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Die
Erfindung bezieht sich auf topische Zusammensetzungen zur Auftragung
auf die menschliche Haut und auf ihre Verwendung beim Aufhellen
der menschlichen Haut.
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Hintergrund und Stand
der Technik
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Viele
Leute sind von dem Pigmentationsgrad ihrer Haut betroffen. Beispielsweise
wünschen
sich die Leute mit Altersflecken oder Sommersprossen, daß diese
pigmentierten Flecken weniger betont werden. Andere wünschen sich,
die Hautdunkelfärbung,
die durch das Aussetzen dem Sonnenlicht verursacht wird, zu verringern,
oder ihre natürliche
Hautfarbe aufzuhellen. Um diese Erfordernisse zu erfüllen, sind
viele Versuche gemacht worden, um Produkte zu entwickeln, die die
Pigmentproduktion in den Melanozyten verringern. Jedoch weisen die
bisher identifizierten Substanzen gewöhnlich unerwünschte Nebenwirkungen,
beispielsweise Hautreizung, auf. Folglich sind solche Substanzen
nicht zur kosmetischen Verwendung geeignet oder sie können nur
bei einer Konzentration aufgetragen werden, bei der ihr Hautaufhellungseffekt
geringer als gewünscht ist.
Es wird in betracht gezogen, daß die
Verwendung einer Kombination von unterschiedlichen Hautaufhellungssubstanzen
die nachteiligen Nebenwirkungen verringert, aber es besteht ein
beträchtliches
Risiko, daß durch
die Verwendung einer solchen Kombination die Hautaufhellung ebenso
aufgrund der Konkurrenzwirkungen verringert wird. Deshalb besteht
ein Bedarf an der Verbesserung der Wirksamkeit von kosmetischen Hautaufhellungsprodukten.
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GB 2 287 405 offenbart ein
hautweißmachendes
kosmetisches Präparat,
das in Kombination ein Extrakt von Glycyrrhyza glabra oder einer
verwandten Pflanzenspezies und eine α-Hydroxy-, β-Hydroxy- oder Keto-säure oder
ein Amid, Salz oder Ester davon umfaßt. Die Kombination soll zur
Inhibierung der Tyrosinase synergistisch wirken, wodurch die Melaninbildung
inhibiert wird.
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WO
94/07462 offenbart Zusammensetzungen unter anderem zur Aufhellung
der Haut, die Retinol oder ein Derivat davon und eine Dionsäure umfaßt.
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WO
94/09756 schlägt
die Verwendung von Retinol oder einem Derivat davon zusammen mit
einem ausgewählten
Hautaufhellungsmittel für
mehrere Zwecke, einschließlich
aufhellender Hautfarbe, vor. Das bevorzugte Hautaufhellungsmittel
ist Hydrochinon, aber es können
ebenso mehrere andere genannt werden, einschließlich Lakritzeextrakt.
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US 4990330 beschreibt hautweißmachende
Produkte, die Kojisäure
in Kombination mit einer anderen Substanz, die aus einem Bereich
von Materialien, einschließlich
Azelainsäure,
ausgewählt
werden muß,
enthalten. Es wird berichtet, daß die Kombination die Melaninsynthese
synergistisch inhibiert.
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JP 63284119 schlägt gemäß dem Derwent-Abstrakt
ein äußerliches
Hautpflegemittel mit UV-Schutz- und
weißmachenden
Wirkungen vor, das Hesperetinsäure
oder ein Salz davon und eine organische Säure oder ein Salz davon enthält.
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J06199646 beschreibt gemäß dem Derwent-Abstrakt
ein Kosmetikum zum Weißmachen
der Haut, das ein Pflanzenextrakt, Harnstoff und einen Harnstoffstabilisator
enthält.
Das Extrakt kann aus einem breiten Pflanzenbereich, einschließlich Glycyrrhizae
radix (Lakritzewurzel) ausgewählt
werden. Der Harnstoffstabilisator kann ebenso aus einer breiten
Gruppe ausgewählt
werden, wobei die Gruppe aliphatische Dicarbonsäuren umfaßt.
