DE2539622A1 - Verfahren zur herstellung einer therapeutischen zubereitung und das dabei erhaltene produkt - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer therapeutischen zubereitung und das dabei erhaltene produkt

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DE2539622A1
DE2539622A1 DE19752539622 DE2539622A DE2539622A1 DE 2539622 A1 DE2539622 A1 DE 2539622A1 DE 19752539622 DE19752539622 DE 19752539622 DE 2539622 A DE2539622 A DE 2539622A DE 2539622 A1 DE2539622 A1 DE 2539622A1
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staphylococcus aureus
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streptococcus
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Institut de Recherches Chimiques et Biologiques Appliquees SARL IRCEBA
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Description

PATENTANWÄLTE A. GRÜNECKER
OPL-ING.
H. KINKELDEY
DR-ING
*} C O Q β O O W. STOCKMAlR
(t D O J D t /, DR-ING AüElCAI-TECH)
K. SCHUMANN
m DR RER NAT - DtPL,-fMVS
P. H. JAKOB
DlPU-INS
G. BEZOLD
Da RER MAT ■ DIPL-CHEM
MÜNCHEN
E. K. WEIL
DB RER OEC INC»
8 MÜNCHEN 22
MAXIMILIANSTRASSE 43
5. Sept. 1975 P 9556
LINDAU
I.E.C.E.B.A.(INSTITUT DE EECHERCHES CHIMIQUES ET BIOLOGIQUES APPLIQUEES)
38, rue de Lisbonne, 75008 Paris, Fra.' :reich
Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zubereitung und das dabei erhaltene Produkt
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zubereitung, die sich insbesondere für die Behandlung von Infektionen im Hals-Hasen-Ohren-Bereich eignet und aus einer Mischung von Ant igenfrakt ionen bakteriellen Ursprungs besteht oder diese enthält, durch Züchten einer Bakterienkultur auf einem ÜTährmedium, Lysieren der Bakterien, Extrahieren, Eeinigen und Mischen der dabei erhaltenen Antigenfraktionen, sowie das dabei erhaltene Produkt; sie betrifft insbesondere eine neue therapeutische Fasenzubereitung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie die Verwendung dieser
609812/0913
Ν (Ο83) 222362 TELEX Ο5-2938Ο TELEQSAMME MONAPAT
Zubereitimg für die Behandlung von infektiösen Erkrankungen im Hals-lTasen-Ohren-Bereich und insbesondere von Rhinitiden, Rhinopharyngitiden, Otitiden und Sinusitiden.
Die einen Gegenstand der Erfindung "bildende neue Zubereitung ist dadurch gekennzeichnet, daß sie 3 Gew.-Teile einer gereinigten Antigenfraktion von Staphylococcus aureus 634-, 3 Gew.-. Teile einer gereinigten Antigenfraktion von Staphylococcus aureus 636, 3 Gew.-Teile einer gereinigten Antigenfraktion von Staphylococcus aureus 659·, 3 Gew.-Teile einer gereinigten Antigenfraktion von Streptococcus 14-7, 3 Gew.-Teile einer gereinigten Antigenfraktion von Streptococcus pyogenes 155» 3 Gev/.-Teile einer gereinigten Antigenfraktion von Streptococcus pyogenes 1178, 3 Gew.-Teile einer gereinigten Antigenfraktion von Diplococcus pneumoniae 209 5 3 Gew.-Teile einer gereinigten Antigenfraktion von Diplococcus pneuraoniae 210 und 1 Gew.-Teil einer gereinigten Antigenfraktion von Neisseria catarrhalis 987 enthält.
Die hinter den oben genannten Stämmen angegebenen Nummern sind diejenigen des Katalogs der Sammlung des "Centre International de Distribution de Souches et d1Informations sur les Types Microbiens de Lausanne".
Die neun Stämme,von denen die in der erfindungsgemäßen Zubereitung enthaltenen Antigenfraktionen abgeleitet sind, die einen Teil der häufig in Kliniken vorkommenden pathogenen Stämme darstellen und gegenüber denen es besonders interessant (vorteilhaft) ist, eine Immunität zu erzeugen, wurden aufgrund ihrer Fähigkeit, Antigene zu bilden, ausgewählt. Selbstverständlich können die gereinigten Antigenfrakt ionen, die aus diesen neun Stämmen extrahiert wurden, auch mit anderen Bestandteilen kombiniert werden, wie das aus dem weiter unten folgenden Beispiel B hervorgeht, ohne daß dadurch der Eahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.
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Das einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildende Verfahren zur Herstellung der vorstehend angegebenen erfindungsgemäßen therapeutischen Zubereitung, die sich insbesondere für die Behandlung von infektiösen Erkrankungen im Hals-Nasen-Ohren-Bereich eignet und eine Mischung von Antigenfraktionen bakteriellen Ursprungs enthält oder daraus besteht, das umfaßt die Züchtung der Bakterien in einem im wesentlichen flüssigen Nährmedium, die Lysis der Bakterien, die Extraktion der Antigenfraktionen und ihre Reinigung sowie das anschließende Mischen dieser Fraktionen)ist dadurch gekennzeichnet, daß die Lysis der Bakterien in dem Nährmedium der Kultur auf enzymatischem Wege bei 60 bis 65°C mittels Papain und dann bei 37°C mittels Trypsin durchgeführt wird, wobei jedes Enzym nach seiner Verwendung durch 30-minütiges Er?/ärmen auf 100 bis 120°C zerstört wird (inaktivierung), und daß die Extraktion und die Reinigung der Antigenfraktionen die folgenden Stufen umfassen:
a) Eliminierung der bei der Lysis erhaltenen festen Substanzen bakteriellen Ursprungs durch Zentrifugieren,
b) Absorption der in dem flüssigen Milieu nach dem Zentrifugieren enthaltenen Antigenfraktionen an einem festen Träger, insbesondere an Aktivkohle,
■Ό Abtrennung der Aktivkohle, an welcher die Antigenfraktionen absorbiert worden sind, durch Zentrifugieren,
d) Eluieren der Antigenfraktionen aus der Aktivkohle mittels einer wäßrigen Ammoniaklösung, und
e) Verdampfen des Ammoniaks und Einengen des Eluats und anschließende Lyophilisierung unter Bildung eines Pulvers aus den gereinigten Antigenfraktionen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in dem weiter unten folgenden Diagramm I erläutert.
