CN1293566A - 护理皮肤的化妆方法 - Google Patents

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Abstract

通过把含有岩芹酸和/或其衍生物的组合物局部应用来提供一种用于治疗老化、起皱和/或光损害皮肤的化妆方法。所述方法还降低皮肤刺激并且增白皮肤。

Description

护理皮肤的化妆方法
本发明涉及改善皮肤健康状况和皮肤外观的化妆方法，本发明还涉及岩芹酸在制备用于改善皮肤健康状况和皮肤外观的局部施用组合物中的应用。
皮肤容易受下列多种因素影响而变坏：皮肤学疾病、环境滥用(风、空调、集中采暖)或正常老化进程(即时间老化，其可因皮肤受阳光照射(光老化)而加速)。近来，非常需要开发化妆品组合物和化妆方法用于改善皮肤健康状况和皮肤外观。
消费者逐渐寻求能治疗或延迟皮肤时间老化和光老化的可见迹象、例如皱纹、条纹、松垂、色素沉着过度和老年斑的“抗老化”化妆产品。
消费者还经常从化妆品中寻求除抗老化之外的其它好处。“敏感性皮肤”的概念也使消费者需要化妆品用于改善干燥和／或薄而易剥落的敏感性皮肤的外观和健康状况以及用于缓和皮肤发红和／或炎症。消费者还需要能够处理皮肤斑点、丘疹和瑕疵等的化妆产品。
许多人关心皮肤的色素沉着程度。例如，具有老年斑或雀斑的人们希望这些色素斑能够变浅些。还有一些人希望降低由阳光照射引起的皮肤发黑或减轻他们的自然皮肤颜色。为了满足这些需要，已经进行了许多尝试来开发能够降低黑素细胞色素产生的产品。然而，迄今为止，已经鉴定的物质具有不需要的副作用例如皮肤发炎。
因此，这些物质不适合用于化妆，或者他们只能以使皮肤增白效果不能令人满意的浓度应用。可以考虑把不同的增白皮肤物质组合来用于降低不利副作用，但这样可能导致由于相容性作用而引起皮肤增白效果减弱。因此，需要改进化妆性增白皮肤产品的效果，特别是这些物质不刺激皮肤。
已知脂肪酸例如岩芹酸能够用于处理头发的化妆品制剂。EP116439记载了生发油含有脂肪酸(例如岩芹酸)来减轻头皮屑和发痒以及用于刺激头发生长。
EP-A 709084中描述了在化妆组合物中应用芫荽子油(富含岩芹酸甘油三酯)来湿润干燥的皮肤。
我们已经令人惊奇地发现：岩芹酸还有一些未公开的特性，这些特性能在局部应用的皮肤化妆组合物中提供以前未公开的皮肤护理效果。
我们已经发现：通过把含有岩芹酸或其衍生物的化妆组合物施用于皮肤，可以有效地处理和预防由时间老化或光老化引起的正常皮肤状态例如皱纹、条纹、松垂、色素沉着过重和老年斑。我们还发现：在化妆组合物中应用岩芹酸能够有利地提供除抗老化之外的其它皮肤效应例如降低皮肤敏感性和／或发炎以及增白皮肤。
发明概述
本发明的一个方面是提供化妆方法用于提供至少一种下列皮肤护理作用：处理／预防起皱、松垂、老化和／或光损害皮肤；增加皮肤的胶原沉积；增加皮肤核心蛋白聚糖的产生；增强组织修复；增白皮肤；缓解皮肤炎症、发红和／或过敏；改进皮肤纹理、光滑性和／或结实性；该方法包括：把含有岩芹酸和／或其衍生物的局部用组合物施用于皮肤。
本发明还涉及岩芹酸和／或其衍生物在用于提供至少一种选自下列的皮肤护理效果的局部施用组合物中的应用：处理／预防起皱、松垂、老化和／或光损害皮肤；增加皮肤胶原沉积、增加皮肤中核心蛋白聚糖的产生、增强组织修复；增白皮肤；增白皮肤；缓解皮肤炎症、发红和／或过敏；改进皮肤纹理、光滑性和／或结实性。
本发明的方法和岩芹酸的应用提供抗老化效果，该效果使皮肤更光滑和更柔软，弹性更好，皮肤起皱和皮肤老化减少或延迟，并改善皮肤颜色。在皮肤外观、纹理和健康状况特别是光亮性、清晰性和通常的年轻外观方面，均可以达到通常的改进效果。本发明的方法和用途还有益于缓解和减轻皮肤的致敏和／或发炎。岩芹酸还可以局部用于人皮肤来降低黑色素产生从而增白其应用部位的皮肤。因此，本发明的方法有利地提供广泛的皮肤护理作用。
术语“处理”在此包括：减轻、延迟和／或防止上面描述的皮肤健康状况例如起皱、老化、光损害和／或炎症，并通过防止或降低起皱和增强柔韧性、结实性、光滑性、柔软性和弹性来通常增进皮肤质量和改善皮肤外观。本发明化妆方法和，岩芹酸和／或其衍生物的用途可能用于处理起皱、老化、光损害和发炎的皮肤，或者用于治疗年轻的皮肤以预防或降低前面提到的由于正常老化／光老化引起的皮肤恶化。
发明详述
岩芹酸(下文称“PA”)是单不饱和长链(C18)脂肪酸，化学式为CH3(CH2)10CH=CH(CH2)4COOH。
