PL215134B1

PL215134B1 - Kompozycja szczepionki oraz sposób jej wytwarzania

Info

Publication number: PL215134B1
Application number: PL367904A
Authority: PL
Inventors: Alain Françon
Original assignee: Aventis Pasteur
Priority date: 2001-08-08
Filing date: 2002-07-31
Publication date: 2013-10-31
Also published as: ES2284940T5; BRPI0211151B1; FR2828406A1; HUP0401182A2; ES2284940T3; CN1282486C; DE60219177D1; IL159519A0; CA2455406A1; WO2003013600A1; BRPI0211151B8; CN1541108A; IL159519A; FR2828406B1; DK1416958T4; KR100881703B1; EP1416958B1; PT1416958E; HUP0401182A3; US20040170648A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki oraz sposób jej wytwarzania. Kompozycja szczepionki według wynalazku jest kompozycją przeciwko zapaleniu wątroby typu A/durowi brzusznemu (HA-Vi), w której wartościowość Vi zachowuje swoje właściwości immunogenne przez co najmniej 24 miesiące.

Zapalenie wątroby typu A i dur brzuszny są chorobami, dla których dysponujemy już szczepionką. Obie te choroby występują w regionach świata, w których warunki higieny dalekie są od optymalnych. Ponieważ oba czynniki zakaźne mają tę samą drogę przenoszenia (doustno-fekalną), a ich strefy endemiczne w znacznym stopniu się pokrywają, interesujące wydawałoby się połączenie tych dwóch wartościowości w jednym produkcie. W szczególności należy przyznać, że w gamie szczepionek dla osób podróżujących połączenie HA-Vi byłoby bardziej atrakcyjne niż dwie jednowartościowe HA i Vi do oddzielnego podawania.

Przeprowadzono już badania w celu stwierdzenia, czy wartościowości HA i Vi wykazują zgodność, zwłaszcza w zakresie działania immunogennego i stabilności. W badaniach tych wykorzystywano połączenie HA-Vi wytworzone z już dostępnych szczepionek jednowartościowych, znajdujących się na rynku. Są to w zasadzie dwie szczepionki: badania prowadzono łącząc sposób jej wytwarzania. Kompozycja szczepionki według szczepionki jednowartościowe Havrix™ (HA) i Vi produkcji firmy SmithKline Beecham Biologicals (Rixensart, Belgia) lub łącząc szczepionki jednowartościowe Avaxim™ (HA) i Typhim Vi™ (Vi) produkcji Aventis Pasteur (Lyon, Francja).

W obu tych seriach badań szczepionka jednowartościowa HA utworzona jest przez wirus zapalenia wątroby typu A, unieczynniony i adsorbowany na wodorotlenku glinu. Podobnie szczepionka jednowartościowa przeciw durowi brzusznemu składa się z polisacharydu otoczki Salmonella typhi, bez dodatku adiuwantu. Połączenia dwuwartościowe wytwarza się w identyczny sposób, po prostu mieszając odpowiednie szczepionki jednowartościowe (te szczepionki jednowartościowe znajdują się na rynku w postaci ciekłej). I tak w celu uzyskania dawki połączenia dwuwartościowego HA-Vi miesza się jedną dawkę Avaxim™ z jedną dawką Typhim Vi™.

Obie te serie badań przeprowadzono z połączeniami wytworzonymi w czasie krótszym od dwudziestu miesięcy przed rozpoczęciem wstrzyknięć w ramach badania klinicznego. Badania wykazały, że połączenia dwuwartościowe były równoważne odpowiadającym im szczepionkom jednowartościowym, zwłaszcza pod względem działania immunogennego. I tak, połączenie dwuwartościowe firmy SmithKline Beecham Biologicals spełniało wymagania władz brytyjskich i zostało już zarejestrowane do wprowadzenia na rynek w tym kraju. Ograniczeniem rejestracji jest jednak data ważności ustalona na 12 miesięcy od daty produkcji.

W dziedzinie szczepionek 12-miesięcznego terminu ważności nie można uznać za wystarczający, biorąc pod uwagę czas niezbędny na kontrolę partii przed dystrybucją. Wprowadzenie partii na rynek znacznie ułatwiłoby uzyskanie terminu ważności wynoszącego 24 lub jeszcze lepiej 36 miesięcy.

