DE3927286A1 - Waessrige enzym-fluessigformulierungen - Google Patents

Waessrige enzym-fluessigformulierungen

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Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft wäßrige Enzym-Flüssigformulierungen in Form unmittelbar anwendungsfähiger Präparate, insbesondere von Enzymen mit proteolytischer Aktivität wie z.B. dem pankreatischen Komplex.
Stand der Technik
Enzymatische Flüssigpräparate haben eine gewisse Vorzugsstellung in der Praxis der Enzymanwendung erlangt. Ein wichtiger Gesichtspunkt war dabei die Sicherheit (vgl. H.J. Rehm + G.Reed Ed. Biotechnology, Vol., 7a "Enzyme Technology", S. 722, 731, VCH 1987).
Flüssige Enzympräparationen haben den unbestreitbaren Vorteil, staubfrei zu sein und daher die Gefahr allergischer Reaktionen zu verringern. Auf der anderen Seite wächst das Risiko der mikrobischen Verunreinigung, so daß wäßrige Enzym-Flüssigformulierungen in der Regel mit einem Konservierungsmittel versehen sind oder einen Träger enthalten, der die "Wasseraktivität" für mikrobiologisches Wachstum herabsetzt.
Ein weiterer, anwendungstechnischer Vorteil liegt in der besseren Dosierbarkeit flüssiger Präparationen verglichen mit den festen Präparationen des Standes der Technik.
Die mikrobiologische Kontamination ist jedoch nicht die einzige Ursache für die Verschlechterung der Qualität von Enzymen in Flüssigformulierungen über einige Zeit hin. Sobald proteolytische Enzyme im Spiel sind, sei es als hautpsächliches Enzym oder als Verunreinigung, ist mit Selbstverdauung der Enzyme zu rechnen. Der damit verbundene, meist schnelle Aktivitätsverlust ist bei Anwesenheit von Pankreasproteasen besonders hoch und ist auch mit sehr geringer Wasseraktivität kaum umgehbar. Ein Ausweg bietet sich in der kovalenten Fixierung von Proteasen an Trägern an. Abgesehen vom hohen Preis trägergebundener Enzyme setzt aber eine sinnvolle Anwendung immobilisierter Enzyme die relative Beweglichkeit der abzubauenden Substrate voraus, die z.B. bei der Anwendung auf dem Ledergebiet nur in unzureichendem Maße gegeben ist.
Dagegen werden nicht kovalent gebundene, etwa in Mikrokapseln, Fäden und vernetzten Polymergelen eingeschlossene Enzymgemische in ähnlicher Weise wie die löslichen Enzyme autolytisch zersetzt bzw. von Proteasen gespalten (vgl. Ullmanns Encyklopädie der techn. Chemie, 4. Auflage, Bd. 10, S. 544, Verlag Chemie 1975).
Die Probleme bei der Aufarbeitung von Pankreas werden noch dadurch verschärft, daß gerade Pankreassäfte wegen ihres zoogenen Ursprungs von vorneherein hoch mit Keimen beladen sind.
Im Verdauungssystem spielen, wie bekannt, Enzyme verschiedener Wirkungsrichtungen zusammen.
Die gemeinhin technisch verwendeten Pankreasprotease- Präparate stellen daher Gemische von Trypsin (E.C.3.4.21.4.), Chymotrypsin (E.C.3.4.4.5.) und verschiedenen Peptidasen (z.B. E.C.3.4.4.7) in fester Form dar, die als Begleitenzyme Amylase (E.C.3.2.1) und Lipase (E.C.3.1.1.3) enthalten können. Derartige Präparate werden meistens durch Salzfällung von frischem Pankreasdrüsen-Preßsaft oder aus Rückständen der Insulingewinnung hergestellt. Durch äußerst schonende Dehydratisierung der ganzen Drüsen wird das sogenannte Pankreatin gewonnen, in dem die Proteasen überwiegend in Form von inaktiven Vorstufen vorliegen und das einen besonders hohen Lipaseanteil aufweist. Solche Präparate müssen vor der Verwendung zunächst aktiviert werden, z.B. durch Autolyse, durch Zusatz von Enterokinase oder saure Pilzproeinasen u.ä. (vgl. Ullmanns Encyklopädie der techn. Chemie, 4. Auflage, Bd. 10, S. 515-537, Verlag Chemie 1975; Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology 3rd Ed. Vol. 9, S. 173-224, Wiley-Interscience 1980).
