DE69912254T2

DE69912254T2 - Kosmetisches verfahren zur hautbehandlung

Info

Publication number: DE69912254T2
Application number: DE69912254T
Authority: DE
Inventors: S. Sharnbrook ALALUF; Karen Elizabeth Sharnbrook BARRETT; Maria Anita BRINKER; William Frederick Hogeweg 1 CAIN; Martin Richard Green; Heng-Long Colworth House HU; Koichi 45 River Road Edgewater IWATA; Eugene Thomas JANUARIO; Karen Angela Ottey; Laura Rose Palanker; Jonathan R. Powell; Anthony Vincent Sharnbrook RAWLINGS; Julia Sarah Rogers; Uma 45 River Road Edgewater SANTHANAM; Allan Colworth House WATKINSON; Ronni Lynn Weinkauf
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1998-03-16
Filing date: 1999-03-08
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2019-03-09
Also published as: CN1293566A; CN1225237C; WO1999047110A1; CA2322233A1; JP2002506800A; CA2322233C; ID27020A; DE69912254D1; EP1061896A1; EP1061896B1; AU2836499A

Description

Diese Erfindung betrifft ein kosmetisches Verfahren zum Verbessern des Zustands und Aussehens von Haut und die Verwendung von Petroselinsäure bei der Herstellung von örtlichen Zusammensetzungen zum Verbessern des Zustands und Aussehens von Haut.
Haut unterliegt Verschlechterung durch dermatologische Störungen, Umwelteinfluss (Wind, Klimaanlage, Zentralheizung) oder durch den normalen Alterungsprozess (Chronoaltern), welcher durch das Aussetzen der Haut der Sonne beschleunigt wird (Photoaltern). In den letzten Jahren haben die Anforderungen an kosmetische Zusammensetzungen und kosmetische Verfahren zum Verbessern des Aussehens und Zustands der Haut stark zugenommen.
Verbraucher suchen zunehmend nach kosmetischen „Anti-Alterungs"-Produkten, die die sichtbaren Anzeichen von zeitlich und durch Licht gealterter Haut, wie Falten, Linien, Herunterhängen, Hyperpigmentierung und Altersflecken, behandeln oder verzögern.
Die Verbraucher suchen auch häufig andere Vorteile aus kosmetischen Produkten, zusätzlich zu dem Anti-Altern. Das Konzept der „empfindlichen Haut" hat die Nachfrage der Verbraucher für kosmetische Produkte, die das Aussehen und den Zustand von empfindlicher, trockener und/oder schuppiger Haut verbessern und rote und/oder gereizte Haut mildern, ansteigen lassen. Verbraucher wünschen auch kosmetische Produkte, die Flecken, Pickel, Schönheitsfehler, usw. behandeln.
Viele Menschen befassen sich mit dem Pigmentierungsgrad ihrer Haut. Beispielsweise mögen sich Menschen mit Altersflecken oder Sonnenflecken wünschen, dass solche pigmentierten Flecken weniger ausgeprägt sind. Andere mögen sich wünschen, die Hautdunkelung, die durch das Aussetzen dem Sonnenlicht verursacht wird, zu vermindern oder ihre natürliche Hautfarbe aufzuhellen. Um diesen Bedarf zu erfüllen, wurden viele Versuche unternommen, um Produkte zu entwickeln, die die Pigmenterzeugung in den Melanozyten vermindert. Die bislang identifizierten Substanzen haben jedoch in der Regel unerwünschte Nebenwirkungen, z. B. Hautreizung.
Folglich sind solche Substanzen zur kosmetischen Verwendung nicht geeignet oder sie können nur mit einer Konzentration aufgetragen werden, bei der ihre hautaufhellende Wirkung weniger als erwünscht ist. Das Anwenden einer Kombination von verschiedenen hautaufhellenden Substanzen kann als Vermindern von Nebenwirkungen betrachtet werden, jedoch gibt es ein wesentliches Risiko, dass unter Verwendung einer solchen Kombination das Hautaufhellen aufgrund von konkurrierenden Effekten vermindert wird. Deshalb gibt es einen Bedarf zur Verbesserung in der Wirksamkeit von kosmetischen hautaufhellenden Produkten, insbesondere jene, die die Haut nicht reizen.
Die Verwendung von Fettsäuren, einschließlich Petroselinsäure, in kosmetischen Formulierungen zum Behandeln des Haars sind bekannt. EP-A-116439 beschreibt Haartonika, die Fettsäuren (wie Petroselinsäure) zum Lindern von Schuppen und Jucken und zum Stimulieren des Haarwuchses einschließen.
EP-A-709084 beschreibt die Verwendung von Koriandersamenöl, welches reich an Petroselinsäuretriglyceriden ist, in einer kosmetischen Zusammensetzung zum Befeuchten von trockenen Hautzuständen.
Wir haben nun überraschenderweise weitere, nicht offenbarte Eigenschaften von Petroselinsäure gefunden, die bei kosmetischen Zusammensetzungen zur örtlichen Auftragung auf Haut zum Bereitstellen der vorher nicht offenbarten Hautpflegevorteile verwendbar sind.
Wir haben nun gefunden, dass wirksame Behandlung und Verhinderung von normalen Hautzuständen aufgrund von Chronoalterung oder Photoalterung, wie Falten, Linien, Herunterhän gen, Hyperpigmentierung und Altersflecken, durch die Auftragung von kosmetischen Zusammensetzungen auf die Haut erhalten werden können, die Petroselinsäure oder Derivate davon umfassen. Wir haben auch gefunden, dass die Verwendung von Petroselinsäure in kosmetischen Zusammensetzungen vorteilhafterweise weitere Hautvorteile, zusätzlich zu Anti-Alterung, bereitstellt, wie zum Glätten von empfindlicher und/oder gereizter Haut und zum Aufhellen der Haut.