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WO
98/17269 offenbart Zusammensetzungen, die Zinksalze von konjugierter
Linolsäure
enthalten, zur Behandlung von Hauterkrankungen, wie Ekzem, Schuppenflechte
und Dermatitis. Die beschriebenen Zusammensetzungen werden nicht
verwendet, um die Melaninsynthese zu inhibieren, noch werden sie
in dem speziellen trans-10,cis-12-Isomer von konjugierter Linolsäure angereichert.
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US 4,393,043 beschreibt
kosmetische Zusammensetzungen zur topischen Auftragung von Vitaminen auf
die Haut, speziell Vitamin F, das im wesentlichen aus Linolsäure besteht.
Die Zusammensetzungen werden durch die Zugabe eines Pflanzenöls stabilisiert.
Es gibt keine Offenbarung über
Zusammensetzungen, die in einem speziellen Isomer von Linolsäure angereichert
werden, noch werden die Zusammensetzungen verwendet, um die Melaninsynthese
zu inhibieren.
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Die
oben beschriebenen Produkte fanden bisher keine breite Akzeptanz
und daher besteht der Bedarf an Verbesserung in diesem Bereich fort.
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Wir
fanden nun heraus, daß die
verbesserte Verringerung des Melaninproduktes durch die Auftragung der
kosmetischen Zusammensetzungen auf die Haut, die ein spezielles
Isomer von konjugierter Linolsäure oder
Derivate davon umfaßt,
erreicht werden kann.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine topische Zusammensetzung
bereitgestellt, umfassend:
- (a) konjugierte
Linolsäure
und/oder Derivate davon, umfassend konjugierte Linolsäurefettacylanteile,
wobei mindestens 50 Gew.-% der konjugierten Linolsäurefettacylanteile
als das trans-10,cis-12-Isomer vorliegen, und
- (b) ein dermatologisch akzeptables Vehikel, umfassend ein oder
mehrere eines Duftstoffes, eines Farbstoffes, eines Silikonöls, eines
Feuchthaltemittels, eines Treibmittels und eines Sonnenschutzmittels.
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Diese
Zusammensetzungen sind besonders zur topischen Auftragung auf die
menschliche Haut zur Verbesserung der Verringerung der Melaninproduktion
und daher Aufhellung der Haut, auf die sie aufgetragen worden ist,
geeignet.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein kosmetisches
Verfahren zur Aufhellung der menschlichen Haut bereit, wobei das
Verfahren die Auftragung einer topischen Zusammensetzung auf die
Haut umfaßt,
wie oben beschrieben.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ebenso die Verwendung
von konjugierter Linolsäure und/oder
Derivaten davon, unfassend konjugierte Linolsäurefettacylanteile, in einer
topischen Zusammensetzung zur Aufhellung der menschlichen Haut bereit,
wobei mindestens 50 Gew.-% der konjugierten Linolsäurefettacylanteile
als trans-10,cis-12-Isomer vorliegen.
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In
noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Umkehrung der
Hautaufhellungswirkung der oben beschriebenen konjugierten Linolsäure und/oder
Derivaten durch den Einschluß eines
UV-absorbierenden Sonnenschutzmittels in die Zusammensetzungen gemäß dem ersten
Aspekt der vorliegenden Erfindung vermieden. Unter dem Ausdruck „Sonnenschutzmittel" ist irgendein Material,
entweder organisch oder anorganisch, zu verstehen, das die Haut
vor UV-Strahlung innerhalb eines Bereiches von 290 bis 400 nm schützen kann.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Trans-10,cis-12-Isomer-enthaltende
konjugierte Linolsäure
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Konjugierte
Linolsäure
(hierin nachstehend als CLA bezeichnet) umfaßt eine Gruppe von Positions- und
geometrischen Isomeren von Linolsäure, bei denen verschiedene
Konfigurationen von cis- und trans-Doppelbindungen an den Positionen
(6, 8), (7, 9), (8, 10), (9, 11), (10, 12) oder (11, 13) möglich sind.