W przypadku połączeń HA-Vi firma zgłaszająca stwierdziła, że po upływie 16-18 miesięcy od daty produkcji wartościowość Vi stopniowo traci swe właściwości immunogenne; opracowano hipotezę na temat tej niestabilności. Grupy O-acetylowe polisacharydu Vi, charakterystyczne dla immunogenności Vi, ulegają z upływem czasu hydrolizie, zwłaszcza w warunkach zasadowych. Uważa się, że właśnie ta hydroliza odpowiada za zmniejszanie się działania immunogennego polisacharydu Vi; byłaby ona spowodowana adsorpcją składnika Vi na wodorotlenku glinu, obecnym w połączeniu dwuwartościowym jako wartościowości HA. Wartościowość Vi ulega natychmiast adsorpcji na żelu glinowym, od momentu połączenia ze sobą szczepionek jednowartościowych. Adsorpcja ta powoduje przebywanie polisacharydu Vi w środowisku zasadowym. W istocie, jako że wodorotlenek glinu ma ładunek dodatni, przyciąga on jony OH” ze środowiska, co powoduje podwyższenie pH w mikrośrodowisku żelu glinowego, w którym znajduje się wartościowość Vi po jej adsorpcji. Hydroliza grup acetylowych jest natomiast zjawiskiem przebiegającym bardzo powoli; jej efekty stają się zauważalne po około 17-18 miesiącach.

Firma zgłaszająca nie tylko wykazała problemy z niestabilnością wartościowości Vi w miarę upływu czasu, lecz zaproponowała również rozwiązanie tych problemów, polegające na dołączeniu do dwuwartościowego połączenia związku uniemożliwiającego adsorpcję wartościowości Vi na żelu glinowym, przy utrzymaniu wartościowości HA w postaci z adiuwantem. Korzystnie, związek ten może być anionem, takim jak jon fosforanowy lub cytrynianowy.

PL 215 134 B1

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki, charakteryzująca się tym, że zawiera (i) wartościowość pierwszą, dla której adiuwantem jest związek glinu zawierający grupy wodorotlenkowe, (ii) wartościowość drugą, zawierającą polisacharyd otoczki bakteryjnej, w skład którego wchodzi jedna lub więcej grup O-acetylowych i (iii) jony fosforanowe, cytrynianowe lub węglanowe w ilości uniemożliwiającej adsorpcję drugiej wartościowości na związku glinu, przy utrzymaniu pierwszej wartościowości w postaci ze związkiem glinu.

Korzystnie, pierwszą wartościowością jest wartościowość wirusowego zapalenia wątroby typu A.

Korzystniej, wartościowość wirusowego zapalenia wątroby typu A utworzona jest przez unieczynniony wirus zapalenia wątroby typu A.

Korzystnie, drugą wartościowością jest wartościowość duru brzusznego, utworzona przez polisacharyd Vi otoczki Salmonella typhi.

Korzystniej, wartościowość duru brzusznego wykazuje stabilne miano antygenowe przez co najmniej 24 miesiące.

Korzystnie do pierwszej wartościowości jako adiuwant dodaje się związek glinu, a mianowicie wodorotlenek glinu lub hydroksyfosforan glinu.

Korzystnie do pierwszej wartościowości dodaje się adiuwant przez adsorpcję na związku glinu.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania kompozycji szczepionki według wynalazku, obejmujący następujące etapy:

(i) dodawanie jonów fosforanowych, cytrynianowych lub węglanowych do preparatu zawierającego pierwszą wartościowość, do której jako adiuwant dodany jest związek glinu, w skład którego wchodzą grupy wodorotlenkowe, (ii) mieszanie preparatu wytworzonego według (i) z preparatem zawierającym drugą wartościowość, utworzoną przez polisacharyd otoczki bakteryjnej, zawierający jedną lub więcej grup O-acetylowych;

przy czym jony fosforanowe, cytrynianowe lub węglanowe dodawane są do preparatu zawierającego pierwszą wartościowość w ilości uniemożliwiającej adsorpcję drugiej wartościowości na związku glinu, przy utrzymaniu pierwszej wartościowości w postaci ze związkiem glinu.

