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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf topische Zusammensetzungen zur Auftragung
auf die menschliche Haut und auf ihre Verwendung zur Verbesserung
des Zustandes und Aussehens der Haut.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Haut unterliegt der Verschlechterung durch dermatologische Erkrankungen,
Umweltschädigung (Wind,
Klimatisierung und Zentralheizung) oder durch normale Alterungsprozesse
(Chronoaging), die durch das Aussetzen der Haut der Sonne (Photoaging)
beschleunigt werden können.
In den letzten Jahren ist der Bedarf an kosmetischen Zusammensetzungen
und kosmetischen Verfahren zur Verbesserung des Aussehens und des
Zustandes der Haut enorm gewachsen.
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Die
Verbraucher suchen immer mehr nach Alterungsschutzkosmetikprodukten,
die die sichtbaren Anzeichen von chronoalternder und photoalternder
Haut, wie Falten, Linien, Durchhängen,
Hyperpigmentierung und Altersflecken, behandeln oder verzögern.
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Die
Verbraucher suchen ebenso häufig
nach anderen Vorteilen aus Kosmetikprodukten zusätzlich zum Alterungsschutz.
Das Konzept empfindlicher Haut erhöhte ebenso den Verbraucherbedarf
an Kosmetikprodukten, die das Aussehen und den Zustand von empfindlicher,
trockener und/oder schuppiger Haut verbessern und rote und/oder
gereizte Haut mildern. Die Verbraucher wünschen ebenso Kosmetikprodukte,
die eine Öl/Talg-Kontrollwirkung
aufweisen.
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Viele
Leute sind von dem Pigmentationsgrad ihrer Haut betroffen. Beispielsweise
wünschen
sich die Leute mit Altersflecken oder Sommersprossen, daß diese
pigmentierten Flecken weniger betont werden. Andere wünschen sich,
die Hautdunkelfärbung,
die durch das Aussetzen dem Sonnenlicht verursacht wird, oder das
Aufhellen ihrer natürlichen
Hautfarbe zu verringern. Um diese Erfordernisse zu erfüllen, sind
viele Versuche gemacht worden, um Produkte zu entwickeln, die die
Pigmentproduktion in den Melanozyten verringern. Jedoch weisen die
bisher identifizierten Substanzen gewöhnlich unerwünschte Nebenwirkungen,
beispielsweise Hautreizung, auf.
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Folglich
sind solche Substanzen nicht zur kosmetischen Verwendung geeignet
oder sie können
nur bei einer Konzentration aufgetragen werden, bei der ihr Hautaufhellungseffekt
geringer als gewünscht
ist. Es wird in betracht gezogen, daß die Verwendung einer Kombination
von unterschiedlichen Hautaufhellungssubstanzen die nachteiligen
Nebenwirkungen verringert, aber es besteht ein beträchtliches
Risiko, daß durch
die Verwendung einer solchen Kombination die Hautaufhellung ebenso
aufgrund der Kompetitionswirkungen verringert wird. Deshalb besteht
ein Bedarf an der Verbesserung der Wirksamkeit von kosmetischen
Hautaufhellungsprodukten, speziell so, daß sie die Haut nicht reizen.
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J07277939 beschreibt eine
Hautpflegezusammensetzung zur Verbesserung der Hautalterung und Hautentzündung, die
(A) Flor de Manita und (B) mindestens 1 aktive Verbindung, ausgewählt aus
Sauerstoffentfernern, Antioxidationsmitteln, Zellaktivatoren, Entzündungshemmern,
Tyrosinaseinhibitoren und Feuchtigkeitserhaltungsmitteln, enthält. Unter
den vielen Optionen von Inhaltsstoffen, die für Komponente B beschrieben
werden, sind Quercitolin, Quercitolin, Catechin, Gallussäure, gamma-Linolensäure und
Eicosapentaenylsäure.
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J05271046 beschreibt eine
hautaufhellende Zusammensetzung, die eine ungesättigte Fettsäure mit 18
bis 22 Kohlenstoffen und zwei oder mehreren ungesättigten
Bindungen, wie Linolsäure
und Arachidonsäure,
und ein Polyphenol enthält.
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WO99/26588
beschreibt Alterungsschutzhautpflegeformulierungen, die konjugierte
Linolsäure
umfassen und die gegebenenfalls konventionelle Sonnenschutzmittel,
wie Benzophenone enthalten können.
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Der
oben erläuterte
Stand der Technik offenbart weder eine spezielle synergistische
Kombination von konjugierter Linolsäure mit einer Phenolverbindung
(die kein Sonnenschutzmittel ist) noch die Verwendung einer solchen
speziellen Kombination zur Behandlung von Falten, empfindlicher
Haut, trockener Haut, zur Kontrolle der Öl/Talg-Absonderung oder zum Aufhellen der Haut.
Phenolverbindungen, die als ein Sonnenschutzmittel fungieren, werden
speziell aus dem Umfang der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen.
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Ein
Sonnenschutzmittel wird hierin als ein Inhaltsstoff definiert, der
einen Sonnenschutzfaktor (SPF) von mindestens 2 aufweist, wenn er
in einer Kosmetikproduktformulierung auf menschlicher Haut unter
Verwendung des standardisierten Protokolls, beschrieben in Food
and Drug Administration Monograph Sunscreen Drug Product sfr Over-the-Counter Human
Use; Final Monograph, veröffentlicht
in Federal Register Band 64, Nr. 98, 21. Mai 1999, Seiten 27666
bis 27691, getestet wird.