Der Wunsch, wäßrige Enzym-Flüssigformulierungen mit deren beträchtlichen Vorteilen zur Verfügung zu haben unter gleichzeitiger Vermeidung der Nachteile wie Aktivitätsverlusten und von Kontamination, hat zu verschiedenen Lösungsversuchen geführt, beispielsweise zum Verschneiden mit organischen Lösungsmitteln (DE-A 18 08 834, HU-PS 2 642, DDR-PS 10 058), bzw. zu nicht­ wäßrigen Flüssigformulierungen.
Bislang ist ein in jeder Hinsicht überzeugender Erfolg speziell bei Enzymen mit proteolytischer Aktivität und inbesondere bei pankreatischen Enzymen nicht zu verzeichnen gewesen (vgl. DE-A 37 04 465, US-A 37 41 902).
Die Nachteile bei Flüssigformulierungen in organischen Medien liegen darin, daß man die Präparation der Enzyme in trockener Form kaum umgehen kann und daß die geeignetsten organischen Medien wie z.B Propylencarbonat unverhältnismäßig teuer sind.
Aufgabe und Lösung
Es bestand demnach nach wie vor die Aufgabe, wäßrige Flüssigformulierungen mit ausreichender Stabilität von proteolytisch wirksamen Enzymen, insbesondere des prankreatischen Komplexes zur Verfügung zu stellen. Dabei war einerseits auch auf Umweltunbedenklichkeit zu achten, andererseits sollte z.B im Hinblick auf die industrielle Anwendung, insbesondere in der Lederindustrie, keine zu hohe Kostenbelastung daraus erwachsen.
Es wurde nun gefunden, daß die bestehende Aufgabe in sehr günstiger Weise durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von wäßrigen Enzym-Flüssigformulierungen besteht darin, daß die in wäßrigem Milieu vorliegenden Enzyme in an sich bekannter Weise in feiner Verteilung gefällt werden und durch Dichteangleichung in wäßrigem Milieu ein absatzstabiler, feindispergierter Zustand der Enzyme hergestellt wird.
Wie bereits ausgeführt, empfiehlt sich das Verfahren zur Anwendung bei wäßrigen Enzympräparationen von Proteasen, von Enzymkomplexen mit proteolytischer Wirkung und von Enzymen wie Amylasen, Lypasen usw. mit proteolytischer Begleitaktivität. Besonders genannt sei der prankreatische Komplex (Pankreatin).
Die Enzyme
Unter Enzymen mit proteolytischer Aktivität seien zunächst die Endopeptidasen ("Proteasen" E.C.3.4.) verstanden, wobei im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung insbesondere die technisch genutzten Enzyme von Interesse sind.
(Kirk-Othmer, loc.cit. Vol. 9, K. Aunstrup in B. Spencer Ed. Industrial Aspects of Biochemistry, Vol. 30 (I), pp 23-46, North Holland 1974.)
Man unterscheidet: Proteasen
  • a) tierischen Ursprungs, wie beispielsweise
    • α) Rennin (E.C.3.4.23.4)
    • β) Pankreas-Proteasen
      Pancreatin, insbesondere Trypsin, Chymotrypsin (pH-Wirkungsbereich ca. 7-10)
      Pepsin (E.C.3.4.23.1) (pH-Wirkungsbereich ca. 1,5-4,0)
      Kathepsin (E.C.3.4.23.5) (pH-Wirkungsbereich ca. 4,0-5,0).
  • b) pflanzlichen Ursprungs
    • α) Papain (E.C.3.4.22.1) pH-Wirkungsbereich ca. 5,0-8,0
    • β) Ficin (E.C.3.4.22.3) pH-Wirkungsbereich ca. 4,0-9,0
    • γ) Bromelain (E.C.3.4.22.4 und 3.4.22.5) pH-Wirkungsbereich ca. 5,0 bis 7,0
  • c) mikrobiellen Ursprungs (vgl. L. Keay in "Process Biochemistry", 1971, 17-21).
