne die Adsorption der ersten Valenz zu stören.
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Nach einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Adsorption der zweiten Valenz durch das Vorliegen einer anionischen Schutzverbindung verhindert, unter der Bedingung, dass sie alle notwendigen Sicherheitsgarantien für eine Verwendung zu Impfzwecken erfüllt. Diese Schutzverbindung ist ein Phosphat, ein Citrat oder auch ein Carbonat. Es ist auch möglich, eine Kombination unterschiedlicher Anionen zu verwenden, z. B. eine Kombination von Phosphat- und Citrationen. Als Beispiel kann man präzisieren, dass die Phosphationen insbesondere durch eine Lösung, die Monokaliumphosphat, Dinatriumphosphat und Natriumchlorid enthält, eingebracht werden können.
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Die Verwendung einer Schutzverbindung ermöglicht es insbesondere, die Antigenaktivität der zweiten Valenz über einen langen Zeitraum (24 Monate oder mehr), vorzugsweise während einer Konservierung bei Lagerung bei Normaltemperatur oder erhöhter Temperatur (z. B. 37°C), zu stabilisieren. Die Stabilität der immunogenen Aktivität kann durch unterschiedliche Techniken bestimmt werden, indem diese Aktivität zu dem Zeitpunkt, zu dem die Zusammensetzung hergestellt wird, gemessen wird, und dann identische Messungen im Lauf der Zeit oder wenigstens nach 24 Monaten ab dem Fabrikationsdatum durchgeführt werden und indem die erhaltenen Resultate verglichen werden. Wenn die chiffrierten Angaben sich nicht als statistisch unterschiedlich erwiesen haben, muss davon ausgegangen werden, dass die immunogene Aktivität stabil ist. Das Titrieren der immunogenen Aktivität eines Antigens kann durch die ELISA-Technik erfolgen, die auf dem Gebiet der Vakzine in gängiger Verwendung ist.
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Die Valenz Hepatitis A kann aus dem inaktivierten Virus HA bestehen. Die zweite Valenz besteht per Definition aus dem Polysaccharid Vi der Kapsel von Salmonella typhi, das konjugiert ist oder nicht, das im Inneren seiner Repetiereinheit eine oder mehrere 0-Acetyl-Gruppierungen enthält. Unter ”Bakterienkapsel-Polysaccharid” versteht man ein Polysaccharid, das aus einer Verkettung der charakteristischen Repetiereinheit eines Kapselpolysaccharids besteht, und zwar unabhängig von seiner Größe und unabhängig von einer angefügten Modifikation. Die Repetiereinheit eines Polysaccharids, das in die Zusammensetzung der Erfindung eingebracht wird, enthält notwendiger Weise wenigstens eine 0-Acetyl-Gruppierung. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung kann das Polysaccharid in gereinigter Form, ausgehend vom Ursprungsbakterium nach ganz herkömmlichen Techniken erhalten werden. Nach Bedarf kann das Polysaccharid (i) fragmentiert sein oder nicht und (ii) oder an einen Polypeptidträger wie Diphterie- oder Tetanus-Anatoxin konjugiert sein oder nicht.
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In einem spezifischeren Rahmen hat die Erfindung eine Vakzinzusammensetzung zum Gegenstand, umfassend
(i) die HA Valenz, die mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans versetzt ist, (ii) die Flecktyphus-Valenz, die aus dem Polysaccharid Vi besteht, wobei in der Zusammensetzung die Vi-Valenz nicht an Aluminiumhydroxid adsorbiert ist, und (iii) Phosphat-, Citrat- oder Carbonationen, und zwar in ausreichender Menge, um die Adsorption der Flecktyphus-Valenz unter Aufrechterhaltung der ersten Valenz in der Form mit Adjuvans zu verhindern.