Daher existieren 25 unterschiedliche Isomere der CLA.
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Die
im wesentlichen aktive Verbindung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
ist das trans-10,cis-12-Isomer (hierin nachstehend als t10-c12-Isomer
bezeichnet). Dieses spezielle Isomer der freien Säuren weist
die Struktur (I) auf, die nachstehend gezeigt wird:
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Die
Erfindung umfaßt
ebenso Derivate der freien Säure,
die daher konjugierte Linolsäureeinheiten
umfassen. Bevorzugte Derivate umfassen die, die aus der Substitution
der Carboxylgruppe der Säure,
wie Ester (beispielsweise Retinylester, Triglyceridester, Monoglyceridester,
Diglyceridester, Phosphoester), Amide (beispielsweise Ceramidderivate),
Salze (beispielsweise Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze, Ammoniumsalze) stammen;
und/oder die, die aus der Substitution der C18-Kohlenstoffkette
stammen, wie alpha-Hydroxy- und/oder beta-Hydroxyderivate.
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Bei
den Triglyceridesterderivaten sind alle Positionsisomere von CLA-Substituenten
an der Glycerolhauptkette eingeschlossen. Die Triglyceride müssen mindestens
eine CLA-Einheit enthalten. Beispielsweise können von den drei veresterbaren
Positionen an der Glycerol hauptkette die 1- und 2-Position mit CLA
und durch ein anderes Lipid an Position 3 verestert werden oder
als Alternative können
die Glycerolhauptkette durch CLA an den 1- und 3-Positionen mit einem anderen Lipid an
Position 2 verestert werden.
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Wo
immer der Ausdruck „konjugierte
Linolsäure" oder „CLA" in dieser Beschreibung
verwendet wird, ist es selbstverständlich, daß die Derivate davon, die CLA-Einheiten
umfassen, ebenso einbezogen sind.
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„CLA-Einheiten" beziehen sich auf
die CLA-Fettacylanteil(e) eines CLA-Derivats.
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Unter „t10-c12-Isomer-enthaltender
CLA" ist zu verstehen,
daß mindestens
1 Gew.-% der gesamten CLA und/oder CLA-Einheiten, die in der Zusammensetzung
vorliegen, in Form des trans-10,cis-12-Isomers vorliegen. Vorzugsweise
liegen mindestens 20 Gew.-%, stärker
bevorzugt mindestens 50 Gew.-% der gesamten CLA und/oder Einheiten,
die in der Zusammensetzung vorliegen, in Form des t10-c12-Isomers
vor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegen mindestens
70 Gew.-% der gesamten CLA und/oder Einheiten in Form des t10-c12-Isomers
vor.
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Die
CLA und/oder Derivate davon, umfassen CLA-Einheiten gemäß der vorliegenden
Erfindung, können
gemäß dem Verfahren,
das in WO 97/18320 offenbart wird, hergestellt werden. Ein bevorzugtes
Verfahren zur Herstellung wird nachstehend in Beispiel 1 offenbart.
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Die
aktive Verbindung, t10-c12-Isomer-enthaltende CLA, die gemäß der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden soll, liegt in der topischen Zusammensetzung
in einer wirksamen Menge vor. Normalerweise liegt die Gesamtmenge
der aktiven Verbindung in einer Menge zwischen 0,00001 und 50 Gew.-%
der Zusammensetzung vor. Stärker
bevorzugt liegt die Menge von 0,01 bis 10 % und am stärksten bevorzugt
von 0,1 bis 5 % vor, um die Vorteile bei minimalen Kosten zu maximieren.
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Dermatologisch akzeptables
Vehikel
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
umfaßt
ebenso ein dermatologisch/kosmetisch akzeptables Vehikel, das als
Verdünnungsmittel,
Dispergiermittel oder Träger
der aktiven Verbindung, t10-c12-Isomer-angereicherte CLA, agiert.