    • α) aus Bacillus-Arten wie B. subtilis, B. licheniformis, B. alkalophilus, B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides.
    • β) aus Streptococcus-Arten
    • γ) aus Streptomyces-Arten wie Streptomyces fradiae, S. Griseus, S. rectus
    • δ) aus Aspergillus-Arten wie Aspergillus flavus-oryzae, A. niger, A. saitori, A. usamii
    • ε) aus Mucor- und Rhizopus-Arten wie Mucor pusillus, M. mietrei
    • ζ) Endothia-Arten wie Endothia parasitica
    • η) aus Trametes-Arten wie Trametes sanguinea
Außer der Unterscheidung nach der Herkunft findet auch die Unterscheidung gemäß dem Angriffsort (Exo-versus-Endo- Enzyme) und aufgrund der "Acitve Site" der Proteasen (Serin-Proteasen, die durch DFP gehemmt werden, Sulfhydryl-Enzyme) Anwendung.
Weiter ist von erheblicher praktischer Bedeutung die pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität.
Man unterscheidet daher vor allem unter praktischen Gesichtspunkten
  • i) Alkalische Proteasen, mit Wirkungsoptimum etwa im Bereich von pH 7,5 bis 13,
    inbesondere alkalische Bakterienproteasen (E.C.3.4.21.) (die zumeist dem Serin-Typ angehören) und alkal. Pilzproteasen.
  • ii) Neutrale Proteasen, mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 6,0-9,0,
    insbesondere neutrale Bakterienproteasen (E.C.3.4.24) (die zu den Metalloenzymen gehören) und Pilzproteasen, beispielsweise Bacillus-Proteasen, Pseudomonas- Proteasen, Streptomyces-Proteasen, Aspergillus- Proteasen.
  • iii) Saure Proteasen mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 2,0-5,0 (E.C.3.4.23),
    insbesondere saure Pilzproteasen, z.B. aus Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium spp. Mucor spp. und Impex lacteus und Endothitia parasitica.
Zur Analyse technischer Produkte eignet sich Casein als Substrat (Methode nach LÖHLEIN-VOLHARD, KUNITZ, LASKOWSKI s. unten) oder Hämoglobin (Methode nach ANSON, s. unten) oder Gelatine (viskosimetrische Methode).
Üblicherweise wird die proteolytische Aktivität nach der Löhlein-Volhard-Methode (modifiziert nach TEGEWA in "Leder" 22, 121-126 (1971)) bestimmt. Dabei entspricht eine Löhlein-Volhard-Einheit (LVE) unter den Testbedingungen (1 Stunde, 37 Grad C) einer Enzymmenge, die in 20 ml Casein-Filtrat einen Anstieg an Hydrolyseprodukt entsprechend einem Äquivalent von 5,75×10-3 ml 0,1 n NaOH hervorruft.
Weiter ist die Bestimmung der proteolytischen Wirksamkeit der Enzyme nach der Anson-Hämoglobin-Methode (M.L.Anson, J. Gen. Physiol., 22, 79 (1939)) gebräuchlich.
Proteasen finden u.a. bei der Lederherstellung, in Waschmitteln und bei der Reinigung, in der Entschlichtung, bei der Käseherstellung, beim Fleischabbau und bei der Stabilisierung von Bier industrielle Anwendung. Weiter sind, wie bereits erwähnt, Enzymkomplexe mit proteolytischer Wirkung und Enzyme mit proteolytischer Begleitaktivität von Interesse.
Dazu gehören u.a. Amylasen, insbesondere α-Amylasen (vgl. Fischer und Stein in "The Enzymes", 2nd Ed., P.D. Boyer et al., Vol. IV, S. 313-34, Academic Press), die als technische Präparate in der Regel Proteasen als Begleitenzyme enthalten. Die α-Amylasen sind tierischen, pflanzlichen oder mikrobiologischen Ursprungs. Bevorzugte Quellen sind z.B. Pankreas-Amylasen, Bakterien- und Pilzamylasen.
