KR101324654B1 - 에스쿨레틴을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에스쿨레틴의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 에스쿨레틴은 MAPK와 PI3K/Akt 경로에 관여하는 ERK1/2, p38, JNK, PI3K를 활성화시키므로 I형 프로콜라겐의 발현을 증가시킨다. 또한, 본 발명의 에스쿨레틴은 Sp1 발현을 증가시키므로 I형 프로콜라겐의 발현을 증가시킨다.
따라서, 본 발명의 에스쿨레틴은 콜라겐 합성을 촉진하므로 항노화 활성이 우수하며 특히 주름 개선 효과가 탁월하여 화장료 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있다.

Description

에스쿨레틴을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화용 화장료 조성물{Cosmetic Composition comprising the esculetin for anti-wrinkle and anti-aging effect}

본 발명은 에스쿨레틴(esculetin)의 신규한 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 에스쿨레틴을 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 우리나라에서는, 의료, 공중위생 혜택이 개선됨에 따라 고령화 사회가 급속히 도래하고 있으며, 이에 따라, 생활의 질적인 향상이 도모되고 있으며, 젊음의 유지에 대한 욕구도 증가하고 있어, 화장품, 특히 항노화 화장료에 대한 요구가 증가하게 되었다.

이러한 항노화 화장품 개발의 기초가 되는 피부 노화 메카니즘에 대해서는, 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 내인성 생리적 노화(intrinsic, chronological aging)와 장기간 자외선 노출에 의해 진행되는 외인성 광노화(phtoaging)로 구분될 수 있다. 내인성 피부노화의 임상적 특징은 피부가 얇아지고, 탄력성이 떨어지게 되는 것이다. 또한, 조직학적 소견으로는, 표피 및 진피의 두께가 얇아지고, 혈관이 감소되며, 진피내의 섬유 아세포의 수가 감소하게 되는 것이다. 또한, 외인성 피부노화인 광노화의 임상적 특징은, 피부가 거칠고 탄력성이 없어지며, 불규칙한 색소 침착이 발생되고, 깊은 주름살이 증가되는 것이다.

이러한 현상의 근본적인 원인은 아직 밝혀지지 않고 있지만, 많은 연구들은 이러한 현상이 피부 콜라겐 함량의 감소와 연관이 있음을 보고하고 있다 (Rittie & Fisher, 2002). 즉, 주름 형성에 관해서는, 지금까지 피부의 주요 구성성분인 콜라겐의 합성, 분해 등의 기초적인 생리 대사 변화를 검토한 결과가 다수 보고되고 있다(Lavker R.M.,Cutaneous aging: chronological versus photoaging.In:Gilchrest B.A.(ed).photodamage.USA: Blackwell science,Inc.,123-135(1995)).

따라서, 내인성 및 외인성 피부 노화를 방지하기 위해서는 피부 섬유아세포에서 콜라겐의 합성을 촉진시킬 필요가 있다.

일반적으로 콜라겐 합성을 촉진하는 종래의 물질로는 레티노이드(RE36068), TGF-β(Transforming growth factor), 베툴린산(JP8-208424)등이 알려져 있으며, 이외에도 다양한 천연물들이 콜라겐 합성을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

하지만, 레티노이드는 불안정한 화합물로 소량만을 피부에 적용하여도 자극이 나타난다는 단점을 가진다. 또한, 대부분의 천연물 유래의 원료들은 단순추출물의 형태로 사용되어 왔고, 그 추출물들이 보이는 효능이 정확하게 어떤 물질에 의한 것인지 밝혀지지 않아 그 추출물의 활성을 지속적으로 유지, 제어하기가 어려운 것이 현실이다.

따라서, 피부 자극이 적은 천연물 중에서 피부주름개선에 효과를 보이는 유효 성분을 밝혀낼 필요가 있다.

한편, 에스쿨레틴은 쿠마린 유도체로서 식물 중에 광범위하게 존재한다. 에스쿨레틴이 항산화, 항염증, 항암효과 등의 생리적 활성을 가진다는 것이 보고된 바 있다 (Kaneko et al., 2003; Kim et al., 2008; Lee et al., 2007). 또한, 에스쿨레틴은 장염의 동물모델에서 리폭시게나제 활성을 억제하고 염증을 감소시킨다 (Fylaktakidou et al., 2004; Witaicenis et al., 2010).