Das Vehikel kann Materialien umfassen, die allgemein in Hautpflegeprodukten verwendet
werden, wie Wasser, flüssige
oder feste Erweichungsmittel, Silikonöle, Emulgatoren, Lösungsmittel,
Feuchthaltemittel, Verdikkungsmittel, Pulver, Treibmittel und dergleichen.
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Das
Vehikel wird normalerweise 5 bis 99,9 Gew.-%, vorzugsweise 25 bis
80 Gew.-% der Zusammensetzung bilden, und kann in Abwesenheit von
anderen kosmetischen Hilfsmitteln den Rest der Zusammensetzung bilden.
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Optionale
Hautwirkstoffmaterialien und kosmetische Hilfsmittel
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Neben
der aktiven Verbindung, t10-c12-Isomer-enthaltende CLA, können andere
spezielle Hautwirkstoffe, wie Sonnenschutzmittel, und/oder andere
Hautaufhellungsmittel ebenso einbezogen werden. Wenn das Sonnenschutzmittel
ein organisches Material ist, wird es üblicherweise mindestens ein
chromophores Mittel enthalten, das innerhalb des UV-Bereiches so
etwa 290 bis 400 nm absorbieren wird. Chromophore organische Sonnenschutzmittel
können
in die folgenden Kategorien (mit sepeziellen Beispielen) eingeteilt
werden, einschließlich:
p-Aminobenzoesäure,
ihre Salze und ihre Derivate (Ethyl-, Isobutyl-, Glycerylester;
p-Dimethylaminobenzoesäure);
Anthranilate (o-Aminobenzoate; Methyl-, Ethyl-, Phenyl-, Benzyl-,
Phenylethyl-, Linalyl-, Terpinyl- und Cyclohexenylester); Salicylate
(Octyl-, Amyl-, Phenyl-, Benzyl-, Menthyl-, Glyceryl- und Dipropylenglykolester);
Zimtsäurederivate
(Menthyl- und Benzylester, α-Phenylcinnamonitril;
Butylcinnamoylpyruvat); Dihydroxyzimtsäurederivate (Umbelliferon,
Methylumbelliferon, Methylaceto-umbelliferon); Trihydroxyzimtsäurederivate
(Esculetin, Methylesculetin, Daphnetin, und die Glucoside, Esculin
und Daphnin); Kohlenwasserstoffe (Diphenylbutadien, Stilben); Dibenzalaceton
und Benzalacetophenon; Naptholsulfonate (Natriumsalze von 2-Naphthol-3,6-disulfon-
und von 2-Naphthol-6,8-disulfonsäuren);
Dihydroxy-naphthoesäure
und ihre Salze; o- und p-Hydroxybiphenyldisulfonate; Coumarinderivate
(7-Hydroxy, 7-Methyl, 3-Phenyl); Diazole (2-Acetyl-3-brom-indazol, Phenylbenzoxazol,
Methylnaphthoxazol, verschiedene Arylbenzothiazole); Chininsalze
(Bisulfat, Sulfat, Chloridoleat und Tannat); Chinolinderivate (8-Hydroxychinolinsalze,
2-Phenylchinolin); Hydroxy- oder Methoxy-substituierte Benzophenone;
Harn- und Viloursäuren;
Gallusgerbsäure
und ihre Derivate (beispielsweise Hexaethylether); (Butylcarbityl)(6-propylpiperonyl)ether;
Hydrochinon; Benzophenone (Oxybenzon, Sulisobenzon, Dioxybenzon,
Benzoresorcinol, 2,2',4,4'-Tetrahydroxybenzophenon,
2,2'-Dihydroxy-4,4'-dimethoxy benzophenon,
Octabenzon; 4-Isopropyldibenzoylmethan, Butylmethoxydibenzoylmethan; Etocrylen;
und 4-Isopropyl-dibenzoylmethan).