本发明还涉及含有岩芹酸部分的该游离酸衍生物。优选的衍生物包括那些羧基部分被取代的衍生物例如酯(如视黄基酯、甘油三酯、单甘油酯、甘油二酯、磷酸酯)、酰胺(例如神经酰胺衍生物)、盐(例如碱金属和碱土金属盐、铵盐)；和／或那些来自于C18碳链部分被取代的衍生物例如α-羟基和／或β-羟基衍生物。
在甘油三酯衍生物中，包括所有在甘油骨架上PA取代的各种位置异构体。该甘油三酯必须含有至少一个PA部分。例如，在甘油骨架可酯化的三个位置中，位置1和2可以被PA酯化，在位置3被另一个脂类酯化；或者，该甘油骨架可以在位置1和3被PA酯化，在位置2被另一个脂类酯化。
因此，富含岩芹酸甘油三酯的油也适合用于本发明。这样的油可以市售得到，包括：洋芫荽子油、胡萝卜子油、小茴香油、欧洲萝卜子油、芫荽子油、雪维菜子油、藏茴香油和芹菜籽油。
当术语“岩芹酸”或“PA”用于本申请说明书时，应该明白还包括含有PA部分的衍生物。“PA”部分指PA衍生物的PA脂肪酰基部分。
根据本发明，在局部施用组合物中存在有效量的活性岩芹酸。通常地，为了以最小的代价取得最好的效果，按组合物的重量计，在组合物中活性成分的总含量为0．0001-50％重量、更优选0．01-10％重量和最优选0．1-5％重量。
                  皮肤学可接受载体
本发明所用的组合物还含有皮肤学／化妆学上可接受的赋形剂作为活性成分PA的稀释剂、分散剂或载体。这些赋形剂可以含有皮肤护理产品通常所用的物质例如水、液体或固体润肤剂、硅油、乳化剂、溶剂、湿润剂、增稠剂、粉末和推进剂等。
按组合物重量计，所述赋形剂在组合物中的含量通常为5-99．9％、优选25-80％，并可在缺乏其它化妆辅料的情况下用于平衡组合物。
             任选的皮肤有益物质和化妆辅料
除含有活性成分PA外，还可以含有其它特别对皮肤有益的活性物质例如防晒剂、其它皮肤增白剂和皮肤变褐剂。所述载体还进一步包括辅料例如香料、遮光剂、防腐剂、着色剂和缓冲剂。
             产品的制备、剂型、用途和包装
为了制备本发明方法所用的局部施用组合物，可以采取制备皮肤护理产品的通常方式。通常是按常规方式将活性组分加到可皮肤用载体中。首先可以把活性成分在一部分水或加入到组合物中的其它溶剂或液体中溶解或分散。优选的组合物是水包油或油包水乳剂。
本组合物可以是常规皮肤护理产品剂型例如膏霜、凝胶或洗剂等。该组合物还可以是所谓的“洗去”产品例如沐浴胶或淋浴胶，可能含有用于在冲洗时促进皮肤粘附的活性成分释放系统。最优选地，产品为“保留(leave-on)”产品：在敷用于皮肤后无需故意的冲洗就能用于皮肤的产品。
该组合物可通过任意的合适方式包装，例如以传统的方式如广口瓶、瓶子、管子或滚动条等。
可以每天1次或多次对需要处理的皮肤实施本发明的方法。通常在3-6个月后可以看出皮肤外观的改进，具体时间取决于皮肤状况、本发明方法所用活性成分的浓度、应用组合物的量及应用频率。通常地，从合适的容器或涂药器中把小量组合物例如0．1-5ml敷用于皮肤，然后用手或手指或合适的设备将其扩散和／或摩擦至皮肤。根据组合物是“保留”或“洗去”产品，可以选择是否需要冲洗步骤。
为了使本发明可以更容易地被理解，列出下列实施例，它们仅仅用于举例说明本发明。
                        实施例
该实施例显示岩芹酸的抗老化作用。
                        实施例1
用于对比目的的局部岩芹酸处理后，体内皮肤中前胶原-I和核心蛋白聚糖增量调节的鉴定
已知胶原(主要的基质皮肤蛋白)能赋予皮肤拉伸强度。核心蛋白聚糖是一种蛋白多糖，已知其对于控制和校正胶原在皮肤细胞外基质中沉积是非常重要的。本领域技术人员还知道：随着皮肤的老化和／或光损害，皮肤中胶原和核心蛋白聚糖的含量显著降低。许多研究显示：随着老化和／或光损害的增加，皮肤中I型胶原减少(例如Lavker，R．J．Inv．Derm．，(1979)，73，79-66；Griffiths等．N．Eng．J．Med．(1993)329，530-535)。对于核心蛋白聚糖，已经显示：在体外的光损害皮肤中，该蛋白多糖的mRNA表达和表达太太降低(Bernstein等．Lab．Invest．(1995)72，662-669)。因此，这些皮肤蛋白含量的降低同引起起皱和松驰的皮肤拉伸强度下降是相关的。