그러나 에스쿨레틴의 콜라겐 합성 촉진 효과에 대해서는 보고된 바 없으며, 이에 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명자는 주름 개선 또는 항노화 활성이 있는 천연물 유래의 물질을 연구하던 중 쿠마린 유도체인 에스쿨레틴이 상기와 같은 활성이 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1의 화합물을 유효 성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 유효 성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화용 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 화학식 1의 화합물은 콜라겐 합성을 촉진하므로 피부 탄력 증진 효과 및 항노화 활성이 우수하며 특히 주름 개선 효과가 탁월하여 화장료 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있다.

도1은 에스쿨레틴이 인간 섬유아세포에서 I형 프로콜라겐 발현을 증가시키는 효과를 나타낸 것이다.
도2는 에스쿨레틴이 전사 수준에서 I형 프로콜라겐 발현을 증가시키는 효과를 나타낸 것이다.
도3은 에스쿨레틴이 인간 섬유아세포에서 MAPK와 PI3K/Akt 경로를 활성화시키는 효과를 나타낸 것이다.
도4는 에스쿨레틴이 MAPK와 PI3K/Akt 경로를 통하여 I형 프로콜라겐의 발현을 증가시키는 효과를 나타낸 것이다.
도5는 에스쿨레틴이 인간 섬유아세포에서 전사인자 Sp1의 발현을 증가시키는 효과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명에 대해서 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 에스쿨레틴은 하기 화학식으로 표시된다.

[화학식 1]

에스쿨레틴의 정식 화학명은 6,7-디히드록시-2H-1-벤조피란-2-온(6,7-디히드록시쿠마린 또는 시코리게닌으로도 공지됨)이다.

상기 에스쿨레틴은 일반적으로 구매 가능한 물질이거나, 공지의 합성 방법을 이용하여 제조될 수 있으며 쑥 등의 식물로부터 분리 정제하여 얻을 수 있다.

상기 에스쿨레틴을 유효성분으로 함유하는 조성물은 항노화 활성이 우수하며 특히 주름 개선, 예방 또는 치료 효과가 탁월하다.

구체적으로 에스쿨레틴을 유효성분으로 함유하는 조성물은 I형 프로콜라겐의 합성을 유도함으로써 콜라겐의 합성을 촉진한다.(<실시예 1, 2> 참조)

피부의 진피층에서 섬유아세포는 II형 프로콜라겐과 다른 세포외기질 단백질은 물론이고 주로 I형 프로콜라겐을 합성하고 분비한다. I형 프로콜라겐은 두 개의 α1 사슬과 한 개의 α2 사슬로 이루어지는데, 이 사슬들은 서로 다른 유전자인 COL1A1과 COL1A2에 의해 각각 만들어진다 (Shoulders & Raines, 2009). 분비된 프로콜라겐들은 아미노말단과 카르복시말단에 부가적인 펩타이드를 가지고 있는데, 이것은 세포외 공간에서 단백질 분해효소에 의하여 잘리게 된다. 결과적으로 생긴 트로포콜라겐은 삼중 나선 구조를 가진 성숙한 콜라겐으로 만들어지게 된다 (Shoulders & Raines, 2009).

I형 프로콜라겐의 mRNA와 단백질 수준이 젊은 사람의 피부에서보다 나이든 사람의 피부에서 유의하게 낮다는 것이 보고된 바 있다 (Chung et al., 2001; Varani et al., 2000; Varani et al., 2006). 또한, 세포 하나당 I형 프로콜라겐의 mRNA와 단백질 합성량이 젊은 사람에서 유래된 피부 섬유아세포보다 나이든 사람의 피부 섬유아세포에서 감소되어 있었다 (Takeda et al., 1992; Varani et al., 2006). 또한, 피부 섬유아세포의 수가 나이가 들면서 감소한다는 보고도 있다 (Varani et al., 2000). 이러한 연구들은 노화에 따른 피부 섬유아세포에서의 수 감소와 I형 프로콜라겐의 발현 감소가 피부 콜라겐 함량 감소와 궁극적으로 피부노화의 핵심적인 기전임을 시사하며, 이에 본 발명자는 에스쿨레틴과 I형 프로콜라겐과의 관계를 연구하던 중 본 발명을 완성하게 되었다.