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Besonders
nützlich
sind: 2-Ethylhexyl-p-methoxycinnamat, 4,4'-t-Butylmethoxydibenzoylmethan, 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon,
Octyldimethyl-p-aminobenzoesäure,
Digalloyltrioleat, 2,2-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon, Ethyl-4-[bis(hydroxypropyl)]aminobenzoat,
2-Ethylhexyl-2-cyano-3,3-diphenylacrylat, 2-Ethylhexylsalicylat,
Glyceryl-p-aminobenzoat, 3,3,5-Trimethylcyclohexylsalicylat, Methylanthranilat, p-Dimethylaminobenzoesäure oder
-aminobenzoat, 2-Ethylhexyl-p-dimethylaminobenzoat, 2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure, 2-(p-Dimethylaminophenyl)-5-sulfoniobenzoxazonsäure und
Gemische davon.
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Geeignete
kommerziell erhältliche
organische Sonnenschutzmittel sind die, die unter der folgenden Tabelle
identifiziert werden.
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Anorganische
aktive Sonnenschutzmittel können
ebenso eingesetzt werden, wie mikrofeines Titandioxid, Zinkoxid,
Polyethylen, Polyamide (beispielsweise Nylon) und verschiedene andere
Polymere. Mengen von Sonnenschutzmitteln (entweder organische oder
anorganisch) werden im allgemeinen in dem Bereich von 0,1 bis 30
Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20 Gew.-%, optimalerweise 4 bis 10 Gew.-%
liegen.
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Das
Vehikel kann ebenso weitere Hilfsmittel, wie Duftstoffe, Antioxidationsmittel,
Trübungsmittel,
Konservierungsmittel, Farbstoffe und Puffer enthalten.
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Produktherstellung, -form,
-verwendung und -verpackung
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Um
die erfindungsgemäße topische
Zusammensetzung herzustellen, kann die übliche Weise zur Herstellung
von Hautpflegeprodukten eingesetzt werden. Die aktiven Komponenten
werden im allgemeinen in einem dermatologisch akzeptablen Träger in konventioneller
Weise eingeführt.
Die aktiven Komponenten können
geeigneterweise zunächst
in einem Teil des Wassers oder einem anderen Lösungsmittel oder Flüssigkeit, die
in die Zusammensetzung aufgenommen werden soll, gelöst oder
dispergiert werden. Die bevorzugten Zusammensetzungen sind Öl-in-Wasser-
oder Wasser-in-Öl-
oder Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen.
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Die
Zusammensetzung kann in Form von konventionellen Hautpflegeprodukten,
wie eine Creme, ein Gel oder eine Lotion oder dergleichen vorliegen.
Die Zusammensetzung kann ebenso in Form eines sogenannten „Abwaschproduktes", beispielsweise
ein Bade- oder Duschgel, vorliegen, das möglicherweise ein Abgabesystem
für die
aktiven Verbindungen enthält,
um das Haften an der Haut während
des Spülens
zu fördern. Am
stärksten
bevorzugt ist das Produkt ein auf der Haut verbleibendes (leave
on) Produkt; ein Produkt, das auf die Haut ohne einen bewußten Abspülschritt
gleich nach seiner Auftragung auf die Haut aufgetragen werden soll.
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Die
Zusammensetzung kann in einer geeigneten Weise, wie in einem Gefäß, einer
Flasche, einer Tube, in Kugeln oder dergleichen, in konventioneller
Weise verpackt werden.
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Das
Produkt kann in derselben Weise wie konventionelle Hautpflegeprodukte
auf die Haut aufgetragen werden, beispielsweise kann es ein- bis
dreimal täglich
auf die Haut von beispielsweise Gesicht und/oder den Händen und
Armen aufgetragen werden. Bei Pigmentflekken kann der Verbraucher
beispielsweise wählen,
das Produkt nur auf die betroffenen Stellen aufzutragen. Die Hautaufhellung
wird normalerweise nach 2 bis 3 Monaten in Abhängigkeit des Hautzustandes,
der Konzentration der aktiven Komponenten in dem Produkt und der Menge
des Produktes und der Häufigkeit,
mit der es aufgetragen wird, sichtbar werden. Das vorliegende Produkt
ist besonders zur allgemeinen Hautaufhellung geeignet, insbesondere
wenn es ebenso Sonnenschutzmittel umfaßt, falls das Produkt für die Verwendung
am Tag gedacht ist.