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Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung kann die erste Valenz mit einem Adjuvans versetzt sein, z. B. durch Präzipitation mit Aluminiumhydroxid oder durch Adsorption auf Aluminiumhydroxid. Das Aluminiumhydroxid, das als Adjuvans für die erste Valenz dient, kann reines Aluminiumhydroxid sein (d. h. eine Aluminiumverbindung, die nur Al3+-Ionen und Hydroxidionen enthält) oder irgendein unter demselben Namen bekanntes Aluminiumhydroxid sein, wenn sie unter chemischen Gesichtspunkten nicht ausschließlich aus Aluminiumhydroxid bestehen. So kann es sich um gemischte Aluminiumverbindungen handeln wie die, die mit dem Namen Aluminiumhydroxyphosphat oder -hydroxysulfat bezeichnet werden. Im Allgemeinen handelt es sich um jede Aluminiumverbindung, die insbesondere Hydroxidionen enthält. Als Beispiel kann man das Aluminiumhydroxid AlhydrogelTM, das von der Societe Superfos Biosector vertrieben wird, nennen. Die Phosphat-, Citrat- oder Carbonationen (Schutzverbindung) müssen in einer Menge zugesetzt werden, die ausreicht, um die Adsorption der zweiten Valenz zu verhindern, wobei die erste Valenz in der Form mit Adjuvans gehalten wird. Diese Menge hängt von verschiedenen Faktoren ab, unter denen die Menge und die Natur der ersten Valenz, der Modus der Adjuvanswirkung, die Menge und die Natur des Aluminiumhydroxids und die Menge der zweiten Valenz sind. Der Fachmann auf dem Gebiet der Vakzine ist jedenfalls in der Lage, diese Beschränkungen zu berücksichtigen, um die geeignete Menge der Verbindung, die die Adsorption der zweiten Valenz verhindert, sobald die anderen Faktoren festgelegt wurden, zu bestimmen, so dass das Aluminiumhydroxid durch die Phosphationen gesättigt wird, wobei jedoch die erste Valenz in der Form mit Adjuvans gehalten wird. Dennoch gibt man genau an, dass die Vakzine des Handels üblicherweise 0,6 bis 1,5 mg Aluminium/ml enthalten. In den HepA-Vakzinen des Handels befindet sich das Aluminiumoxidgel, das in herkömmlichen Dosen vorliegt (ausgedrückt als Aluminiummenge), bezüglich des HepA-Antigens in großem Überschuss, je nachdem wie weit die Adsorptionsstellen des Aluminiumoxidgels davon entfernt sind, gesättigt zu werden. So tritt in der Praxis nur die Aluminiummenge als Determinante zur Entwicklung der Menge der Schutzverbindung, die vorliegen muss, auf.
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Für eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, die 0,3 mg Aluminium in Form von Aluminiumhydroxid und in einem Volumen von 0,5 ml enthält, ist es zweckdienlich, ungefähr 20 mM Phosphationen zuzusetzen. Wenn die Aluminiumdosis bei demselben Volumen verdoppelt wird, ist es zweckdienlich, zweimal mehr Phosphationen, d. h. 20 mM, zuzusetzen. Für eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung, die 0,6 mg Aluminium in einem Volumen von 1 ml enthält, sind aber 20 mM Phosphationen ausreichend. Als Beispiel gibt man an, dass ein bivalentes Vakzin gemäß der Erfindung in einem Volumen von 0,5 ml (i) 160 Antigen-Einheiten oder 1440 ELISA-Einheiten des inaktivierten Virus von Hepatitis A, adsorbiert auf (ii) Aluminiumhydroxid, das 0,3 mg Aluminium enthält, (iii) 0,025 ml Polysaccharid Vi und (iv) 20 mM Phosphationen, enthält.
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Die Antigeneinheiten und die ELISA-Einheiten, die oben genannt wurden, sind entsprechende Einheiten, die mit Hilfe von geeigneten ELISA-Referenztests für die Firmen Aventis Pasteur und SmithKline Beecham Biologicals (van Hoecke et al., J. Travel. Med. (1998) 5: 116 und Andre et al. In Prog. Med. Virol., Melnick JL, Herausg., Basel, Karger (1990) 37: 72) entwickelt wurden. Dies kann auch auf andere Weise geschehen, denn es existiert keine internationale standardisierte Referenz für das HepA-Vakzin. Eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung ist vorteilhafter Weise in flüssiger Form und eine Vakzindosis wird vorteilhafter Weise in einem Volumen zwischen 0,5 und 1 ml, die Grenzen eingeschlossen, formuliert.
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Eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann hergestellt werden:
- (i) indem man Phosphat-, Citrat- oder Carbonationen zu einer Präparation gibt, die eine andere Valenz als die Flecktyphus-Valenz zusammen mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans enthält; und
- (ii) indem man die in Punkt (i) erhaltene Präparation mit einer Präparation mischt, welche die Flecktyphus-Valenz enthält, wobei in dem Verfahren die erste Valenz Hepatitis A ist, die Flecktyphus-Valenz aus dem Polysaccharid Vi von Salmonella typhi besteht und die Phosphat-, Citrat- oder Carbonationen in ausreichender Menge zugesetzt werden, um die Adsorption der zweiten Valenz unter Aufrechterhaltung der ersten Valenz in der Form mit Adjuvans zu verhindern.
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Beispiel: Präparation einer HA-Vi-Zusammensetzung gemäß der Erfindung
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A – Präparation des adsorbierten HA-Bestandteils
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99 ml einer Charge an inaktiviertem HA-Virus, deren Antigentiter 885 E ELISA/ml ist, werden mit 5,94 ml 25%igem 2-Phenoxyethanol vermischt. Während 15 min wird eine Homogenisierung durchgeführt, dann wird die Präparation mit Millipak 40 MPGL 04SH2-Filter filtriert. Nach Filtration erhält man 95 ml einer Präparation mit einem Titer von 835 E ELISA/ml.
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Zu dieser Präparation gibt man 47,5 ml eines Aluminiumoxidgels, das 3,14 mg Aluminium/ml enthält. Man ergänzt mit 40 mM PBS (Phosphatpuffer) auf 48 ml. Das Rühren wird eine Nacht bei 5°C (18 h) durchgeführt, damit der Bestandteil HA auf dem Aluminiumoxidgel adsorbiert. Der pH ist 7,28.
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B – Herstellung einer 10-fach konzentrierten Lösung von Polysaccharid Vi
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Man stellt ein Polysaccharid Vi-Pulver nach dem Verfahren von Gotschlich et al., Prog. Immunobiol. Standard (1972) 5: 485 her. In einen 30 ml-Kolben, der 16,64 mg Vi (9,5 g% Restfeuchtigkeit oder 15,06 mg Trockengewicht) enthält, gießt man nach und nach 25,1 ml destilliertes Wasser, das zur Injektion präpariert war (ppi) und setzt das Rühren fort. Man lässt 24 h bei 5°C weiter rühren, um eine vollständige Auflösung des Polysaccharids zu erhalten. Diese Präparation wird mit Millex 0,22 pm GV SLGV 025-Filter filtriert. Der Filter wird mit 5 ml destilliertem ppi-Wasser gespült. Das Endvolumen ist dann 30,1 ml.
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C – Herstellung des bivalenten HA-Vi-Vakzins
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Zu 62 ml der in Punkt A erhaltenen Präparation (HA) gibt man 10,6 ml einer 24 mM Phosphat-Lösung, dann 8,1 ml der in Punkt B erhaltenen Präparation (Vi). Die Merkmale des so erhaltenen Vakzins sind die folgenden:
Endkonzentration an Phosphat: 20 mM pH: 7,3
Osmolarität: 578 mosm/kg
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Diese Präparation, die Präparation P2 genannt wird, wird dann in Dosen mit 0,5 ml verteilt. Parallel dazu hat man auch zwei andere bivalente Zusammensetzungen P2' und P2'' hergestellt, die nicht mehr 20 mM Phosphat, sondern in entsprechender Weise 10 bzw. 40 mM Phosphat enthalten. Dazu gibt man 10,6 ml einer Phosphat-Lösung, je nach Art mit 17,6 mM oder 246 mM. Das Verhalten der Bestandteile HA und Vi in den Zusammensetzungen P2, P2' und P2'' wurde unverzüglich untersucht, indem diese Bestandteile in den Zusammensetzungen wie sie waren oder nach Zentrifugation durch ELISA bestimmt wurden. Man hat festgestellt, dass HA mit 10 mM Phosphat adsorbiert blieb, Vi aber am Aluminiumoxidgel adsorbiert wurde, während bei 40 mM Phosphat Vi nicht adsorbierte, HA aber partiell desorbierte. Mit 20 mM Phosphat sind die gesuchten Bedingungen erfüllt: HA bleibt adsorbiert, während Vi nicht adsorbiert.
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Im Folgenden wurde die Stabilität der Dosen P2 bei 5°C ± 3°C während 30 Monaten untersucht. Die Antigenkapazität des Polysaccharids Vi in den genommenen Vakzindosen wurden durch ELISA in ihrer Gesamtheit und nach Zentrifugation im Überstand bestimmt (der an dem Aluminiumoxidgel adsorbierte Bestandteil sedimentiert mit dem Gel); das erlaubt außerdem den Prozentwert an nicht-adsorbiertem Vi zu bestimmen. ELISA wird als indirekte Methode verwendet. Das zu bestimmende Antigen Vi wird zwischen den anti-Vi-Antikörpern, die den Boden eines Plaques bedecken, und den Maus-anti-Vi-Antikörper genommen. Man gibt einen biotinylierten Antikörper gegen Maus-IgG, dann den biotinylierten Streptavidinkomplex, der an Meerrettichperoxidase gebunden ist, zu. Die Reaktion wird durch Zugabe des Substrats ortho-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (OPD) entwickelt. Der Abbau von OPD lässt sich durch eine braun-orange Färbung erkennen, die proportional zur Menge an Antigen Vi ist. Ihre Intensität wird mit dem spektralen Fotometer gemessen. In Platten mit 96 Vertiefungen verteilt man 100 μl eines anti-Salmonella typhi-Serums. Man lässt 5 h bei 37°C inkubieren, dann leert man die Platte und führt 3 Waschgänge mit PBS(Phosphatpuffer)-Tween 0,05 durch. Man sättigt die freien Stellen, indem man 200 μl einer Lösung von Milchpulver, verdünnt in PBS, zusetzt. Man inkubiert 1 h 30 bei 37°, dann leert man die Platte und führt 3 Waschgänge durch. Man stellt Reihenverdünnungen im Verhältnis von 2 von einem Standardvakzin her, um einen Standardbereich zu erhalten. Die zu titrierenden Vakzindosen sowie eine Referenzdosis (ermöglicht es, den Standardbereich zu verifizieren) werden in geeigneter Weise verdünnt; 100 μl jeder Verdünnung werden in die Vertiefungen verteilt und man lässt eine Nacht bei 37°C inkubieren.
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Man leert die Platten und führt Waschgänge durch. Dann gibt man 100 μl eines anti-Vi-Mausserums, das in geeigneter Weise verdünnt ist, pro Vertiefung hinzu. Man lässt 1 Stunde bei 37°C inkubieren, dann leert man die Platte und führt Waschgänge durch. Man fixiert so die biotinylierten Anti-Immunglobuline von Mäusen (100 μl einer geeigneten Verdünnung pro Vertiefung). Man lässt 1 Stunde bei 37°C inkubieren, dann leert man die Platte und führt Waschgänge durch. Dann fixiert man das biotinylierte Streptavidin, das an Peroxidase konjugiert ist (100 μl einer geeigneten Verdünnung pro Vertiefung). Man lässt 1 h bei 37°C inkubieren, dann leert man die Platte und führt Waschgänge durch. Man entwickelt die Platte, indem man pro Vertiefung 100 μl einer OPD-Lösung mit 1 mg/ml in Citratphosphat-Puffer, pH 5, zusetzt. Man lässt 30 min bei Umgebungstemperatur in der Dunkelheit inkubieren, bevor man 100 μl 2 N Schwefelsäure in die Vertiefungen gibt. Das Lesen der Platte erfolgt im Spektrophotometer bei 492 nm. Man entwickelt die Eichkurve mit der Extinktion als Funktion der Konzentration. Der Titer jeder der getesteten Verdünnungen wird mit Hilfe der Eichkurve erreicht und in ng/ml ausgedrückt. Um den mittleren Titer jeder untersuchten Vakzindosis zu erhalten, bildet man den Mittelwert der Titer, die mit der Gesamtheit der Verdünnungen erhalten wurden. Der Titer wird in μg/Dosis angegeben.
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Man hat auch die Menge der 0-Acetylgruppen des Polysaccharids Vi, die im Überstand vorliegen, nach Zentrifugation bestimmt. Die 0-Acetylgruppen werden durch eine kolorimetrische Methode unter Verwendung von Hydroxylamin titriert (Hestrin S. J. Biol. Chim. (1949) 180: 249). Hydroxylamin bildet in alkalischem Milieu mit den Estern eine Hydroxamsäure, die in Gegenwart von Eisen(III)salz eine kastanienfarbige Färbung gibt, deren Intensität mit dem Spektralphotometer bei 540 nm gemessen wird.
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Parallel dazu hat man eine identische Untersuchung mit einer Präparation, die Präparation P1 genannt wird und die in der gleichen Weise wie P2 lediglich mit dem Unterschied, dass man zum Zeitpunkt der Konstitution des bivalenten Vakzins kein Phosphat zusetzt, hergestellt wurde, durchgeführt. In diesem Fall adsorbiert der Bestandteil Vi unverzüglich an das Aluminiumoxidgel und um seine Dosierung nach Zentrifugation wie für P2 zu bestimmen, muss er vorher desorbiert werden. Diese Desorption wird durch Modifikation des pH und der Ionenstärke des Mediums erreicht. Nach Zentrifugation wird das Aluminiumoxidgel für 6 Stunden bei 37°C mit einer 150 mM Trinatriumcitrat-Lösung in Kontakt gebracht. Dann zentrifugiert man, um den Überstand zu erhalten, indem sich der Bestandteil Vi befindet.
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Die Resultate sind in der folgenden Tabelle I angegeben. TABELLE I
| 5°C | | | T0 | 3 Mon. | Mon . | 9 Mon. | Mon . | 18 Mon. | 24 Mon. | 30 Mon. |
| Vi im ganzen Vakzin | Vi ELISA μg/Dosis | P2 | 23,6 | 25,5 | 21,7 | 21,3 | 18,5 | 23,7 | 24,3 | 26,5 |
| | P1 | 24,4 | 23,3 | 22,2 | 19,8 | 17,9 | 20,5 | 18,6 | 19,3 |
| | Vi ELISA μg/Dosis | P2 | 24,3 | 26 | 23,1 | 21,8 | 17,9 | 25 | 21,9 | 25,8 |
| | P1 | 21 | 16,9 | 16,5 | 15,4 | 12 | 14,7 | 21,8 | 15,7 |
| | O-Acetyl μmol/Dosis | P2 | 0,127 | 0,148 | 0,116 | 0,117 | 0,130 | 0,134 | 0,095 | 0,143 |
| | P1 | 0,081 | 0,056 | 0,055 | 0,055 | 0,061 | 0,057 | 0,090 | 0,054 |
| | Polysaccharid μg/Dosis | P2 | 32,5 | 30,5 | 27,6 | 31 | 30,4 | 29,1 | 31,7 | 29,3 |
| | P1 | 20,8 | 22 | 15,6 | 16,2 | 18,5 | 16,5 | 17 | 18,4 |
| % Desorption von Vi in P1 | 86% | 72% | 74% | 78% | 67% | 72% | 63% | 81,6% |
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Die Stabilität der Formulierung P2 wurde auch bei 25°C ± 2°C während 6 Monaten und bei 37°C ± 3°C während 3 Monaten untersucht. Die Resultate sind in den folgenden Tabellen II und III angegeben. TABELLE II
| 25°C | | | T0 | 1 Mon. | 3 Mon. | 6 Mon. |
| Vi im ganzen Vakzin | Vi ELISA (μg/Dosis) | P2 | 23,6 | 23,6 | 21,7 | 20,6 |
| P1 | 24,4 | 19,6 | 11,3 | 7,4 |
| Vi im Überstand nach Zentrifugation | Vi ELISA (μg/Dosis) | P2 | 24,3 | 25,5 | 22,6 | 20,1 |
| P1 | 21 | 15 | 10,3 | 6,3 |
| 0-Acetyl (μmol/Dosis) | P2 | 0,127 | 0,130 | 0,103 | 0,137 |
| P1 | 0,081 | 0,053 | 0,041 | 0,029 |
| Polysaccharid (μg/Dosis) | P2 | 32,5 | 31,6 | 25,5 | 27,2 |
| P1 | 20,8 | 17,3 | 10,3 | 6,3 |
| % Desorption von Vi in P1 | 86% | 77% | 91% | 85% |
TABELLE III
| 37°C | | | TO | 1 Mon. | 3 Mon. |
| Vi im ganzen Vakzin | Vi ELISA (μg/Dosis) | P2 | 23,6 | 24,1 | 21 |
| P1 | 24,4 | 12,7 | 5,6 |
| Vi im Überstand nach Zentrifugation | Vi ELISA (μg/Dosis) | P2 | 24,3 | 25,5 | 21,1 |
| P1 | 21 | 9,9 | 4,7 |
| 0-Acetyl (μmol/Dosis) | P2 | 0,127 | 0,143 | 0,104 |
| P1 | 0,081 | 0,050 | 0,026 |
| Polysaccharid (μg/Dosis) | P2 | 32,5 | 36 | 22,5 |
| P1 | 20,8 | 15,4 | 9,9 |
| % Desorption von Vi in P1 | 86% | 78% | 84% |