Der pH-Wirkungsbereich von α-Amylasen verschiedener Provenienz (d.h. Amylasen, welche die α-1,4-Glycosid­ bindung innerhalb der Amylose bzw. des Amylopektins spalten) liegt im Bereich 3,5-9,0.
Die aus Pankreas gewonnene α-Amylase hat einen pH- Wirkungsbereich von 5,5-9,0 (pH-Optimum ca. 7,2), die aus Bakterien gewonnene hat einen Wirkungsbereich von 4,5 bis 8,5 (wobei das pH-Optimum für die verflüssigende α-Amylase bei 6,5-7,0, für die verzuckernde bei 4,8-5,2 liegt), die aus Pilzen hergestellte einen Wirkungsbereich von 3,5-7,0 (pH-Optimum 5,0) die aus Malz hergestellte einen solchen von 4,5 bis 7,0 (pH- Optimum 4,7) (vgl. Ullmann, loc.cit. Bd. 10, S. 507).
Stetig an Bedeutung gewonnen hat die Herstellung aus Bacillus-Arten, wie B. subtilis, B. mesentericus, B. polymixa, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, ferner aus Pilzen, insbesondere Aspergillus-Arten wie A. niger, A. phoenicis, A. oryzae, A. awamori, Mucor-Arten wie M. rouxianus, Rhizopus-Arten wie R. delemar, R. oryzae, R. Japonicus, und Endomyces-Arten wie E. fibuliger.
Amylasen finden u.a. Anwendung auf dem Ernährungssektor (vgl. H.-J. Rehm + G. Reed Ed., "Biotechnology" Vol. 5, Verlag Chemie 1983; B. Spencer, Ed. Industrial Aspects of Biochemistry; Vol. 30, part I, pp. 139-186, 213-260, Elseviers (1973)) in der Stärkeverflüssigung, Malzgewinnung, in der Ethanolgewinnung, Entschlichtung, in der Lederherstellung u.ä. Die Aktivität von -Amylasen unter Verwendung von Stärke als Substrat kann nach der Methode von Sandstedt, Kneen + Blish (Cereal Chem. 16, 172 (1939) und Technical Bulletin Nr. 1024, U.S. Dept. of Agriculture) bestimmt werden. Dabei ist 1 Amylaseneinheiten (=1 SKB-Einheit) diejenige Enzymmenge, die bei 30 Grad C und den im übrigen gegebenen Reaktionsbedingungen imstande ist, 1 g lösliche Stärke im Laufe von 1 Stunde zu dextrinieren.
Ferner wird die Methode von Willstätter zur Bestimmung der Aktivität der Pankreas-Amylase herangezogen (Hoppe- Seylers, Z. physiol. Chem. 126, 143 (1923). Dabei wird eine Willstätter-Amylase-Einheit als das Hundertfache derjenigen Enzymmenge definiert, die unter den gegebenen Versuchsbedingungen die Stärke mit einer solchen Geschwindigkeit spaltet, daß die monomolekulare Reaktionskonstante gleich 0,01 ist.
Weiter gehört in den Bereich des erfindungsgemäßen Verfahrens die Anwendung auf Lipasen (E.C.3.1.1.3) mit proteolytischer Begleitaktivität. Als Lipasen werden bekanntlich Carboxylesterasen bezeichnet, die Glycerinester in wäßriger Emulsion spalten.
Man unterscheidet dabei:
Pankreas-Lipasen, die im pankreatischen Enzymkomplex neben Esterasen, Proteasen und Amylasen als technisch wichtige Begleitenzyme enthalten sind. Das pH-Optimum (gegenüber Olivenöl) liegt im Bereich 7-8,5, der Aktivitätsbereich liegt bei pH 6,5-9,5.
Lipasen gelten i.a. als sehr instabil, insbesondere gegenüber proteolytischem Abbau durch Begleitproteasen.
Ferner:
Mikrobiologische Lipasen, z.B. aus Pseudomonas fragii, Aspergillus sp. (z.B. A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola languinosa, Mucor pusillus, Penicillium sp. (z.B. P. chrysogenum, P. oxalicum), Rhizopus sp. (R. nigericans, R. oryzae).
Diese Lipasen weisen in der Regel ein pH-Optimum bei pH < 7,0 auf.
