CZ20012329A3

CZ20012329A3 - Prostředek pro místní podání

Info

Publication number: CZ20012329A3
Application number: CZ20012329A
Authority: CZ
Inventors: Simon Alaluf; Martin Richard Green; Koichi Iwata; Gerald Patrick Mcneill; Jonathan Richard Powell; Anthony Vincent Rawlings
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-11-23
Publication date: 2001-12-12
Also published as: PL198763B1; US6403064B1; EP1140002A1; DE69931392D1; ES2264276T3; CN1331579A; TWI230077B; WO2000037039A1; GB9828380D0; CZ292080B6; CA2355955C; EP1140002B1; AU1777400A; AR021920A1; DE69931392T2; US20020068042A1; ZA200104732B; RU2229294C2; BR9916440B1; JP2002532530A

Description

Předmětem řešení je prostředek pro místní podání, obsahující: (a) konjugovanou kyselinu linolovou a/nebo její deriváty, zahrnující konjugované části kyseliny linolové, přičemž alespoň 50 % hmotn. konjugované kyseliny linolové a/nebo jejich derivátů je přítomno jako trans-10, cis-12 isomer; a (b) dermatologicky přijatelný nosič. Výrobek je zvláště vhodný pro zesvětlení lidské pokožky.

CZ 2001 - 2329 A3

Prostředek pro místní podání

Oblast techniky

Vynález se týká prostředků pro místní podání na lidskou pokožku a jejich použití ke zesvětlení lidské pokožky.

Dosavadní stav techniky

Mnoho lidí se zajímá o stupeň pigmentace své pokožky. Například lidé se stařeckými skvrnami nebo pihami si mohou přát, aby byly tyto pigmentové skvrny méně výrazné. Jiní mohou chtít omezit ztmavnutí pokožky vyvolané slunečním svitem nebo zesvětlení své přirozené barvy kůže. Pro splnění těchto požadavků bylo učiněno mnoho pokusů o vytvoření výrobků, snižujících tvorbu pigmentu v melanocytech. Ovšem látky, rozpoznané až do nynějška, mají sklon vykazovat nežádoucí vedlejší účinky, například dráždí pokožku. V důsledku toho nejsou takové látky vhodné pro kosmetické použití, anebo mohou být nanášeny jen v takových koncentracích, při nichž je jejich účinek na zesvětlení pokožky menší, než by bylo požadováno. Pro snížení nežádoucích vedlejších účinků lze uvažovat použití kombinace různých látek zesvětlujících pokožku. Existuje však značné riziko, že použitím takové kombinace se vzhledem ke kompetitivním účinkům sníží zesvětlení pokožky. Proto přetrvává potřeba zlepšení účinnosti kosmetických výrobků, zesvětlujících pokožku.

GB 2 287 405 předkládá kosmetický přípreavek pro bělení pokožky, který obsahuje kombinaci extraktu z Glycyrrhyza glabra nebo odpovídajících rostlinných druhů a α-hydroxy-, β-hydroxy- nebo keto-kyseliny či amidu, soli nebo esteru takové látky. Uvádí se, že kombinace působí synergicky k inhibování tyrosinázy, čímž inhibuje tvorbu melaninu.

WO 94/07462 předkládá prostředky sloužící kromě jiného i k zesvětlení pokožky, obsahující retinol nebo jeho derivát a -diové kyseliny.

• ·· ·· ·· · * • · · · · · · · · · ·

- 2 WO 94/09756 navrhuje použití retinolu nebo jeho derivátu, spolu se zvoleným činidlem zesvětlujícím pokožku, k různým účelům včetně zesvětlení barvy pokožky. Upřednostňovaným činidlem zesvětlujícím pokožku je hydrochinon, ovšem zmiňována jsou i různá jiná činidla, včetně extraktu z lékořice.

US 4 990 330 popisuje výrobky bělící pokožku, obsahující koji-kyselinu v kombinaci s jinými látkami, které jsou zvoleny z celé škály látek, včetně kyseliny azelaové. Je uvedeno, že kombinace synergicky inhibuje syntézu melaninu.

JP 63284119 podle Derwentova abstraktu navrhuje externí činidlo k použití na pokožku, mající bělící účinky a chránící vůči UV-záření, které obsahuje kyselinu isoferulovou nebo její sole a organickou kyselinu či její sole.

JP 6199646 podle Derwentova abstraktu popisuje kosmetický výrobek k bělení pokožky, který obsahuje rostlinný extrakt, močovinu a stabilizátor močoviny. Extrakt může být zvolen z široké škály rostlin včetně glycyrrhizae radix (lékořicového kořenu). Podobně může být stabilizátor močoviny zvolen ze široké skupiny, která zahrnuje alifatické dikarboxylové kyseliny.

WO 98/17269 předkládá prostředky, obsahující zinečné sole konjugované kyseliny linolové, k léčbě kožních onemocnění jako jsou ekzém, lupenka a dermatitidy. Popsané prostředky nejsou používány k inhibici syntézy melaninu, ani nejsou obohaceny specifickým trans 10, cis 12 isomerem konjugované lyseliny linolové.

US 4 393 043 popisuje kosmetické přípravky pro místní aplikaci vitamínů na pokožku, zejména vitamínu F, který sestává zejména z kyseliny linolové. Přípravky jsou stabilizovány přidáním rostlinného oleje. Nejsou zde nikde zmíněny prostředky obohacené jedním specifickým isomerem kyseliny linolové, ani přípravky nejsou používány k inhibici syntézy melaninu.

Výše zmíněné výrobky dosud nenalezly široké přijetí a v této oblasti tak zůstává potřeba zlepšení.

Autoři vynálezu nyní zjistili, že rostoucí redukci melaninového produktu lze získat aplikací na kůži takových kosmetických prostředků, které obsahují specifický isomer konjugované kyseliny linolové, nebo jeho deriváty.

Podstata vynálezu

Podle prvního aspektu předkládaného vynálezu je zde poskytován prostředek pro místní podání, zahrnující:

(a) konjugovanou kyselinu linolovou, a/nebo její deriváty, zahrnující částice konjugované kyseliny linolové, kde alespoň 1 % hmotn. konjugované kyseliny linolové a/nebo částic je přítomno jako trans 10, cis 12 isomer; a (b) dermatologicky přijatelné vehikulum (pojidlo, nosič).

Takové prostředky jsou zvláště vhodné k místnímu nanášení na lidskou pokožku k posílení redukce tvorby melaninu a tím k zesvětlení pokožky, na niž byly naneseny.

Podle druhého aspektu poskytuje předkládaný vynález kosmetický postup pro zesvětlení lidské pokožky, způsob, zahrnující nanášení prostředku pro místní podání, jak byl popsán výše, na kůži.

V dalším aspektu vynález rovněž poskytuje použití konjugované kyseliny linolové, a/nebo derivátů této látky, obsahujících částice konjugované kyseliny linolové, v prostředku pro místní použití k zesvětlení lidské pokožky, v němž alespoň 1 % hmotnosti konjugované kyseliny linolové a/nebo částic je přítomno jako trans 10, cis 12 isomer.

- 4 V ještě dalším aspektu vynálezu, se zvrat zesvětlení kůže, vyvolaného působením výše popsané konjugované linolové kyseliny a/nebo jejích derivátů, zabraňuje začleněním ochrany vůči slunečnímu záření, absorbující ultrafialové záření, do prostředků podle prvního aspektu předkládaného vynálezu. Výrazem ochrana vůči slunečnímu záření se míní jakýkoli materiál, ať organický nebo anorganický, který může chránit pokožku před ultrafialovým zářením v rozmezí 290 až 400 nm.

TranslO, cisl2 isomer, obsahující konjugovanou linolovou kyselinu

Konjugovaná kyselina linolová (zde označovaná jako CLA) zahrnuje skupinu polohových a geometrických isomerů kyseliny linolové, u nichž jsou možné různé konfigurace cis a trans dvojných vazeb v polohách (6, 8), (7, 9), (8, 10), (9, 11), (10, 12) nebo (11, 13). Existuje tedy 24 odlišných isomerů CLA.

Základní aktivní látkou prostředků podle předkládaného vynálezu je trans 10, cis 12 (dále zde uváděný jako tlO, cl2) isomer. Tento konkrétní isomer volné kyseliny má strukturu (I), znázorněnou níže:

(I)

Vynález rovněž obsahuje deriváty volné kyseliny, které tak obsahují konjugované částice kyseliny linolové. Deriváty s výhodou zahrnují ty, jež jsou získány substitucí karboxylové skupiny kyseliny, jako jsou estery (např. retinylové estery, triglyceridové estery, monoglyceridové estery, diglyceridové estery, fosfoestery), amidy (např. ceramidové deriváty), sole (např. sole alkalického kovu a sole kovů alkalických zemin, amonné sole); a/nebo ty, jež jsou získány substitucí na Cl8 uhlíkového řetězce, jako α-hydroxy- a/nebo β-hydroxyderiváty.

- 5 V případě triglyceridových esterových derivátů jsou zahrnuty veškeré polohové isomery CLA substituentů na glycerolové kostře. Triglyceridy musejí obsahovat alespoň jednu CLA částici. Například ze tří esterifikovatelných poloh glycerolové kostry mohou být polohy 1 a 2 esterifikovány CLA a jiným tukem v poloze 3, anebo v jiném případě může být glycerolová kostra esterifikována CLA v polohách 1 a 3 a jiným tukem v poloze 2.

Kdekoli je v tomto popisu vynálezu použitý výraz konjugovaná kyselina linolová nebo CLA, je třeba ho chápat tak, že jsou v něm rovněž zahrnuty deriváty, obsahující CLA částice.

Výraz CLA částice se vztahuje k acylové části (částím) dlouhého alifatického řetězce CLA derivátu.

Výraz tlO, cl2 isomer obsahující CLA znamená, že alespoň 1 % hmotn. celkové CLA a/nebo CLA částic, přítomných v prostředku, je ve formě trans 10, cis 12 isomeru. S výhodou je ve formě tlO, cl2 isomeru alespoň 20 %, lépe pak alespoň 50 % hmotn. celkové CLA a/nebo částic přítomných v prostředku. Ve zvláště upřednostňovaném ztělesnění je ve formě tlO, cl2 isomeru alespoň 70 %, hmotn. celkové CLA a/nebo částic.

CLA a/nebo její deriváty obsahující CLA částice podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny způsobem, popsaným ve WO 97/18320. Upřednostňovaný způsob přípravy je uveden níže v Příkladu 1.

Aktivní látka, isomer tlO, cl2 obsahující CLA, pro použití podle předkládaného vynálezu, je v prostředku pro místní podání přítomna v účinném množství. Běžně je celkové množství aktivní látky přítomno v množství od 0,00001 % do 50 % hmotnostních prostředku. Ještě lépe je toto množství v rozmezí od 0,01 % do 10 % a nejlépe od 0,1 % do 5 % pro maximální přínos při nejmenších nákladech.

- 6 ·· 99 ΦΦ Φ·

ΦΦΦ* «Φφ

Φ ΦΦΦ Φ φφφφφ φ

9 9 9 ΦΦ φφ φ

Dermatologicky přijatelné vehikulum

Prostředek podle vynálezu rovněž obsahuje dermatologicky/kosmeticky přijatelné vehikulum, působící jako ředidlo, dispersní látka nebo nosič pro aktivní látku, tlO, cl2 isomer, obohacený CLA. Vehikulum může obsahovat materiály běžně používané u výrobků pro péči o pokožku jako jsou voda, kapalné nebo pevné změkčovadlo, silikonové oleje, emulgátory, rozpouštědla, zvlhčovadla, zahušťovadla, prášky, hnací látky (propelanty) a podobně.

Vehikulum bude obvykle tvořit od 5 % do 99,9 % a s výhodou od 25 % do 80 % hmotnosti prostředku a může, v nepřítomnosti jiných kosmetických přídavných látek, vytvářet zůstatek prostředku.

Volitelné látky přínosné pro pokožku a kosmetické přídavné látky

Kromě aktivní látky, tlO, cl2 isomeru s obsahem CLA, mohou být začleněny do prostředku i jiné specifické aktivní látky přínosné pro pokožku, jako jsou ochranné látky vůči slunečnímu záření a/nebo jiná činidla zesvětlujíci pokožku.Pokud je ochrannou látkou vůči slunečnímu záření organická látka, bude obvykle obsahovat alespoň jedno chromoforní činidlo absorbující v ultrafialové oblasti od 290 do 400 nm. Chromoforní organická činidla chránící před slunečním zářením lze rozdělit do následujících kategorií (se specifickými příklady), zahrnujících: kyselinu p-aminobenzoovou, její sole a deriváty (ethylové, isobutylové, glycerylové estery; kyselinu p-dimethylaminobenzoovou); anthraniláty (o-aminobenzoáty; methylové, fenylové, benzylové, fenylethylové, linalylové, terpinylové a cyklohexenylové estery); salicyláty (oktylové, amylové, fenylové, benzylové, menthylové, glycerylové a dipropylenglykolové estery); deriváty kyseliny skořicové (menthylové a benzylové estery, a-fenylcinnamonitril; butylcinnamoylpyruvát); deriváty kysliny dihydroxyskořicové (umbelliferon, methylumbelliferon, methylacetoumbelliferon); deriváty kyseliny trihydroxyskořicové (esculetin, methylesculetin,

daphnetin, a glukosidy, esculin a daphnin); uhlovodíky (difenylbutadien, stilben); dibenzalaceton a benzalacetofenon; naftolsulfonáty (sodné sole

2-naftol-3,6-disulfonové kyseliny a 2-naftol-6,8-disulfonové kyseliny); kyselinu dihydroxynaftoovou a její sole; o- a p-hydroxybifenyldisulfonáty; kumarinové deriváty (7-hydroxy, 7-methyl, 3-fenyl); diazoly (2-acetyl-3-bromoindazol, fenylbenzoxazol, metylnaftoxazol, různé arylbenzothiazoláty; chininové sole (bisulfát, sulfát, chloridoleát a tanát); chinolinové deriváty (8-hydroxychinolinové sole, 2-fenylchinolin); hydroxy- nebo methoxysubstituované benzofenony; kyselinu močovou a vilourovou; kyselinu tříslovou a její deriváty (např. hexaethylether); (butylkarbityl) (ó-propylpiperonyl)ether; hydrochinon; benzofenony (oxybenzon, sulisobenzon, dioxybenzon, benzoresorcinol, 2,2',4,4'-tetrahydroxybenzofenon, 2,2'-dihydroxy-4,4'-dimethoxybenzofenon, oktabenzon; 4-isopropyldibenzoylmethan, butylmethoxydibenzoylmethan; etocrylen; a 4-isopropyl-dibenzoylmethan).

Zvláště vhodné jsou: 2-ethylhexyl-p-methoxycinnamát, 4,4'-t-butylmethoxydibenzoylmethan, 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon, oktyldimethyl-p-aminobenzoová kyselina, digalloyltrioleát, 2,2-dihydroxy-4-methoxybenzofenon, ethyl-4-[bis(hydroxypropyl)]aminobenzoát, 2-ethylhexylsalicylát, glyceryl-p-aminobenzoát, 3,3,5-trimethylcyklohexylsalicylát, methylanthranilát, p-dimethylaminobenzoová kyselina nebo aminobenzoát,

2-ethylhexyl-p-dimethylaminiobenzoát, 2-fenylbenzimidazol-5-sulfonová kyselina, 2-(p-dimethylaminofenyl)-5-sulfoniobenzoxazolová kyselina a směsi takových látek.

Vhodná obchodně dostupná organická činidla, chránící vůči slunečnímu záření, jsou ta, popsaná v následující tabulce.

• · · · · · · · φ «Φφ.φ φ * · · * · · ·

- 8 φ · · · φ φ · φ · « · φ ··· φφ ·· ♦· ·· ···

Tabulka 1

název podle CTFA	firemní název	dodavatel
benzofenon-3	UVINUL M-40	BASF Chemical Co.
benzofenon-4	UVINUL MS-40	BASF Chemical Co.
benzofenon-8	SPECTRA-SORB UV-24	Američan Cyanamid
DEA-methoxyskořičnan	BERNEL HYDRO	Bernel Chemical
ethyldihydroxypropyl-PABA	AMERSCREEN P	Amerchol Corp.
glyceryl-PABA	NIPA G.M.P.A.	Nipa Labs.
homosalate	ΚΕΝΕ STER HMS	Humko Chemical
menthylanthranilát	SUNAROME UVA	Felton Worldwide
octocrylene	UVINUL N-539	BASF Chemical Co.
oktyldimethyl-PABA	AMERSCOL	Amerchol Corp.
oktylmethoxyskořičnan	PARSOL MCX	Bernel Chemical
oktylsalicylát	SUNAROME WMO	Felton Worldwide
PABA (kys. paraaminobenzoová)	PABA	National Starch
2-fenylbenzimidazol-5-sulfono- vá kyselina	EUSOLEX 6300	EM Industries
TEA-salicylát	SYBARINE W	Felton Worldwide
2-(4-methylbenzyliden)kafr	EUSOLEX 6300	EM Industries
benzofenon-1	UVINUL-400	BASF Chemical Co.
benzofenon-2	UVINUL D-50	BASF Chemical Co.
benzofenon-6	UVINUL D-49	BASF Chemical Co.
benzofenon-12	UVINUL 408	BASF Chemical Co.
4-isopropyldibenzoylmethan	EUSOLEX 8020	EM Industries
butylmethoxydibenzoylmethan	Parsol 1789	Givaudan Corp.
etocrylene	UVINUL N-35	BASF Chemical Co.

DEA = diethanolamin, TEA = triethanolamin

• · · ·· · · ·· · · ·» ·

Použity mohou být i anorganické látky, chránící před slunečním zářením, jako mikromletý oxid titaničitý, oxid zinečnatý, polyethylen, polyamidy (např. nylon) a různé jiné polymery. Množství činidel, chránících před slunečním zářením (ať organických nebo anorganických), se bude obecně pohybovat od 0,1 do 30 %, lépe od 2 do 20 % a optimálně od 4 do 10 % hmotnostních.

Vehikulum může rovněž dále obsahovat přídavné látky jako jsou parfémy, antioxidanty, zneprůhledňující látky, konzervační látky, barviva a pufry.

Příprava výrobku, formování, použití a balení

Pro přípravu prostředku pro místní podání podle předkládaného vynálezu může být použito obvyklého způsobu přípravy výrobků pro péči o pokožku. Aktivní složky jsou obecně začleněny do dermatologicky přijatelného nosiče běžným způsobem. Aktivní složky mohou být vhodně nejprve rozpuštěny nebo dispergovány v části vody či jiného rozpouštědla nebo tekutiny, která má být začleněna do prostředku. Upřednostňovanými prostředky jsou emulze typu oleje ve vodě nebo typu vody v oleji.

Prostředek může být také ve formě běžných výrobků pro péči o pokožku jako je krém, gel či pleťová voda a podobně. Prostředek může být rovněž ve formě tak zvaného smývatelného výrobku, například koupelového či sprchového gelu, který může obsahovat dávkovači zařízení pro aktivní látky k podpoře přilnavosti na pokožku během oplachování. Nejvíce se upřednostňuje výrobek ve formě nesmývaného výrobku, určeného pro nanesení na pokožku bez záměrného opláchnutí brzo po nanesení.

Prostředek může být balen jakýmkoli vhodným způsobem jako v nádobce, v lahvi, v tubě, v nádobce s kuličkovým rolerem a podobně, a to běžným způsobem.

• Φ ·♦ ·· ·* ♦ ♦ φ » · · «

- 10 ·· ··· ···<·· * ₉ • · · · · · · · φ ··· ·♦ ·· ♦ · · · · · ·

Výrobek může být nanášen na pokožku stejným způsobem jako běžné výrobky pro péči o pokožku, např. může být nanášen 1 až 3 krát denně na pokožku např. tváře a/nebo rukou a paží. V případě pigmentových skvrn může uživatel například zvolit nanášení výrobku pouze na postižená místa. Zesvětlení kůže se obvykle stane viditelným po 2 až 3 měsících v závislosti na stavu pokožky, koncentraci aktivních složek ve výrobku a množství nanášeného výrobku a četnosti jeho nanášení. Předkládaný výrobek je zvláště vhodný pro obecné zesvětlení pokožky, zejména pokud obsahuje také ochranné činidlo proti slunečnímu záření v tom případě, že výrobek je určen pro denní používání.

Pro lepší pochopení předkládaného vynálezu jsou uvedeny, pouze pro jeho dokreslení, následující příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Tento příklad ozřejmuje syntézu CLA, obsahující 80,5 % hmotnostních tl0, cl2 isomeru vzhledem ke hmotnosti celkových částic CLA.

Směsné isomery CLA se připravují alkalickým působením za vysoké teploty na saflorový olej, přičemž vzniká CLA se stejnými množstvími isomeru c9, til a isomeru tlO, cl2. CLA obohacená isomerem c9, til se ze směsi odděluje selektivní esterifikací s laurylalkoholem za použití Geotrichum Ccindidum jako katalyzátoru. Po kroku esterifikace a oddělení jsou zbývající volné kyseliny CLA obohaceny isomerem tlO, cl2 a isolovány.

Výroba směsných isomerů CLA

Hydroxid sodný (0,6 kg) jako vysoce čisté analytické činidlo (označení Analar®, AR) byl rozpuštěn v 6 kg propylenglykolu o farmaceutické čistotě smísením a zahřátím na 80 až 85°C. Vzorek byl ochlazen a poté byly přidány 2

kg saflorového oleje. Za použití zařízení pro pokusná množství byla směs udržována ve varu pod zpětným chladičem (při refluxu) po dobu 3 hodin za rychlého míchání a při teplotě 170°C. Pak byla reakční směs ochlazena přibližně na 95°C, míchání bylo zpomaleno na střední rychlost a směs byla neutralizována za použití 1,28 litru 35,5 % kyseliny chlorovodíkové, rozpuštěné v demineralizované vodě (8 1), při udržování teploty přibližně na 90°C. Reakční směs byla ponechána se usadit a vodná fáze byla slita. Olejová fáze byla dvojnásobně promyta vždy 1 litrem 5 % AR solného roztoku a dvojnásobně promyta vždy 1 litrem demineralizované vody při 90°C, přičemž byl odstraňován jakýkoli mýdlovitý materiál. Olej obohacený CLA byl sušen při 100°C ve vakuu před odvodněním při teplotě přibližně 50°C a zfiltrován na Bůchnerově nálevce přes filtrační papír Whatman a tenkou vrstvu celitového hyflo-filtru. Olej s obsahem směsných isomerů CLA byl do své spotřeby uchováván pod dusíkem při -25°C.

Výroba CLA, obohacené c9, til isomerem (I) Příprava laurylesterů:

CLA, připravená ze světlice (2,0 kg), byla přidána ke 2 molárním ekvivalentům laurylalkoholu (1-dodekanol; 98 % od Aldrich chem.) spolu s 5,96 kg demineralizované vody. Teplota byla upravena na 25°C a 1 % (hm./hm.) Geotrichum Candidum (od Amano Pharmaceuticals, Japonsko) bylo přidáno po předchozím smísením s malým množstvím vody a důkladně mícháno. Reakce byla ukončena po 44 hodinách. Nádoba byla zahřáta na 80 až 90°C, vodná vrstva byla odčerpána a olej byl promyt demineralizovanou vodou a sušen ve vakuu 30 minut při 100°C. Poté byl olej zchlazen na 50°C a zfiltrován na Bůchnerově nálevce přes filtrační papír Whatman a tenkou vrstvu celitového hyflo-filtru.

(II) Oddělení obohacené tlO, cl2 CLA:

- 12 Zbylý laurylalkohol byl odstraněn při 130°C rychlostí 25 až 35 ml za minutu molekulární destilací. Zbytek byl hrubě rozdělen na laurylestery (obohacené c9, til CLA) a volné kyseliny (obohacené tlO, cl2 CLA) odpařením při 158°C a rychlosti toku 25 až 35 ml za minutu.

Isolace obohacené tlO, c!2 CLA

Volné kyseliny CLA z kroku (II) uvedeného výše byly opět destilovány při 160-165°C a rychlosti toku 20 až 30 ml za minutu ke snížení obsahu esteru. Obsah zbytkového laurylalkoholu byl dále snížen destilací při 131°C a rychlosti toku 25 až 30 ml za minutu. Pro odstranění veškerého zbytkového laurylalkoholu byly volné alkoholy esterifikovány na mastné kyseliny přítomné v reakční směsi za použití SP392 Mucor miehei lipázy (5%, šarže 0110 od Novo Nordisk). Obohacená tlO, cl2 CLA, obsahující mastné kyseliny, byla oddělena od laurylesterů za použití molekulární destilace ve vakuu při 155°C a rychlosti toku 15 až 20 ml za minutu. Složení obohacené tlO, cl2 CLA, vyrobené tímto způsobem, je uvedena níže v Tabulce 1.

Tabulka 1

složení typ. preparátu mastných kyselin CLA, obohaceného tlO, cl2 (hm. %)	B
c9, til	8,3
tlO, cl2	53,9 (80,5 % celkové CLA)
c9, cil & clO, cl2	2,9
t9, tl ít & tlO, 12t	Li
jiná CLA	0,7
celková CLA	66,9
mastné kyseliny 16:0	13,6
16:1	-
18:0	4,6
18:1	10,3
18:2 (ne CLA)	3,1
jiné mastné kyseliny	1,5

Příklad 2

Příprava 110. c!2 CLA triglyceridů

CLA obohacená tlO, cl2 isomerem (10 g), připravená podle příkladu 1, byla smísena s 1,01 g (10,1 %) glycerolu (Pricerine 9083 glycerin CP od firmy Ellis and Everards) a přidáno bylo 0,5 g (přibližně 5 %) nespecifické lipázy z SP392 Mucor Miehie (Mucor Miehie od firmy Novo Nordisk, šarže 0110). Smíchané látky byly míchány ve vakuu v rotační odparce při 60°C za slabého unikání dusíku.

Po 96 hodinách byla reakce zastavena filtrací směsi přes tenkou vrstvu filtrační pomůcky celíte super-cel na Bůchnerově nálevce, čímž byla shromážděna olejová fáze s obsahem CLA triglyceridů. Její složení je uvedeno níže v Tabulce 2.

Tabulka 2 složení mastných kyselin v triglyceridech poměrné proč, údaje z celkových mastných kyselin lipidu c9, til tlO, cl2 c9, cil & clO, cl2 t9, tlít & tlO, 12t jiná CLA celková CLA mastné kyseliny 16:0 (ne CLA) jiné mastné kyseliny

8,3

54,8 (81,7 % celkové CLA)

2,7

1.3 0

67,1

13,5

0,1

4,9

10,3

3.4

0,7

- 14 Příklad 3

Metodologie stanovení

Uchovávání buněk

Buňky melanomu B16-F1 myší (Americká sbírka typů kultur, Američan Type culture Collection, Maryland, USA) byly uchovávány v kultivačních lahvích o objemu 75 cm² v médiu RPMI 1640 (ICN-Flow, katalog, číslo 12-60-54), doplněném L-glutaminem (4 mmol.I'¹) a 10% fetálním hovězím sérem (FBS) při 37°C ve vodou nasycené atmosféře s obsahem 5 % CO₂ ve vzduchu. Buňky byly pasážovány dvakrát týdně.

Stanovení pigmentace

Málo se slévající B16 buňky byly zaočkovány na 96 jamkové mikrotitrační destičky v hustotě 5 000 buněk na jamku a poté byly kultivovány přes noc v médiu DMEM (Life Technologies, NY), obsahujícícm 10% fetální hovězí sérum a 1% penicilin/streptomycin bez fenolové červeně při 37°C v 5% CO₂ atmosféře. Po 24 hodinách bylo médium nahrazeno čerstvým médiem, obsahujícím testované látky, nebo kontrolní vehikulum. Buňky byly inkubovány 72 hodin, po nichž byl melanin v kontrolních jamkách viditelný. Dále bylo médium obsahující melanin z každé jamky přeneseno do prázdné 96 jamkové destičky a kvantifikováno odečtením absorbance při 530 nm za použití spektrofotometru pro mikrotitrační destičky (Dynatech MR5000) a korigováním vůči základní absorpci čerstvého média. Vzhledem k tomu, že korigovaná absorpce odpovídá koncentraci melaninu, procentní množství pigmentace pro látku, testovanou na zesvětlení pokožky, může být počítáno jako:

% pigmentace = (OD₅₃₀ test/OD₅₃₀ ref) x 100 % •to •to to«t tto

t · • · ·· kde OD₅₃₀ test a OD₅₃₀ ref označují průměrnou korigovanou absorpci média z buněk s testovanou látkou a průměrnou korigovanou absorpci média z buněk bez testované látky. Procentní inhibice vyvolaná testovanou látkou tedy činí 100 - % pigmentace.

Stanovení životnosti buněk

Produkce melaninu může být snížena inhibici melanogenese, ale může být ovlivněna také cytotoxicitou, nebo buněčnou proliferaci. K otestování, zda k takovým jevům došlo, byla sledována životnost buněk absorpcí neutrálního červeného barviva. Neutrální červeň je vodou rozpustné barvivo, které prochází neporušenou plazmatickou membránou a koncentruje se v lysosomech neporušených buněk. Celkové zachycení neutrální červeně je úměrné počtu živoucích buněk v kultuře.

Ihned po odstranění média z mikrotitračních jamek pro stanovení melaninu bylo k buňkám přidáno 200 μΐ čerstvého, předehřátého barviva neutrální červeň (od firmy Sigma, UK, katalog, číslo 2889) v množství 25 pg/ml média a inkubováno 3 hodiny jako při kultivaci buněk. Barvivo, které nebylo absorbováno buňkami, bylo odstraněno převrácením destičky a poklepáním na ssavý papír. Buňky byly promyty 200 μΐ PBS (pufrovaný solný roztok), který pak byl opět odstraněn. Následně bylo přidáno 100 μΐ rozpouštědla (50 % H₇0, 49 % ethanolu, 1 % kyseliny octové). Po 20 minutách při teplotě okolí byla každá destička 5 sekund protřepávána na třepačce pro mikrotitrační destičky. Absorpce byla měřena tak, jak bylo popsáno výše.

Testy

Tabulka 3 viz níže udává látky, stanovované v testu zesvětlení pokožky a množství, v nichž byly podávány. Rovněž jsou v ní uvedena procenta inhibice tvorby melaninu, vyvolané dříve popsanými testovanými látkami.

φ φφ φφ φφ ·*♦ «φφ φ φ φ · φ · φφ® • · i · · φ · φ ·· •Φ φφφ ΦΦΦΦ·· ·♦

-16- φ·φ·φ · · ··

Hodnoty menší než 100% melaninová kontrola ukazují na inhibici melanogenese. Výsledky v tabulce 3 tedy ukazují, že CLA obsahující tlO, cl2 isomer CLA inhibuje tvorbu melaninu.

V pokusech byly testované sloučeniny naředěny pomocí DMEM v množstvích, uvedených níže v tabulce 3.

CLA tlO, cl2 v tabulce odpovídají CLA, kde 80,5 % hmotn. z celkové CLA představuje tlO, cl2 isomer, tj. aktivní činidlo, patřící do rozsahu předkládaného vynálezu. Připraveno bylo podle popisu ve výše uvedeném příkladu 1.

- 17 Tabulka 3

životnost buněk měřená neutrální červení % kontroly S. D. t-test/kontrola		o o o θ' * *	o o o cT * *	** (0,000)	o> Ol θ'	* ( 0,042)
4,6 I	o	un cn	cn cn	(N rď	4,4
100,0	Ol 1“i	89,5	90,4	97,6	96,2
melanin v médiu % kontroly S. D. t-test/kontrola		** (0,000)	/—s O O o θ' * *	Z—s O o o o * *	z-s O O O θ' * *	** (0,000)
QcT	6‘0	00 θ'	cn θ'	un r—<	kcT
100,0	4,0		o	Γ σΓ	00 o?
působení	kontrola	1:100 tlO, c!2 CLA	1:250 tlO, cl2 CLA	1:500 tlO, cl2 CLA	1:750 tlO, cl2 CLA	1:1000 tlO, C12 CLA

ττ

II e ir, O θ'

V &

o θ' v

Ph > op 4-» c

ω Ό

P

4-1 (Z>

• · ··

- 18 Příklad 4

Níže uvedené složení popisuje emulzní krém podle předkládaného vynálezu.

plný chem. název či název dle CTFA	firemní název	% hmotnostní
triglycerid CLA (80,5 % tlO, cl2 isomeru vzhledem k hmotn. celk. CLA částic vyrobených dle př. 2)		2,0
dvoj sodná sůl EDTA	Sequesterene Na2	0,05
křemičitan hořečnato-hlinitý	Veegum Ultra	0,6
methylparaben	Methyl Paraben	0,15
simethicon	DC Antifoam Emulsion	0,01
butylenglykol 1,3	Butylene Glycol 1,3	3,0
hydroxyethylcelulóza	Natrosol 250HHR	0,5
glycerin, podle US lékopisu	Glycerine USP	2,0
xanthanová guma	Keltrol 1000	0,2
triethanolamin	Triethanolamine 99 (%)	1,2
kyselina stearová	Pristerene 4911	3,0
propylparaben, nehořlavý	Propylparaben NF	0,1
glycerylhydrostearát	Naturechem GMHS	1,5
stearylalkohol	Lanette 18DEO	1,5
isostearylpalmitát	Protachem ISP	6,0
oktanoát C₁₂-C₁₅ alkoholů	Hetester FAO	3,0
dimethicon	Silicone Fluid 200 (50 %)	1,0
cholesterol, nehořlavý	Cholesterol NF	0,5
stearát sorbitanu	Sorbitanstearát	1,0
butylovaný hydroxytoluen .......................	Embanox BHT	0,05

• Φ φ «5 · »Φ Φ · φφφ* ΦΦ

ΦΦΦ ΦΦΦΦ Φ*

Φ · φφφ · ΦΦ φ Φ φ ·

ΦΦΦ ΦΦ · ΦΦ

ΦΦΦ Φφ ·« ΦΦ ··

- 19 «I · φφ

tokoferylacetát	Acetát vitamínu E	0,1
stearát PEG-100	MYRJ 59	2,0
stearoyllaktylát sodný	Pationic SSL	0,5
retinylpalmitát	Palmitát vitamínu A	0,06
kyselina hydroxykaprylová	kyselina hydroxykaprylová	0,01
alfa-bisabolol	alfa-bisabolol	0,2
voda, deionizovaná		dle'potřeby do 100

EDTA = kyselina ethylendiamintetraoctová

Dimethicone, Simethicon = protipěnivé emulse na bázi dimethylpolysiloxanu, vyrábí např. firmy Dow Corning či Elkay

PEG = polyethylenglykol

Příklad 5

Složení krému na pokožku (typu oleje ve vodě) s ochranou vůči slunečnímu záření podle předkládaného vynálezu je popsáno níže:

4

- 20 •Φ ·· 44 9 • 4 « 4 4 4 4 4 4· Φ 4 • 44 4444 444

4 4 Φ ·····» ·4

444 44 4 · »· • ••44 44 44 44«··

přísada	hmotn. %
hydroxyethylcelulóza	0,50
křemičitan hořečnato-hlinitý	0,75
kakaové máslo	1,25
skvalen	1,05
isostearyl isononanoátu	2,25
DC Silicone Fluid 200® (50 CST)	1,25 - .....- '
DC Silicone Fluid 200® (100 CST)	0,50
butylenglykol	3,00
Parsol MCX®	3,00
Parsol 1789®	3,00
glycerin	2,50
hyaluronát sodný	0,50
CLA triglycerid tlO, cl2	5,00
glycereth-7-hydroxystearát	1,50
kyselina stearová	3,50
cetyl/stearylalkohol	2,55
sodná PCA	2,10
glyceryl hydroxystearátu	1,25
tokoferol	0,35
methylparaben	0,20
propylparaben	0,10
Glydant®	0,30
steareth-20	1,20
dvojsodná sůl EDTA	0,05
triethanolamin	1,50
deionizovaná voda	dle potřeby

Parsol MCX® = 2-ethylhexyl-p-methoxyskořičnan

Parsol 1789 = butylmethoxydibenzoylmethan; avobenzon

- 21 • 4 •4 a4

4 • ·44 « * 44

4 *4 • ··4 4

44 • 444

4·4

44 4 • 44

44 «4

44«4

DC Silicone Fluid 200® = dimethylsiloxanový polymer, viskozita v SI: lcps=10'⁶m²s·'

Glydant® = [DMDM(dimethylolmethyl)hydantoin] glycereth = polyethylenglykolový ester glycerinu steareth 20 = polyoxyethylen(20)stearylether ♦ ·· ·4 4· ΦΦ · «· > 4 · Φ Φ · · φ·· • 44 Φ Φ Φ Φ ΦΦΦ · Φ Φ Φ · ·φφ φ φ φφ >44 ΦΦ Φ Φ Φφ ♦ ·· ·Φ φφ 44 44444

Αν- ^ζζ^

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Prostředek pro místní podání, vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) konjugovanou kyselinu linolovou, a/nebo její deriváty, kde alespoň 50 % hmotn. konjugované kyseliny linolové a/nebo jejích derivátů je přítomno jako trans-10, cis-12 isomer; a (b) dermatologicky přijatelný nosič.

2. Prostředek pro místní podání podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje 0,00001 % až 50 % hmotnostní prostředku a lépe 0,01 až 10 % hmotnostní prostředku uvedené konjugované kyseliny linolové a/nebo jejích derivátů.

3. Prostředek pro místní podání podle kteréhokoli z nároků 1 či 2, vyznačující setím, že rovněž obsahuje ochranu vůči slunečnímu záření.

4. Způsob kosmetického zesvětlení lidské pokožky, vyznačující se tím, že se na pokožku nanáší prostředek pro místní podání podle nároku 1, 2 nebo 3.

5. Použití konjugované kyseliny linolové a/nebo jejích derivátů v kosmetickém prostředku pro místní podání k zesvětlení lidské pokožky, vyznačující se tím, že alespoň 50 % hmotn. konjugované kyseliny linolové a/nebo jejích derivátů je přítomno jako trans 10, cis 12 isomer.