本领域熟知的事实是：视黄酸是强效的抗老化活性成分，能够引起光损害的皮肤修复。已经显示：用视黄酸局部处理皮肤后，通过在皮肤中新的胶原沉积和合成，会引起皱纹的消除和皮肤的修复(例如，Griffiths等，N．Eng．J．med．(1993)329，530-535)。已经广泛接受的事实是：通过应用视黄酸增加胶原的含量从而加强皮肤基质来提供抗老化／皮肤修复效果。前胶原I是胶原的前体。由测试化合物引起前胶原I的升高是增加胶原含量的标志。
选择两组女人进行试验，她们在外侧前臂表面均有相同程度或几乎相同程度的轻度至中度光损害。用在湿润基质中的0．5％视黄酸(Retinava)提供给她们，同时还提供感觉相似、颜色相同、不含有活性成分的湿润膏霜(Dermacare)作为安慰剂对照组。对于两组中的每个参加者，在其一个外侧前臂上敷用Retinova，另一个外侧前臂敷用Dermacare。对于第一组，在其外侧前臂上每天应用产品共14周，第二组的外侧前臂上应用产品28周。在研究结束时，从各个前臂的处理区域取出2个总厚度为4mm的钻取活组织。对从参加者中取出的活组织进行免疫组化分析，鉴定视黄酸处理对皮肤细胞外基质成分核心蛋白聚糖和前胶原-I表达的作用，将其同安慰剂处理前臂进行比较。应用下列程序：
物质：
用于蜡切片的抗体稀释缓冲液组成为：Tris缓冲盐水(TBS)、3％牛血清白蛋白(BSA)、0．05％TritonX-100和0．05％叠氮化钠。前胶原-I(氨基末端)的初级抗体来自Chemicon International Inc．(cat# MAB1912，鼠IgG1)，当该部分被胰蛋白酶(0．5mg／ml，25分钟，37℃)预处理后，把上述前胶原-I以1∶800的稀释比例应用于蜡切片，在4℃的温度下放置过夜。核心蛋白聚糖来自Biogensis(鼠多克隆)，将其以1∶800的稀释比例应用于蜡切片，在4℃的温度下放置过夜。把抗大鼠生物素基化次级抗体[来自DAKO(cat#E0468，兔多克隆)]以1∶400的稀释比例应用于蜡切片。把抗兔生物素化次级抗体[来自Amersham(cat#RPN 1004，驴子多克隆)]以1∶400的稀释比例应用于蜡切片。把链酶抗生物素蛋白结合的碱磷酸酶[来自Zymed(cat#43-4322)]以1∶2500的浓度应用。固红色原来自DAKO(cat#K597)。Gills #3苏木清核复染剂[来自Sigma(cat#GHS-3)]过滤，在不稀释的条件下应用。胰蛋白酶来自Sigma(cat#T-7186)，载玻片用来自DAKO的Glycergel(cat#C563)固定。
方法：
在涂有硅烷的载玻片上固定生物活组织的蜡切片在55℃烧烤18小时。用二甲苯和乙醇脱蜡，移至水中，然后转移至TBS。应用DAKA钢笔划沿着这些切片划圈。必要时，按照各个抗体的说明用胰蛋白酶处理该切片用于抗原提取。当需要抗原提取时，用0．5mg／ml的胰蛋白酶(Sigma Cat#T-7186)在35℃下培养载玻片25分钟。然后用TBS洗掉蛋白酶(2×2分钟)。抗原提取后，如果必要，或者直接在洗掉后，应用次级抗体宿主血清在TBS／0．5％BSA／0．1％叠氮化钠中的5％溶液作为阻断溶液来阻断非特异性抗体结合，使该过程在湿润的腔室中至少进行20分钟。引出剩余的阻断溶液，但不让这些切片干燥。然后在湿润腔室中，在4℃下用初级抗体(如上所述适当稀释的)培养该切片过夜。然后从这些切片中倒掉抗体，不让这些部分干燥。然后用TBS洗涤载玻片以除去未结合的初级抗体(经1分钟洗涤后再进行3次5分钟洗涤)，然后在湿润腔室中室温下用合适的次级抗体(如上所述适当稀释的)培养1小时。然后，不让这些切片干燥的情况下从载玻片上引出抗体溶液。为了除去未结合的次级抗体，在TBS中洗涤载玻片，经1分钟洗涤后再进行4×5分钟洗涤。对于生物素化的次级抗体，用链酶抗生物素蛋白结合物在37℃下培养这些切片45分钟，然后在TBS中洗涤，以除掉未结合的链酶抗生物素蛋白结合物。加入色原，观测颜色变化以避免过度着色。然后对这些切片进行复染色，再封固。
用光学显微镜观察免疫组化着色切片，确定视黄酸(Retinova)和安慰剂(Dermacare)处理部位之间前胶原-I和核心蛋白聚糖表达上的区别。
分析显示：如下列表1所示，在光损害的皮肤中，局部应用视黄酸(Retinova)后，前胶原-I和核心蛋白聚糖明显增量调节。
                             表1
              体内皮肤中用视黄酸处理对前胶原-I
                  和核心蛋白聚糖表达的影响
参加者总数 显示前胶原-I表达明显增加的参加者数目 显示核心蛋白聚糖表达明显增加的参加者数目