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Wir
fanden nun heraus, daß die
effektive Behandlung und Vorbeugung von normalen, aber kosmetisch unerwünschten
Hautzuständen
aufgrund von Chronoaging oder Photoaging, wie Falten, Linien, Durchhängen, Hyperpigmentierung
und Altersflecken, durch die Auftragung von kosmetischen Zusammensetzungen
auf die Haut, die konjugierte Linolsäure und/oder Derivate davon
zusammen mit einer Phenolverbindung umfassen, erhalten werden kann,
mit der Maßgabe,
daß die
Phenolverbindung kein Sonnenschutzmittel ist. Wir fanden ebenso
heraus, daß die
Verwendung von solchen kosmetischen Zusammensetzungen vorteilhafterweise
weitere Hautvorteile zusätzlich
zum Alterungsschutz bereitstellen, wie Mildern empfindlicher und/oder
gereizter Haut, Kontrollieren der Öl/Talg-Absonderung und Aufhellen
der Haut.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine topische Zusammensetzung
bereitgestellt, umfassend:
- (a) konjugierte
Linolsäure
und/oder Derivate davon;
- (b) eine Phenolverbindung oder Gemische davon; und
- (c) ein dermatologisch akzeptables Vehikel;
mit der
Maßgabe,
daß die
Phenolverbindung kein Sonnenschutzmittel ist.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein kosmetisches
Verfahren zur Bereitstellung von mindestens einem Hautpflegevorteil
bereitgestellt, ausgewählt
aus: Behandeln/Verhindern von Falten-bildender, durchhängender,
trockener, gealterter und/oder photogeschädigter Haut; Aktivieren der
Kollagenabscheidung in der Haut, Aktivieren der Decorinproduktion
in der Haut, Verbessern der Geweberekonstruktion; Mildern gereizter,
roter und/oder empfindlicher Haut; Verbessern der Hautbeschaffenheit,
-glätte und/oder
-festigkeit; Aufhellen der Haut; oder Kontrollieren der Öl/Talg-Absonderung;
wobei das Verfahren das Auftragen einer kosmetischen Zusammensetzung,
wie oben beschrieben, auf die Haut umfaßt.
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Die
vorliegende Erfindung umfaßt
ebenso die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur Bereitstellung
von mindestens einem Hautpflegevorteil, ausgewählt aus Behandeln/Verhindern von
Falten-bildender, durchhängender,
trockener, gealterter und/oder photogeschädigter Haut; Aktivieren der Kollagenabscheidung
in der Haut, Aktivieren der Decorinproduktion in der Haut, Verbessern
der Geweberekonstruktion; Mildern gereizter, roter und/oder empfindlicher
Haut; Verbessern der Hautbeschaffenheit, -glätte und/oder -festigkeit; Aufhellen
der Haut; und Kontrollieren der Öl/Talg-Absonderung.
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Gemäß noch einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von
konjugierter Linolsäure
und/oder Derivaten davon zusammen mit einer Phenolverbindung oder
Gemischen davon, mit der Maßgabe,
daß die
Phenolverbindung kein Sonnenschutzmittel ist, in einer kosmetischen
topischen Zusammensetzung zur Bereitstellung von einem kosmetischen
Hautpflegevorteil bereitgestellt, ausgewählt aus Behandeln/Verhindern
von Faltenbildender, durchhängender,
trockener, gealterter und/oder photogeschädigter Haut; Aktivieren der
Kollagenabscheidung in der Haut, Aktivieren der Decorinproduktion
in der Haut, Verbessern der Geweberekonstruktion; Mildern gereizter,
roter und/oder empfindlicher Haut; Verbessern der Hautbeschaffenheit,
-glätte
und/oder -festigkeit; Aufhellen der Haut; oder Kontrollieren der Öl/Talg-Absonderung.
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
Verfahren und Verwendungen stellen daher Alterungsschutzvorteile
bereit, die zur Förderung
von glatter und geschmeidiger Haut mit verbesserter Elastizität und einem
veningerten oder verzögerten
Auftreten von Falten und gealterter Haut mit verbesserter Hautfarbe führt. Eine
allgemeine Verbesserung des Aussehens, der Beschaffenheit und des
Zustandes, insbesondere in bezug auf das Strahlen, die Klarheit
und das allgemeine jugendliche Aussehen der Haut wird erreicht.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
Verfahren und Verwendungen sind ebenso zum Mildern und Beruhigen
empfindlicher und/oder gereizter Haut, zum Aufhellen der Haut und
zum Kontrollieren der Öl/Talg-Absonderung
vorteilhaft. Daher stellt die vorliegende Erfindung vorteilhafterweise
einen breiten Bereich an Hautpflegevorteilen bereit.
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Der
Ausdruck Behandeln, wie hierin verwendet, umfaßt innerhalb seines Umfangs
das Verringern, Verzögern
und/oder Verhindern der obengenannten normalen, aber kosmetisch
unerwünschten
Hautzustände,
wie faltige, gealterte und/oder photogeschädigte und/oder gereizte Haut,
und im allgemeinen das Verbessern der Qualität der Haut und das Verbessern
ihres Aussehens und ihrer Beschaffenheit durch Verhindern oder Verringern
von Reizungen, Faltenbildung und Erhöhen der Flexibilität, Festigkeit,
Glätte,
Geschmeidigkeit und Elastizität
der Haut. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
Verfahren und Verwendungen können zur
Verbesserung der Haut, die bereits in einem faltigen, gealterten,
photogeschädigten,
gereizten Zustand vorliegt, oder zur Behandlung jugendlicher Haut
nützlich
sein, um die obengenannten unerwünschten
Veränderungen
aufgrund des normalen Alterungs/Photoalterungsprozesses zu verhindern
oder zu verringern.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Konjugierte Linolsäure
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Konjugierte
Linolsäure
(hierin nachstehend als CLA bezeichnet) ist eine diungesättigte langkettige (C18)
Fettsäure.