In herkömmlicher Weise wird die Aktivitätsbestimmung von Lipasen mit Olivenöl als Substrat durchgeführt, ferner mit Triacetin und Tributyrin. (vgl. M. Semeriva et al. Biochemistry 10, 2143 (1971); Pharmaceutical Enzymes, edited by. R. Ruyssen and A. Lauwers 1978, (FIP)).
Soweit die fettspaltende Aktivität in Kilo-Lipase-Units (Einheit = KLCA) ausgedrückt wird, wird unter den Standardbedingungen: 40 Grad C, pH = 5,5 mit Tributyrin als Substrat gearbeitet (vgl. M. Semeriva, oben zitierte Literaturstelle). Lipasen finden, soweit ihre Instabilität dies zuläßt, Verwendung u.a. in der Abfallbeseitigung, der Lederindustrie und in der Ernährungsbranche.
Besonders bevorzugter Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der pankreatische Komplex. In der Pankreasdrüse macht der Trypsinogengehalt rd. 23 Gew.-%, der Chymotrypsingehalt rd. 10-14% des gesamten Proteingehalts aus.
Die hier speziell interessierenden Enzyme des pankreatischen Komplexes wurden bereits vorstehend charakterisiert. Aus dem Rinderpankreas lassen sich ferner die Enzyme Ribonuclease (E.C.2.7.7.16) Desoxyribonuclease (E.C.3.1.4.5) Chymotrypsinogen B und -Chymotrypsinogen sowie Trypsinogen isolieren.
Die Isolierung der Enzyme aus dem pankreatischen Komplex ist in der Literatur detailliert beschrieben worden (vgl. z.B. Ullmann, Bd. 10, loc.cit, S. 535-537).
Das Verfahren A. Isolation aus dem pankreatischen Komplex
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sich teilweise an Isolationsverfahren des Standes der Technik anlehnen (vgl. Ullman, Bd. 10, loc.cit. S. 536-537).
1. Extraktion
Die Isolierung geht vorteilhafterweise von Pankreasdrüsen unmittelbar nach der Schlachtung aus, vorwiegend vom Schwein oder vom Rind.
Man kann beispielsweise ca. 100 Pankreasdrüsen in einem Ansatz verarbeiten, indem man sofort nach der Schlachtung Fett und Bindegewebe so gut wie möglich von den Drüsen entfernt und dann das Drüsengewebe homogenisiert, z.B. mittels eines Fleischwolfs.
Unmittelbar daran anschließend wird zweckmäßig mit etwa dem doppelten Volumen (ca. 60 l) 0,25 n Schwefelsäure bei 5 Grad C 18-24 h extrahiert. Nach Zugabe von Filterflocken wird, vorteilhafterweise über eine Packmittelpresse abgepreßt. Die Preßplatten können verworfen werden.
2. Das Verfahren
Weitgehend fettfreier Preßsaft aus Pankreasdrüsen wird mit einer hohen Menge an Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat ("A-Salz") vorteilhaft durch schnelle Zugabe und bei Raumtemperatur gefällt. Die Zusatzmenge an festem, wasserfreiem A-Salz liegt vorteilhaft bei ca. 50± 2 Gew.-% bezogen auf den Preßsaft.
Es kann vorteilhaft sein, durch starkes Rühren (z.B. mittels eines Zahnscheibenrührers) das gefällte Gut bis zu einem feineren Verteilungsgrad zu zerschlagen. In vielen Fällen ist diese Maßnahme jedoch entbehrlich, da infolge der schnellen Zugabe des A-Salzes die Fällung der pankreatischen Enzyme ohnehin in feinverteilter Form erfolgt.
Zur Konfektionierung/Standardisierung des Produkts auf eine bestimmte gewünschte Aktivität wird bei Bedarf mit isotonischer A-Salzlösung (beispielsweise 38,3 kg A-Salz auf 61,7 kg Wasser) verdünnt. Durch Zugabe von festem A-Salz bzw. Wasser soll eine Dichte der wäßrigen Enzym­ präparation von 1,22 bis 1,23 eingestellt werden. Die Erfahrungen mit dem pankreatischen Komplex besagen, daß nur in einem engen Dichtebereich, nach allen vorliegenden Ergebnissen eben dem Dichtebereich 1,22 bis 1,23, die Enzymsuspension weitgehend absatzstabil bleibt.