第1组经14周后     16     9     10
第2组经28周后     15     10     15
因此，多余的细胞基质组份前胶原1和核心蛋白聚糖是视黄酸诱导的皮肤修复的明显识别标志。
在人皮肤成纤维细胞中测定前胶原-I和核心蛋白聚糖合成的步骤
皮肤成纤维细胞条件培养液的制备
以1000细胞／cm2的密度把初级人包皮成纤维细胞第2代(P2)接种于12孔培养板中，在补充有10％胎牛血清的Dulbeccos改性Eagle培养基(DMEM)中并在5％二氧化碳和4％氧气的气氛下维持24小时。然后，用不含血清的DMEM洗涤细胞，再在不含血清的新鲜DMEM中培养60小时。再用不含血清的DMEM洗涤该成纤维单层细胞。在最终体积为0．4毫升／孔不含血清的新鲜DMEM中，以一式三份把试剂和载体对照加入到细胞中，再培养24小时。立即分析该成纤维细胞条件培养基或者将其在液氮中突然冷冻，在-70℃下储存以便进一步分析。对细胞进行计数，然后把根据斑点印迹分析得到的数据标准化为细胞数目。
在皮肤成纤维条件培养基中对前胶原-I和核心蛋白聚糖的斑点印迹分析
对于用载体(作为对照)或测试试剂处理的皮肤成纤维细胞条件培养基样品，由用20mM二硫苏糖醇(200mM储存液的1∶10的稀释液)和0．1％十二烷基硫酸钠(10％储存液的1∶100稀释液)进行补充，充分混合，在75℃下培养2分钟。分析标准是这样生成的：在175cm2烧瓶中以1000细胞／cm2的密度接种成纤维细胞，如上所述，将其在不含血清的DMEM中培养，将从中得到的纯成纤维条件培养基进行系列稀释。然后应用来自Bio-Rad的96孔Bio-Dot仪器，按照制造商的说明，一式三份地把分析样品应用于Immobilon-P转移膜的预湿润片中。在每个孔中大约应用200μl培养基。然后将培养基在重力作用下透过膜(30分钟)过滤，然后用PBS(200μl)洗涤膜两次。把这些PBS洗涤物在重力作用下通过膜过滤(2×15分钟)。再把Bio-Dot仪器连接到真空多支管中，在抽吸下用PBS进行第三次(最后一次)洗涤。拆开仪器，在4℃下，按照需要移开膜，并快速切开，置于封闭缓冲液中静置过夜。对于用于核心蛋白聚糖分析制备的膜，用3％(w／v)BSA／0．1％(v／v)吐温20的PBS液封闭该膜；而对于用于前胶原-I分析所用的膜，则用脱脂干奶粉／0．05％吐温20的PBS液封闭膜。次日，应用人前胶原-I(MAB1912；鼠单克隆；Chemicon Int．Inc．，Temecula，CA)的或者人核心蛋白聚糖的(鼠单克隆；Biogensis)的初级抗体的1∶1000稀释液在室温对该膜探测2小时。然后用TBS／0．05％吐温20(3×5分钟)对膜进行洗涤，然后在室温下，将其置于125I-结合的抗大鼠或抗兔F(ab＇)2片断(Amersham)的1∶1000稀释液中培养1小时。然后，再次用TBS／吐温20洗涤(3×5分钟)该Immbilon条，再让其在室温下的空气中干燥。把干燥膜包裹于玻璃纸中，将其置于分子动态储存磷屏上16-18小时。最后，通过phosphorimager(Molecular DynamicsPhosphorimager SF)用ImagequantTM软件扫描。通过电脑辅助成象分析应用ImageQuantTM的定量工具评价点强度，标准化至细胞数，把载体处理的对照值定为100任意单位，相对于该值来确定不同测试试剂对核心蛋白聚糖和前胶原-I合成的作用。
测试：
下表2显示岩芹酸对人皮肤成纤维细胞的前胶原-I和核心蛋白聚糖合成的作用及其应用的数量。为了将这些结果标准化，以载体处理的对照值100任意单位作为基准来确定测试物质的作用。为了对比，还用视黄酸进行了试验以确定其对人皮肤成纤维细胞中核心蛋白聚糖合成的作用。在试验中所用试剂的浓度对细胞存活率没有影响。
                         表2
      岩芹酸对前胶原-I和核心蛋白聚糖合成的作用
处理                   前胶原-I           核心蛋白聚糖
对照组(载体)              100                 100
岩芹酸(10μM)   118．4±48．6          153．0±19．1
                        (n=3)            (p=0．01，n=4)
表2的结果显示：同对照组相比，岩芹酸明显增加人皮肤成纤维细胞中的前胶原-I和核心蛋白聚糖的合成。