Kurzdarstellung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein kosmetisches Verfahren zum Bereitstellen von mindestens einem Hautpflegevorteil bereitgestellt, ausgewählt aus: Behandeln/Verhindern von faltiger, herunterhängender und/oder gealterter Haut; Verstärken der Collagenabscheidung in der Haut, Verstärken der Decorinerzeugung in der Haut, Verbessern der Hauterneuerung, Verbessern von Hauttextur, Glätte und/ oder Festigkeit, wobei das Verfahren Auftragen einer örtlichen Zusammensetzung, umfassend Petroselinsäure und/oder Derivate davon, auf die Haut umfasst.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Petroselinsäure und/oder Derivaten davon zur Herstellung einer örtlichen Zusammensetzung zum Bereitstellen von mindestens einem Hautpflegevorteil, ausgewählt aus Behandeln/Verhindern von faltiger, herunterhängender, gealterter und/oder lichtgeschädigter Haut; Verstärken von Collagenabscheidung in der Haut, Verstärken der Decorinerzeugung in der Haut, Verbessern der Hauterneuerung, Verbessern der Hauttextur, Glätte und/oder Festigkeit.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendung von Petroselinsäure stellen somit Anti-Alterungs-Vorteile bereit, die sich in der Förderung von glatter und geschmeidiger Haut mit verbesserter Elastizität und einem verminderten oder verzögerten Aussehen von Falten und gealterter Haut mit verbesserter Hautfarbe ergeben. Eine allgemeine Verbesserung im Aussehen, in der Textur und im Zustand, insbesondere bezüg lich Strahlen, Klarheit und allgemein jugendliches Aussehen von Haut, wird erreicht. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Anwendungen sind auch vorteilhaft zum Glätten und Beruhigen von empfindlicher und/oder gereizter Haut. Petroselinsäure ist auch verwendbar zur örtlichen Auftragung auf menschliche Haut zur Verminderung von Melaninproduktion und somit Aufhellen der Haut, auf die sie aufgetragen wurde. Somit stellen die erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhafterweise einen breiten Bereich von Hautpflegevorteilen bereit.
Der hierin verwendete Begriff „Behandeln" schließt in seinem Umfang Vermindern, Verzögern und/oder Verhindern der vorstehend erwähnten Hautzustände, wie faltige, gealterte, lichtgeschädigte und/oder gereizte Haut und allgemeines Verstärken der Qualität der Haut und Verbessern ihres Aussehens und ihrer Textur durch Verhindern oder Vermindern von Faltenbildung und Erhöhung von Biegsamkeit, Festigkeit, Glätte, Geschmeidigkeit und Elastizität der Haut, ein. Die kosmetischen Verfahren und die Anwendungen von Petroselinsäure und/oder Derivaten gemäß der Erfindung können zum Behandeln von Haut, die bereits in einem faltigen, gealterten, lichtgeschädigten und gereizten Zustand ist, oder zum Behandeln von jugendlicher Haut, um die vorstehend erwähnten verschlechternden Veränderungen aufgrund des normalen Alterungs-/Lichtalterungsprozesses zu verhindern oder zu vermindern, verwendbar sein.
Beschreibung der Erfindung im Einzelnen
Petroselinsäure (nachstehend als PA bezeichnet) ist eine monoungesättigte langkettige (C₁₈)-Fettsäure mit der Formel CH₃(CH₂)₁₀CH=CH(CH₂)₄COOH.
Die Erfindung schließt auch Derivate der freien Säure ein, die somit Petroselinsäureeinheiten umfasst. Vorzugsweise schließen Derivate jene, die von der Substitution der Carbonsäuregruppe der Säure, wie Ester (z. B. Retinylester, Triglyceridester, Monoglyceridester, Diglyceridester, Phosphoester), Amide (z. B. Ceramidderivate), Salze (z. B. Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze, Ammoniumsalze) abgeleitet sind; und/oder jene, abgeleitet von der Substitution der C₁₈-Kohlenstoffkette, wie α-Hydroxy- und/oder β-Hydroxyderivate, ein.
Im Fall von Triglyceridesterderivaten sind alle Positionsisomeren von PA-Substituenten an dem Glyceringerüst eingeschlossen. Die Triglyceride müssen mindestens eine PA-Einheit enthalten. Beispielsweise können die drei veresterbaren Positionen an dem Glyceringerüst die 1- und 2-Positionen mit PA und durch ein weiteres Lipid an Position 3 verestert sein, oder als eine Alternative könnte das Glyceringerüst mit PA an den 1- und 3-Positionen mit einem weiteren Lipid an Position 2 verestert sein.
Öle, die reich an Petroselinsäuretriglycerid sind, sind somit auch zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Solche Öle sind kommerziell erhältlich und schließen Petersiliensamenöl, Karottensamenöl, Fenchelfruchtöl, Pastinakensamenöl, Koriandersamenöl, Kerbelsamenöl, Kümmelpflanzenöl und Selleriesamenöl ein.
Wann immer der Begriff „Petroselinsäure" oder „PA" in dieser Beschreibung verwendet wird, ist er so zu verstehen, dass die Derivate davon, die PA-Einheiten umfassen, auch eingeschlossen sind. „PA-Einheiten" bezieht sich auf PA-Fettacylanteil(e) eines PA-Derivats.
Die wirksame Petroselinsäure, die gemäß der vorliegenden Erfindung anzuwenden ist, liegt in der örtlichen Zusammensetzung in einer wirksamen Menge vor. Normalerweise liegt die Gesamtmenge des Wirkstoffs in einer Menge zwischen 0,0001% und 50 Gewichtsprozent der Zusammensetzung vor. Bevorzugter ist die Menge 0,01% bis 10% und besonders bevorzugt 0,1% bis 5%, um die Vorteile bei minimalen Kosten zu maximieren.
Dermatologisch verträglicher Träger
Die gemäß der Erfindung angewendete Zusammensetzung umfasst auch einen dermatologisch/kosmetisch verträglichen Träger, um als ein Verdünnungsmittel, Dispersant oder Träger für den Wirkstoff, PA, zu wirken. Der Träger kann Materialien, die üblicherweise in Hautpflegeprodukten angewendet werden, wie Wasser, flüssige oder feste Erweichungsmittel, Silikonöle, Emulgatoren, Lösungsmittel, Feuchthaltemittel, Verdickungsmittel, Pulver, Treibmittel und dergleichen, umfassen.
Der Träger wird gewöhnlich 5% bis 99,9%, vorzugsweise 25% bis 80, Gewichtsprozent der Zusammensetzung bilden und kann in Abwesenheit von anderen kosmetischen Hilfsstoffen den Ausgleich der Zusammensetzung bilden.
Wahlweise Hautvorteilsmaterialien und kosmetische Hilfsstoffe
Neben dem Wirkstoff, PA, können auch andere spezielle Hautvorteilswirkstoffe, wie Sonnenschutzmittel, andere hautaufhellende Mittel, Hautbräunungsmittel, eingeschlossen sein. Der Träger kann auch weiterhin Hilfsmittel, wie Parfüms, Opazitätsmittel, Konservierungsmittel, Färbemittel und Puffer, einschließen.
Produktherstellung, Form, Verwendung und Verpacken
Um die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete örtliche Zusammensetzung herzustellen, können die in üblicher Weise zum Herstellen von Hautpflegeprodukten verwendeten angewendet werden. Die wirksamen Komponenten werden im Allgemeinen in einen dermatologisch verträglichen Träger in herkömmlicher Weise eingearbeitet. Die wirksamen Komponenten können geeigneterweise zuerst gelöst oder in einem Teil des Wassers oder weiterem Lösungsmittel oder Flüssigkeit, um in die Zusammensetzung eingearbeitet zu werden, dispergiert werden. Die bevorzugten Zusammensetzungen sind Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionen.
Die Zusammensetzung kann in Form von herkömmlichen Hautpflegeprodukten, wie Creme, Gel oder Lotion oder dergleichen, vorliegen. Die Zusammensetzung kann auch in Form eines sogenannten „Abwasch"-Produkts, z. B. einem Bade- oder Dusch gel, das möglicherweise ein Freisetzungssystem für den Wirkstoff enthält, um das Anhaften an der Haut während des Abspülens zu fördern, vorliegen. Besonders bevorzugt ist das Produkt ein „leave-on"-Produkt; ein Produkt, das auf die Haut aufzutragen ist, ohne dass ein absichtlicher Abspülschritt bald nach seiner Auftragung erfolgt.
Die Zusammensetzung kann in beliebiger geeigneter Weise, wie in einer Dose, einer Flasche, Tube, Rollkugel oder dergleichen, in herkömmlicher Weise verpackt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ein- oder mehrmals täglich auf der Haut, welche die Behandlung erfordert, ausgeführt werden. Die Verbesserung des Hautaussehens wird gewöhnlich nach 3 bis 6 Monaten in Abhängigkeit vom Hautzustand, der Konzentration der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten wirksamen Komponenten, der Menge an verwendeter Zusammensetzung und der Häufigkeit, mit der es aufgetragen wird, sichtbar. Im Allgemeinen wird eine kleine Menge der Zusammensetzung, beispielsweise 0,1 bis 5 ml, aus einem geeigneten Behälter oder Applikator auf die Haut aufgetragen und darüber verteilt und/oder unter Verwendung von Händen oder Fingern oder einer geeigneten Vorrichtung in die Haut gerieben. Ein Abspülschritt kann gegebenenfalls folgen, in Abhängigkeit davon, ob die Zusammensetzung als ein „leave-on"- oder ein „Abspül"-Produkt formuliert ist.
Um die vorliegende Erfindung leichter verständlich zu machen, werden nur zur Erläuterung die nachstehenden Beispiele angegeben.
BEISPIELE
Dieses Beispiel zeigt die Anti-Alterungs-Vorteile von Petroselinsäure.
Beispiel 1
Identifizierung von Procollagen-I und Decorin-Aufregelung in der Haut in vivo nach örtlicher Retinsäurebehandlung für Vergleichszwecke
Collagen, das vorherrschende Matrixhautprotein, ist dafür bekannt, dass es der Haut Zugfestigkeit verleiht. Decorin ist ein Proteoglycan, von dem bekannt ist, dass es zur gesteuerten und korrekten Abscheidung von Collagen in der extrazellulären Matrix von Haut wirksam ist. Es ist auf dem Fachgebiet auch bekannt, dass die Anteile von Collagen und Decorin in der Haut mit gealterter und/oder lichtgeschädigter Haut wesentlich vermindert sind. Viele Untersuchungen haben gezeigt, dass die Anteile von Collagen Typ I in der Haut mit dem Alter und/oder mit erhöhter Lichtschädigung sinken (beispielsweise Lavker, R. J. Inv. Derm., (1979), 73, 79–66; Griffiths et al. N. Eng. J. med. (1993) 329, 530–535). In dem Fall von Decorin wurde gezeigt, dass mRNA-Expression und Expression von dem Proteoglycan in lichtgeschädigter Haut in vitro stark vermindert ist (Bernstein et al. Lab. Invest. (1995)72, 662–669). Die Verminderung der Anteile von diesen Hautproteinen ist folglich mit einer Abnahme an Zugfestigkeit der Haut, unter Verursachen von Falten und Schlaffheit, verbunden.
Es ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, dass Retinsäure ein starker Anti-Alterungs-Wirkstoff ist und Hautreparatur von lichtgeschädigter Haut induziert. Es wurde gezeigt, dass Faltenauslöschung und Hautreparatur nach örtlicher Behandlung von Haut mit Retinsäure durch neue Collagenabscheidung und Synthese in der Haut anwächst (beispielsweise Griffiths et al. N. Eng. J. med. (1993) 329, 530–535). Es wird weithin akzeptiert, dass das Verfestigen der Dermalmatrix durch Verstärken des Anteils von Collagen in der Haut unter Verwendung von Retinsäure Antialterungs-/Hautreparaturvorteile bereitstellt. Procollagen I ist eine Vorstufe von Collagen. Erhöhte Erzeugung von Procollagen I in Reaktion auf eine Testverbindungsanwendung ist ein Marker für einen erhöhten Collagenspiegel.
Zwei Gruppen von Frauen wurden mit identischen oder nahezu identischen Graden von milder bis mittlerer Lichtschädigung am jeweiligen äußeren Unterarm ausgesucht. Sie wurden mit 0,05% Retinsäure in einer befeuchtenden Grundlage (Retinova^®) und auch mit einer Farbe-anpassenden Befeuchtigungscreme mit ähnlichen sensorischen Eigenschaften (Dermacare^® Lotion), jedoch ohne Wirkbestandteile, als ein Placebokontrolle, behandelt. Jedem Teilnehmer der zwei Gruppen wurde Retinova^® auf den äußeren Unterarm und Placebo (Dermacare^®) auf den äußeren Unterarm aufgetragen. Gruppe 1 wurden die Produkte täglich auf deren äußere Unterarme für 14 Wochen aufgetragen und Gruppe 2 wurden die Produkte auf deren äußere Unterarme für 28 Wochen aufgetragen. Am Ende der Untersuchungen wurden zwei vollständige Dicken von 4 mm Stanzungsbiopsien aus den behandelten Flächen von jedem Unterarm genommen. Immunohistochemische Analyse des aus den Teilnehmern genommenen Biopsiegewebes wurde durchgeführt, um die Wirkung von Retinsäurebehandlung auf die Expression von extrazellulären Haut-Matrixkomponenten und Decorin und Procollagen-I, verglichen mit den Placebo-behandelten Unterarmen, zu identifizieren. Dem nachstehenden Verfahren wurde gefolgt:
MATERIALIEN
Antikörperverdünnungspuffer für Wachssektionen war zusammengesetzt aus tris-gepufferter Salzlösung (TBS), 3%igem Rinderserumalbumin (BSA), 0,05%igem Triton X-100 und 0,05%igem Natriumazid. Primäre Antikörper von Procollagen-I (Amino-endständig) wurden von Chemicon International Inc. (Cat# MAB 1912, Ratten-IgG1) erhalten und auf Wachsabschnitten bei einer Verdünnung von 1 : 800 über Nacht bei 4°C, nachdem der Abschnitt mit Trypsin (0,5 mg/ml, 25 Minuten, 37°C) vorbehandelt wurde, verwendet. Primäre Antikörper für Decorin wurden aus Biogenese (Kaninchen-polyklonal) erhalten und auf Wachsabschnitten bei einer Verdünnung von 1 : 800 über Nacht bei 4°C verwendet. Anti-Ratten-biotinylierte sekundäre Antikörper, erhalten von DAKO (Cat# E0468, Kaninchen-polyklonal), wurden auf Wachsabschnitte bei einer Verdünnung von 1 : 400 aufgetragen. Anti-Kaninchen-biotinylierte sekundäre Antikörper, erhalten von Amersham (Cat# RPN 1004, Esel-polyklonal), wurden auf Wachsabschnitte mit einer Verdünnung von 1 : 400 aufgetragen. Streptavidin-konjugierte alkalische Phosphatase, erhalten von Zymed (Cat# 43-4322), wurde bei einer Konzentration von 1 : 2500 verwendet. Echtrot-Chromogen wurde von DAKO (Cat# K597) erhalten. Gills #3 Haemotoxylinkernzählstamm, erhalten von Sigma (Cat# GHS-3), wurde filtriert und ohne Verdünnung verwendet. Trypsin wurde von Sigma (Cat# T-7186) erhalten und die Scheiben wurden mit Glycergel von DAKO (Cat# C563) befestigt.
VERFAHREN
Wachsabschnitte des Biopsiegewebes wurden an Silanbeschichteten Scheiben befestigt und 18 Stunden bei 55°C gesintert. Die Scheiben wurden durch Xylol und Alkohol entwachst und in Wasser gebracht und dann zu TBS überführt. Ein DAKO^®-Stift wurde verwendet, um die Abschnitte einzukreisen. Die Abschnitte wurden zur Antigenwiedergewinnung unter Verwendung von Trypsin, falls erforderlich, wie für jeden Antikörper ausgewiesen, verarbeitet. Wenn Antigenwiedergewinnung notwendig war, wurden die Scheiben 25 Minuten bei 35°C mit Trypsin bei 0,5 mg/ml (Sigma Cat# T-7186) inkubiert. Die Protease wurde anschließend mit TBS (2 × 2 Minuten) abgespült. Nach Antigenwiedergewinnung, falls erforderlich, oder andererseits direkt nach Einkreisen der Bereiche, wurde nichtspezifisches Antikörperbinden mit 5%igen Lösungen von sekundärem Antikörperwirtsserum in TBS/0,5% BSA/0,1% Natriumazid, als der Blockierungslösung, für mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer blockiert. Die überschüssige Blockierungslösung wurde entzogen, jedoch die Abschnitte wurden nicht austrocknen lassen. Die Abschnitte wurden dann mit dem primären Antikörper (ungefähr verdünnt wie vorstehend ausgewiesen) in einer Feuchtigkeitskammer über Nacht bei 4°C inkubiert. Antikörper wurde anschließend von den Abschnitten, ohne dieselben austrocknen zu lassen, entfernt. Die Scheiben wurden dann mit TBS zum Entfernen von ungebundenem primärem Antikörper – eine Minute Spülung, gefolgt von drei Fünf-Minuten-Waschungen – gewaschen und dann mit geeignetem sekundärem Antikörper (ungefähr verdünnt wie vorstehend beschrieben) in einer Feuchtigkeitskammer für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Antikörperlösung wurde anschließend von den Scheiben, ohne den Abschnitt austrocknen zu lassen, entfernt. Die Scheiben wurden in TBS gewaschen, eine Minute Spülung, gefolgt von 4 × 5-Minuten-Waschungen, um den ungebundenen sekundären Antikörper zu entfernen. Für den biotinylierten sekundären Antikörper wurden die Abschnitte anschließend mit Streptavidinkonjugat 45 Minuten bei 37°C inkubiert und dann in TBS zum Entfernen von ungebundenem Streptavidinkonjugat gewaschen. Das Chromogen wurde zugegeben und die Farbe unter Beobachtung zum Vermeiden von Überanfärben entwickelt. Die Abschnitte wurden dann gegengefärbt und fixiert.
Die Unterschiede in der Expression von Procollagen-I und Decorin zwischen Retinsäure (Retinova^®)- und Placebo (Dermacare^®)-behandelten Stellen wurden durch visuelle Einschätzung von immunohistochemisch angefärbten Abschnitten unter Verwendung von Lichtmikroskopie bestimmt.