Das Einhalten des erforderlichen, engen Dichtebereichs ist somit für die vorliegende Erfindung konstitutionell. Diese Regel gilt auch für Rohextrakte von Enzymen anderer Provenienz, wie sie oben dargestellt wurden.
3. Weitere Konfektionierung
Durch die erfindungsgemäße isotonische Einstellung der Kulturfiltrate, insbesondere der pankreatischen Ursprungs, gelingt es absetzstabile Formulierungen zur Verfügung zu stellen, die den Anforderungen für einen Zeitraum von Tagen bis Wochen zuverlässig gerecht werden, so daß in vielen Fällen die Voraussetzungen für die technische Anwendbarkeit erfüllt sind. Eine Beeinträchtigung der Absetzstabilität kann indessen durch Verdunsten der Trägerflüssigkeit (Wasser) bzw. starke Temperaturänderungen durch die damit verbundenen Dichteänderungen bzw. Dichteschwankungen eintreten. Es kann dann zum Brechen (Aufrahmen bzw. Absetzen) der Enzymsuspension kommen. Die weitergehenden Anforderungen der Praxis zielen jedoch auf völlig absatzstabile und homogene Enzympräparationen ab.
Überraschenderweise gelingt es nur durch Anwendung von mindestens einem Verdickungsmittel auf Xanthanbasis eine hinreichende Verdickung der stark elektrolythaltigen Enzymsuspensionen (mit z.B. 38,3 Gew.-% A-Salz-Gehalt) zu erreichen.
Bewährt hat sich insbesondere Xanthan (Polysaccharide B-1459, Keltrol F. Kelzan; vgl. Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd. Ed. Vol, 12, S. 62-66, J. Wiley + Sons 1980, Rees + Welch, Angew. Chemie 89, 228-239 (1977)) bzw. andere Verdickungsmittel auf Xanthanbasis. Beispielsweise ergibt die Verdickung mit einem speziell modifizierten Xanthanderivat (z.B. K1A96, anion. Heteropolysaccharid d. Fa. Kelco, San Diego, USA) bei einer Konzentration von 0,1 bis 5%, vorzugsweise 0,1 bis 1% bei einer 38,3 Gew.-% A-Salzlösung Viskositäten von 200 bis 1000 mPa×s.
In der Regel gibt die Verdickung mit einer 0,1 bis 5%igen (Gew.)-Lösung von Xanthan bzw. dessen Derivaten in einer Lösung von 38,3 Gew.-% festem A-Salz sehr gute Resultate, insbesondere wenn das Xanthan unter Scherung, beispielsweise sehr schnell (z.B. mit Umfangsgeschwindigkeiten von 1-5 m/sec) eingearbeitet wird. Diese Xanthan-Lösung ist zweckmäßig mit der zur Fällung verwendeten A-Salzlösung isotonisch. Sie kann direkt dem mit A-Salz gefällten Prankreas-Preßsaft zugesetzt werden um somit die gewünschte Enzym-Endaktivität einzustellen. Es wurde indessen gefunden, daß selbst bei nicht-isotonischen Bedingungen, z.B. im weiteren Dichtebereich 1-1,5 die erzielte Verdickung ausreicht, um absetzstabile Enzymformulierungen zu erhalten. Angemerkt sei, daß beim Verdünnen einer mit A-Salz gefällten Pankreas-Suspension mit der verdickten, isotonischen A-Salzlösung eine Viskositätsverminderung um ca. 50% eintritt. Es reicht die Restviskosität von 100- 500 mPa×s aus, daß völlig absetz- und aktivitätsstabile, homogene Enzympräparationen erhalten werden.
B. Isolierung aus anderen proteinasehaltigen Rohextrakten
Statt des Pankreas-Preßsafts können andere proteinasehaltige Kultursäfte, z.B. aus Pilz- oder Bakterienkulturen eingesetzt werden (vgl. die vorstehenden Angaben zu den Enzymvorkommen).