在皮肤中，核心蛋白聚糖的含量同皮肤的健康状况和外观改善有关。增加皮肤中核心蛋白聚糖的含量对于控制和纠正皮肤胶原(皮肤胶原同许多皮肤效应例如皱纹消失和光损害皮肤的皮肤损伤有关)的沉积是非常重要的。
用视黄酸(1μm)的对比试验显示：相对于100任意单位的载体处理的对照值相比，核心蛋白聚糖增量调节，其值为138±14．0(p=0．035，n=4)。令人惊奇地，这些数据还进一步表明：在人皮肤成纤维细胞中，岩芹酸对核心蛋白聚糖合成增量调节的幅度超过了标准抗老化皮肤修复活性视黄酸的影响值。
                        实施例2
本实施例测量岩芹酸的抗刺激功能。
角质形成细胞SDS生存能力测试
方法学
在96孔培养皿中用角质形成细胞生长培养基(KGM)培养角质形成细胞，培养至大约80％融合时，培养液用不含氢化可的松的KGM替换，培养24-28小时。然后，在岩芹酸的存在下或不存在下，应用能够产生大约50％细胞存活能力浓度(2μ／ml)的十二烷基硫酸钠(SDS)处理细胞。然后应用岩芹酸(浓度如表3所示)对细胞用药。对照组不含有任何SDS或测试化合物。经培养24小时后，除去培养基，用中性红方法确定存活能力。应用该方法，在含有25μg／ml的中性红的KGM中培养该细胞3小时，然后除掉培养基，再用1ml 1％(v／v)乙酸、50％(v／v)乙醇提取细胞30分钟。测定提取物在562nm处的吸收度，参照不含SDS并且不含测试化合物的对照孔评价生存能力。得到的结果如下表3所示：
                     表3
处理组                角质形成细胞的％存活性
SDS(μg／ml)     PA(μM)    平均     SD      n
0                 0         100     11．9    8
2                 0         55．8   18．3    8
2                 0．1      94．5   16．5    8
2                 1． 0     84．1   16．8    8
2                 10        85．8   11．9    8
通过1way ANOVA，应用Student-Neumann-Kuels多次对比检验，同单独的2μg／ml SDS值相比，所有岩芹酸(PA)值显示明显增加的生存能力，p＜0．05。
该方法显示：刺激剂的角质形成细胞毒性同试剂在体内的刺激作用有关(Lawrence，JN，Starkey，S．，Dickson，FM ＆ Benford，DJ．)，应用人和大鼠角质形成细胞培养物以评价皮肤刺激能力。Toxitol． Invitro．10，331-340(1996)．)。因此，我们在此证明：应用岩芹酸处理能够显著降低SDS对角质形成细胞的毒性作用，因此其具有抗刺激功能。
                       实施例3
本实施例显示：岩芹酸能够有效地降低由体外角质形成细胞分泌的PGE2(前列腺素E2)。
角质形成细胞PGE2分析
在96孔培养皿中用角质形成细胞生长培养基(KGM)培养角质形成细胞，培养至大约80％融合时，培养液用不含氢化可的松的KGM替换，培养24-28小时。然后，对细胞给予岩芹酸，其量如表下表4所示。在对照组细胞中不加入岩芹酸。用岩芹酸(或者，对于对照组，不用岩芹酸)培养细胞24小时。在培养结束时，收集培养基，应用市售PGE2试剂盒(Amersham，Buckinghamshire，英国)通过酶联免疫检测检测培养基中促炎因子PGE2的基本释放。
然后，按照上面实施例2描述的中性红摄取方法，测试细胞的生存能力。通过应用测试浓度的岩芹酸处理，没有发现对细胞存活能力有副作用。
通过测试化合物降低PEG2基本分泌的能力(同对照组相比)，确定测试化合物抗炎作用。应用Student’s t-检验，确定统计学有效性。得到的结果总结于下列表4。
                   表4
处理           角质形成细胞PGE2
               含量(pg／孔)
               平均         SD            n
对照组         197．9       50．2         4
PA 0．1μM     150．1       55．7         4
PA 1μM        117．8       22．6         4
通过1way ANOVA，应用Student-Neumann-Kuels多次对比检验，统计分析显示0．1μM和1μM的岩芹酸(PA)明显(p＜0．05)降低未刺激角质形成细胞中PGE2的释放。
PGE2是公知的皮肤炎症介质，参见Greaves等“Prostagludus，白三烯、磷酯酶、血小板活化因子和细胞因子：人皮肤炎症的综合治疗途径”Arch．Dermatol．Res．(1988)[增刊]：533-541。
该结果显示：岩芹酸(PA)处理的角质形成细胞产生较少的促炎前列腺素PGE2，因此降低皮肤的发炎可能性。
                     实施例4
本实施例测定岩芹酸对降低皮肤成纤维细胞炎症反应的作用。
成纤维细胞PGE2和ICAM测试
人皮肤成纤维细胞中细胞间粘附分子(ICAM)和PEG2的产生可以通过炎症刺激剂PMA(佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯phorbal myristateacetate)来诱导。PMA代表外部应激物，其诱导细胞中的氧化应激和炎症反应。该模型通常用于体内炎症模型。
以1000细胞／孔的密度把初级人包皮成纤维细胞第2代(P2)接种于96孔培养皿中，在补充有10％胎牛血清的Dulbeccos改性Eagle培养基(DMEM)中并在5％二氧化碳和4％氧气的气体下维持24小时。一式三份把岩芹酸加入到新鲜细胞培养基(补充有10％胎牛血清的DMEM)的二甲基亚砜(DMSO，终浓度1％)液中，再培养24小时。把佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)(Sigma)加入到培养基中，继续培养细胞24小时。对照组不含有测试化合物并且不含有任意PMA。然后，立即按照下面描述分析成纤维细胞／培养基，或者在液氮中突然冷冻，并在-70℃下储存，用于以后分析。对细胞进行计数，然后把根据斑点印迹分析得到的数据标准化为细胞数目。
前列腺素E2(PGE2)分析：轻轻摇荡培养皿后，取50μl培养基进行PGE2分析。用Biotrak PGE2免疫分析试剂盒(Amersham，UK)测定培养基中PGE2含量。分析的基础是：对于限定量固定PGE2特异性抗体，样品中未标记PEG2和固定量辣根过氧化物酶标记的PGE2之间的竞争。按照同一时间得到的标准曲线，确定未标记样品PGE2的浓度。
ICAM-1分析：弃去培养基，用DulbeccoPBS洗涤细胞。对于洗涤的细胞，以3分钟时间把150μl 0．1％Triton X-100(Sigma)加入到细胞膜中的提取物ICAM中。把提取物转移至Eppendoff离心管中，在1000g下离心2分钟以除掉细胞碎片。取100μl上清液用于ICAM分析。应用市售免疫酶分析试剂盒(R&D系统)分析可溶性ICAM-1。按照平行标准曲线确定样品中ICAM-1的浓度。
从PGE2和ICAM分析得到的结果如下表5所示。
                         表5
             岩芹酸对人皮肤成纤维细胞中
           PMA-诱导的ICAM和PGE2产生的作用
处理             N       ICAM(ng／ml)        PGE2(pg／ml)
对照组           4       3．07+0．54         32±6
PMA(10nM)-处理   4       14．42±1．86       2371±241
PMA+PA(0．1μM)  4       8．64±0．89*       500±127*
PMA+PA(1μM)     4       7．71±0．66*       486±93*
PMA+PA(10μM)    4       7．39±0．14*       233±139*
PMA+PA(100μM)   4       6．68±1．35*       117±39*
*同PMA处理细胞得到的数值对比，p＜0．001。
上述结果显示：通过产生所测定的前列腺素E2(PGE2)，炎症刺激剂例如PMA(Phorbol myristyl acetate)攻击细胞使炎症反应增加。岩芹酸，即使浓度在0．1μm时，也明显降低通过测定PGE2产生所测得的炎症反应。这些结果表明：岩芹酸具有良好的抗炎活性。
上述结果还显示：用PMA攻击细胞引起ICAM产生增加。岩芹酸降低细胞间粘附分子(ICAM)(炎症的另一个指标)的产生。因此，这些结果进一步显示：岩芹酸具有良好的抗炎效应。
                       实施例5
                  皮肤增白测定方法
*细胞培养
在75cm2的培养瓶中，应用补充L-谷氨酰胺(4mM)和10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基(ICN-Flow，cat．no．12-60-54)，在含5％CO2的空气下，培养B16-F1小鼠黑素瘤细胞(美国典型物培养中心，Maryland，USA)。把细胞每周传代两次。
*色素沉着分析：
在96孔微量滴定培养皿中，以5000细胞／孔的密度接种subconfluent B16细胞，在含有10％胎牛血清和1％青霉素／链霉素但不含酚红的DMEM中，在37℃和5％CO2的气体下培养过夜。24小时后，培养基用含有测试物质或赋形剂对照物的新鲜培养基替换。将细胞培养72小时，此时可在对照组孔中看见黑色素。然后，把从每个孔中得到的含黑色素的培养基转移到清洁的96孔培养皿中，通过应用微量培养板分光光度计(Dynatech MR5000)读取其在530nm处的吸收度来定量分析，并校正新鲜培养基的基准吸收度。因为校正的吸收正比于黑色素浓度，因此皮肤增白试验物质的色素沉着百分比可以按照下式计算：
％色素沉着=(OD530检测／OD503参比)×100％
其中OD530检测和OD503参比分别表示从含有测试物质的孔中得到的培养基平均校正吸收度和从不含有测试物质的孔中得到的平均培养基校正吸收度。然后，由测试物质引起的百分比抑制值为：
100-％色素沉着
*细胞存活测试
抑制黑色素生成可以降低黑色素的产生，但黑色素的产生还受细胞毒性或细胞增生影响。为了测试其释放出现，用中性红染料吸附测试细胞存活能力。中性红是水溶性染料，其能够通过完整的血浆膜，并浓集于完整细胞的溶酶体中。中性红染料的总摄取同培养物中生存细胞数成正比。
把用于黑色素分析的培养基从微量滴定孔中除去后，立即把200μl新鲜预热的中性红染料(ex．Sigma，UK，Cat．Nr 2889)的25μg/ml培养液应用于细胞，并培养3小时。通过反转培养板除掉没有被细胞吸收的染料，轻叩吸水纸。用200μl PBS洗涤细胞，然后除去洗涤液。加入100μl溶剂(50％H2O、49％EtOH、1％乙酸)。20分钟后，在室温下，在微滴培养皿摇荡器上把每个培养皿摇动5秒钟。如上所述，测定吸收度。
测试：
下表6显示所测定皮肤增白测试物质及其用量。如上所述，由测试物质引起的黑色素生产百分比抑制反映于表中。
小于100％黑色素对照组的值显示黑素生成的抑制。因此，下表3中的结果显示PA抑制黑素的生成。
在试验中，用DMEM稀释测试物质，其量如下表5所示。
                              表6培养基中的黑色素               中性红细胞存活能力处理          ％对照     S．D．   t-测试      ％对照    S．D． t-测试相对于对照相对于对照对照组         100       8．5                  100．0   4．60．1％岩芹酸   19．3     1．2    **(0．000)    1．0     0．4    **(0．000)0．04％岩芹酸  3．9      0．7    **(0．000)    69．9    8．8    **(0．000)0．02％岩芹酸  55．3     18．2   **(0．000)    103．1   3．9    **(0．082)0．013％岩芹酸 40．4     10．7   **(0．000)    105．2   4．1    (0．006)0．01％岩芹酸  79．5     8．6    **(0．000)    104．8   3．9    *(0．009)Student’s t-测试        **p＜0．01；*p＜0．05(n=4)
                       实施例6
下列配方描述适合于本发明方法和用途的水包油膏霜。显示的百分比是按组合物重量而计的。
                     wt％
矿物油               4
岩芹酸(三甘油酯)     1．15
Brij 56*             4
Alfol 16RD           4
三乙醇胺             0．75
丁烷-1，3-二醇       3
黄原胶               0．3
香料                 适量
丁化羟基甲苯         0．01
水                   加至100
*Brij 56为十六烷醇POE(10)
Alfol 16RD为十六烷醇
实施例7
下列制剂描述本发明的乳膏
化学全名或CTFA名称        商品名             重量百分比
PA甘油三酯                                      2．0
EDTA二钠              Sequesterne Na2           0．05
硅酸铝镁              Veegum Ultra              0．6
对羟基苯甲酸甲酯      Methyl Paraben            0．15
二甲基硅油            DC Antifoam Emulsion      0．01
1，3-丁二醇           1，3-丁二醇               3．0
羟乙基纤维素          Natrosol 250HHR           0．5
甘油，USP             甘油USP                   2．0
黄原胶                Keltrol 1000              0．2
三乙醇胺              三乙醇胺(99％)            1．2
硬脂酸                Pristerene 4911           3．0
对羟基苯甲酸丙酯NF    Propylparaben NF          0．1
氢化硬脂酸甘油酯      Naturechem GMHS           1．5
十八烷醇              Lanette 18 DEO            1．5
棕榈酸异十八烷基酯    Protachem ISP             6．0
C12-15醇辛酸酯        Hetester FAO              3．0
二甲聚硅氧烷          Silicone Fluid 200(50cts) 1．0
胆固醇NF              Cholesterol NF            0．5
硬脂酸脱水山梨糖醇酯  硬脂酸脱水山梨糖醇酯      1．0
丁化羟基甲苯          Embanox BHT               0．05
乙酸生育酚酯          维生素E乙酸酯             0．1
PEG-100硬脂酸酯       Myrj 59                   2．0
硬脂酰基乳酸钠        Pationic SSL              0．5
羟基辛酸              羟基辛酸                  0．1
棕榈酸视黄酯          维生素A棕榈酸酯           0．06
α-红没药醇           α-红没药醇               0．2
水，DI                适量至100
当用于经老化或光老化损害的皮肤时，上面实施例6和实施例7的局部用组合物均通过有效的化妆处理用于增白皮肤和／或改善起皱、老化、光损害和／或刺激性皮肤的外观，当用于青年皮肤时，用于防止或延迟这种损害变化。这些组合物可以通过常规方式制备。

Claims (2)

1．提供至少一种选自下列皮肤护理效应的化妆方法，所述皮肤护理效应选自：处理和／或预防起皱、松垂、老化和／或光损害皮肤；增加皮肤中胶原的沉积，促进皮肤中核心聚糖蛋白的生成，增强组织修复；增白皮肤；缓和皮肤的刺激、发红和／或致敏，增强皮肤纹理、光滑性和／或结实性；该方法包括：把含有岩芹酸和／或其衍生物的局部组合物应用于皮肤。
2．岩芹酸和／或其衍生物在局部组合物中的应用，所述的局部用组合物用于提供至少一种下列皮肤护理功能，选自：处理和／或预防起皱、松垂、老化和／或光损害皮肤；增加皮肤中胶原的沉积，促进皮肤中核心聚糖蛋白的生成，增强组织修复；增白皮肤；缓和皮肤的刺激、发红和／或致敏，增强皮肤纹理、光滑性和／或结实性。
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