Diese Analyse wies markierte Aufregulierung von sowohl Procollagen-I als auch Decorin in lichtgeschädigter Haut nach örtlicher Anwendung von Retinsäure (Retinova^®) auf, wie in der nachstehenden Tabelle 1 ausgewiesen.
Tabelle 1
Wirkung von Retinsäurebehandlung bei Expression von Procollagen-I und Decorin in Haut in vivo
Die extrazellulären Matrixkomponenten Procollagen-1 und Decorin sind somit deutlich identifizierbare Marker von Retinsäure-induzierter dermaler Reparatur.
Verfahren zum Messen von Procollagen-I und Decorin-Synthese in humanen dermalen Fibroblasten
Herstellung von dermalem Fibroblasten-konditioniertem Medium
Primäre humane Vorhautfibroblasten bei Passage 2 (P2) wurden in 12-Vertiefungs-Platten bei 10000 Zellen/cm² beimpft und 24 Stunden in einer Atmosphäre von 5%igem Kohlendioxid und 4%igem Sauerstoff in Dulbeccos-modifiziertem Eagles Medium (DMEM), ergänzt mit 10%igem fötalem Kalbsserum, gehalten. Nach dieser Zeit wurden die Zellen mit serumfreiem DMEM gewaschen und dann in frischem serumfreiem DMEM für weitere 60 Stunden inkubiert. Die Fibroblastenmonoschichten wurden dann erneut mit serumfreiem DMEM gewaschen. Testreagenzien und Trägerkontrollen wurden zu den Zellen in dreifacher Ausführung in einem Endvolumen von 0,4 ml/Vertiefung frischem serumfreiem DMEM gegeben und weitere 24 Stunden inkubiert. Dieses Fibroblasten-konditionierte Medium wurde, entweder sofort oder nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff und gelagert bei –70°C zur zukünftigen Analyse, analysiert. Die Zel- len wurden dann gezählt und die Daten aus der Datenauftragungsanalyse anschließend zur Zellzahl standardisiert.
Dot-Blot-Assay für Procollagen-I und Decorin-Protein in dermalem Fibroblasten-konditioniertem Medium
Die Proben von konditioniertem Medium aus dermalen Fibroblasten, behandelt mit Träger (als eine Kontrolle), oder Testreagenzien wurden mit 20 mM Dithiothreitol (1 : 10 Verdünnung von 200 mM Stammlösung) und 0,1%igem Natriumdodecylsulfat (1 : 100 Verdünnung von 10%iger Stammlösung) ergänzt, gut vermischt und dann 2 Minuten bei 75°C inkubiert. Ein Standard für das Assay wurde durch serielle Verdünnung von unverdünntem Fibroblasten-konditioniertem Medium aus Fibroblasten, beimpft bei 10000 Zellen/cm², in einem 175-cm²-Kolben erzeugt und in serumfreiem DMEM, wie vorstehend beschrieben, gehalten. Assayproben wurden anschließend in dreifacher Ausführung auf einen vorbefeuchteten Bogen von Immobilon-P-Übertragungsmembran, unter Verwendung der 96-Vertie-fungs-Bio-Dot-Apparatur von Bio-Rad, wie durch die Anleitungen der Hersteller beschrieben, aufgetragen. Ungefähr 200 μl Medium wurden pro Vertiefung aufgetragen. Das Medium wurde durch die Membran unter Schwerkraft (30 Minuten) filtrieren lassen, wonach die Membran zweimal mit PBS (200 μl) gewaschen wurde. Diese PBS-Waschungen wurden durch die Membran unter Schwerkraft (2 × 15 Minuten) filtrieren lassen. Die Bio-Dot-Apparatur wurde dann an einer Vakuumvorrichtung befestigt und eine dritte und End-PBS-Waschung unter Saugen ausgeführt. Die Apparatur wurde abgestellt, die Membran entfernt und schnell, wie erforderlich, vor dem Anordnen in Blockierungspuffer über Nacht bei 4°C geschnitten. Die für die Decorinanalyse hergestellten Membranen wurden mit 3%igem (Gewicht/Volumen) BSA/0,1%igem (Volumen/Volumen) Tween 20 in PBS blockiert, während jene zur Procollagen-I-Analyse mit 5%igem (Gewicht/Volumen) Nichtfettgetrocknetem Milchpulver/0,05%igem Tween 20 in PBS blockiert wurden. Am nachfolgenden Tag wurden die Membranen mit 1 : 10000 Verdünnung von primärem Antikörper zu entweder Human-Procollagen-I (MAB1912; Ratten-monoklonal; Chemicon Int. Inc., Temecula, CA) oder Human-Decorin (Kaninchen-polyklonal; Biogenesis) 2 Stunden bei Raumtemperatur per Sonde untersucht. Die Membranen wurden anschließend mit TBS/ 0,05%igem Tween 20 (3 × 5 Minuten) gewaschen und dann mit 1 : 1000 Verdünnung von ¹²⁵I-konjugierten Anti-Ratten- oder Anti-Kaninchen-F(ab')-2-Fragmenten (Amersham), wie erforderlich, für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Immobilonstreifen vor dem trocknen lassen an der Luft bei Raumtemperatur erneut mit TBS/Tween 20 (3 × 5 Minuten) gewaschen. Die getrockneten Membranen wurden in Cellophan gepackt und einem Speicherphosphorschirm von Molecular Dynamics für 16–18 Stunden ausgesetzt. Am Ende dieses Zeitraums wurde der exponierte Schirm durch einen Phosphorimager (Molecular Dynamics Phosphorimager SF) unter Verwendung von ImageQuant^TM Software gescannt. Die Punktintensität (Dot) wurde durch Computer unterstützte Bildanalyse unter Verwendung der Quantifizierungswerkzeuge in ImageQuant^TM, standardisiert auf Zellzahl, bewertet und die Wirkungen von verschiedenen Testreagenzien auf Decorin und Procollagen-I-Synthese wurden bestimmt, bezogen auf einen Träger-behandelten Kontrollwert von 100 willkürlichen Einheiten.
TESTS
Die nachstehende Tabelle 2 weist die Wirkungen von Petroselinsäure auf Procollagen-I und Decorinsynthese in humanen dermalen Fibroblasten aus und die Mengen, in denen sie aufgetragen wurden. Um die Ergebnisse der Wirkungen der Testsubstanz zu normalisieren, wurden sie relativ zu einem Trägerbehandelten Kontrollwert von 100 willkürlichen Einheiten bestimmt. Zum Vergleich wurde ein Versuch mit Retinsäure zum Bewerten ihrer Wirkung auf die Decorinsynthese in humanen dermalen Fibroblasten ausgeführt. Die Konzentrationen an in den Versuchen verwendeten Reagenzien hatten keinen Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit.
Tabelle 2 Die Wirkung auf Procollagen-I und Decorin-Synthese durch Petroselinsäure
Die Ergebnisse in Tabelle 2 weisen aus, dass Petroselinsäure signifikant die Synthese von sowohl Procollagen-I als auch Decorin in humanen dermalen Fibroblasten provoziert, verglichen mit der Kontrolle.
Der Anteil an Decorin in der Haut ist mit verbessertem Zustand und Aussehen der Haut verbunden. Erhöhen des Anteils von Decorin in der Haut ist wichtig für die gesteuerte und korrekte Ablagerung von Collagen in der Haut, die mit vielen Hautvorteilen, wie Faltenentfernung und Hautreparatur von lichtgeschädigter Haut, verbunden ist.
Der Vergleichsversuch mit Retinsäure (1 μm) zeigte eine Aufregulierung von Decorin, 138 ± 14,0 (p = 0,035, n = 4), wie bestimmt, bezogen auf einen Träger-behandelten Kontrollwert von 100 willkürlichen Einheiten. Überraschenderweise weisen die Daten somit weiterhin aus, dass der Höchstwert der durch Petroselinsäure bestimmten Aufregulierung von humanen dermalen Fibroblasten und Decorinsynthese darin jenen der Bezugsgröße für Anti-Alterungs-Hautreparaturwirkstoff, nämlich Retinsäure, übersteigen wird.
Beispiel 2
Dieses Beispiel misst die Anti-Reiz-Funktionalität von Petroselinsäure.
Keratinozyten SDS Lebensfähigkeits-Assay Methodologie
Keratinozyten wurden in 96-Vertiefungs-Platten auf ungefähr 80% Zusammenfluss in Keratinozyten-Wachstumsmedium (KGM) wachsen lassen, welches dann gegen KGM ohne Hydrocortison für 24–48 Stunden ersetzt wurde. Die Zellen wurden dann mit einer Konzentration von Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt, welche Zelllebensfähigkeit von ungefähr 50% (2 μ/ml) in Gegenwart oder Abwesenheit von Petroselinsäure erzeugen wird. Die Zellen wurden dann mit Petroselinsäure bei in nachstehender Tabelle 3 ausgewiesenen Konzentrationen dosiert. Die Kontrolle enthielt kein beliebiges SDS oder Testverbindungen. Nach Inkubieren für 24 Stunden wurde das Medium entfernt und die Lebensfähigkeit durch das Neutralrotverfahren bestimmt. Mit diesem Verfahren wurden die Zellen 3 Stunden in KGM, enthaltend 25 μg/ml Neutralrot, inkubiert, wonach das Medium entfernt wurde und die Zellen dann mit 1 ml 1%iger (Volumen/Volumen) Essigsäure, 50%igem (Volumen/Volumen) Ethanol in Einheiten von 30 Minuten extrahiert wurden. Die Absorption des Extrakts bei 562 nm wurde bestimmt und die Lebensfähigkeit durch Bezug auf Kontrollvertiefungen bewertet, welche weder SDS noch Testverbindungen enthielten. Die Ergebnisse, die erhalten wurden, werden in der nachstehenden Tabelle 3 zusammengefasst:
Tabelle 3
Alle Petroselinsäure-(PA)-Werte zeigen signifikant erhöhte Lebensfähigkeit, verglichen mit dem 2 μg/ml SDS-Wert allein, wie durch 1-Weg-ANOVA mit Student-Neumann-Kuels-Mehrfachvergleich bestimmt, p < 0,05.
Diese Methodologie hat gezeigt, dass die Keratinozytentoxizität von einem Reizmittel zur Reizwirkung des Mittels in vivo in Beziehung steht (Lawrence, JN, Starkey, S., Dickson, PM & Benford, DJ. Use of human and rat keratinocyte cultures to assess skin irritation potential. Toxicol. In Vitro. 10, 331–340 (1996)). Somit zeigen wir hier, dass die Behandlung mit Petroselinsäure signifikant die toxischen Wirkungen von SDS auf Keratinozyten vermindert und folglich, dass sie eine Anti-Reiz-Funktionalität aufweist.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt, dass Petroselinsäure die Grundanteile von PGE₂ (Prostaglandin E₂), sekretiert durch Keratinozyten in vitro, wirksam vermindern kann.
Keratinozyten PGE₂ Assay
Keratinozyten wurden in 96-Vertiefungs-Platten auf ungefähr 80%igen Zusammenfluss in Keratinozyten-Wachstumsmedium (KGM) wachsen lassen. Dies wurde dann gegen KGM ohne Hydrocortison für 24–48 Stunden ersetzt. Die Zellen wurden dann mit Petroselinsäure in den in nachstehender Tabelle 4 gezeigten Mengen dosiert. Keine Petroselinsäure wurde zu den Kontrollzellen gegeben. Die Zellen wurden mit (oder für die Kontrolle ohne) Petroselinsäure für 24 Stunden inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde das Medium geerntet und auf basale Freisetzung von Pro-Entzündungs-PGE₂ durch Enzym-gebundenes Immunoassay unter Verwendung eines kommerziellen PGE₂-Kits (Amersham, Buckinghamshire, England) bewertet.
Die Zellen wurden dann auf Lebensfähigkeit durch das Neutralrotaufnahmeverfahren, beschrieben vorstehend in Beispiel 2, getestet. Die Zelllebensfähigkeit erwies sich als nicht durch die Behandlung mit Petroselinsäure, die in den getesteten Konzentrationen verwendet wurde, nachteilig beeinflusst.
Das Anti-Entzündungspotenzial der Testverbindungen wurde durch die Fähigkeit der Verbindungen bewertet, die Basalanteile von sekretiertem PGE₂, wie durch die Kontrolle verglichen, zu vermindern. Statistische Signifikanz wurde unter Verwendung des Student-T-Tests bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse werden in nachstehender Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4
Statistische Analyse unter Verwendung von 1-Weg-ANOVA mit Student-Neumann-Kuels-Mehrfachvergleich zeigte, dass eine 0,1 und 1 μM Petroselinsäure (PA) signifikant (p < 0,05) die Freisetzung von PGE₂ aus nichtstimulierten Keratinozyten verminderte.
PGE₂ ist ein gut bekannter Mediator von Entzündung in der Haut, siehe Greaves et al. „Prostagludus, leukotriemes, phospholipase, platelet actuating factor and cytokines: an integrated approach to inflammation of human skin, "Arch. Dermatol. Res. (1988) 280 [Supp]: 533–541.
Die Ergebnisse weisen aus, dass Petroselinsäurebehandelte Keratinozyten weniger von dem pro-entzündlichen Prostaglandin PGE₂ erzeugen, wodurch das Entzündungspotenzial der Haut vermindert wird.
Beispiel 4
Dieses Beispiel misst die Wirkung von Petroselinsäure auf das Vermindern der Entzündungsreaktion von dermalen Fibroblasten.
Fibroblasten PGE₂ und ICAM Assay
Intrazelluläre Anhaftungsmoleküle (ICAM) und PGE₂-Erzeugung durch Humanhautfibroblasten können durch den Entzündungsstimulus PMA (Phorbal-Myristat-Acetat) induziert werden. PMA gibt einen externen Stressor wieder, der oxidative Belastung und entzündliche Reaktionen in Zellen induziert. Dieses Modell wird verwendet, um Entzündung in vivo zu modellieren.
Primäre humane Vorhautfibroblasten bei Passage 2 (P2) wurden in 96-Vertiefungs-Platten bei 10000 Zellen/Vertiefung beimpft und 24 Stunden in einer Atmosphäre von 5%igem Kohlendioxid in Dulbeccos-modifiziertem Eagles Medium (DMEM), ergänzt mit 10%igem fötalem Kalbsserum, gehalten. Petroselinsäure wurde zu frischen Zellmedien (DMEM, ergänzt mit 10%igem fötalem Kalbsserum) in Dimethylsulfoxid (DMSO, Endkonzentration 1%) in dreifacher Ausführung gegeben und für weitere 24 Stunden beimpft. Phorbales Myristatacetat (PMA) (Sigma) wurde zu den Medien gegeben und die Zellen für weitere 24 Stunden inkubiert. Die Kontrolle enthielt weder Testverbindungen noch beliebiges PMA. Die Fibroblasten/Medien wurden dann, wie nachstehend beschrieben, analysiert, sofort oder nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff, und bei –70°C zur zukünftigen Analyse, gelagert. Die Zellen wurden dann gezählt und die Daten aus der Dot-Blot-Analyse anschließend auf die Zellzahl standardisiert.
Prostaglandin E2 (PGE₂) Assay: Volumina von 50 μl Kulturmedium wurden für das PGE₂-Assay nach mildem Schütteln der Kulturplatte genommen. PGE₂-Anteile in dem Medium wurden mit einem Biotrak-PGE₂-Immunoassaykit (Amersham, GB) bestimmt. Das Assay basierte auf der Konkurrenz zwischen nichtmarkiertem PGE₂ in der Probe und einer fixierten Menge an Meerrettichperoxidase-markiertem PGE₂ für eine begrenzte Menge an fixiertem PGE₂-spezifischem Antikörper. Konzentrationen von nichtmarkierter Probe PGE₂ werden gemäß einer Standardkurve bestimmt, die zur gleichen Zeit erhalten wurde.
ICAM-1-Assay: Medien wurden verworfen und Zellen mit Dulbecco PBS gewaschen. Zu den gewaschenen Zellen wurden 150 μl 0,1%iges Triton X-100 (Sigma) 3 Minuten gegeben, um ICAM aus Zellmembran zu extrahieren. Die Extrakte wurden zu Eppendorff-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 1000 G 2 Minuten zum Entfernen von Zelldebris zentrifugiert. Ein Volumen von 100 μl Überstand wurde für ICAM-Assay verwendet. Das lösliche ICAM-1 wurde mit kommerziell verfügbarem immunoenzymometrischem Assaykit (R & D Systems) bewertet. Konzentrationen an I-CAM-1 in den Proben wurden, basierend auf einer parallel laufenden Standardkurve, bestimmt.
Die Ergebnisse, die aus dem PGE₂- und ICAM-Assay erhalten wurden, werden in nachstehender Tabelle 5 zusammengefasst.
Tabelle 5 Wirkungen von Petroselinsäure auf PMA-induziertes I-CAM und PGE₂-Produktion in humanen Hautfibroblasten
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass exponierte Zellen mit einem Entzündungsstimulus, wie PMA (Phorbol-Myristyl-Acetat), eine Erhöhung der Entzündungsreaktion, wie gemessen durch Prostaglandin E2 (PGE₂)-Produktion, verursachen. Petroselinsäure vermindert selbst in einer Menge von 0,1 μM dramatisch die Entzündungsreaktion, wie durch PGE₂-Produktion gemessen. Die Ergebnisse zeigen somit, dass Petroselinsäure gute Antientzündungswirkung aufweist.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen auch, dass die Exposition von Zellen mit PMA eine Erhöhung der ICAM-Produktion verursacht. Petroselinsäure senkt die Produktion an intrazellulärem Anhaftungs-Molekül (ICAM), welches ein weiterer Entzündungsmarker ist. Diese Ergebnisse zeigen somit weiterhin, dass Petroselinsäure gute entzündungshemmende Wirkung aufweist.
Beispiel 5
Hautaufhellungsassay-Methodologie
* Zellhalten
B16-F1-Maus-Melanomzellen (American Type Culture Collection, Maryland, USA) wurden in 75 cm²-Kulturkolben in RPMI 1640 Medium (ICN-Flow, Cat. Nr. 12-60-54), ergänzt mit L-Glutamin (4 mM) und 10%igem fötalem Rinderserum (FBS) bei 37°C in einer Wasser-gesättigten, 5%igen CO₂ in Luftatmosphäre gehalten. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich durchgegangen.