Adsorpcję drugiej wartościowości uniemożliwia się przez dodanie związku anionowego, o działaniu ochronnym, pod warunkiem, że związek ten wykazuje bezpieczeństwo niezbędne do wykorzystania go do produkcji szczepionek. Ten związek ochronny może być fosforanem, cytrynianem lub węglanem. Możliwe jest również wykorzystanie połączenia różnych anionów, na przykład połączenia jonów cytrynianowego i fosforanowego. Tytułem przykładu można stwierdzić, że zwłaszcza jony fosforanowe można przeprowadzać w roztwór zawierający fosforan jednopotasowy, fosforan dwusodowy i chlorek sodu.

Zastosowanie związku ochronnego umożliwia zwłaszcza stabilizację aktywności antygenowej drugiej wartościowości w długim czasie (24 miesiące i dłużej), korzystnie przy przechowywaniu w temperaturze otoczenia lub w temperaturze wyższej (np. 37°). Stabilność aktywności immunogennej można oceniać różnymi sposobami, mierząc tę aktywność w momencie produkcji kompozycji i następnie wykonując identyczne pomiary w miarę upływu czasu, co najmniej do 24 miesięcy od daty produkcji, i porównując uzyskane wyniki. Ponieważ nie stwierdzono, aby dane liczbowe różniły się między sobą w sposób statystycznie znamienny, można uznać, że aktywność immunogenna jest stabilna. Miareczkowania aktywności immunogennej antygenu można, korzystnie, dokonać techniką ELISA, stosowaną powszechnie w dziedzinie szczepionek.

Pierwszą wartościowością może być dowolna wartościowość szczepionki, bez ograniczenia typu lub struktury, oczywiście pod warunkiem, że wymaga ona dodania adiuwantu. Można wymienić zwłaszcza wartościowość zapalenia wątroby typu A (HepA lub HA) , wartościowość zapalenia wątroby typu B (HepB) i wartościowość pneumokokową. Ta pierwsza wartościowość może być złożona z unieczynnionego wirusa, takiego jak unieczynniony wirus HA lub unieczynniony wirus polio, wirusa atenuowanego, wirusowego lub bakteryjnego antygenu podjednostkowego, takiego jak antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, anatoksyna błonicy lub tężca.

Druga wartościowość z definicji utworzona jest z polisacharydu sprzężonego lub niesprzężonego, zwierającego wewnątrz każdej z powtarzających się jednostek jedną lub więcej grup O-acetylowych. Definicji tej odpowiada polisacharyd otoczkowy Salmonella typhi (zwany również polisacharydem Vi) i polisacharyd otoczki Neisseria meningitidis grupy A. W tym przypadku mówimy zatem o wartościowości Vi (wartościowości duru brzusznego) i wartościowości meningo-A.

PL 215 134 B1

Termin „polisacharyd otoczki bakteryjnej oznacza polisacharyd utworzony przez łańcuch powtarzających się jednostek, charakteryzujący się obecnością polisacharydu otoczkowego, niezależnie od jego wielkości i dołączonych modyfikacji. Powtarzająca się jednostka polisacharydu, wchodzącego w skład kompozycji według niniejszego wynalazku, zawiera koniecznie co najmniej jedną grupę O-acetylową.

Dla celów niniejszego wynalazku polisacharyd można wytwarzać w postaci oczyszczanej z danej bakterii konwencjonalnymi sposobami. W zależności od potrzeby polisacharyd może być (i) fragmentowany lub niefragmentowany i (ii) sprzężony lub niesprzężony z polipeptydem nośnikowym, takim jak anatoksyna błonicy lub tężca.

Dla celów niniejszego wynalazku do pierwszej wartościowości można dodawać adiuwant przez strącenie wodorotlenkiem glinu lub przez adsorpcję na wodorotlenku glinu.

Wodorotlenek glinu, służący jako adiuwant pierwszej wartościowości, może być czystym wodorotlenkiem glinu (to znaczy związkiem glinu zawierającym jedynie jony Al³⁺ i grupy wodorotlenowe) lub dowolnym innym znanym pod tą nazwą wodorotlenkiem glinu, nawet jeśli z punktu widzenia chemicznego ten wodorotlenek glinu składa się nie tylko z wodorotlenku glinu. Pojęcie to obejmuje również mieszane związki glinu, na przykład związki określane nazwami hydroksyfosforan lub hydroksysiarczan glinu. Ogólnie, według niniejszego wynalazku można stosować wszelkie związki glinu zawierające grupy wodorotlenowe. Jako przykład można podać wodorotlenek glinu Alhydrogel™ produkowany przez Societe Superfos Biosector.