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Damit
die vorliegende Erfindung ohne weiteres verstanden wird, werden
die folgenden Beispiele nur zur Illustration angegeben.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel stellt die Synthese von CLA dar, umfassend 80,5 % t10-c12-Isomer,
bezogen auf das Gewicht der gesamten CLA-Einheiten.
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Gemischte
Isomere von CLA werden durch Hochtemperaturalkalibehandlung von
Safloröl
hergestellt, was CLA mit gleichen Mengen der c9-t11- und t10-c12-CLA-Isomere
erzeugt. CLA, angereichert in dem c9-t11-CLA, wird von der Mischung
durch selektive Veresterung mit Laurylalkohol unter Verwendung von
Geotrichum Candidum als Katalysator getrennt. Nach dem Veresterungsschritt
und der Trennung der übrigen CLA
werden freie Säuren
in t10-c12-CLA angereichert und isoliert.
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Herstellung von gemischten
Isomeren von CLA
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Analysenreines
(AR) Natriumhydroxid (0,6 kg) wurde in 6 kg Propylenglykol mit pharmazeutischer Reinheit
durch Mischen und Erhitzen auf 80 bis 85 °C gelöst. Die Probe wurde abgekühlt und
2 kg Safloröl wurden
zugegeben. Unter Verwendung einer Standardvorrichtung im halbtechnischen
Maßstab
wurde das Gemisch für
3 Stunden unter schnellem Rühren
bei 170 °C
unter Rückfluß erhitzt.
Das Reaktionsgemisch wurde auf etwa 95 °C abgekühlt, der Rührer auf eine intermediäre Geschwindigkeit
reduziert und die Mischung unter Verwendung von 1,280 Liter von
35,5%iger Salzsäure,
die in vollentsalztem Wasser (8 Liter) gelöst wurde, während des Haltens der Temperatur
bei etwa 90 °C
neutralisiert. Das Reaktionsgemisch konnte sich absetzen, und die
wässerige
Phase wurde abgezogen. Die Ölphase
wurde mit 2 × 1
Liter 5%iger AR-Salzlösung und
durch 2 × 1
Liter vollentsalztes Wasser bei 90 °C unter Ausscheidung jeglichen
Seifenmaterials gewaschen. Das CLA-angereicherte Öl wurde
bei 100 °C
unter Vakuum vor dem Ablassen bei etwa 50 °C getrocknet und durch ein Buch ner-System,
das einen Whatman-Filter und eine dünne Schicht des Celite-Hyflo-Filterhilfsmittels
enthält,
filtriert. Das gemischte Isomer-CLA-Öl wurde unter Stickstoff bei –25 °C, bis es
benötigt
wird, gelagert.
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Herstellung von angereichertem
CLA c9-t11
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- (I) Herstellung von Laurylestern:
CLA,
hergestellt aus Saflor (2,0 kg), wurde zu 2 x Moläquivalenten
von Laurylalkohol (1-Dodecanol; 98 % von Aldrich Chemicals) zusammen
mit 5,96 kg vollentsalztem Wasser zugegeben. Die Temperatur wurde auf
25 °C eingestellt
und 1 Gew.-% Geotrichum Candidum (von Amano Pharmaceuticals, Japan)
wurde in Vormischung mit etwas Wasser zugegeben und kräftig gemischt.
Die Reaktion wurde bei 44 Stunden gestoppt. Der Behälter wurde
auf 80 bis 90 °C
erhitzt, die wässerige
Schicht abgelassen und das Öl
wurde mit vollentsalztem Wasser gewaschen und bei 100 °C unter Vakuum
für 30
min getrocknet. Das Öl
wurde auf 50 °C
abgekühlt
und durch ein Buchner-System, das einen Whatman-Filter und eine
dünne Schicht
des Celite-Hyflo-Filterhilfsmittels enthält, filtriert.
- (II) Trennung der angereicherten t10-c12-CLA:
Der restliche
Laurylalkohol wurde bei 130 °C
bei 25 bis 35 ml pro Minute durch Molekulardestillation entfernt.