CLA umfaßt
eine Gruppe aus Stellungs- und geometrischen Isomeren von Linolsäure, bei
denen verschiedene Konfigurationen der cis- und trans-Doppelbindungen
an den Stellen (6, 8), (7, 9), (8, 10), (9, 11), (10, 12) oder (11,
13) möglich
sind. Daher existieren 24 unterschiedliche Isomere von CLA.
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Die
Erfindung umfaßt
ebenso Derivate der freien Säure,
die daher konjugierte Linolsäurekomponenten umfaßt. Vorzugsweise
umfassen die Derivate die, die aus der Substitution der Carboxylgruppe
der Säure
stammen, wie Ester (beispielsweise Triglyceridester, Monoglyceridester,
Diglyceridester, Phosphoester), Amide (beispielsweise Ceramid derivate),
Salze (beispielsweise Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze, Ammoniumsalze);
und/oder die, die aus der Substitution der C18-Kohlenstoffkette
stammen, wie alpha-Hydroxy- und/oder beta-Hydroxy-Derivate.
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Bei
Triglyceridesterderivaten sind alle Stellungsisomere von CLA-Substituenten
an der Glycerolhauptkette einbezogen. Die Triglyceride müssen mindestens
eine CLA-Komponente enthalten. Beispielsweise können von den drei veresterbaren
Stellen an der Glycerolhauptkette die 1- und 2-Stellungen mit CLA
und durch ein anderes Lipid an Stelle 2 verestert sein, oder als
Alternative könnte
die Glycerolhauptkette durch CLA an den 1- und 3-Stellen mit einem
anderen Lipid an Stelle 2 verestert sein.
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Die
am stärksten
bevorzugten Isomere von CLA zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
sind das cis-9-trans-11-(c9-t11)
oder trans-10-cis-12-(t10-c12)-Isomer. Vorzugsweise liegt mindestens
1 Gew.-% der gesamten CLA (und/oder CLA-Komponenten), die in der
Zusammensetzung vorliegt, in Form des c9,t11- und/oder t10,c12-Isomers vor. Stärker bevorzugt
liegen mindestens 20 Gew.-% und am stärksten bevorzugt mindestens
40 Gew.-% der gesamten CLA und/oder CLA-Komponenten, die in der
Zusammensetzung vorliegen, in der Form des c9,t11-Isomers und/oder
t10,c12-Isomers vor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
wird die konjugierte Linolsäure
in dem c9,t11- oder dem t10,c12-Isomer angereichert. Unter angereichert
ist zu verstehen, daß mindestens
50 Gew.-% der gesamten CLA und/oder CLA-Komponenten, die in der
Zusammensetzung vorliegen, in Form des cis 9,trans 11- oder des
trans 10,cis 12-Isomers vorliegen – vorzugsweise liegen mindestens
70 Gew.-%, stärker
bevorzugt mindestens 80 Gew.-% und am stärksten bevorzugt mindestens
90 Gew.-% der gesamten CLA und/oder CLA-Komponenten, die in der
Zusammensetzung vorliegen, in Form des c9,t11-Isomers oder des t10,c12-Isomers
vor.
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Die
CLA und/oder Derivate davon, umfassend CLA-Komponenten gemäß der vorliegenden
Erfindung, sind als Öle
kommerziell erhältlich,
die reich an konjugiertem Linolsäuretriglycerid
sind, wie Holzöl
oder dehydratisiertes Rizinusöl
(Unichema). Ein Mischisomerprodukt ist von Sigma erhältlich und
eine c9,t11-Isomer-angereicherte CLA ist von Matreya Inc. erhältlich.
Alternativ kann CLA gemäß den bevorzugten
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung gemäß dem Verfahren,
das in WO 97/18320 offenbart wird, dessen Inhalte hierin als Verweis
aufgenommen sind, hergestellt werden. Ein bevorzugtes Verfahren
zur Herstellung wird in Beispiel 1 und 2 nachstehend offenbart.
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Egal
ob dieser Ausdruck konjugierte Linolsäure oder CLA in dieser Beschreibung
verwendet wird, ist es zu verstehen, daß die Derivate davon, die die
CLA-Komponenten umfassen, ebenso einbezogen werden. Die CLA-Komponenten beziehen
sich auf CLA-Fettacylanteil(e) eines CLA-Derivats.
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Die
CLA, die gemäß der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden soll, liegt in der topischen Zusammensetzung
in einer effektiven Menge vor. Normalerweise liegt die Gesamtmenge
der aktiven Verbindung in einer Menge zwischen 0,0001 und 50 Gew.-%
der Zusammensetzung vor. Stärker
bevorzugt liegt die Menge von 0,01 bis 10% und am stärksten bevorzugt
von 0,1% bis 5% vor, um die Vorteile bei minimalen Kosten zu maximieren.
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Phenolverbindungen
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Phenolverbindungen
können
in mindestens 10 unterschiedliche Klassen in Abhängigkeit ihrer basischen chemischen
Struktur unterteilt werden. Die Verbindungen umfassen einfache Phenole
(C6), Benzochinone (C6),
Phenolsäuren
(C6-C1), Acetophenone
(C6-C2), Phenylessigsäuren (C6-C2), Hydroxyzimtsäuren (C6-C3), Phenylpropene
(C6-C3), Kumarine,
Isokumarine (C6-C3),
Chromone (C6-C3),
Naftochinone (C6-C4), Xanthone
(C6-C1-C6), Stilbene (C6-C2-C6), Flavonoide
(C6-C3-C6), Lignane, Neolignane (C6-C3)2 und Lignine (C6-C3)n.
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Der
Ausdruck Flavonoide stellt eine sehr große Gruppe von Verbindungen
dar, die aus zwei aromatischen Ringen bestehen, welche durch eine
Dreikohlenstoffeinheit, beispielsweise C6-C3-C6, verbunden sind. Die
Familie der Flavonoide umfaßt
Isoflavonoide, monomere Flavonole, Dihydroflavonoide, Catechine,
Epicatechine (beispielsweise Laurone), Leukoanthocyanadine, Proanthocyanadine,
Anthocyanadine, Flavone, Flavonone, Chalkone, Dihydrochalkone, Isoflavone,
Neoflavone, Aurone, Flavan-3-ole, Flavan-3-ole und Anthrocyanine.
Der Ausdruck Isoflavanoide umfaßt
ebenso Isoflavone, Pterocarpane, Isoflavonone, Rotenoide, Isoflavane
und Isoflavanole.
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Die
bevorzugten Phenolverbindungen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
sind Flavonoide, einschließlich
Flavonone, wie Naringenin, Flavonole, wie Quercetin, Catechin (beispielsweise
Epigallocatechingallat, EGCG), Isoflavonoide, wie Daidzein, Genistein,
Lycetin, und ebenso Phenolsäuren,
wie Gallussäure,
und die Grünteepolyphenole.
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Quercetin,
Naringenin, Daidzein, Genistein, EGCG und Grünteepolyphenole können von
Sigma erhalten werden. Pflanzenextrakte, enthaltend die Phenolverbindungen,
sind ebenso zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
Beispielsweise enthalten Rutin, Nachtkerze, Zwiebel, Zitrusspezies
Quercetin und Naringenin, Soja enthält Daidzein und Genistein und
Grünteevariationen,
wie Kamelie sinensis, und Assamica, enthalten EGCG und Grünteepolyphenole.
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Phenolverbindungen,
die speziell aus der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen sind,
sind die, die günstigerweise
als Sonnenschutzmittel verwendet werden, wie para-Aminobenzoesäure und
Benzophenone.
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Die
Phenolverbindung oder Gemische davon werden in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in
einer Menge von etwa 0,01% bis etwa 10%, vorzugsweise in einer Menge
von etwa 10% bis etwa 1%, am stärksten
bevorzugt in einer Menge von etwa 0,1% bis etwa 5% eingesetzt.
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Dermatologisch
akzeptable Vehikel
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Die
Zusammensetzung, die gemäß der Erfindung
verwendet wird, umfaßt
ebenso ein dermatologisch/kosmetisch akzeptables Vehikel, das als
ein Verdünnungsmittel,
Dispergiermittel oder Träger
für die
aktiven Verbindungen fungiert. Das Vehikel kann Materialien umfassen,
die im allgemeinen in Hautpflegeprodukten eingesetzt werden, wie
Wasser, flüssige
oder feste Erweichungsmittel, Silikonöle, Emulgatoren, Lösungsmittel,
Feuchthaltemittel, Verdickungsmittel, Pulver, Treibmittel und dergleichen.
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Das
Vehikel wird normalerweise 5 bis 99,9 Gew.-%, vorzugsweise 25 bis
80 Gew.-% der Zusammensetzung bilden, und kann in Abwesenheit von
anderen kosmetischen Zusatzstoffen den Rest der Zusammensetzung
bilden.
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Optionale
hautfreundliche Materialien und kosmetische Zusatzstoffe
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Neben
den aktiven Verbindungen können
ebenso andere spezifische hautfreundliche aktive Verbindungen, wie
Sonnenschutzmittel, Hautaufhellungsmittel, Hautbräunungsmittel,
einbezogen werden. Das Vehikel kann außerdem ebenso Zusatzstoffe,
wie Antioxidationsmittel, Duftstoffe, Trübungsmittel, Konservierungsmittel,
Farbstoffe und Puffer, umfassen.
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Produktherstellung, Form,
Verwendung und Verpackung
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Um
die topische Zusammensetzung, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet wird, herzustellen, kann die übliche Weise zur Herstellung
von Hautpflegeprodukten eingesetzt werden. Die aktiven Komponenten
werden im allgemeinen in einem dermatologisch kosmetisch akzeptablen
Träger
in konventioneller Weise aufgenommen. Die aktiven Komponenten können geeigneterweise
zunächst
in einem Teil des Wassers oder einem anderen Lösungsmittel oder Flüssigkeit,
die in die Zusammensetzung aufgenommen werden soll, gelöst oder
dispergiert werden. Die bevorzugten Zusammensetzungen sind Öl-in-Wasser-
oder Wasser-in-Öl-
oder Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen.
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Die
Zusammensetzung kann in Form von konventionellen Hautpflegeprodukten,
wie eine Creme, ein Gel oder eine Lotion, Kapseln oder dergleichen,
vorliegen. Die Zusammensetzung kann ebenso in Form eines sogenannten
Waschproduktes, beispielsweise ein Bade- oder Duschgel, vorliegen,
das möglicherweise
ein Abgabesystem für
die aktiven Verbindungen enthält,
um das Haften an der Haut während
des Spülens
zu fördern.
Am stärksten
bevorzugt ist das Produkt ein auf der Haut verbleibendes (leave
on) Produkt; ein Produkt, das auf die Haut ohne einen bewußten Abspülschritt
gleich nach seiner Auftragung auf die Haut aufgetragen werden soll.
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Die
Zusammensetzung kann in einer geeigneten Weise, wie in einem Gefäß, einer
Flasche, einer Tube, in Kugeln oder dergleichen, in der konventionellen
Weise verpackt werden. Es wird ebenso dargestellt, daß die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
als ein Kit aus zwei separaten Zusammensetzungen verpackt werden
könnten,
wobei die eine die konjugierte Linolsäure enthält und die zweite die Phenolverbindung
enthält,
die gleichzeitig oder nacheinander auf die Haut aufgetragen werden
können.
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann ebenso zu einer Form formuliert werden, die zur oralen Nahrungsaufnahme
geeignet ist, wie eine Kapsel, Tablette oder ähnliches.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann ein oder mehrmals täglich
auf der Haut, die die Behandlung benötigt, durchgeführt werden.
Die Verbesserung des Hauterscheinungsbildes wird normalerweise nach
3 bis 6 Monaten in Abhängigkeit
des Hautzustandes, der Konzentration der aktiven Verbindungen, die
in dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, der Menge der verwendeten Zusammensetzung und
der Häufigkeit,
mit der sie aufgetragen wird, sichtbar. Im allgemeinen wird eine
kleine Menge der Zusammensetzung, beispielsweise 0,1 bis 5 ml, auf
die Haut aus einem geeigneten Behälter oder Applikator aufgetragen
und darüber
verteilt und/oder in die Haut unter Verwendung der Hände oder
Finger oder einer geeigneten Vorrichtung eingerieben. Ein Abspülschritt
kann gegebenenfalls in Abhängigkeit,
ob die Zusammensetzung als ein verbleibendes oder ein Abspül-Produkt
formuliert wurde, folgen.
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Damit
die vorliegende Erfindung ohne weiteres verstanden werden kann,
werden die folgenden Beispiele nur zur Illustration angegeben.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel stellt die Synthese von konjugierter Linolsäure dar,
umfassend das c9,t11-Isomer und t10,c12-Isomer.
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Herstellung
von gemischten Isomeren aus CLA
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Analysenreines
(AR) Natriumhydroxid (0,6 kg) wurde in 6 kg Propylenglykol mit pharmazeutischer Reinheit
durch Mischen und Erhitzen auf 80 bis 85°C gelöst. Die Probe wurde abgekühlt und
2 kg Safloröl
wurden zugegeben. Unter Verwendung einer Standardvorrichtung im
halbtechnischen Maßstab
wurde das Gemisch für
3 Stunden unter schnellem Rühren
bei 170°C
unter Rückfluß erhitzt.
Das Reaktionsgemisch wurde auf etwa 95°C abgekühlt, der Rührer auf eine intermediäre Geschwindigkeit
reduziert und die Mischung unter Verwendung von 1,280 Liter von
35,5%iger Salzsäure,
die in vollentsalztem Wasser (8 Liter) gelöst wurde, während des Haltens der Temperatur
bei etwa 90°C
neutralisiert. Das Reaktionsgemisch konnte sich absetzen, und die
wässerige
Phase wurde abgezogen. Die Ölphase
wurde mit 2 × 1
Liter 5%iger AR-Salzlösung und
durch 2 × 1
Liter vollentsalztes Wasser bei 90°C unter Ausscheidung jeglichen
Seifenmaterials gewaschen. Das CLA-angereicherte Öl wurde
bei 100°C
unter Vakuum vor dem Ablassen bei etwa 50°C getrocknet und durch ein Buchner-System,
das einen Whatman-Filter und eine dünne Schicht des Celite-Hyflo-Filterhilfsmittels
enthält,
filtriert. Das gemischte isomer-CLA-Öl wurde unter Stickstoff bei –25°C, bis es
benötigt
wird, gelagert. Die Zusammensetzung des Öls, das durch dieses Verfahren
hergestellt wurde, wird in Tabelle 1 nachstehend dargestellt:
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2. Herstellung von c9,t11-Isomer-angereicherter
CLA
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(I) Herstellung von Laurylestern:
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CLA,
hergestellt aus Saflor (2,0 kg), wurde zu 2 × Moläquivalenten von Laurylalkohol
(1-Dodecanol; 98% von Aldrich Chemicals) zusammen mit 5,96 kg vollentsalztem
Wasser zugegeben. Die Temperatur wurde auf 25°C eingestellt und 1 Gew.-% Geotrichum
Candidum (von Amano Pharmaceuticals, Japan) wurde in Vormischung
mit etwas Wasser zugegeben und kräftig gemischt. Die Reaktion
wurde bei 44 Stunden gestoppt. Der Behälter wurde auf 80 bis 90°C erhitzt,
die wässerige
Schicht abgelassen und das Öl
wurde mit vollentsalztem Wasser gewaschen und bei 100°C unter Vakuum
für 30
min getrocknet. Das Öl
wurde auf 50°C
abgekühlt
und durch ein Buchner-System, das einen Whatman-Filter und eine
dünne Schicht
des Celite-Hyflo-Filterhilfsmittels enthält, filtriert.
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(II) Trennung der angereicherten
c9,t11-CLA-Ester:
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Der
restliche Laurylalkohol wurde bei 130°C bei 25 bis 35 ml pro Minute
durch Molekulardestillation entfernt. Der Rest wurde grob in die
Laurylester (angereichert in c9,t11-CLA) und freie Säuren (angereichert
in t10,c12-CLA)
durch Verdampfung bei 158°C
bei einer Fließgeschwindigkeit
von 25 bis 35 ml pro Minute getrennt. Jede verbleibende freie Säure in dem
Laurylesterrest wurde durch eine weitere Destillation bei 171°C bei einer
Fließgeschwindigkeit
von 30 bis 40 ml pro Minute reduziert. 2790 g des Laurylesterrests
wurden bei 90°C
unter Verwendung von 330 ml 4M AR-Natriumhydroxid neutralisiert,
gefolgt von der Trennung des Öls aus
der wässerigen
Phase, 3 × Waschen
des Öls
in heißem
vollentsalztem Wasser, einer weiteren 0,1 M Alkaliwäsche und
zwei Heißwasserwäschen. Die
angereicherte Laurylesterölprobe
wurde wie zuvor getrocknet.
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(III) Verseifung der angereicherten
c9,t11-CLA-Laurylester:
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Laurylester
von c9,t11-angereicherter CLA wurden unter Verwendung von AR-Natriumhydroxid/96% lebensmitteltauglichen
Ethanol verseift und unter Verwendung von AR-konzentrierter Salzsäure erneut
angesäuert.
Das Reaktionsgemisch, das die angereicherten freien CLA-Fettsäuren enthält, wurde
bei 100°C
getrocknet und wie zuvor bei etwa 50°C filtriert. Laurylalkohol wurde
bei 132°C
bei 25 bis 30 ml pro Minute eingedampft. Um jeglichen restlichen
Laurylalkohol zu entfernen, wurden freie Alkohole zu den Fettsäuren, die
in dem Reaktionsgemisch vorliegen, unter Verwendung der SP392-Mucor
miehei-Lipase (5%, Charge Lux 0110 von Novo Nordisk) verestert.
Die angereicherte c9,t11-CLA, die Fettsäuren enthält, wurde von den Laurylestern
unter Verwendung der Molekulardestillation unter Vakuum bei 155°C bei 15
bis 20 ml pro Minute getrennt. Die Zusammensetzung der angereicherten
c9,t11-CLA, die durch das obige Verfahren hergestellt wurde, wird in
Tabelle 2 nachstehend dargestellt:
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(II) Trennung der angereicherten
t10,c12-CLA:
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Der
restliche Laurylalkohol wurde bei 130°C bei 25 bis 35 ml pro Minute
durch Molekulardestillation entfernt. Der Rest wurde grob in die
Laurylester (angereichert in c9,t11-CLA) und freie Säuren (angereichert
in t10,c12-CLA)
durch Verdampfung bei 158°C
bei einer Fließgeschwindigkeit
von 25 bis 35 ml pro Minute getrennt.
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Isolierung der angereicherten
t10,c12-CLA
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Die
CLA-freien Säuren
aus dem obigen Schritt (II) wurden erneut bei 160 bis 165°C und 20
bis 30 ml/min destilliert, um den Estergehalt zu verringern. Der
restliche Laurylalkohol wurde außerdem durch eine Destillation
bei 131°C
und einer Fließgeschwindigkeit
von 25 bis 30 ml/min reduziert. Um jeglichen restlichen Laurylalkohol
zu entfernen, wurden freie Alkohole zu den Fettsäuren, die in dem Reaktionsgemisch
vorliegen, unter Verwendung der SP392-Mucor miehei-Lipase (5%, Charge
Lux 0110 von Novo Nordisk) verestert. Die angereicherte t10,c12-CLA,
die Fettsäuren
enthält,
wurde von den Laurylestern unter Verwendung der Molekulardestillation
unter Vakuum bei 155°C
bei 15 bis 20 ml pro Minute getrennt. Die Zusammensetzung der angereicherten
t10,c12-CLA, die durch dieses Verfahren hergestellt wurde, wird
in Tabelle 3 nachstehend dargestellt:
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Beispiel 2 – Herstellung
von t10,c12-CLA-Triglyceriden
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Die
angereicherte t10,c12-CLA (10 g), die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde,
wurde mit 1,01 g (10,1%) Glycerol (Pricerine 9083 Glyerin CP von
Ellis and Everards) gemischt und 0,5 g (ungefähr 5%) SP392-Mucor Meihie nicht-spezifische
Lipase (Mucor Meihie von Novo Nordisk Charge Lux 0110) wurde zugegeben.
Die gemischten Materialien wurden unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer
bei 60°C
mit einer leichten Stickstoffentlüftung gerührt.
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Nach
96 Stunden wurde die Reaktion durch Filtrieren des Gemisches durch
eine dünne
Schicht des Celite-Supergel-Filterhilfsmittels
auf einem Buchner-Filter, der die CLA-Triglyceridölphase sammelt,
gestoppt, wobei die Zusammensetzung davon in Tabelle 4 nachstehend
dargestellt wird:
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Beispiel 3
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Verfahrensweise zur Messung
von Prokollagen-I und Decorinsynthese in menschlichen Hautfibroblasten
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Herstellung von Hautfibroblasten-konditioniertem
Medium
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Primäre menschliche
Hautfibroblasten bei Passage 2 (P2) wurden in 12-Lochplatten bei
10.000 Zellen/cm2 gesät und für 24 Stunden in einer Atmosphäre von 5%
Kohlendioxid und 4% Sauerstoff in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium
(DMEM), ergänzt
mit 10% fetalem Kälberserum,
gehalten. Nach dieser Zeit wurden die Zellen mit serumfreiem DMEM
gewaschen und dann in frischem serumfreiem DMEM für weitere
60 Stunden inkubiert. Die Fibroblasteneinzelschichten wurden dann
erneut mit serumfreiem DMEM gewaschen. Die Testreagenzien und Vehikelkontrollen
wurden zu den Zellen in dreifacher Ausfertigung in einem Endvolumen
von 0,4 ml/Loch frischem serumfreiem DMEM zugegeben und für weitere
24 Stunden inkubiert. Dieses Fibroblasten-konditionierte Medium
wurde entweder direkt analysiert oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren
und bei –70°C für die künftige Analyse
gelagert. Die Zellen wurden dann gezählt und die Daten aus der Dot-Blot-Analyse
anschließend
auf die Zellzahl standardisiert.
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Beispiel 4
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Dot-Blot-Assay für Prokollagen-I
und Decorinprotein in Hautfribroblasten-konditioniertem Medium
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Die
Proben des konditionierten Mediums aus Hautfibroblasten, die mit
dem Vehikel (als Kontrolle) oder Testreagenzien behandelt wurden,
wurden mit 20 mM Dithiothreitol (1:10-Verdünnung der 200 mM Stammlösung) und
0,1% Natriumdodecylsulfat (1:100-Verdünnung der 10% Stammlösung) ergänzt, gut
gemischt und dann bei 75°C
für 2 Minuten
inkubiert. Ein Standard für
den Assay wurde durch Reihenverdünnung
von sauberen Fibroblasten-konditioniertem
Medium aus Fibroblasten, gesät
bei 10.000 Zellen/cm2 in einem 175 cm2 Kolben und aufrechterhalten in serumfreiem
DMEM, wie oben beschrieben, erzeugt.