Jony fosforanowy, cytrynianowy i węglanowy (związek ochronny) należy dodawać w ilości wystarczającej do uniemożliwienia adsorpcji drugiej wartościowości przy utrzymaniu pierwszej wartościowości w postaci z adiuwantem. Ilość ta zależy od wielu czynników, takich jak ilość i rodzaj pierwszej wartościowości, sposób łączenia jej z adiuwantem, ilość i rodzaj wodorotlenku glinu i ilość drugiej wartościowości. Specjalista z dziedziny szczepionek zna dobrze te ograniczenia przy ustalaniu odpowiedniej ilości związku uniemożliwiającego adsorpcję drugiej wartościowości po ustaleniu wszystkich czynników, tak aby wodorotlenek glinu był nasycony jonami fosforanowymi przy utrzymaniu pierwszej wartościowości w postaci z adiuwantem.

Precyzuje się jednak, że szczepionki dostępne w handlu zawierają zwykle od 0,6 do 1,5 mg glinu na ml. W dostępnych na rynku szczepionkach HepA ilość żelu glinowego, wyrażona w dawkach konwencjonalnych (w ilości glinu) pozostaje zwykle w nadmiarze w stosunku do antygenu HepA, tak że miejsca adsorpcji żelu glinu są dalekie od wysycenia. Tak więc w praktyce, jak się wydaje, jedynie ilość glinu determinuje niezbędną ilość związku ochronnego.

W przypadku kompozycji według wynalazku zawierającej 0,3 mg glinu w postaci wodorotlenku glinu i w objętości 0,5 ml, należy dodać około 20 mM jonów fosforanowych. Jeżeli dawkę glinu w tej samej objętości podwoi się, należy dodać dwa razy więcej jonów fosforanowych, to znaczy 40 mM. Jednak w przypadku kompozycji według niniejszego wynalazku zawierającej 0,6 mg glinu w objętości 1 ml wystarczająca będzie ilość 20 mM jonów fosforanowych.

Tytułem ilustracji można wskazać, że dwuwartościowa szczepionka według niniejszego wynalazku może zawierać w objętości 0,5 ml (i) 160 jednostek antygenowych, czyli 1440 jednostek ELISA unieczynnionego wirusa zapalenia wątroby typu A adsorbowanego na (ii) wodorotlenku glinu zawierającym 0,3 mg glinu; (iii) 0, 025 mg polisacharydu Vi i (iv) 20 mM jonów fosforanowych.

Jednostki antygenowe i jednostki ELISA cytowane powyżej są odpowiednio jednostkami ustalonymi za pomocą testu referencyjnego ELISA, opracowanego przez firmy Aventis Pasteur i SmithKline Beecham Biologicals (van Hoecke i wsp., J. Travel. Med. (1998)5:116 i Andre i wsp. w Prog. Med. Virol., Melnick JL (red.), Basel, Karger (1990)37:72). Nie może być inaczej, ponieważ nie istnieją standaryzowane wzorce międzynarodowe dla szczepionki HepA.

Kompozycję według niniejszego wynalazku wytwarza się, korzystnie, w postaci cieczy, a dawkę szczepionki, korzystnie, wytwarza się w objętości wynoszącej 0,5 do 1 ml, włączając w to nośniki.

Kompozycję według niniejszego wynalazku można wytwarzać:

(i) dodając jony fosforanowy, cytrynianowy lub węglanowy do preparatu zawierającego wartościowość inną niż wartościowość duru brzusznego z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem; i (ii) mieszając preparat wytworzony w punkcie (i) z preparatem zwierającym wartościowość duru brzusznego.

Przykład: wytwarzanie kompozycji HA-vi według niniejszego wynalazku

A - preparat adsorbowanego składnika HA 99 ml partii wirusa unieczynnionego HA, którego miano antygenowe wynosi 885 U ELISA na ml, miesza się z 5,94 ml 2-fenoksyetanolu o stężeniu 25%.

PL 215 134 B1

Homogenizację prowadzi się przez 15 minut, po czym preparat filtruje się przez filtr Millipak 40 MPGL 04SH2. Po filtracji uzyskuje się 95 ml preparatu o mianie 835 U ELISA na ml.

Dodaje się 47,5 ml żelu glinu zawierającego 3,14 mg glinu na ml. Całość uzupełnia się 48 ml PBS (bufor fosforanowy) 40 mM. Mieszaninę wstrząsa się przez noc w temperaturze 5°C (18 godzin) w celu uzyskania adsorpcji składnika HA na żelu glinowym. pH wynosi 7,28.

B - dziesięciokrotnie zatężony preparat polisacharydu Vi

Z polisacharydu Vi wytwarza się proszek sposobem opisanym przez Gotschlich i wsp., Prog Immunobiol. Standard (1972)5:485. Do butelki 30 ml, zawierającej 16,64 mg Vi (9,5 g% wilgoci resztkowej, co odpowiada 15,06 mg suchej masy), wlewa się powoli 25,1 ml wody destylowanej do wstrzyknięć (ppi) ciągle mieszając. Mieszanie prowadzi się przez 24 godziny w temperaturze 5°C, w celu uzyskania pełnego rozpuszczenia polisacharydu. Preparat filtruje się przez filtr Millex 0,22 ąm GV SLGV 025. Filtr płucze się 5 ml wody destylowanej ppi. Objętość końcowa wynosi zatem 30,1 ml.

C - wytwarzanie dwuwartościowej szczepionki HAVi

Do 62 ml preparatu uzyskanego w punkcie A (HA) dodaje się 10,6 ml roztworu fosforanu 94 mM i następnie 8,1 ml preparatu uzyskanego w punkcie B (Vi). Charakterystyka tak uzyskanej szczepionki jest następująca:

Końcowe stężenie fosforanu: 20 mM pH: 7,3

Osmolarność: 578 mosm/kg.

Preparat, ten zwany preparatem P2, dzieli się następnie na dawki 0,5 ml.

Jednocześnie przygotowuje się dwie kompozycje dwuwartościowe P2' i P2'' zawierające zamiast 20 mM fosforanu odpowiednio 10 i 40 mM fosforanu. W tym celu dodaje się 10,6 ml roztworu fosforanu do 17,6 mM i 246 mM.

Zachowanie składowych HA i Vi w preparatach P2, P2' i P2'' badano natychmiast, dawkując składniki sposobem ELISA w kompozycjach jako takich lub w kompozycjach po odwirowaniu. Stwierdzono, że przy 10 mM fosforanu HA pozostawał zaadsorbowany natomiast Vi adsorbował na żelu glinowym, natomiast przy 40 mM Vi już nie adsorbował, zaś HA ulegał częściowej desorpcji. Przy 20 mM fosforanu pożądane warunki były spełnione: HA pozostaje zaadsorbowany, natomiast Vi nie adsorbuje.

Następnie stabilność dawek P2 badano w temperaturze 5°C ± 3°C przez 30 miesięcy. Oceniano zwłaszcza, metodą ELISA, aktywność antygenową polisacharydu Vi w dawkach szczepionki pod względem ich integralności i w nadsączu po odwirowaniu (składnik zaadsorbowany na żelu glinu osadza się wraz z żelem); pozwala to między oszacować innymi odsetek niezaadsorbowanego Vi.

ELISA prowadzi się metodą pośrednią. Oznaczany antygen Vi umieszczany jest w „sandwiczu pomiędzy przeciwciałami przeciwko Vi opłaszczającymi płytkę a przeciwciałami mysimi skierowanymi przeciwko Vi. Dodaje się biotynylowane mysie przeciwciała przeciwko IgG, a następnie biotynylowany kompleks streptawidyny sprzężony z peroksydazą chrzanową. Reakcję odczytuje się, dodając substrat dwuchlorowodorek ortofenylenodiaminy (OPD). Rozpad OPD ujawnia się jako zabarwienie brunatnopomarańczowe, proporcjonalne do ilości antygenu Vi. Intensywność tego zabarwienia mierzy się spektrofotometrycznie.

100 ąl surowicy skierowanej przeciwko Salmonella typhi umieszcza się na płytkach 96-studzienkowych. Płytki pozostawia się do inkubacji na 5 godzin w temperaturze 37°C, po czym płytkę opróżnia się i trzykrotnie płucze PBS (bufor fosforanowy) Tween 0,05%. Miejsca wolne wysyca się, dodając 200 ąl mleka w proszku rozcieńczonego w PBS. Całość inkubuje się przez 1,5 godziny w temperaturze 37°C, po czym płytkę opróżnia się i trzykrotnie płucze. Sporządza się seryjne rozcieńczenia dwukrotne szczepionki wzorcowej w celu uzyskania gamy wzorców. Dawki szczepionki, której miano oznacza się, jak również dawki referencyjne (umożliwiające potwierdzenie gamy wzorców) rozcieńcza się odpowiednio; 100 ąl każdego rozcieńczenia umieszcza się w studzienkach i pozostawia się całość do inkubacji przez noc w temperaturze 37°C. Płytkę opróżnia się i płucze. Następnie dodaje się 100 ąl na studzienkę mysiej surowicy skierowanej przeciwko Vi, odpowiednio rozcieńczonej. Płytkę pozostawia się do inkubacji przez godzinę w temperaturze 37°C, po czym opróżnia się ją i płucze. Następnie przytwierdza się biotynylowane mysie antyimmunoglobuliny (100 ąl na studzienkę w odpowiednim rozcieńczeniu). Płytkę inkubuje się przez godzinę w temperaturze 37°C, po czym opróżnia się ją i płucze. Następnie przytwierdza się biotynylowaną streptawidynę sprzężoną z peroksydazą (100 ąl na studzienkę w odpowiednim rozcieńczeniu). Płytkę inkubuje się przez godzinę w temperaturze 37°C, po czym opróżnia się ją i płucze. Płytkę odczytuje się, dodając 100 ąl na stu6

PL 215 134 B1 dzienkę roztworu OPD w stężeniu 1 mg/ml w buforze cytrynianowo-fosforanowym o pH 5. Płytkę inkubuje się przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności i następnie dodaje się 100 μΐ kwasu 2N siarkowego do studzienek. Płytki odczytuje się w spektrofotometrze przy długości fali 492 nm. Sporządza się krzywą wzorcową adsorbancji w funkcji stężenia. Miano każdego z badanych rozcieńczeń oblicza się w stosunku do krzywej wzorcowej i wyraża w ng/ml. W celu uzyskania średniego miana dla danej dawki szczepionki oblicza się średnią mian uzyskanych dla całości rozcieńczeń. Miano podaje się w μg na dawkę.

Zmierzono również ilość grup O-acetylowych polisacharydu Vi obecnego w nadsączu po odwirowaniu. Grupy O-acetylowe miareczkuje się metodą kolorymetryczną z zastosowaniem hydroksyloaminy (Hestrin S. J. Biol. Chim. (1949)180:249). Hydroksyloamina w środowisku zasadowym tworzy z estrami kwas hydroksyaminowy, który w obecności soli żelaza daje zabarwienie brązowe, którego intensywność mierzy się w spektrofotometrze przy długości fali 540 nm.

Równolegle przeprowadzono identyczne badanie z preparatem, nazywanym preparatem P1, wytworzonym w taki sam sposób jak P2, z tą różnicą, że w momencie wytwarzania szczepionki dwuwartościowej nie dodano fosforanu. W tym przypadku składnik Vi adsorbuje natychmiast na żelu glinowym i aby zmierzyć jego dawkę po odwirowaniu, jak w przypadku P2, najpierw trzeba poddać go desorpcji. Desorpcję przeprowadza się przez modyfikację pH i siły jonowej środowiska. Po odwirowaniu żel glinowy styka się z roztworem cytrynianu trójsodowego 150 mM na 6 godzin w temperaturze 37°C. Następnie dokonuje się odwirowania w celu zebrania nadsączu, w którym znajduje się składowa Vi.

Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli I.

T a b e l a I

5°C	T0	3 miesiące	6 miesięcy	9 miesięcy	12 miesięcy	18 miesięcy	24 miesiące	30 miesięcy
Vi w całej szczepionce	Vi ELISA μg/dawka	P2	23,6	25,5	21,7	21,3	18,5	23,7	24,3	26,5
P1	24,4	23,3	22,2	19,8	17,9	20,5	18,6	19,3
Vi w nadsączu po odwirowa- niu	Vi ELISA μg/dawka	P2	24,3	26	23,1	21,8	17,9	25	21,9	25,8
P1	21	16,9	16,5	15,4	12	14,7	21,8	15,7
Grupy O-acetylowe μmol/dawka	P2	0,127	0,148	0,116	0,117	0,130	0,134	0,095	0,143
P1	0,081	0,056	0,055	0,055	0,061	0,057	0,090	0,054
Polisacharydy μg/dawka	P2	32,5	30,5	27,6	31	30,4	29,1	31,7	29,3
P1	20,8	22	15,6	16,2	18,5	16,5	17	18,4
% desorpcji Vi w P1	86%	72%	74%	78%	67%	72%	63%	81,6%

Badano także stabilność preparatu P2 w temperaturze 25°C ± 2°C przez 6 miesięcy i w temperaturze 37°C ± 3°C przez 3 miesiące. Wyniki przedstawiono w poniższych tabelach II i III.