Der Rest wurde grob in die Laurylester (angereichert in c9-t11-CLA)
und freie Säuren
(angereichert in t10-c12-CLA) durch Verdampfung bei 158 °C bei einer
Fließgeschwindigkeit
von 25 bis 35 ml pro Minute getrennt.
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Isolation der angereicherten
t10-c12-CLA
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Die
CLA-freien Säuren
aus dem obigen Schritt (II) wurden erneut bei 160 bis 165 °C und 20
bis 30 ml/min destilliert, um den Estergehalt zu verringern. Der
restliche Laurylalkohol wurde außerdem durch eine Destillation
bei 131 °C
und einer Fließgeschwindigkeit
von 25 bis 30 ml/min reduziert. Um jeglichen restlichen Laurylalkohol
zu entfernen, wurden freie Alkohole zu den Fettsäuren, die in dem Reaktionsgemisch
vorliegen, unter Verwendung der SP392-Mucor miehei-Lipase (5 %,
Charge Lux 0110 von Novo Nordisk) verestert. Die angereicherten
t10-c12-CLA-enthaltenden Fettsäuren
wurden von den Laurylestern unter Verwendung der Molekulardestillation
unter Vakuum bei 155 °C
bei 15 bis 20 ml pro Minute getrennt. Die Zusammensetzung der angereicherten
t10-c12-CLA, die durch dieses Verfahren hergestellt wurde, wird
in Tabelle 1 nachstehend dargestellt: Tabelle
1
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Beispiel 2 – Herstellung
von t10-c12-CLA-Triglyceriden
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Die
angereicherte t10-c12-CLA (10 g), die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde,
wurde mit 1,01 g (10,1 %) Glycerol (Pricerine 9083 Glycerin CP von
Ellis and Everards) gemischt und 0,5 g (ungefähr 5 %) SP392-Mucor Meihie
nicht-spezifische Lipase (Mucor Meihie von Novo Nordisk Charge Lux
0110) wurde zugegeben. Die gemischten Materialien wurden unter Vakuum
in einem Rotationsverdampfer bei 60 °C mit einer leichten Stickstoffentlüftung gerührt.
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Nach
96 Stunden wurde die Reaktion durch Filtrieren des Gemisches durch
eine dünne
Schicht des Celite-Supergel-Filterhilfsmittels auf einem Buchner-Filter,
der die CLA-Triglyceridölphase sammelt,
gestoppt, wobei die Zusammensetzung davon in Tabelle 2 nachstehend
dargestellt wird: Tabelle
2
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Beispiel 3
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Assaymethodik
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* Zellhaltung
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B16-F1-Mausmelanomzellen
(American Type Culture Collection, Maryland, USA) wurden in 75-cm2-Kulturkolben in RPMI-1640-Medium (ICN-Flow,
Kat. Nr. 12-60-54), ergänzt
mit L-Glutamin (4 mM) und 10 % fetalem Rinderseruun (FKS), bei 37 °C in einem
wassergesättigten
5%igen CO2 in Luftatmosphäre gehalten.
Die Zellen wurden zweimal wöchentlich
passagiert.
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* Pigmentationsassay
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Subkonfluente
B16-Zellen wurden in 96-Loch-Mikrotiterplatten bei einer Dichte
von 5000 Zellen/Loch gesät
und über
Nacht in DMEM (Life Technologies, NY), enthaltend 10 % fetales Rinderserum
und 1 % Penicillin/Streptomycin ohne Phenolrot, bei 37 °C unter 5
% CO2 kultiviert. Nach 24 Stunden wurden
die Medien mit frischem Medium, enthaltend die Testmaterialien oder
Vehikelkontrollen, ersetzt. Die Zellen wurden für 72 Stunden inkubiert, wobei
zu der Zeit Melanin in den Kontrollöchern sichtbar war. Als nächstes wurde
das Melanin enthaltende Medium aus jedem Loch zu einer sauberen 96-Loch-Platte überführt und
durch Ablesen der Extinktion bei 530 nm unter Verwendung eines Mikroplattenspektrophotometers
(Dynatech MR5000) und Korrigieren der Grundlinienextinktion von
frischem Medium quantifiziert. Wenn die korrigierte Extinktion proportional
zu der Melaninkonzentration ist, kann die prozentuale Pigmentierung
für eine
Hautaufhellungstestsubstanz berechnet werden: %
Pigmentierung = (OD530 Test/OD530 Ref) × 100 %wo
OD530 Test und OD530 Ref
die durchschnittliche korrigierte Extinktion des Mediums aus den
Löchern
mit der Testsubstanz und die des Mediums aus den Löchern ohne
Testsubstanz angeben. Die prozentuale Inhibierung, die durch die
Testsubstanz verursacht wird, ist dann 100 – %-Pigmentierung.