die Extraktion der gereinigten Antigenfraktionen sind zwei verschiedene Kulturmedien erforderlich, die jeweils eine Kohlenstoff quelle, eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthalten:
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a) Ein Milieu ( Medium ) für Staphylococcus aureus, Streptococcus und Diplococcus pneumoniae, wobei dieses Milieu in einem Behälter mit einem Volumen von 300 1 hergestellt wird, sowie
b) ein spezielles Milieu (Medium) für ITeisseria catarrhalis, wobei dieses Milieu in einem Behälter mit einem Volumen von 5 1 hergestellt wird.
Obgleich es möglich ist, die acht Stämme von Staphylococcus, Streptococcus und Diplococcus gleichzeitig zu kultivieren und gleichzeitig ihre Antigenfraktionen zu extrahieren, arbeitet man vorzugsweise Stamm für Stamm, um ein eventuelles Risiko einer zusätzlichen Kontamination zu vermeiden und insbesondere um im Augenblick der fertigen Mischung jede der Antigenfrakt ionen besser dosieren zu können. Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung gehen aus den nachfolgend beschriebenen Beispielen hervor, auf die die Erfindung jedoch keineswegs beschränkt ist.
Beispiel A
I.) Herstellung der gereinigten Antigenfrakt ionen von Staphylo-
1.) Nährmedium^iKulturmin-i^eu^
NaGl 1500 g
Dikaliumphosphat I5OO g
Monokaliumphosphat 600 g
Monoammoniumphosphat 600 g
Glucose 1500 g
Magnesiumsulfat 60 g
Glycerin 600 g
Autolysat von Bierhefe (des Hefepilzes) 600 g
Mangansulfat 6 g
Thiaminhydrοchlorid 1,50 g
Pyridoxinhydrochlorid 1,50 g
Calciumpantothenat 1,50 g
Nicotinsäure 1,50 g
Riboflavin 609812/0913 0,75 g
V/asser -■- ad JOO
Die Bestandteile des Nährmediums wurden in 50 1 Tfesser unter Rühren gelöst. Fach dem Auffüllen des Volumens mit Wasser auf 300 1 wurde der pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge auf 7j8 eingestellt. Fach erneutem Rühren wurde das Milieu 30 Minuten lang bei 100 bis 1200C, vorzugsweise bei 11O°C, sterilisiert.
2.) Erhaltung der SJ;ä.inme_
Die für die Extraktion der Antigenfrakbionen bestimmten Stämme wurden erhalten durch Ernährung auf einer Maus Swiss Albinos, um ihre pathogenen und biochemischen Eigenschaften aufrechtzuerhalten. Die Einimpfung in das Tier erfolgte auf intravenösem Wege.
Nach dem Tod der Tiere durch Blutvergiftung wurde durch Herz— punktion das Blut steril entnommen, mit dem ein flüssiges Anreicherungsmilieu und dann, ausgehend von dem flüssigen Milieu, ein festes Isolierungsmilieu geimpft wurde. Mit der so erhaltenen Reinkultur wurde eine geeignete Menge des flüssigen Milieus, das als Inokulum für die technische Kultur dienen sollte, nach dem nachfolgend unter Punkt 3.) beschriebenen Verfahren geimpft. Nach jeder neuen Isolierung wurde nach klassischen Identifizierung sverfahr en die Übereinstimmung in bezug auf die biochemischen Eigenschaften geprüft.
3.) Herstellung de_s technischen Inokulums Die Impfung mit der oben erhaltenen Reinkultur erfolgte auf 10 ml des flüssigen Milieus (wie unter 1.) beschrieben). Nach 2zi~stündigem Aufenthalt im Trockenschrank bei 37°C wurde dieses Volumen steril in 5 1 Milieu der gleichen Zusammensetzung, die vorher sterilisiert worden war, eingeführt. Nach 24— stündigem. Aufenthalt im Trockenschrank bei 37°C wurde dieses Volumen steril in 300 1 des vorher sterilisierten gleichen Milieus eingeführt.
60981 2/091 3,
4.) Kultur_
Die Kultivierung wurde 24 Stunden lang unter Belüften des Milieus durch Einleiten von filtrierter Luft ("beispielsweise mittels einer Millipore-Membran) durchgeführt, wobei die Temperatur des Milieus "bei 37°C gehalten wurde. Räch 24 Stunden wurde die Kultivierung durch 1-stündige Sterilisierung des Milieus hei 100 bis 120°C gestoppt. In diesem Stadium wurden zur Kontrolle der Sterilität 10 ml Milieu aseptisch entnommen.
5.) Ly.sis der Bakterien
Sie wurde durch enzymatische Hydrolyse durchgeführt und diente dazu, die Antigenfraktionen in dem Milieu freizusetzen. Nach der Kontrolle der Sterilität des Milieus wurde diese enzymatische Hydrolyse in zwei Stufen durchgeführt: zunächst bei 60 bis 65°C mittels Papain bei pH 6,5» dann bei 37 C mittels Trypsin bei pH 7·
Die enzymatische Lysis diente dazu, die Bakterienzelle abzubauen, damit sich in dem oben unter 4.) angegebenen Kulturmedium (in dem die enzymatische Lysis durchgeführt wurde, die bei der Behandlung mit Trypsin bis zu pH 6,5 und bei der Behandlung mit Trypsin bis zu pH 7 durchgeführt wurde) Antigene anreicherten.
Die Papain- und Trypsinmengen sind nicht kritisch. Der vereinfachte Mechanismus dieses Vorgangs ist folgender: die Enzyme (selbst wenn sie in geringer Menge vorhanden sind) zerstören die Zellwand und legen einen Teil der Cy t oplasmamembr an frei ; diese Membran wird anschließend zerstört (i) durch die vorhandene osmotische Druckdifferenz zwischen der Cytoplasmamasse und dem Milieu der enzymatischen Lysis und/oder (ii) durch den enzymatischen Abbau; daraus folgt, daß die.(in der Zellwand und vor allem im Innern der Cytoplasmamem.bran enthaltenen) Antigene oder mindestens ein Teil davon in das Milieu der enzymatischen Lysis gelangt. Allgemein kann davon ausgegangen werden, daß die Enzyme die Abtrennung der Antigene von den sie umgebenden Substanzen oder eventuellen Substraten, mit denen sie verbunden
609812/0913 -
sind, und die Gewinnung eines Bakterienextrakts (einer Antigenfraktion), der aus jedem vollständigen Antigen erhalten wird und in seiner Struktur die Antigenzentren des vollständigen Antigens (I1antigene complet) beibehält, erlaubt. Darüber hinaus ist die Behandlungsdauer, die von den Enzymmengen abhängt, nicht übermäßig kritisch. Zur Erzielung von guten Ergebnissen in bezug auf die Menge und Qualität der extrahierten Antigene wird empfohlen:
- für 300 1 Milieu (Medium) 25 bis 35 g Papain (mit einem Gehalt von 660 Einheiten pro mg Enzym) (bezüglich der Definition des Gehaltes bzw. Titers vgl. das Arzneibuch Pharmacopee francaise von 1949) zu verwenden, wobei die Behandlung 3 Stunden lang bei 60 bis 65°0 und einem pH-Wert von 6,5 durchgeführt wird;
- 30 Minuten lang auf iOO bis 120°C zu erwärmen, um das Papain zu zerstören;
- für 500 1 Milieu (Medium) anschließend 12 bis 18 g Trypsin (mit einem Gehalt von mindestens 30 Internationalen Einheiten pro mg Enzym (bezüglich der Definition des Gehaltes bzw. Titers vgl. das Arzneibuch Pharmacopee franeaise von 1965) zu verwenden, wobei die Behandlung 3 Stunden lang bei 37°C urd einem pH-Wert von 7 durchgeführt wird; und
- 30 Minuten lang auf 100 bis 120 C zu erwärmen, um das Trypsin zu zerstören.
Bei diesem Beispiel wurden die folgenden Bedingungen angewendet: Behandlung mit 30 g Papain (mit einem Gehalt von 660 Einheiten (U)/mg) für 300 1 Milieu bei 600C und einem pH-Wert von 6,5 für einen Zeitraum von 3 Stunden; 30-minütige Erwärmung auf 100°C; Behandlung mit 15 g Trypsin (mit einem Gehalt von mindestens 30 Internationalen Einheiten (IU)/iag) für 300 1 Milieu bei 37°C und einem pH-Wert von 7 für einen Zeitraum von 3 Stunden und anschließendes 30-minütiges Erwärmen auf 100°C.
6.) Extrakt i£n_de_r__Antigenf raktionen_
Zunächst wurden die Bakterienkörper durch Zentrifugieren entfernt, Die die Antigenfraktionen enthaltenden 300 1 Kulturmedium wurden
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anschließend abgetrennt (gewonnen). Diese Antigenfraktionen wurden danach an einem Träger, "beispielsweise an Aktivkohle (insbesondere OENO-Kohle)^adsorbiert. Es wurde erneut in der Zentrifuge behandelt, um die an der Kohle adsorbierten Antigenfraktionen zurückzugewinnen, die anschließend mittels einer wäßrigen Ammoniaklösung eluiert wurden. Die Antigenfraktionen befanden sich dann in dem Ammoniakwasser.
Die Losung wurde durch einen Verdampfer geführt, der dazu diente, das Ammoniak zu entfernen und die wäßrige Lösung einzuengen. Die Einengung der wäßrigen Lösung erfolgte unter üblichen Bedingungen; sie diente dazu, einen solchen Gehalt an Antigenfraktion zu erhalten, daß diese lyophilisiert werden konnte. Auf diese Weise kann man von 2 Volumina oder besser von 5 Volumina, oder von mehr als 1 Volumina auf 1 Volumen einengen. Die Lyophilisierung dieser wäßrigen Lösung stellt die letzte Stufe der Extraktion dar. Die gereinigten Antigenfraktionen liegen dann in Form eines Pulvers vor.
II.) Herstellung der aus Heisseria catarrhalis extrahierten
Auch in diesem Falle änderte sich das Prinzip nicht, das Kulturmedium war jedoch ein anderes (dies war auf die Schwierigkeiten bei der Kultivierung dieses Keims zurückzuführen); darüber hinaus erfolgte die Kultivierung in einem 5 1-Behälter und dauerte 4-8 Stunden. Nachfolgend werden nur die Unterschiede in bezug auf die Herstellung^der aus Staphylococcus aureus, Staphylococcus und Diplococcus pneumoniae extrahierten Antigenfraktionen angegeben:
Nä.hrmedium__ ( KuI turmi1 ieu)_
Pferdeserum 250 ml
Bouillon T ad 5 1
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_g der Bouillon_T_
Pepton 200 g
Glucose 1Og
NaCl 25 S
destilliertes V/asser ad 5 1
Zur Herstellung dieses Milieus wurde das Pferdeserum steril in die sterile Bouillon T eingeführt und auf pH 7j2 eingestellt. Das Milieu vmrde anschließend 4-5 Minuten lang bei 1000G sterilisiert. Die Lysis der Bakterien, die Extraktion der Antigenfraktionen und die lyophilisierung wurden anschließend nach dem in bezug auf Staphylococcus, Streptococcus und Diplococcus beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Molekulargewichte Jeder der gemäß I.) und II.) erhaltenen neun Antigenfraktionen betrugen etv/a 12000.
III.) Mi£c]p-£S—Τ^λ^^0]*^
1 Gev/._ö?eil der gereinigten und ly.ophylisierten Antigenfraktion von Heisseria catarrhalis wurde mit jeweils 3 Gew.-Teilen der gereinigten und lyophilisierten Antigenfraktionen von Staphylococcus aureus 634-, 636 und 659, Streptococcus 147, ^53 und II78 und Diplococcus pneumoniae 209 und 210 gemischt.
Beispiel B
Durch Wiederholung des Beispiels A wurde eine bevorzugte erfindungsgemäße Zubereitung hergestellt, indem man in der Stufe III die Antigenfraktionen der neui Stämmen mit Natriummercurothiolat, Natriumchlorid und Wasser mischte zur Herstellung der folgenden Zubereitung:
Zubereitung I
gereinigte Antigenfraktion, extrahiert aus Staphylococcus
aureus 634 3 mg
" Staphylococcus
aureus 636 3 mg
" Rnqfin/nqn Staphylococcus
bUyöU/uaiJ aureus 659 3 mg
gereinigte Antigenfraktion, extrahiert aus Streptococcus
147 3 mg
" Streptococcus
pyogenes 155 3 mg
" Streptococcus
pyogenes 1178 3 mg
" Diplococcus
pneumoniae 209 3 mg
" Diplococcus
pneumoniae 210 3 mg
" Neisseria
catarrhalis 987 Ί mg
Natriummercurothiolat 0,25 mg
Natriumchlorid 90 mg
destilliertes V/asser ad 10 ml
Unter Berücksichtigung der Mengenverhältnisse der Zubereitung I vmrde auf die gleiche Weise wie oben eine Zubereitung II hergestellt.
Zubereitung II
gereinigte Antigenfraktion, extrahiert aus Staphylococcus
aureus 634 4,5 mg
" Staphylococcus
aureus 636 4,5 mg
" Staphylococcus
aureus 659 4,5 mg
" Streptococcus
14-7 4,5 mg
" Streptococcus
pyogenes I55 4,5 mg
" Streptococcus
pyogenes 1178 4,5 mg .
" Diplococcus
pneumoniae 209 4,5 mg
" . Diplococcus
^ pneumoniae 210 4,5 mg
" Heisseria
catarrhalis 987 1,5 mg
Natriummercurothiolat ' 0 3^5 mp
Natriumchlorid 135 mg
destilliertes Wasser ßO9812/ogi3 ' ad 15 ml
Die Zubereitung II, konditioniert in I5 ml-Fläschchen für die Verabreichung durch Einsprühen in die Nasenhöhle^wurde -vorläufig mit "Rhinapten" und "Rhinapten ITebuliseur" bezeichnet. Nachfolgend sind die Ergebnisse von damit durchgeführten pharmakologischen und klinischen Versuchen zusammengefaßt,
Toxizität
Durch Untersuchung der akuten Toxizität bei der Maus per os konnte gezeigt v/erden, daß die DL-O (minimale tödliche Dosis) jeder der neun Antigenfraktionen in den Zubereitungen I und II mehr als 4- g/kg beträgt. Es konnte außerdem gezeigt werden, daß die DL-O der Mischung der neun -«-ntigenfraktionen deutlich oberhalb 1,8 g/kg liegt und daß die DL-O der Zubereitungen I und II 4-0 mg/kg beträgt (dies entspricht einer Dosis der Mischung der neun Antigenfraktionen von 100 mg/kg).
Durch Untersuchung der subakuten Toxizität bei der Maus und bei der Ratte per os der Mischung der neun Antigenfralrfcionen in den Zubereitungen I und II in Dosen von 1 mg/kg und 10 mg/kg während eines Zeitraumes von 13 Wochen an 5 Tagen pro Woche konnte das Fehlen einer Mortalität festgestellt werden.
Pharmakoloprische Versuche '
Bei der pharmako logisch en Untersuchung mit einem Tier stieß man im Prinzip auf zwei praktische Schwierigkeiten: einerseits war es schwierig, in Höhe der Nasenhöhlen lokal eine experimentell hervorgerufene Infektion zu erzeugen, die nicht innerhalb eines Zeitraumes spontan ausheilte, der zu kurz v/ar, um zuverlässige Erfahrungen sammeln zu können, andererseits ist das Einsprühen, das eine für den Menschen gut geeignete Verabreichungsform darstellt, beim Tier kaum geeignet, da dieses die Einträufelung oder die Einwirkung eines Aerosolnebels besser verträgt. Zur Beseitigung dieser Schwierigkeiten wurden vier Versuchsreihen durchgeführt:
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a) Immunologische Eigenschaften der neun Antigenfraktionen
_ __und_ihr_er>_Mis£hun£ gemäß den Zuberei-tungen I und II_in vitro
Es wurde gezeigt, daß die Extrakte der neun Stämme (Staphylococcus aureus 634, 636 und 659, Streptococcus 147, Streptococcus pyogenes 115 und 1178, Diplococcus pneumoniae 209 und 210 und Neisseria catarrhalis 987) eine Antigenstruktur aufweisen, wobei das Verfahren von Kolmer angewendet wurde; jede gemäß Beispiel A erhaltene Fraktion und die Mischung dieser Fraktionen ergaben eine positive Reaktion mit Immunseren, die bei einem'Tier (Kaninchen) erzeugt worden waren durch Injektion von Suspensionen jedes der neun Stämme in Formaldehyd (die Suspension wurde erhalten durch Zugabe von Formaldehyd zu dem Nährmedium der Kultur des Beispiels A, die den Stamm enthielt, und anschließendes Zentrifugieren).
b) Immunisierung auf parenteralem Wege mit Antigenfraktionen und _ ihrer__Mi. s_chung gemäß den Zubereitungen I und II
Kaninchen wurden 4 Ifochen lang dreimal pro Woche und 2 mg pro Tag jede der Antigenfrakt ionen in den Zubereitungen I und II (die Antigenfraktion, extrahiert von Neisseria catarrhalis, war ausgeschlossen, weil bei parenteraler Verabreichung bei ihr die Gefahr der Erzeugung von Schocks bestand) injiziert. Anschließend wurde den Tieren das Serum entnommen, das mit den neun Antigenfrakt ionen und ihrer Mischung nach dem Verfahren von Kolmer und dem Verfahren von Ouchterlony getestet wurde. Die Ergebnisse der beiden Verfahren bestätigten, daß die Antigenfraktionen und ihre Mischung zu einer guten Immunisierung der Tiere führten. ■ '
c) Nachweis von Antikörpern in der Nasenschleimhaut bei dem be-
Der Versuch wurde durchgeführt durch Einträufelung (Ratte) und Einwirkung eines Aerosols (Meerschweinchen), die dabei erhaltenen Ergebnisse, die übereinstimmten, sind nachfolgend nur in
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"bezug auf die Versuche mit der Ratte angegeben. Versuch sprοt qko11
Der Versuch wurde mit 40 Ratten durchgeführt, die wie folgt aufgeteilt wurden:
Vergleichsjgruppe_£_ Männliche Ratten SPF (mittleres Gewicht 250 g) Kr. 1 bis 10
weibliche Ratten SPF (mittleres Gewicht 250 g) Fr. 11 bis 20. Behandelte_Grup_p_e:_ Männliche Ratten SPi1 (mittleres Gewicht 250 g) Kr, 21 bis 30
weibliche Ratten SPi1 (mittleres Gewicht 250 g) Kr. 31 bis 40.
Die ^iere wurden auf nasalem 7/ege zweimal am Tage 8 Wochen lang mit 11 Tropfen einer Lösung der Mischung der neun Antigenfraktionen der Zubereitung I des Beispiels B pro Hasenloch behandelt. Diese Lösung enthielt 5 S der Mischung der gereinigten Antigenfraktionen auf 100 ml destilliertes Wasser.
Die Vergleichsgruppe erhielt nur destilliertes Wasser unter den gleichen Bedingungen.
Nach 8-wöchiger Behandlung wurden die Tiere getötet und die Nasen-Schleimhäute wurden entnommen. Die Nasenschleimhäute wurden anschließend mit physiologischem Serum gewaschen und in Gegenwart von 0,5 ml einer isotonischen Natriumchloridlösung zerkleinert. Nach einmaligem Abzentrifugieren der Peinteile wurde die überstehende Flüssigkeit zur Durchführung der Kolmer-Reaktion gegen die Antistaphylococcen-, Antistreptococcen-, Antipneumococcen- und Antineisseria-Immunseren und zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern verwendet.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen I und II für jede
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Gruppe und Tier für Tier zusammengefaßt, wobei diese Ergebnisse außerdem jexveils in den Tabellen III und IV neu gruppiert wurden, um den Prozentsatz entsprechend den Indikationen der Kolmer-Reaktion anzugeben.
d) Nachweis der schützenden Eigenschaften der Antigenfraktionen gegenüber experimentell mit Streptococcen und Staphylococcen
h^rvorg£rufenen_Infektionen_in vivo
Da es schwierig war, bei einem Tier eine für die Versuche braixch-, bare Nas enracheninf ekt ion hervorzurufen, wurden bei einem Meerschweinchen durch subkutane Injektion einer Mikrobendosis in der Nähe der minimalen Infektionsdosis (DMI) von Streptococcus pyogenes 155 (DMI = 0,5 ml des Milieus einer 24—stündigen Kultur dieses Stammes) und von Staphylococcus aureus 636 (DMI = 0,5 ml des Milieus einer 24—stündigen Kultur dieses Stammes) Abszesse hervorgerufen. Anschließend wurde die Mischung der Antigenfrakt ionen (ausschließlich der Fraktion von Neisseria catarrhalis) auf intramuskulärem Wege in einer Menge von 8 mg/kg Mischung 5 Wochen lang jeden Tag verabreicht. Im Vergleich zu infizierten Vergleichstieren, denen die Mischung nicht verabreicht worden war, wurde festgestellt, daß die behandelten Tiere besser geschützt waren.
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- 15 Tabelle I
verp;leichsgru"ppe Antistaphylo-
coccen-Gegen-
serum		 • - - Antistrepto-
coccen-Gegen-
serum		 • - • - Antipneumo-
coccen-G-egen-
serum		 Ant-ineis s er ia-
Gegenserum
Ratten
SPP Nr		 + + - - - - -
1 - - + - -
2 + - · . -. -
3 - +
4 + - - -
5 - - - -
6 - + - -
7 + - -
8 - t - -
9 - - -
10 - - - -
11 - - -
12 + - . -
13 - -
14 - - -
15 + - -
16 - -
17 - -
18 - -
19 - -
20
Kolmer-Reaktjon
Erläuterung: - negative Reaktion
+ schwach positive Reaktion
+ positive Reaktion
++ stark positive Reaktion
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Tabelle II
"behandelte Gruppe
Batten.
SPF Br.		 Antistaphyio-
e ο e c e n-G e g e rt-		 Antistreptococce
Gegenserum		 ■ + i- Antipne-umo-
coccen-Gegen-
serixGi		 Antineisseris
j-egenserum
21 + 4- - + " + ;
22 + + + 4-
23 + + + + -
24 4+ + + . . 4- +
25 + 4- 4- +
26 + · - 4+ ■ - ' +
27 4- + + 4-
28 - - - -
29 + t +
30 4- 4- + -
31 + t 4- 4-
32 4-f -H- 4- +
33 + + 4- +
34 - - -
35 + -
36 + - +
37 + + + '
38 4-f 4· + ·
39 +4- + +
40 + 4-
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Tabelle III
Verftleichsgruppe
Ergebnisse, ausgedrückt in
Oi
Ant-istaphylococcen-Gegrens er um
Antistreptococcen-Gegen serum
Antipneumo-
coccen-Geger)
serum
A.ntineisse- - ria-Gegenserum
_ negativ
+ s chwach - po " sitiv ^. positiv
μ. stark positi
65 15 %
20 %
75 7. 10 7.
5 %
100 %
100 %
behandelte Gruppe
Ergabnisse,
ausgedrückt in		 Ant i s t aphy10-
coccen-Gegen-
serum		 Antistrepto-
coccen-Gegen
serum		 Antipneumo-
-coccen-Ge-
genserum		 Antineisse-
ria-Gegen-
serum
» negativ 10 7. 15 7. 25 % 25 %
+ schwach posi
" tiv		 15 % 20 % 45 7. 50 %
"*" positiv 55 7. 55 7. • 30 7. 25 %
■*"** stark posi-.
tiv		 20 % 10 %
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Die klinische Unter sue hung wurde rait der Zubereitung II des Beispiels B durchgeführt, um die Effekte dieser Zubereitung auf die infektiösen Erkrankungen des Hals-Fasen-Ohren-Bereiches sowie das gegenüber isolierten Keinen erzeugte Immunisierungsvermögen sowohl bei einem Kind als auch bei einem Erwachsenen zu untersuchen. Parallel dazu wurde eine Untersuchung des sekretorischen Immunoglobulingehaltes vom Typ IgA in der Hasenschleimhaut vor und nach der Behandlung durchgeführt. Diese klinische Untersuchung erstreckte sich auf 50 Patienten, die in die in der nachfolgenden Tabelle V angegebenen Altersgruppen eingeteilt wurden und litten unter
a) Rhinitiden und Ehinopharyngotxden,
b) wiederholten Otitiden und/oder
c) Sinusitiden.
Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI zusammengefaßt.
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Alter
Tabelle IT
Anzahl der Fälle
Dosierung (a.)
O bis 5 Jahre
5 bis 10 Jahre
10 bis 20 Jahre
22
10
20 Jahre und darüber
Einsprühung in jedes Nasenloch
2 χ am Tage
Einsprühung in jedes Nasenloch
3 x am Tage
zweimaliges Einsprühen in jedes Nasenloch 2 χ am Tage
zweimaliges Einsprühen in jedes Nasenloch 3 χ am Tage
!Fußnote: (a) mittlere Behandlungsdauer: 2 bis 3 Wochen
Tabelle VI
Gesamtergebnisse
Ergebnisse
Anzahl der Fälle
Prozentsatz
sehr gut
mittelmäßig
3 34-
6 )
68 }
8 )
= 82
keine
Bei 82 % der brauchbaren Ergebnisse der Tabelle VI wurde eine Wirksamkeit ab dem 15. Behandlungstag mit einer dauerhaften Wirkung beobachtet, da bei der Mehrzahl der Patienten ihre Symptome während einer Dauer von 2 bis 3 Monaten nach Ende ihrer Behandlung nicht wieder auftraten. Für alle 50 Patienten wurde kein Fall der Unverträglichkeit beobachtet.
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DIAGRAMM ί
KULTUR
Papain bei 60 bis 65 C, pH 6,5
30-minütige Erwärmung auf 100 bis 1200C (Papain-Inakt ivi erung)
-.Trypsin bei 37 0, pH
30-minütige Erwärmung auf 100 bis 120°G (Trypsin-Inak·- tivierung)
er υ. ν α
.J 4ι
die Anti- feste
genfraktion Bakterien-
enthalt ende rückst ände Flüssigkeit
Aktivkohle für
die Absorption
der Antigenfraktion
^'weggeworfen
ZE IT TRIFUGIERUNG
Peststoffe: _ Flüssigkeit
an Kohle absor- I } weggeworfen
bierte Antigenfraktion
EL-UTION mit einer wäßrigen MEU-Lösung
die Antigenfraktion enthaltendes Eluat
i Kohle
-Verdampfung und Einengung
i
L TOPHILI S I ERUNG
pulVerförmige Antigenfraktion
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weggeworfen

Claims (10)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zubereitung, insbesondere für die Behandlung von Infektionen im Hals-lTasen-Ohren-Bereich, die aus einer Mischung von Antigenfraktionen bakteriellen Ursprungs besteht oder diese enthält, durch Züchten einer Bakterienkultur auf einem Nährmedium, Lysieren der Bakterien, Extrahieren, Reinigen und Mischen der dabei erhaltenen Antigenfraktionen, dadurch gekennzeichnet, daß man auf einem flüssigen Eahrmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, jeden der Stämme von Staphylococcus aureus 634-, Staphylococcus aureus 636, Staphylococcus aureus 659j Streptococcus 14-7, Streptococcus pyogenes 155» Streptococcus pyogenes 1178» Diplococcus pneumoniae 209» Diplococcus pneumoniae 210 und Neisseria catarrhalis 98? (gemäß dem Katalog der Sammlung des "Centre International de Distribution de Souches et d1Informations sur les Types Microbiens de Lausanne") züchtet, daß man die Lysis dieser Stämme in dem Kulturmedium auf enzymatischem Wege bei 60 bis 65°C mittels Papain, dann bei 37°C mittels Trypsin durchführt, wobei jedes Enzym nach der Verwendung durch 30-minütiges Erhitzen auf 100 bis 120°C zerstört wird, daß man die Antigenfrakt ionen extrahiert und reinigt unter Anwendung der folgenden Stufen: Eliminierung der festen Substanzen bakteriellen Ursprungs, die bei der Lysis erhalten werden, durch Zentrifugieren, Absorption der in dem flüssigen Milieu nach dem Zentrifugieren enthaltenen Antigenfraktionen auf einem festen Träger, insbesondere auf Kohle, Abtrennung des Trägers, auf dem die Antigenfraktionen absorbiert worden sind, durch Zentrifugieren, Eluieren der Antigenfraktionen aus dem Träger mittels einer wäßrigen llHj-Losung, Verdampfen des MH, und Einengen des Eluats und anschließende Lyophilisierung unter Bildung von pulverförmigen Antigenfraktionen, und daß man die dabei erhaltenen neun Antigenfraktionen miteinander mischt.
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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeden der Stämme Staphylococcus aureus 634-, Staphylococcus aureus 636, Staphylococcus aureus 659, Streptococcus 14-7, Streptococcus pyogenes 155, Streptococcus pyogenes 1178, Diplococcus pneuaoniae 209 und Diplococcus pneumoniae 210 getrennt auf einem Nährmedium züchtet, das I5OO g ITaCl, I5OO g Dikaliumphosphat, 600 g Monökaliumphosphat, 600 g Monoammo-niumphosphat, I5OO g Glucose, 60 g Magnesiumsulfat, 600 g Glycerin, 600 g Bierhefeautolysat, 6 g Mangansulfat, 1,50 g Thiaminhydrochlorid, 1,50 g Pyridoxinhydrochlorid, 1,50 g Calciumpantothenat, 1,50 g nikotinsäure, 0,75 g Riboflavin und Wasser bis zum Auffüllen auf ein Volumen von 300 1 enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Neisseria catarrhalis 987 auf einem Nährmedium züchtet, das 250 ml Pferdeserum, 200 g Pepton, 10 g Glucose, 25 g ITaOl- und Wasser bis zum Auffüllen auf ein Volumen von 5 1 enthält.
4·. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man jeden der neun Stämme getrennt einer enzymatischen Lysis unterwirft, die umfaßt: eine 3-stündige Behandlung mit Papain bei 60 bis 65°0 und einem pH-Wert von 6,5,
die Inaktivierung des Papains durch 30~minütiges Erwärmen auf 100 bis 1200C,
eine 3-stündige Behandlung mit Trypsin bei 37°G und einem pH-Wert von 7
die Inaktivierung des Trypsins durch 30-minütiges Erwärmen auf 100 bis 1200G.
5· Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß man die lyophilisierten Antigenfraktionen in Mengen von jeweils 3 Gew.-Teilen jeder der lyophilisierten Antigenfraktionen von Staphylococcus aureus 634-, Staphylococcus aureus 636, Staphylococcus aureus 659, Streptococcus 14-7, Streptococcus pyogenes 155, Streptococcus p-yogenes
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1178, Diplococcus pneumoniae 209 und Diplococcus pneumoniae auf 1 Gew.-Teil der lyophilisierten Antigenfraktion von Neisseria· catarrhalis 987 miteinander mischt.
6. Verfahren zur Herstellung eines aus Antigenfraktionen bakteriellen Ursprungs bestehenden Produkts nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 59 dadurch gekennzeichnet, daß man
a) getrennt züchtet
-jeden der Stämme Staphylococcus aureus 634-, Staphylococcus aureus 636, Staphylococcus aureus 659» Streptococcus 14-7 j Streptococcus pyogenes 155» Streptococcus pyogenes 1173, Diplococcus pneumoniae 209 und Diplococcus pneumoniae 210 (entsprechend dem Katalog der "Collection du Centre International de Distribution de Souches et d1Informations sur les Types Microbiens de Lausanne") auf einem flüssigen Nährmedium, das 1500 g ITaCl, I5OO g Dikaliumphosphat, 600 g Monokaliumphosphat, 600 g Monoammoniumphosphat, I5OO g G-lucose, 60 g Magnesiumsulfat, 600 g Glycerin, 600 g Bierhefeautolysat, 6 g Mangansulfat, 1,50 g Thiaminhydrochlorid, 1,50 g Pyridoxinhydrochlorid, 1,50 g Calciumpantothenat, 1,50 g Nikotinsäure, 0,75 g Riboflavin und Wasser bis zum Auffüllen auf ein Volumen von 300 1 enthält,
- den Stamm Neisseria catarrhalis 987 (entsprechend dem Katalog der "Collection du Centre International de Distribution de Souches et d1Informations sur les Types Microbiens de Lausanne") auf einem flüssigen Nährmedium, das 250 ml Pferdeserum, 200 g Pepton, 10 g Glucose, 25 g NaGl und Wasser bis zum Auffüllen auf ein Volumen von 5 1 enthält5
b) die Kulturen jedes der neun Stämme einer enzymatischen Lysis unterv/irft, die umfaßt
- eine 3-stündige Behandlung mit Papain bei 6O0C und bei einem • , pH -VTert von 6,5,
- die Inaktivierung des Papains durch 30-minütiges Erwärmen auf
1000C,
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- eine 3-stündige Behandlung mit Trypsin bei 37°C ί*&& einem pH -Wert von 7,
- die Inaktivierung des Trypsins durch 30-minütiges"Erwärmen auf 10O0C;
c) das bei der enzymatischen Lysis jedes Stammes erhaltene Milieu zentrifugiert, um die festen Substanzen bakteriellen Ursprungs zu eliminieren;
d) jede der in dem flüssigen Milieu nach dem Zentrifugieren enthaltenen Antigenfraktxonen auf Kohle absorbiert;
e) jedes erhaltene Milieu zentrifugiert, um die Kohle abzutrennen, auf der jede der Antigenfraktxonen fixiert ist;
f) jede der auf der Kohle absorbierten Antigenfrakt ionen mit einer wäßrigen WH--Lösung eluiert;
g) das in jedem Eluat enthaltene Ammoniak verdampft und jede zurückbleibende wäßrige Lösung einengt und lyophilisiert und
h) jede der so erhaltenen neun Antigenfrakt ionen in einer Menge von 3 Gew.-Teilen jeder der lyophilisierten Antigenfraktxonen von Staphylococcus aureus 634-, Staphylococcus aureus 636, Staphylococcus aureus 659j Streptococcus 14-7, Streptococcus pyogenes 155j Streptococcus pyogenes 1173, Diplococcus pneumoniae 209 und Diplococcus pneumoniae 210 mit 1 Gew.-Teil der lyophilisierten Antigenfraktion von Heisseria catarrhalis 987 mischt.
7. Produkt, das sich für die Behandlung von Infektionen im Hals-Fasen-Ohren-Bereich und insbesondere von Bakterieninfektionen der Nasenhöhlen eignet, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Antigenfraktionen besteht, wie sie bei dem Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 erhalten werden.
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8. Produkt nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Antigenfraktionen besteht, wie sie nach dem Verfahren, gemäß Anspruch 6 erhalten werden, und daß jede darin enthaltene Antigenfraktion ein Molekülargeivicht von etwa 12000 aufweist.
9. Therapeutische Zubereitung für die Behandlung von Infektionen des Hals-iTasen-Ohren-Bereiches und insbesondere von · bakteriellen Infektionen der Nasenhöhlen, dadurch gekennzeichnet, daß sie enthält 3 Gew.-Teile der gereinigten Antigenfraktion von Staphylococcus aureus 634-, 3 Gew.-Teile der gereinigten Antigenfraktion von Staphylococcus aureus 636, 3 Gew.-Teile der gereinigten Antigenfraktion von Staphylococcus aureus 659» 3 G-evr.-Teile der gereinigten Antigenfraktion von Streptococcus 14-7» 3 Gew.-Teile der gereinigten Antigenfraktion von Streptococcus pyogeiies 155» 3 Gew.-Teile der gereinigten Antigenfraktion von Streptococcus pyogenes 1178, 3 Gew.-Teile der gereinigten Antigenfraktion von Diplococcus pneumoniae 209 und 3 Gew.—Teile der gereinigten Antigenfraktion von Diplococcus pneumoniae auf 1 Gew.-Teil der gereinigten Antigenfraktion von Neisseria catarrhalis 987 (entsprechend dem Katalog der "Collection du Centre International de Distribution de Souches et d'Informations sur les Types Microbiens de Lausanne"), 0,25 Gew.-Teile Natriummercurothiolat, 90 Gew.-Teile KaCl und destilliertes Wasser zum Auffüllen auf 10 Volumenteile.
10. Zubereitung nach Anspruch 95 dadurch gekennzeichnet, daß sie in 15 ml-Fläschchen für das Einsprühen in die Nasenhöhle konditioniert wird und daß sie das Produkt gemäß Anspruch 8 enthält und besteht aus
4,5 mg der gereinigten Antigenfraktion von Staphylococcus aureus634, 4,5 mg der gereinigten Antigenfraktion von Staphylococcus aureus636, 4,5 mg der gereinigten Antigenfraktion von Staphylococcus aureus659, 4,5 mg der gereinigten Antigenfraktion von Streptococcus 147 4,5 mg der gereinigten Antigenfraktion von Streptococcus pvogenes
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4,5 mg der gereinigten Antigenfraktion von Streptococcus
pyogenes 1178,
4,5 mg der gereinigten Antigenfraktion von Diplococcus
pneumoniae 209,
4,5 mg der gereinigten Antigenfraktion von Diplococcus
pneumoniae 210,
1,5 mg der gereinigten Antigenfraktion von ITeisseria
catarrhalis 987,
0,375 mg Fatriummercurottiiolat,
135 mg NaCl und
Wasser in einer Menge zum Auffüllen auf ein Endvolumen von 15-ml,
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