T a b e l a II

25°C	T0	1 miesiąc	3 miesiące	6 miesięcy
Vi w całej szczepionce	Vi ELISA μg/dawka	P2	23,6	23,6	21,7	20,6
P1	24,4	19,6	11,3	7,4
Vi w nadsączu po odwirowaniu	Vi ELISA μg/dawka	P2	24,3	25,5	22,6	20,1
P1	21	15	10,3	6,3
Grupy O-acetylowe μmol/dawka	P2	0,127	0,130	0,103	0,137
P1	0,081	0,053	0,041	0,029
Polisacharydy μg/dawka	P2	32,5	31,6	25,5	27,2
P1	20,8	17,3	10,3	6,2
% desorpcji Vi w P1	86%	77%	91%	85%

PL 215 134 B1

37°C		1 miesiąc	3 miesiące
Vi w całej szczepionce	Vi ELISA μg/dawka	P2	23,6	24,1	21
P1	24,4	12,7	5,6
Vi w nadsączu po odwirowaniu	Vi ELISA μg/dawka	P2	24,3	25,5	21,1
P1	21	9,9	4,7
Grupy O-acetylowe μmol/dawka	P2	0,127	0,143	0,104
P1	0,081	0,050	0,026
Polisacharydy μg/dawka	P2	32,5	36	22,5
P1	20,8	15,4	9,9
% desorpcji Vi w P1	86%	78%	841%

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera (i) wartościowość pierwszą, dla której adiuwantem jest związek glinu zawierający grupy wodorotlenkowe, (ii) wartościowość drugą, zawierającą polisacharyd otoczki bakteryjnej, w skład którego wchodzi jedna lub więcej grup O-acetylowych i (iii) jony fosforanowe, cytrynianowe lub węglanowe w ilości uniemożliwiającej adsorpcję drugiej wartościowości na związku glinu, przy utrzymaniu pierwszej wartościowości w postaci ze związkiem glinu.
2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że pierwszą wartościowością jest wartościowość wirusowego zapalenia wątroby typu A.
3. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że wartościowość wirusowego zapalenia wątroby typu A utworzona jest przez unieczynniony wirus zapalenia wątroby typu A.
4. Kompozycja szczepionki według dowolnego z zastrz. 1-3, znamienna tym, że drugą wartościowością jest wartościowość duru brzusznego, utworzona przez polisacharyd Vi otoczki Salmonella typhi.
5. Kompozycja szczepionki według zastrz. 4, znamienna tym, że wartościowość duru brzusznego wykazuje stabilne miano antygenowe przez co najmniej 24 miesiące.
6. Kompozycja szczepionki według dowolnego z zastrz. 1-5, znamienna tym, że do pierwszej wartościowości jako adiuwant dodaje się związek glinu, a mianowicie wodorotlenek glinu lub hydroksyfosforan glinu.
7. Kompozycja szczepionki według dowolnego z zastrz. 1-6, znamienna tym, że do pierwszej wartościowości dodaje się adiuwant przez adsorpcję na związku glinu.
8. Sposób wytwarzania kompozycji szczepionki według dowolnego z zastrz. 1-7, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

(i) dodawanie jonów fosforanowych, cytrynianowych lub węglanowych do preparatu zawierającego pierwszą wartościowość, do której jako adiuwant dodany jest związek glinu, w skład którego wchodzą grupy wodorotlenkowe, (ii) mieszanie preparatu wytworzonego według (i) z preparatem zawierającym drugą wartościowość, utworzoną przez polisacharyd otoczki bakteryjnej, zawierający jedną lub więcej grup O-acetylowych;

przy czym jony fosforanowe, cytrynianowe lub węglanowe dodawane są do preparatu zawierającego pierwszą wartościowość w ilości uniemożliwiającej adsorpcję drugiej wartościowości na związku glinu, przy utrzymaniu pierwszej wartościowości w postaci ze związkiem glinu.