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* Zellebensfähigkeitsassay
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Die
Melaninproduktion kann durch Inhibierung der Melanogenese verringert
werden, aber sie kann ebenso durch Zytotoxizität oder Zellproliferation beeinflußt werden.
Um zu testen, ob diese Zellebensfähigkeit vorkommt, wurde mittels
Neutralrotfarbstoffextinktion getestet. Neutralrot ist ein wasserlöslicher
Farbstoff, der durch die intakte Plasmamembran strömt und in
den Lysosomen in intakten Zellen konzentriert wird. Die gesamte
Neutralrotfarbstoffaufnahme ist proportional zu der Anzahl an lebensfähigen Zellen
in der Kultur.
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Direkt
nach der Entfernung von Medium zur Melaninanalyse aus den Mikrotiterplatten
wurden 200 μl frischer
vorerwärmter
Neutralrotfarbstoff (von Sigma, UK, Kat. 2889) bei 25 μg/ml Medium
auf die Zellen aufgetragen und für
3 Stunden wie für
die Zellhaltung inkubiert. Farbstoff, der nicht durch die Zellen
aufgenommen worden ist, wurde durch Umdrehen der Platte und leichtes
Schlagen auf das Saugpapier entfernt. Die Zellen wurden mit 200 μl PBS gewaschen,
das dann erneut entfernt wurde. 100 μl Lösungsmittel (50 % H2O, 49 % Ethanol, 1 % Essigsäure) wurden
zugegeben. Nach 20 Minuten bei Umgebungstemperatur wurde jede Platte für 5 Sekunden
auf einer Mikrotiterplattenschüttelvorrichtung
geschüttelt.
Die Extinktion wurde, wie oben beschrieben, gemessen.
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Tests
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Die
nachstehende Tabelle 3 gibt die bewerteten Hautaufhellungstestsubstanzen
und die Menge an, bei der sie aufgetragen werden. Die prozentuale
Inhibierung der Melaninproduktion, die durch die Testsubstanzen
verursacht wird, wie oben beschrieben, wird ebenso in der Tabelle
wiedergegeben.
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Werte
von weniger als 100 % Melaninkontrolle geben die Inhibierung der
Melanogenese an. Daher zeigen die Ergebnisse in Tabelle 3, daß CLA, die
das t10-c12-Isomer von CLA enthält,
die Melaninproduktion inhibiert.
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In
den Versuchen wurde die Testsubstanz mit DMEM in den Mengen, die
in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt werden, verdünnt.
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„CLA-t10-c12" in der Tabelle bezieht
sich auf CLA, bei dem 80,5 Gew.-% der gesamten CLA das t10-c12-Isomer,
d. h. der Wirkstoff, ist, der innerhalb des Umfangs der Erfindung
liegt. Dies wurde, wie in Beispiel 1 oben beschrieben, hergestellt.
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- Student t-Test ** p < 0,01
* p < 0,05 (n =
4)
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Beispiel 4
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Die
nachstehende Formulierung beschreibt eine Emulsionscreme gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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Beispiel 5
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Eine
Hautcreme (Öl-in-Wasser-Typ)
mit Sonnenschutzformulierung gemäß der vorliegenden
Erfindung wird nachstehend dargestellt:
