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Impfstoff zur aktiven I@mmisierung in Form einer Wasser-in-Öl-Emulsion
und Verfahren zu dessen Herstellung Die vonliegende Erfindung betrifft einen neun
Impfstoff in Form einer Wasser-in-Öl-Emulsion und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
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Ausser der Potenzierung des Antikörpertiters hält der erfindungsgemässe
Impfstoff diese höheren Titer auoh über eine viel unsere Zeitspanne aufrecht, als
sie durch eine äquivalente witssrige Dosis der ima@unologiachen Substans erzielt
wird.
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Das Erfordernis eines Adjuvans bei der Verabreichung von immunologischen
Substanzen ist seit langem erkennt, und es wurde beträchtliche Forsohungsarbet darauf
gerichtet. Substanzen zu rinden, die bei zugabe zu einem Antigen cder einer anderen
iamunologischen Substanz dessen bzw. ieren antigene @irksamkeit und hiermit das
Vermögen zur Antikörper-Stimulierung potenzieren Wurde. Bis heute wurden viele solche
Adjuvantien gefunden, wie beispielsweise die Verwendung von AlaunausfUllung von
Antigenen, die Kombination gewisser spezieller Antigene, von denen einige die Aktivität
der anderen in dem Gemisoh potenzieren, die Verwendung von Caloiumphosphat, insbesondere
zur Potenzierung der Grippeantikörperproduktion, die entsprechende Verwendung von
Staphylococcus-Toxin, das das Ansprechen der Antikörper gegen gewisse Antigene zu
verbessern scheint. Es wurder auch verschiedene andere Adjuvantien in Betracht gezogen,
wie beispielsweise Tapioca, Calcium- oder Magnesiumsalze, Tannin
und
dgl., die bei Zugabe zu gewissen speziellen Antigenen den Antikörpertiter Uber denjenigen
erhöhen wUrden, der erzielbar wäre, wenn das Antigen allein verabreicht wird.
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Die meisten dieser Mittel ergeben zwar zutriedenstellende Wirkungen,
wenn sie zusammen mit einem oder höchstens ein paar Antigenen verabreicht werden,
doch konnte keines dieser Mittel mit erfolg als Adjuvans mit allen immunologischen
Substanzen zur Potezierung der Antikörperempfindlichkeit, d. h. des Ansprechens
der Antikdrper, verwendet werden.
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Die bekannten Mittel schienen zwar zu einer zufriedenstellenden Lösung
des Problems zu führen, da nur verhältnismässig wenige Antigene zur Verwendung zur
Immunisierung von Menschen und Tieren zur Verfügung standen, doch wird heute eine
stets steigende Zahl von Antigenen zur Immunisierung und Prophylaxe verfügbar, und
es besteht ein ständig wichtiger werdendes Bedürfnis, dass die Antigene zur Verabreichung
in einer Einzeldosierungsfore kombiniert werden. Um dies zu erreichen, ist es erforderlich,
kleinere Mengen des. Antigens zu verwenden, damit dieses in einem zur Verabreiohung
in einer Einzeldosierungzform ausreichend kleinen Volumen enthalten ist. Es besteht
daher ein Bedürfnis nach einem Adjuvans, das ftir den Wirt verhältnismässig nichttoxisch
ist und die Antikörperemprindlichkeit gegen-Uber Allen Antigenen potenziert und
zusätzlich den Titer wihrend längerer Zeitspanne aufrecht erhält und sonit den
Wirt
mit einer länger dauernden Immunität ausstattet.
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Bei einem Versuch, die derzeitigen BedUrtnisse zu erfüllen, wurde
vorgeschlagen, eine Mineralölemulsion zu verwenden, in der das Antigen in die wässrige
Phase eingebracht wurde.
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Dies schien zwar eine gewisse Aussicht für die Bereltstellung einer
Adjuvans-Zusemmensetzung zu bieten, doch wurde gefunden, dass dies keine geeignete
Lösung darstellte, da das Mineralöl von dem Wirttier nicht verarbeitet wird und
daher caroinogen sein kann. Es wurde dann versucht, die toxisohen Eigenschaften
des Mineralöls durch Ersatz desselben durch Erdnussöl auszuschalten. Es wurde Jedoch
gefanden, dass das pflanzliche Öl die antigenen Eigenschaften der immunologischen
Mittel nicht potenziert und keinen brauchbaren Ersatz für das Mineralöl darstellt
(Annual Review Microbiology, 1947, Seite 297).