* Pigmentierungsassay
Subkonfluent-B16-Zellen wurden in 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatten bei einer Dichte von 5000 Zellen/Vertiefung beimpft und über Nacht in DMEM (Life Technologies, NY), enthaltend l0%iges fötales Rinderserum und 1%iges Penizillin/Streptomycin ohne Phenolrot, bei 37°C unter 5%igem CO₂ kultiviert. Nach 24 Stunden wurden die Medien gegen frische Medien, die die Testmaterialien oder Trägerkontrollen enthielten, ersetzt. Die Zellen wurden 72 Stunden inkubiert, wobei Melanin in den Kontrollvertiefungen sichtbar wurde. Nun wurden die Melanin-enthaltenden Medien aus jeder Vertiefung zu einer sauberen 96-Vertiefungs-Platte überführt und durch Le sen der Absorption bei 530 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Spektrophotometers (Dynatech MR5000) und Korrigieren der Grundlinienabsorption von frischem Medium quantifiziert. Wenn die korrekte Absorption proportional zu der Melaninkonzentration ist, kann der Prozentsatz Pigmentierung für eine Hautaufhellungstestsubstanz berechnet werden wie: % Pigmentierung = (OD530 Test/OD530 Bezug) × 100%,worin OD₅₃₀ Test und OD₅₃₀ Bezug die mittlere korrigierte Absorption des Mediums aus den Vertiefungen mit der Testsubstanz und jenem von dem Medium aus den Vertiefungen ohne die Testsubstanz ausweist. Der durch die Testsubstanz verursachte Prozentsatz Inhibierung ist dann 100% Pigmentierung.
* Zelllebensfähigkeitsassay
Die Melaninproduktion kann durch Inhibierung von Melanogenese vermindert werden, jedoch kann sie auch durch Zytotoxizität oder Zellproliferation beeinflusst werden. Um zu testen, ob dieses stattfindet, wurde die Zelllebensfähigkeit durch Neutralrotfarbstoffabsorption getestet. Neutralrot ist ein in Wasser löslicher Farbstoff, der durch die intakte Plasmamembran gelangt und in den Lysosomen in intakten Zellen konzentriert wird. Die gesamte Neutralrotfarbstoffaufnahme ist proportional zu der Anzahl an lebensfähigen Zellen in der Kultur.
Sofort nach der Entfernung von Medium zur Melaninanalyse aus den Mikrotiterplatten wurden 200 μl frischer, vorerwärmter Neutralrotfarbstoff (von Sigma, GB, Cat. Nr. 2889) bei 25 μg/ml Medium, aufgetragen auf die Zellen und 3 Stunden zum Zellhalten, inkubiert. Der Farbstoff, welcher nicht durch die Zellen aufgenommen wurde, wurde durch Inversion der Platte und Auffangen auf Absorptionsmittelpapier entfernt. Die Zellen wurden mit 200 μl PBS ge waschen, was anschließend wieder entfernt wurde. 100 μl Lösungsmittel (50% H₂O, 49% Ethanol, 1% Essigsäure) wurden zugegeben. Nach 20 Minuten bei Umgebungstemperatur wurde jede Platte 5 Sekunden auf einem Mikrotiterplattenschüttler geschüttelt. Die Absorption wurde wie vorstehend beschrieben gemessen.
Tests
Nachstehende Tabelle 6 weist die Hautaufhellungs-Testsubstanzen, die bewertet wurden, aus und die Menge, in der sie aufgetragen wurden. Der Prozentsatz Inhibierung der durch die Testsubstanzen, wie vorstehend beschrieben, verursachten Melaninproduktion wird in der Tabelle ebenfalls reflektiert.
Werte, weniger als 100% Melaninkontrolle, weisen Inhibierung von Melanogenese aus. Somit zeigen die Ergebnisse in Tabelle 3, dass PA Melaninproduktion inhibiert.
In den Versuchen wurde die Testsubstanz mit DMEM in in nachstehender Tabelle 6 gezeigten Mengen verdünnt.
Tabelle 6
Beispiel 6
Die nachstehende Formulierung beschreibt eine Öl-in-Wasser-Creme, die für die Verfahren und Anwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Die angegebenen Prozentsätze sind auf das Gewicht der Zusammensetzung bezogen.
Beispiel 7
Die nachstehende Formulierung beschreibt eine Emulsionscreme gemäß der vorliegenden Erfindung.
Sowohl die vorstehenden örtlichen Zusammensetzungen von Beispiel 6 als auch 7 stellen eine wirksame kosmetische Behandlung zum Aufhellen der Farbe von Haut bereit und/oder zum Verbessern des Aussehens von faltiger, gealterter, lichtgeschädigter und/oder gereizter Haut, wenn auf die Haut aufgetragen, die sich verschlechtert hat durch das Altern oder Lichtschädigung, oder, wenn aufgetragen auf jugendliche Haut, um das Verhindern oder Verzögern solcher verschlechternder Veränderungen zu unterstützen. Die Zusammensetzungen können in herkömmlicher Weise verarbeitet werden.

Claims

Kosmetisches Verfahren zum Bereitstellen von mindestens einem Hautpflegevorteil, ausgewählt aus: Behandeln/Verhindern von faltiger, herunterhängender und/oder gealterter Haut; Verstärken der Collagenabscheidung in der Haut, Verbessern von Hauttextur, Glätte und/oder Festigkeit, wobei das Verfahren Auftragen einer örtlichen Zusammensetzung, umfassend Petroselinsäure und/oder Derivate davon, auf die Haut umfasst.
Verwendung von Petroselinsäure und/oder Derivaten davon zur Herstellung einer örtlichen Zusammensetzung zum Bereitstellen von mindestens einem Hautpflegevorteil, ausgewählt aus Behandeln/Verhindern von faltiger, herunterhängender, gealterter und/oder lichtgeschädigter Haut; Verstärken von Collagenabscheidung in der Haut, Verbessern der Hauttextur, Glätte und/oder Festigkeit.