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Die
Assayproben wurden anschließend
in dreifacher Ausfertigung auf ein vorher angefeuchtetes Tuch von
Immobilon-P-Transfermembran unter Verwendung der 96-Loch-Bio-Dot-Vorrichtung
von Bio-Rad, wie in den Richtlinien des Herstellers beschrieben,
aufgetragen. Ungefähr
200 μl Medium
wurden pro Loch aufgetragen. Das Medium konnte durch die Membran
unter Schwerkraft (30 Minuten), nachdem die Membran zweimal mit
PBS (200 μl)
gewaschen wurde, filtriert werden. Diese PBS-Wäschen konnten durch die Membran
unter Schwerkraft (2 × 15
Minuten) filtriert werden. Die Bio-Dot-Vorrichtung wurde dann an
einen Vakuumverteiler angeschlossen und eine dritte und letzte PBS-Wäsche wurde
unter Saugung durchgeführt.
Die Vorrichtung wurde demontiert, die Membran entfernt und, wenn
notwendig, schnell zerschnitten, bevor sie in einem Blockierungspuffer über Nacht
bei 4°C
plaziert wird.
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Die
Membranen, die zur Decorinanalyse hergestellt wurden, wurden mit
3% (Gewicht/Volumen) BSA/0,1% (Volumen/Volumen) Tween 20 in PBS
blockiert, während
die zur Prokollagen-I-Analyse mit 5% (Gewicht/Volumen) fettarmem
getrocknetem Milchpulver/0,05% Tween 20 in PBS blockiert wurde.
Am darauffolgenden Tag wurden die Membranen mit einer 1:10000-Verdünnung von
primären
Antikörpern
zu entweder menschlichen Prokollagen-I (MAB1912; Ratte monoklonal;
Chemicon Int. Inc., Temecula, CA) oder menschlichen Decorin (Kaninchen
polyklonal; Biogenesis) für
2 Stunden bei Raumtemperatur untersucht. Die Membranen wurden anschließend mit
TBS/0,05% Tween 20 (3 × 5
Minuten) gewaschen und dann mit einer 1:1.000-Verdünnung von 125I-konjugierten Anti-Ratten- oder Anti-Kaninchen-F(ab')2-Fragmenten (Amersham), wenn
erforderlich, für
1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Immobilon-Streifen
erneut mit TBS/Tween 20 (3 × 5
Minuten) gewaschen, bevor sie an der Luft bei Raumtemperatur trocknen
konnten. Die getrockneten Membranen wurden in Cellophan eingewickelt
und einem Molecular Dynamics Lagerleuchtschirm für 16 bis 18 Stunden ausgesetzt.
Nach dieser Zeit wurde der exponierte Schirm durch einen Phosphorbildgeber
(Molecular Dynamics Phosphorimager SF) unter Verwendung der Image-QuantTM-Software
gescannt. Die Dot-Intensität
wurde durch computergestützte
Bildanalyse unter Verwendung der Quantifizierungstools in ImageQuantTM, standardisiert auf die Zellzahl, bewertet,
und die Wirkungen der verschiedenen Testreagenzien auf Decorin-
und Prokollagen-I-Synthese wurden in Bezug auf einen Vehikel-behandelten
Kontrollwert von 100 beliebigen Einheiten bestimmt.
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Beispiel 5
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Tests
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Die
nachstehende Tabelle 5 zeigt die synergistische Wirkung von konjugierter
Linolsäure
in Kombination mit der Phenolverbindung Epigallocatechingallat (EGCG)
auf die Prokollagen-I- und/oder Decorinsynthese in menschlichen
Hautfibroblasten und die Menge, in der die aktiven Verbindungen
aufgetragen werden. Um die Ergebnisse zu normalisieren, wurden die
Wirkungen der Testsubstanzen in Bezug auf einen Vehikel-behandleten
Kontrollwert von 100 beliebigen Einheiten bestimmt. Die Konzentrationen
der Reagenzien, die in den Versuchen verwendet werden, hatten keinen
Einfluß auf
die Zellebensfähigkeit.
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Die
Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen, daß die Kombination von konjugierter
Linolsäure
mit einer Phenolverbindung die Synthese von Prokollagen-I und/oder
Decorin in menschlichen Hautfibroblasten synergistisch hochreguliert.
Das Niveau von Decorin in der Haut wird mit dem verbesserten Zustand
und dem Aussehen der Haut in Verbindung gebracht. Die Erhöhung des
Niveaus von Decorin in der Haut ist für die kontrollierte und korrekte
Ablagerung von Kollagen auf der Haut wichtig, die mit vielen Hautvorteilen,
wie Faltenauslöschung und
Hautwiederherstellung von photogeschädigter Haut, verbunden ist.
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Beispiel 6
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Dieses
Beispiel zeigt die synergistische Wirkung der speziellen Kombination
von konjugierter Linolsäure
mit einer Phenolverbindung beim Reduzieren der Entzündungsreaktion
von Hautfibroblasten.
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Fibroblasten PGE2 und ICAM-Assay
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Die
intrazelluläre
Adhäsionsmolekül-(ICAM)
und PEG2-Produktion durch menschliche Hautfibroblasten
können
durch den Entzündungsreiz
PMA (Phorbalmyristatacetat) induziert werden. PMA stellt einen externen
Streßfaktor
dar, der den oxidativen Streß und
die Entzündungsreaktion
in Zellen induziert. Dieses Modell wird verwendet, um die Entzündung in
vivo darzustellen.