또한 발명자는 에스쿨레틴을 유효성분으로 함유하는 조성물이 콜라겐 합성을 촉진하는 기전을 추가적으로 확인하였다.

구체적으로 I형 프로콜라겐의 합성에는 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 PI3K(phosphatidiylinositol 3-kinase)/Akt 경로가 관여한다.

MAPK는 ERK(extracllular-regulated protein kinase)1/2, p38, JNK(Jun-N-terminal kinase)를 포함하는데 이들은 상부의 MAPK 활성화 효소에 의해 트레오닌과 타이로신 잔기가 인산화되면서 활성화된다. MAPK 활성화 효소들 중에서 MEK1/2, MKK3/6, MKK4/7가 각각 ERK1/2, p38, JNK를 인산화시키고 활성화시키는 것으로 알려져 있다 (Pearson et al., 2001). PI3K는 Akt와 PDK(Pyruvate dehydrogenase kinase)1을 세포막으로 불러들이며, PDK1이 Akt를 인산화시키고 활성화시킨다 (Leevers et al., 1999).

본 발명의 일실시예에서는 인간 섬유아세포에 에스쿨레틴을 처리하였을 때, ERK1/2, p38, JNK 뿐만 아니라 Akt의 인산화가 증가되는 것이 확인되었으며 특히 에스쿨레틴 처리 후 15분 정도에 분명하게 관찰되었다 (도 3).

또한, MAPK 활성화 효소(MEK1/2) 및 PI3K 효소가 활성화되었을 때, 섬유아세포에서 I형 프로콜라겐의 합성이 증가됨을 확인하였다 (도 4).

따라서, 에스쿨레틴이 MAPK와 PI3K/Akt 경로를 활성화시킴으로써 I형 프로콜라겐의 발현을 증가시킴을 알 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 에스쿨레틴의 I형 프로콜라겐 합성 효과

농도에 따른 에스쿨레틴의 I형 프로콜라겐 합성 효과를 알아보기 위해 웨스턴 블롯팅의 방법으로 측정하였다.

에스쿨레틴은 Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.

인간 피부 섬유아세포는 피부에서 분리한 후, 100 mm dish를 이용하여 10% 우태아혈청, 페니실린 (100 units/ml)과 스트렙토마이신 (100 units/ml) (Life technologies, Grand Island, NY, USA)을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에서 5% CO₂ 존재 하에 37^oC에서 배양하였다.

0 내지 100㎍/㎖의 에스쿨레틴으로 8시간동안 처리한 섬유아세포는 RIPA 완충액 (150 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 1% Tween-20, 1% sodium deoxycholate and 0.1% SDS with 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 mg/ml aprotinin, 10 mg/ml leupeptin and 1 mg/ml pepstatin)에서 용해시켰다. 섬유아세포 용해액에서 단백질을 추출하여 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로스 막으로 이동시킨 후, I형 프로콜라겐에 대한 항원-특이적 일차항체를 붙였다. I형 프로콜라겐에 대한 항체(#sc-25974)는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.

그 후 항원-항체 덩어리를 증폭 화학형광(Amersham Bioscience, Boston, MA, USA)으로 검출하여 섬유아세포에서 I형 프로콜라겐의 생성을 확인하였다.

β-액틴은 단백질 양에 대한 대조군으로 사용하였다.

얻어진 결과는 도1A에 나타내었다.

도1A를 보면 에스쿨레틴으로 처리한 섬유아세포에서 농도 의존적으로 I형 프로콜라겐의 생성이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

도1B는 도1A에서 얻어진 결과를 덴시토메트리를 이용하여 정량분석한 그래프이다. 도1B를 보면 10㎍/㎖의 에스쿨레틴을 처리한 경우 대조군에 비해 I형 프로콜라겐 양이 약 20배 증가하였으며, 100㎍/㎖의 에스쿨레틴을 처리한 경우 대조군에 비해 I형 프로콜라겐 양이 약 25배 증가하였음을 알 수 있다.

상기 결과를 통하여 에스쿨레틴이 농도 의존적으로 I형 프로콜라겐의 생성을 증가시킴을 알 수 있었다.

<실시예 2> 에스쿨레틴의 I형 프로콜라겐 합성 효과

처리시간에 따른 에스쿨레틴의 I형 프로콜라겐 합성 효과를 알아보기 위해 웨스턴 블롯팅의 방법으로 측정하였다.

100㎍/㎖의 에스쿨레틴으로 섬유아세포를 0 내지 24시간동안 처리하는 것을 제외하고는 상기 실시예1과 동일한 방법으로 시행하였다.

얻어진 결과는 도1C에 나타내었다.

도1C를 보면 100㎍/㎖의 에스쿨레틴으로 처리한 섬유아세포에서 2시간 이내에 I형 프로콜라겐이 생성되었으며, 시간 의존적으로 I형 프로콜라겐의 생성이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

도1D는 도1C에서 얻어진 결과를 덴시토메트리를 이용하여 정량분석한 그래프이다. 도1D를 보면 100㎍/㎖의 에스쿨레틴을 처리한 후 2시간에서 대조군에 비해 I형 프로콜라겐 양이 약 40배 증가하였으며, 24시간 후에는 대조군에 비해 I형 프로콜라겐 양이 약 80배 증가하였음을 알 수 있다.

상기 결과를 통하여 에스쿨레틴이 시간 의존적으로 I형 프로콜라겐의 생성을 증가시킴을 알 수 있었다.

<실시예 3> 에스쿨레틴이 전사 수준에서 I형 프로콜라겐 발현에 미치는 효과

에스쿨레틴이 I형 프로콜라겐 발현을 전사 수준에서 증가시키는지를 알아보기 위하여, 에스쿨레틴을 처리한 인간 섬유아세포에서 COL1A1과 COL1A2 전사물의 양을 노던 블롯팅으로 측정하였다.

에스쿨레틴과 인간 섬유아세포는 실시예 1과 동일한 것을 사용하였다.

0 내지 100㎍/㎖의 에스쿨레틴으로 8시간동안 처리한 섬유아세포는 TRIzol 용액 (Life technologies, Grand Island, NY, USA)에 부유시킨 후 클로로포름을 첨가하여 용해하였다. 용해액을 12,000 x g로 4℃에서 15분간 원심분리 후 상층액에 동량의 이소프로파놀을 첨가하여 RNA를 침전시켰으며, 침전된 RNA를 에탄올로 한 번 씻은 후에 DEPC 용액에 녹여 총 RNA를 추출하였다.

추출된 40 mg의 총 RNA를 1% 포름알데히드 아가로즈 젤에서 전기영동 한 후에 나일론 막으로 이동시켰다. RNA에 COL1A1과 COL1A2에 대한 DNA 프로브를 붙인 후, 필름에 감광시켜 COL1A1과 COL1A2 전사물의 양을 노던 블롯팅으로 측정하였다.

COL1A1과 COL1A2에 대한 DNA 프로브는 일본의 Dokkyo University School of Medicine의 Dr. Atsushi Hatamochi로부터 받아서 사용하였다 (Ikeda et al., 2008).

얻어진 결과는 도 2AB에 나타내었으며 에스쿨레틴이 COL1A1 전사물의 양을 농도-의존적으로 증가시킴을 확인하였다 (도 2A). 그러나 COL1A2 전사물의 양에는 유의한 변화가 없었다 (도 2B). 이러한 데이터는 에스쿨레틴이 주로 COL1A1의 전사를 증가시킴으로써 I형 프로콜라겐의 발현을 증가시킨다는 것을 시사한다.

<실시예 4> 에스쿨레틴이 MAPK와 PI3K/Akt 경로에 미치는 효과

에스쿨레틴이 MAPK와 PI3K/Akt를 활성화하는지 알아보기 위해 웨스턴 블롯팅의 방법으로 측정하였다.

인간 섬유아세포에 에스쿨레틴을 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후, p-ERK1/2 (A), p-p38 (B), p-JNK (C), p-Akt (D)에 대한 항체를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 시행하였다.

p-ERK1/2 (#9106), p-p38 (#9211), p-JNK (#9251), p-Akt (#4060) 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.

β-액틴은 단백질 양에 대한 대조군으로 사용하였다.

얻어진 결과는 도3에 나타내었다.

도3을 보면 인간 섬유아세포에 에스쿨레틴을 처리하였을 때, ERK1/2, p38, JNK 뿐만 아니라 Akt의 인산화가 증가되는 것이 관찰되었으며 특히 에스쿨레틴 처리 후 15분 정도에 분명하게 관찰되었다. 이러한 결과는 에스쿨레틴이 인간 섬유아세포에서 MAPK와 PI3K/Akt 경로를 활성화시킨다는 것을 시사한다.

<실시예 5> MAPK와 PI3K/Akt 경로가 에스쿨레틴에 의한 I형 프로콜라겐 발현 증가에 미치는 효과

에스쿨레틴의 MAPK와 PI3K/Akt 경로를 통한 I형 프로콜라겐 합성 효과를 알아보기 위해 웨스턴 블롯팅의 방법으로 측정하였다.

에스쿨레틴과 인간 섬유아세포는 실시예 1과 동일한 것을 사용하였다.

인간 섬유아세포에 U0126 (MEK1/2 저해제) (A), SB203580 (p38 저해제) (B), SP600125 (JNK 저해제) (C), LY294002 (PI3K 저해제) (D)을 20 mM 농도로 처리하였다. 1시간 후에 에스쿨레틴을 100 ㎍/㎖ 농도로 첨가하였다. 세포를 시간별(0 내지 24시간)로 수확한 후 I형 프로콜라겐 항체를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯 분석을 시행하였다. β-액틴은 단백질 양에 대한 대조군으로 사용하였다.

얻어진 결과는 도4에 나타내었다.

도4를 보면 에스쿨레틴은 DMSO 존재하에서는 I형 프로콜라겐의 단백질 수준을 크게 증가시키지만 U0126, SB203580, SP600125, LY294002 존재하에서는 그 증가가 크게 둔화되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 에스쿨레틴이 MAPK와 PI3K/Akt 경로를 활성화시킴으로써 I형 프로콜라겐의 발현을 증가시킨다는 것을 시사한다.

<실시예 6> 에스쿨레틴이 전사인자 Sp1에 미치는 효과

에스쿨레틴이 COL1A1의 전사를 증가시켰으므로 (실시예 3), 이러한 현상을 매개하는 전사인자가 무엇인지 알아보고자 하였다. 이를 위해 PubMed 데이터베이스로부터 인간 COL1A1 유전자의 프로모터 지역에 대한 염기서열 정보를 얻고, AliBaba2 프로그램을 사용하여 전사시작 부위로부터 2 kb 이내의 프로모터 지역을 분석하였다. 분석 결과, 61개의 전사인자에 대한 잠정적인 결합서열이 프로모터 상에서 발견되었는데, 그 중에서도 Sp1에 대한 결합서열의 발생빈도가 가장 높았다 (도 5A). 이러한 결과는 에스쿨레틴이 전사인자 Sp1을 활성화시킴으로써 COL1A1의 전사를 증가시킬 수 있음을 시사한다.

에스쿨레틴이 Sp1의 발현을 증가시키는지를 알아보기 위하여, 웨스턴 블롯팅의 방법으로 측정하였다.

에스쿨레틴과 인간 섬유아세포는 실시예 1과 동일한 것을 사용하였다.

인간 섬유아세포에 에스쿨레틴을 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후, 항-Sp1 항체를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 시행하였다.

항-Sp1 항체(#sc-14027)는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.

β-액틴은 단백질 양에 대한 대조군으로 사용하였다.

얻어진 결과는 도5에 나타내었다.

도5를 보면 에스쿨레틴을 인간 섬유아세포에 처리하고 2시간 이내에 Sp1의 단백질 수준이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다 (도 5B). 이러한 결과는 에스쿨레틴이 전사인자 Sp1의 발현을 증가시킴으로써 COL1A1의 전사를 증가시킬 수 있음을 시사한다.

Claims (5)

1. 하기 화학식 1의 화합물을 유효 성분으로 포함하며, I형 프로콜라겐의 발현을 증가시켜 콜라겐 합성을 촉진시키는 화장료 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 I형 프로콜라겐의 발현의 증가는 COL1A1의 전사를 증가시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 I형 프로콜라겐의 발현의 증가는 전사인자 Sp1의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 I형 프로콜라겐의 발현의 증가는 MAPK와 PI3K/Akt 경로를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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