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Es wurde nun gefunden, dass eine Adjuvans-Zusammensetzung in Form
einer stabilen Emulsion, die ein pfienzliches tell, Wasser (oder eine wässrige Phase),
Mannidmonooleat und eine Substanz, Aluminiummonostearat, enthalt, als Träger für
alle immunologischen Substanzen verwendet werden kann und bei Kombination mit einem
Antigen oder multiplen Antigenen abnorm hohe Antikörpertiter und eine abnorm lange
Imtunitätsdauer ergibt und ausserdem für den Wirt nicht toxisch ist. Das pflanzliche
o1 und die wässrige Phase der AdJuvans-
Zusammensetzung können zwar
innerhalb der im folgenden beschriebenen Grenzen variiert werden, doch ist es wasentlich,
dass die anderen Bestandteile in der Emulsion vorhanden sind, um eine AdJuvans-Wirkung
zu erzielen, wenn ein Antigen oder Antigene eingebracht werden.
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Die erfindungsgemässe Adjuvans-Zusammensetzung enthält 20 bis 75 Vol.-%
eines pflanzlichen Ois, 2,5 bis 25 Vol.-% Mannidmonooleat, 0,5 bis 5 Voi.-« Aluminiummonostearat
und eine ausreichende Menge Wasser oder wässrige Lösung, um das Volumen auf 100
« zu bringen.
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Die neuen Ad3uvarjtien werden durch intermittierendes Vermischen des
Mannidmonooleats in dem pflanzlichen Ol hergestellt. Das bivalente Gemisch wird
dann mit dem Aluminium monostearat vereinigt. Der vollstilndige trivalente Ölträger
wird langsam unter gleichzeitigem Vermischen auf eine solche Temperatur erhitzt,
dass das Aluminiummonostearat dispergiert und ein gewisser Grad an Thixotropie erreicht
wird.
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Die Lösung wird dann auf Zimmertemperatur vor Zugabe der wässrigen
Phase abgekühlt. Dann wird die wässrige Phase in Anteilen zu dem Gemisch zugesetzt
und durch Homogenisieren durch irgendeines der bekannten mechanisohen Mittel, beispielsweise
durch Verwendung einer Kolloidmühle, eines Waring-Blendor oder eines anderen Mischers,
durch Verwendung
von Homogenisatoren, Vibratoren, Pulsatoren oder
anderen mechanischen Rührvorriohtungen mit einstellbarer Geschwindigkeit, emulgiert.
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Die so hergestellte Emulsion bildet zwar eine stabile Ad-Juvans-Zusarnrnensetzung,
die sicher als Träger zur Verabreichung von immurologisohen Mitteln an Menschen
und Tiere verwendet werden kann, doch können auch andere Materialien, wie beispielsweis3
zusätzliche Emulgatoren, wie "Tween 80", Polysorbate 80 (Atlas Powder-Co.), in die
Emulsion eingebracht werden.
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Die nach dieser Arbeitsweise hergestellte Emulsion ist eine Wasser-inl-Emulsion,
wie durch die TropfenprUrung festgestellt wird, und leitet elektrischen Strom nioht.
Der Brechpunkt bei Einbringen in allmählich erhitztes Wasser liegt ber 80°C, und
die Emulsion kann 560C ftlr zumindest 1 Woche und 37°C fur zumindest 2 Wochen ohne
Abtrennung der wässrigen Phase aushalten. Die Zusammensetzung ist ausserdem zumindest
4 Monate bei. 37°C und bei 4°C ohne Anzeichen eines Brechens stabil. Die Emulsion
bricht auch nicht in 01- und Wasserphasen nach Zentrifugieren bei Geschwindigkeiten
bis zu 2000 UpM während 1 Stunde und ergibt nicht mehr als 20 % übersonüssige Olphase
nach einem solchen Zentrifugieren.
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Die Teilchengrösse der inneren Phase, d.h. der Wasserphase, beträgt
weniger als 100 Mikron, und die Viskosität der gesamten
Emulsion
liegt zwischen 2000 und 8500 oP bai Prüfung in einem Brookrield-Viskosimeter unter
Verwendung einer Spindel Nr. 2 bei 5 UpM. Diese Spezifikationen fir:dei sich jedooh
nicht in allen erfindungsgemässen Emulsionen, da Abänderungen derselben vorgenommen
werden können, ohne die wertvollen Eigenschaften des Adjuvansträgers zu zerataren.
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Bei Verwendung der erfindungsgemässen Adjuvans-Zusammensetzung als
Träger ftlr eine immunologische Substanz bringt man das Antigen (oder die Antigene)
in die wässrige Phase vor der Zugabe der wässrigen Phase zu dem pflanzliohen Öl
bei der oben beschriebenen Arbeitsweise ein. Das immunologische Mittel wird vorteilhafterweise
in gereinigter oder konzentrierter Porw verwendet, doch kann es auch in jedem anderen
gewünschten wässrigen Medium, wie beispielsweise in Form einer Vaccine, in dor es
normalerweise verabreicht wird, oder gelost in einer eingestellten Salzlöaung, Physiologischen
Salzlösung, phosphatgepufferten Salzlösung, in Gewebekulturflüssigkeiten, wie beispielsweise
Eagle Burl Media [Soienoe (1959) flend 130, Seite 432, H. Ragle]; Medium 199 [Proc.
800. Exptl. Biol. and Med., Bend 73, Seite 1 (19,0) J.F. Morgan und Mitarb.] und
dgl., oder in anderen MJedien, in denen der Organisanus gezüohtet worden sein kann,
wie beiapielsweise angebrütetem Ei-, a@niotisehen, allantoischem oder Dottersaok-Material
und dergleiohen, zugegeben werden. Die wässrige Phase kann auch Konservieruägsmittel
und/oder
Substanzen, wie sie üblicherweise in Vaccinepräparate eingebracht werden, enthalten.
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Das Antigen selbst kann in Form von gereinigtem oder teilweise gereinigtem
Antigen, das von Bakterien, Viren, R'ckettsien oder deren Produkten stammt, oder
von Extrakten von Bakterien, Viren oder Rickettsien vorliegen, oder das Antigen
kann ein Allergen, wie beispielsweise Pollen, Staubarten, Schlacken oder Extrakte
derselben sein, oder das Antigen kann in Form eines Gifts oder Giftstoffs, der aus
giftigen Insekten oder Reptilien stammt, vorliegen. In allen Fällen liegen die Antigene
in der Form vor, in der ihre toxischen oder virulenten Eigenscharten vermindert
oder zerstört sind, und die bei Einführung in einen geeigneten Wirt entweder aktive
Immunität durch Erzeugung von Antikörpern gegen die speziellen Mikroorganismen,
den Extrakt oder die Produkte von Mikro organismen, die bei der Herstellung des
Antigens verwendet werden, ergeben, oder im Falle von Allergenen die Symptome der
Allergie durch das spezielle Allergen lindern. Die Antigene können entweder einzeln
oder in Kombination verwendet werden, beispielsweise können multiple Bakterienantigene
verwendet werden, multiple Virenantigene, multiple Rickettsienantigene, multiple
Bakterien- oder Virentoxoide, multiple Allergene, oder Kombinationen beliebiger
der vorstehenden Produkte können in der wässrigen Phase der erfindungsgemassen AdJuvans-Zusaxmensetzung
kombiniert werden. Antigene von besonderer Bedeutung stammen von Bakterien, wie
bei
spielsweise H. pertussis, Leptospira pomona und ioterohaemorrhagiae,
8. typhosa, 8. paratyphi A & B, C. diphtheriae, C. tetani, C. botulinum, C.
perfringens, C. feseri und andere Gasgangraenbakterien, B. anthracis, P. pestis,
P. multocida, V. cholerae und dgl. ; aus Viren, wie beispielsweise Poliovirus (multiple
Typen), Adenovirus (multiple Typen), Para-Influenza-Virus (multiple Typen), Masern,
Mumps, respiratorischer Synoytial-Virus, Influenza (verschiedene Typen), Shipping
fever-Virus (SF4), westliche und örtliche Equine Encephalomyelitis, Japanische B.
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Encephalomyelitis, Russische Frühjahr-Sommer-Encephalomyelitis, Schweinecholeravirus,
Newcastle-disease-Virus, HUhnerpest, Rabies, Katzen-une Hundefieber und dgl. Viren,
aus Riokettsien, wie spidemischer und endemischer Typhus oder anderen Gliedern der
Fleckfiebergruppe, aus verschiedenen Spinnen- und Sohlangengiften oder irgendeinem
der bekannten Allergene, beiapielaweise aus Ambrosiapflanzen, Hausstaub, Pollenextrakten,
Oraspollen und dgl..
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Jedes pflanzliche öl, von dem bekannt ist, dass es sich zur Verwendung
in injizierbaren Präparaten eignet, und das die Spezifikationen der US Pharmaoopeia
oder National Formulary erfüllt, kann in den erfindungsgemässen Aouvans-Zusammensetzungen
verwendet werden. Öle, die bei der rstellung dieser Zussr@ensetzun@en mit Erfolg
verwendet wurden, sind Krdmussöl, Maisöl, Olivenöl, Sesamöl, Chaulmoagraöl,
Baumwollsamenöl,
öl Wasser Mandeln und Persisches Öl.
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Andere pflanzliche Ole, von denen bekannt ißt, dass sie in injizierbaren
Präparaten verwendbar sind, können sel@stverständlich anstelle, Jedes beliebigen
dieser pflanzlichen öle verwendet werden.
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Sind Antigene in die neue erfindungsgemässe, wie ob nergestellte Adjuvans-Zusammensetzung
eingebracht, so wird in dem Wirt nach Verabreichung eine Antikörperempfindliohkeit
hervorgerufen, die in ihrer Art adjuvansähnlich ist.
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Die folgenden Beispiele, die erfindungsgemässe Adjuvans-Zusammensetzungen
zeigen, die sich zur Verwendung bæL der Herstellung von Vaccinen eignen, in die
irgendeines der oben erwähnten Antigene einzeln oder in Kombination eingebracht
ist, erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
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Beisiel 1 Vol.-% Erdnussöl 30,0 Mannidmonooleat 5,0 Aluminiummonostearat
1,4 phosphatgepufferte Salzlösung 63,6 Das Mannidmonooleat wird zu dem Erdnussöl
zugesetzt und mittels eines Hängerührers gründlioh vermischt. Aluminiumonostearat
wird
langsam unter Rtühren zu dem bivalenten Erdnussöl-Mannidmonooleat-Träger zugegeben,
und du homogene Gemisch wird dann langsam unter Rühren auf etwa 120'C erhitzt, um
eine gründliche Dispersion des Aluminiu@monostearats in dem bivalenten Ölträger
zu gewährleisten. Man liest das homogene Gemisch auf Zimmertemperatur (20 bis 30°C)
abkUhlen, wonach die wässrige Phase langsam in das Gemisch unter Viren unter Verwandung
eines mechanischen Rührers mit Geschwindigkeitsregelung eingebraoht wird, um die
Emulsion zu bilden. Die so gebildete Emulsion hat die folgenden Eigenschaften: Stabile
Tröprchen in Wasser bei Zimmertemperatur@ 3a Brechpunkt der Emulsion >95-C Elektrische
leitfähigkeit negativ Prozent Ölphase, gebildet bei 200 UpM1 während 45 Minuten:
keine Trennung 2000 45 " s keine Trennung Viskosität +2 ausgezeichnet +Der Viskositätswert
stellt die Fliessgesohwinhdigkeit durch eine 27 gauge Nadel dar.
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Beispiel 2 Vol.-% Erdnussöl 35.0 Mannidmonooleat 5,0 Aluminiummonostearat
1,6 Phosphatgepufferte Salzlösung 58,4 Die obigen Bestandteile wurden nach der in
Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise vermischt und in eine Emulsion übergeföh@t.
Die so gebildete Emulsion hatte die folgenden Stabilitätseigenscharten: Stabile
Tröpfchen in Wasser bei Zimmertemperatur: Ja Brechpunkt der Emulsion >95°C Elektrische
Leitfähigkeit: negativ Prozent Ülphase, erzeugt bei 200 UpM währene 45 Minuten:
keine Trennun 2000 " " 45 " : keine Trenntng Viskosität: ausgezeichnet Beispiel
3 Vol.-% Erdnussöl 65, o Mannidmonooleat 5,0 Aluminiummonostearat 2,8 Phosphatgepurrerte
Salzlösung 27,2
Die obigen Bestandteile wurden nach der Arbeitsweise
von Beispiel 1 vermischt und in eine Emulsion überge@übrt. Die so gebildete Emulsion
hatte die folgenden Stabil seigenschatten: Stabile Tröpfchen in Wasser bei Zimmertemperatur:
3a Brechpunkt der Emulsion: 920C Elektrische Leitfähigkeit: negativ Prozent ölphase,
gebildet bei 200 UpM während 45 Minuten: keine Trennung 2000 " " 45 " : <als
1 % Trenmung Viskosität: ausgezeichnet Beispiel 4 Vol.-% Erdnussöl 45,5 Mannidmonooleat
2,5 Aluminiummonostearat 2,0 Phosphatgepufferte Salzlösung 50,0 Die obigen Bestandteile
wurden nach der in Beispiel 1 besehrlebenen Arbeitsweise vermischt und in eine Emulsion
übergeruhrt. Die so gebildete Emulsion hatte die folgenden Stabilitätseigensohaften:
Stabile
Tröpfchen in Wasser bei Zimmertemperatur: Ja Brechpunkt der Emulsion: @ >95°C
Elektrisohe Leitfähigkeit: negativ Prozent Olphase, gebildet bei 200 UpM während
45 Minuten: keine I'rennung 2000 " " 45 " : keine I'rennung Viskositüt: ausgezeichnet
Beispiel5 Vol.-% Erdnussöl 23,0 Mannidmonooleat 25,0 Aluminiummonostearat 2,0 Phosphatgepufferte
Salzlösung 50,0 Die obigen Bestandteile wurden nach der in Beispiel 1 beschriebenen
Arbeitsweise vermischt und in eine Emulsion übergefuhrt. Die so gebildete Emulsion
hatte die folgenden Stabilitätseigenschaften: Stabile Tröpfchen in Wasser bei Zimmertemperatur:
Ja Brechpunkt der Emulsion >95°C Elektrische Leitfähigkeit: negativ Prozent ölphase,
gebildet bei 200 UpM während 45 Minuten keine Trennung 2000 n " 45 : <als 1 %
Trennung Viskosität: @ ausgezeichnet
Beispiel 6 Vol.-% Erdnussöl
44,5 Mannldmonooleat 5,0 Aluminiummonostesrat 0,5 Phosphatgepufferte Salzlösung
50,0 Die obigen Bestandteile wurden nach der in Beispiel 1 besohriebnen Arbeitswcise
vermischt und in eine Emuls@on übergeführt. Die so gebildete Emulsion hatte die
folgenden Stabilitätseigenschaften: Stabile Tröpfohen in Wasser bei Zimmertemperatur:
Ja Brechpunkt der Emulsion: 92°C Elektrische Leitfähigkeit: negativ Prozent Ölphase,
gebildet bei 200 UpM während 45 Minuten: keine Trennung 2000 " " 45 " : <als
1 % Trennung Viskosität: ausgezeichnet Beispiel 7 Erdnussö 1 60,0 Mannidmonooleat
5, o Aluminiummonostearat 5,0 Phosphatgepufferte Salzlösung 30,0
Die
obigen Bestandteile wurden nach der in Beispiel 1 bemohriobenen Arbeitsweise vermischt
und in eine Emulsion übergeführt. Die 80 gebildete Emulsion hatte die folgenden
Stabilitätseigensohaften: Stabile Tröpfchen in Wasser bei Zimmertemperatur@ Ja Brechpunkt
der Emulsion: 93°C Elektrische Leitfähigkeit: negativ Prozent ölphase, gebildet
bei 200 UpM während 45 Minuten: keine Trennung 2000 " 45 " : keine Trennung Viskosität:
ausgezeichnet Beispiel 8 Vol.-% Erdnussöl 70,0 Mannidmonooleat 5, 0 Aluminium monostearat
3, o Phosphatgepufferte Salzlösung 22,0 Die obigen Bestandteile wurden nach der
in Beispiel 1 besohriebenen Arbeitsweise vermischt und in eine Emulsion Uber geführt.
Die so gebildete Emulsion hatte die folgenden Stabilitätseigenschaften:
Stabile
Tröpfchen in Wasser bei Zimmertemperatur: Ja Breohpunkt der Emulsion: 92°C Elektrische
Leitfähigkeit: schwach Prozent Ölphase, gebildet bei 200 UpM während 45 Minuten:
keine Trennung 2000 " 45 n t 10 % Trennung Viskosität: gut Beispiel 9 Vol.-% Erdnussöl
43.0 Mannidmonooleat 5,0 Aluminiummonontearat 2,0 Phosphatgepufferte Salzlösung,
50,0 enthaltend Influenza-Virus, polyvalent, Typen A und B mit elnen Oehalt von
insgesamt 500 C.C.A. Einheiten Je ccm (einschliesslich 200 C.C.A.
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Einheiten Typ A-2, Asiatischer Stamm, und 100 C.C.A Einheiten von
Je A/Ann Arbor, A/PR8 und B/Oreat Lakes Je com) Die obigen Bestandteile wurden nach
der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise gemischt und in eine Emulsion übergeführt.
Die so gebildete Emulsion hatte die folgenden Stabilitätaeigenschaften:
Stabile
Tröpfohen in Wasser bei Zimmertemperatur: ja Brechpunkt der Emulsion: 96°C Elektrische
Leitfähigkeit: negativ Prozent ölphase, gebildet bei 200 UpM während 45 Minuten:
keine Trennung 2000 " n 45 " : s 9,7 « Trennung Stabilität bei 4°C während 36 Tagen:
ausgezeichnet Stabilität bei 25°C während 36 Tagen@ Spur von Aufrahmen Stabilität
bei 370C während 36 Tagen: Spur von Au. rahmen Stabilität bei 56°C während 36 Tagen:
40 % Aufrahmen mit einer Spur von wässriger Abscheidung Beispiel 10 Es wurden Emulsionen
wie in Beispiel 9 beschrieben nergestellt, wobei Jedoch das Endnussöl durch Sesamöl,
Maisöl, Olivendl, Baumwollsamenöl. sUsses Mandelöl, Persisches öl und Chaulmoograöl,
Jeweils bei einer Konzentration von 43 Vol.-% ersetzt wurde und wobei in Jedem Falle
eine stabile Wasser-in-Öl-Emulsion erhalten wurde, die die oben angegebenen Normen
für eine stabile Wasser-in-Öl-Emulsion erfüllen.
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Die in den obigen Beispielen beschriebenen Adjuvans-Zusammensetzungen
oder Modifikationen von diesen könr£en als Träger zur Herstellung injizierbarer
Antigenpräparate. verwendet werden. Da Jedes beliebige der oben. beschriebenen Antigene
entweder
allein oder in Kombination in die wässrige Phase eingebracht
werden kann, werden nur einige wenige typisohe Beispiel im rolgenden fMr so hergestellte
Vaccinen angege-, ben, um ihre Herstellung und das bei Verabreichung an Tiere erzielte
Ansprechen auf das Adjuvans zu erläutern, Erschöpfende Baispiele zur Beschreibung
3eder mögliohen Valline werden nicht angeführt, da sonst die Aus@ührumgen untragbar
lang wUrden, ohne dass hierdurch ein erheblicher zusätzlicher Gewinn bezüglioh des
Verständnisses des Gebrauchs der Ädjuvanspräparate ersielt würde.
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In den folgenden Beispielen und. Erörterungen bedeuten die AbitUrzung
"CCA" Hühnchenzellenagglutinin (Chick Cell Agglutinin), das nach der in J. Immunology
45, 273 (1942), Hirst und Pickles beschriebenen Methode bestimmt wird.
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Beispiel 71 Erdnussöl 53.75 Mannidmonooleat 1,25 Aluminiummonostearat
5,0 Influenza-Virus-Vacoine, polyvalent, 40,0 Typen A und B, enthaltond insgesamt
500 CCA Einheiten Je ccm (einsahliessliolr 200 CCA Einheiten Typ A-2, Asiatischer
Stamm, 100 CCA Einheiten von Je A/Ann Arbor, A/PP8 und B/Grat Lakes je ccm)
Die
obigen Bestandteile wurden nach praktisch der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel
1 vermischt und in eine Emulsion Ubergefuhrt. Es wurde festgestellt, dass sie die
oben für eine stabile Wasser-in-Öl-Emulsion angefUhrten Normen erfüllt.
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Beispiel 12 Vol.-% Erdnussöl 54,0 Mannidmonooleat 5,0 Aluminiummonostearat
1,0 Influenza-Virus-Vaccine, polyvalent, 40,0 Typen A und B, enthaltend insgesamt
500 CCA Einheiten je com (einschliesslich 200 CCA Einheiten Typ A-2, Asiatischer
Stamm, 100 CCA Einheiten von Je A/Ann Arbor, A/PR8 und B/Great Lackes Je ccm) Die
obigen Bestandteile wurden nach praktisch der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel
1 vermischt und in eine Emulsion übergeführt. Es wurde gefunden, dass die Emulsion
den oben für eine stabile Wasser-in-Öl-Emulsion angegebenen Normen entspricht.
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Beispiel 13 Vol.-« Erdnussöl Marmidmonooleat 5, o Aluminiummonostearat
2,0 Influenza-Virus-Vaccine, polyvalent, 40,0 Typen A und B, enthaltend insgesamt
500 CCA Einheiten je ccm (einschliesslich 200 CCA Einheiten Typ A-2, Asiatischer
Stamm, 100 CCA Einheiten von je A/Ann Arbor, A/PR8 und B/Oreat Lakes je ccm) Die
obigen Bestandteile wurden nach praktisch der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel
1 gemischt und in eine Emulsion übergeführt. Es wurde gefunden, dass die Emulsion
den oben für eine stabile Wasser-inÖl-Emulsion angegebenen Normen entapricht.
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Beispiel 14 Vol.-% Erdnussül b2,o Mannidmonooleat 5,0 Alvminiummonostearat
3,0 Influenza-Virus-Vacoine, polyvalent, 40,0 Typen A und B, enthaltend insgesamt
500 CCA Rinhei@en je oom (einsohlieaslich 200 CCA Einheiten Typ A-2, Asiatisoher
Stamm, 100 CCA Einheiten von je A/Amn Arbor, A/PR8 und B/@reat Lakes je ccm)
Die
obigen Bestandteile wurden nach praktisch der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel
1 gemischt und in eine Emulsion übergeführt. Es wurde gefunden, dass die Emulsion
den oben für eine stabile Wuser-in-öl-Emulsion angegebene Normen entspricht.
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Beispiel 15 Vol.-% Erdnussöl 43,0 Mannidmonooleat 5,0 Aluminiummonostearat
2,0 Phosphatgepufferte Salzlösung, ent- 50,0 haltend 660 CCA Einheiten je ml an
polyvalenter Influenza-Virus-Vaccine (enthaltend 164 CCA Einheiten A/asiatisch,
132 CCA Einheiten A/Ann Arbor, 132 CCA Einheiten A/PR8, 132 CCA Einheiten B/Great
Lakes Je ml) Die obigen Bestandteile wurden nach praktisch der gleichen Arbeitsweise
wie in Beispiel 1 vermischt und in eine Emulsion übergeführt. Es wurde festgestellt,
dass die Emulsion den oben für eine stabile Wasser-in-öl-Emulsion angagebenen Normen
entspricht.
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Beispiel 16 Vol.-% Erdnussöl 43,0 Mannidmonooleat 5,0 Aluminiummonostearat
2,0 Gereinigte Poliomyelitis-Virus- 50,0 Vaccine4, trivalent, Typen 1, II irnd III
mit einem Gehalt von insgesamt 5-6 8 8[einschliesslich 4,0 8 Typ I (Parket) und
0,8 von je Typ II (MEPI) und III Saukett)] je ccm Die obigen Bestandteile wurden
nach praktisch der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 1 vermischt und in eine
Emulsion übergeführt. Es wurde festgestellt, dass die Emulsion den oben für eine
stabile Wasser-in-Öl-Emulsion angegebenen Normen entaprioht.
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Die Adjuvanswirkung der in den vorstehenden Beispielen besohriebenen
Vaccinen wurde bei Tieren nach der folgenden Methode geprüft, Doppelte Injektionen
zur O-Zelt von 0,25 bis 1 ml wurden intramuskulär Jedem von 10 bis 20 Albinomeerschweinchen,
Stamm Hartle. y, mit einem Gewicht von jeweils 450 bis 550 g verabreicht. Iii allen
Versuchen wurden verschiedene Blutproben in Abständen von 4, 8 und 12 Wochen entnommen,
und
ein abgemesserner Anteil der einzelnen Seren SUr Jede Blutprobe
wurde auf den Antikörpertiter nach der folgenden Technik geprüft: Für Influenza-Antikörper
Standard-Hämagglutinationsinhibierung (HI)-Prüfung nach dem in J.A.M.A., 172, 1230-38
(1960), Jensen, Woodhour und Bailey beschriebenen Verfahren.
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Die Ergebnisse wurden mit der Antikörperempfindlichkeit von Kontrollmeerschweinchen
verglichen, die gleichzeitig mit 0,25 bis 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung, die
die Antigentestdosis enthielt, geimpft waren.
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Die beobachteten Ergebnisse sind in den Tabellen I bis III zusammengestellt.
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Tabelle I Meerachweinohen-Immunreaktion auf Adjovansträger, der Influenza-Virus-Vaccine
enthielt Dosis: 1,0 ml 1.m. mit einem Gehalt von 200 CCA Einheiten zum Tage "O"
Geometrisches Mittel des Serum-HI-Titers für die angegebene Woche
| 4 8 12 |
| A A B A A A B A A A B A |
| Impfmaterial Jap Ann Great Nr. Jap Ann Great Nr. Jap Ann Great
Nr. |
| 305 Arbor Lakea PR8 der 305 Arbor Lakes PR8 der 305 Arbor Lakes
PR8 der |
| 1739 Seren 1739 Seren 1739 Seren |
| Kontroll-Influen- |
| za-Vaccine (phos- |
| phatgepufferte |
| Salzlösung) 5 8 18 60 10 5 3 8 37 9 5 26 24 60 8 |
| Adjuvans-Präparat |
| von Beispiel 11 147 181 169 446 10 128 147 128 631 7 79 181
126 388 6 |
Tabelle II Meersohweinchen-Immunrealction auf Adjuvansträger,
der Influenza-Virus-Vaccine enthielt Dosis: 0,5 ml i.m. mit einem Gehalt von 100
CCA Einheiten zum Tage "0"
| Geometrisches Mittel des Serum-HI-Titers für die angegebene
Woche |
| 4 8 |
| A A B A A A B A |
| Impfmaterial Jap ann Great Nr. Jap Ann grcat Nr. |
| 305 Arbor Lakes PR8 der 305 Arbor Lakes PR8 der |
| 1739 Seren 1739 Seren |
| Kontroll-Influen- |
| za-Vaccine (phos- |
| phatgepufferte |
| Salzlösung) 3 4 9 28 19 2 7 12 69 15 |
| Adjuvans-Präpa- |
| rat von Bei- |
| spiel 12 45 69 39 294 18 37 45 23 416 17 |
| Adjuvans-Präparat |
| von Beispiel 13 52 73 56 338 19 26 39 26 274 16 |
| Adjuvans-Präparat |
| von Beispiel 14 79 119 79 338 17 45 49 34 338 15 |
Tabelle III Meerachweinohen-Immunreaktion auf Adjvansträger, der
polyvalente Influenza-Virus-vaccine Dosis: 0,25 ml i.m. mit einem Gehalt von 62,5
CCA Virus-Einheiten zum Tage "0" Geometrisches Mittel des Serum-HI-Titers für 4
Wochen A A B A Vaccine Jap 305 Ann Arbor Great Lakes PR8 Nr. der 1739 Seren Kontroll-Influenxa-Vaccine
(phos-Phatgepufferte Salzlösung) 3 6 9 56 18 Adjuvans-Präparat von Beispiel 9 97
158 97 548 23