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Primäre menschliche
Vorhautfibroblasten bei Passage 2 (P2) wurden in 95-Lochplatten
bei 10.000 Zellen/Loch gesät
und für
24 Stunden in einer Atmosphäre
von 5% Kohlendioxid in Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium (DMEM), ergänzt mit
10% fetalem Kälberserum,
gehalten. Die Testsubstanzen, wie in der Tabelle 7 nachstehend angezeigt,
wurden zu den frischen Zellmedien (DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum)
in Dimethylsulfoxid und bei einer Ethanolendkonzentration < 1% in dreifacher
Ausfertigung zugegeben und für
weitere 24 Stunden inkubiert. Phorbalmyristatacetat (PMA)(Sigma)
wurde in 10 nM zu den Medien zugegeben, und die Zellen wurden für weitere
24 Stunden inkubiert. Die Kontrolle, die nur das Vehikel enthielt, enthielt
keine Testverbindungen oder irgendwelches PMA. Die Fibroblasten/Medien
wurden dann, wie nachstehend beschrieben, direkt analysiert oder
in flüssigem
Stickstoff schockgefroren, und bei –70°C für die künftige Analyse gelagert. Die
Zellen wurden dann gezählt,
und die Daten aus der Dot-Blot-Analyse anschließend auf die Zellzahl standardisiert.
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Prostaglandin E2 (PGE2) Assay:
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Volumen
von 50 μl
Kulturmedium wurden für
den PGE2-Assay nach vorsichtigem Schütteln der
Kulturplatte genommen. Die PGE2-Niveaus
in dem Medium wurden mit einem Biotrak PGE2-Immunoassaykit (Amersham,
UK) bestimmt. Der Assay basiert auf der Kompetition zwischen unmarkiertem
PGE2 in der Probe und einer fixierten Menge
an Meerettichperoxidase-markiertem PGE2 für eine begrenzte
Menge von fixiertem PGE2-spezifischen Antikörper.
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Konzentrationen
von unmarkiertem Proben-PGE2 werden gemäß einer
Standardkurve, die zum selben Zeitpunkt erhalten wurde, bestimmt.
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ICAM-1-Assay
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Die
Medien wurden verworfen und die Zellen mit Dulbecco PBS gewaschen.
Zu den gewaschenen Zellen wurden 150 μl 0,1% Triton X-100 (Sigma)
für 3 Minuten
zugegeben, um ICAM aus der Zellmembran zu extrahieren. Die Extrakte
wurden zu Eppendoff-Zentrifugenröhrchen übertragen
und bei 1000 g für
2 min zentrifugiert, um die Zellreste zu entfernen. Ein Volumen
von 100 μl Überstand
wurde für
den ICAM-Assay verwendet. Das lösliche
ICAM-1 wurde mit einem kommerziell erhältlichen immunoenzymatischen
Assaykit (R & D Systems)
bewertet. Die Konzentrationen von ICAM-1 in den Proben wurden bestimmt,
basierend auf der parallel laufenden Standardkurve.
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Die
Ergebnisse, die aus dem PGE2- und ICAM-Assay
erhalten wurden, werden in Tabelle 6 nachstehend zusammengefaßt.
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Die
obigen Ergebnisse zeigen, daß die
Anregung von Zellen mit einem Entzündungsreiz, wie PMA (Phorbolmyristylacetat)
eine Erhöhung
der Entzündungsreaktion
verursacht, wie durch die Prostaglandin-E2-(PGE2)-Produktion
gemessen. Die spezielle Kombination von konjugierter Linolsäure mit
einer Phenolverbindung verringert synergistisch die Entzündungsreaktion,
wie durch die PGE2-Produktion gemessen.
Die Ergebnisse zeigen daher, daß die
speziellen Kombinationen von aktiven Verbindungen innerhalb des
Umfangs der vorliegenden Erfindung überraschend synergistische
entzündungshemmende
Wirkung zeigen.
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Die
obigen Ergebnisse zeigen ebenso, daß die Anregung von Zellen mit
PMA eine Erhöhung
der ICAM-Produktion
verursacht. Das Behandeln der Zellen mit einer Kombination aus konjugierter
Linolsäure
mit einer Phenolverbindung verringert synergistisch die Produktion
von intrazellulärem
Adhäsionsmolekül (ICAM), was
ein anderer Marker der Entzündung
ist. Diese Ergebnisse zeigen daher außerdem, daß die speziellen Kombinationen
von aktiven Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden
Erfindung eine gute und überraschend
synergistische entzündungshemmende
Wirkung aufweisen.
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Beispiel 7
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Die
nachstehende Formulierung beschreibt eine Öl-in-Wasser-Creme, die für die Verfahren
und Verwendungen gemäß der vorliegenden
Erfindung geeignet ist. Die angegebenen Prozentangaben beziehen
sich auf das Gewicht der Zusammensetzung.
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56 ist Cetylalkohol POE (10)
- Alfol 16RD ist Cetylalkohol
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Beispiel 8
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Die
nachstehende Formulierung beschreibt eine Emulsionscreme gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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Sowohl
die obigen topischen Zusammensetzungen von Beispiel 7 als auch 8
stellen eine effektive kosmetische Behandlung bereit, um das Aussehen
von faltiger, gealterter, photogeschädigter und/oder gereizter Haut
zu verbessern, wenn sie auf normale Haut, die sich durch die Alterung
oder Photoalterung verschlechtert hat, aufgetragen wird, oder wenn
sie auf jugendliche Haut aufgetragen wird, um solche verschlechternden
Veränderungen
zu verhindern oder zu verzögern.
Die Zusammensetzungen sind ebenso zum Mildern gereizter Haut, Konditionieren
trockener Haut, Aufhellen der Hautfarbe und Verringern der Öl- und Talgabsonderung wirksam.
Die Zusammensetzungen können
in konventioneller Weise verarbeitet werden.