Weiter ist die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Kombination Pilzproteinase/Pankreasproteinase bzw. Bakterienprotease/Pankreasproteinase möglich. Hier gibt es z.B. zwei Möglichkeiten:
  • a) Man mischt die verschiedenen Kultursäfte bei 5 bis 10 Grad C und führt sofort eine Fällung mit A-Salz durch. Anschließend wird durch isotonische Verdünnung gegebenenfalls mit verdickter A-Salzlösung die gewünschte Endaktivität eingestellt.
  • b) Die Bakterien- bzw. Pilzproteinase-Präparation (A-Salz-Fällung) wird analog zur Pankreassuspension aber getrennt hergestellt. Anschließend wird die zur Pankreaspräparation isotonische Pilz- bzw. Bakterienproteinase-präparation zugegeben eventuell zur Standardisierung isotonisch verdünnt und gegebenenfalls mit verdickter isotonischer A-Salzlösung stabilisiert.
In beiden Fällen erhält man sowohl absetzstabile als auch aktivitätsstabile Formulierungen.
Bei sämtlichen Enzymsuspensionen ist aufgrund des hohen Elektrolytgehalts im allgemeinen keine mikrobiologisch wirksame Stabilisierung notwendig. Andererseits stehen der Zugabe herkömmlicher Konservierungsmittel (siehe Stand der Technik) keine technischen Gründe im Wege.
Für alle Enzyme gilt nach den bisher vorliegenden Erfahrungen, daß das Flüssigmedium einen Dichtebereich von 1,22 bis 1,23 besitzen soll, um Absatzstabilität zu erreichen.
Das gilt auch für die Endkonfektionierung mit Verdickungsmittel.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Bestimmung der Dichte wird durch exaktes Auswiegen einer definierten Volumenmenge im geeichten Maßzylinder bei 20 Grad C vorgenommen.
Die Bestimmung der Viskosität wird mit dem Brookfield- Viscosimeter ebenfalls bei 20 Grad C vorgenommen.
Beispiele Beispiel 1 Herstellung der isotonischen Lösung mit der Dichte 1,22 bis 1,23 g/cm3; 20 Grad C
In einem Rührbehälter werden 61,7 kg Leitungswasser vorgelegt und mit 38,3 kg wasserfreies Ammoniumsulfat versetzt. Man rührt so lange, bis sich die gesamte Salzmenge gelöst hat. Wird die Dichte von 1,22 bis 1,23 g/cm3 nicht erreicht, kann diese durch Salz- oder Wasserzugabe eingestellt werden.
Beispiel 2 Herstellung einer flüssigen, wäßrigen Enzymformulierung auf Basis Pankreasenzym
100 kg Preßsaft, mit der Aktivität 30 100 LVE, wie er nach dem Zermahlen, Aktivieren und Extrahieren der Pankreasdrüsen anfällt, wird in einem Rührbehälter vorgelegt und mit 50 kg Ammoniumsulfat versetzt. Es erfolgt die Ausfällung der Pankreasenzyme. Die Pankreasenzymsuspension (29 600 LVE), besitzt eine durchschnittliche Aktivität von 28 000-30 000 LVE/g (Dichte 1,22-1,23 g/cm3). Durch Zugabe der isotonischen Ammoniumsalzlösung aus Beispiel 1 kann jede gewünschte LVE-Aktivität eingestellt werden. Je verdünnter die Enzympräparation ist, desto schneller erfolgt eine Sedimentation des präzipierten Enzyms.
1000-3000 LVE: Sedimentation nach einigen Stunden bzw. Tagen,
3000-9000 LVE: Sedimentation nach einer Woche bzw. mehreren Wochen,
ab ca. 16 000 LVE: weitgehend sedimentationsstabil.
  • - Aktivitätsverlust der rein wäßrigen Pankreasenzymlösung nach 6 Wochen bei 25 Grad C: 81%
  • - Aktivitätsverlust der gefällten Enzymsuspension aus Pankreas nach 6 Wochen bei 25 Grad C: 8,9%.
Beispiel 3
100 kg einer wäßrigen klaren Lösung einer Pilzprotease aus Aspergillus parasiticus mit der Aktivität von 32 000 LVE, wird bei 16 Grad C mit 50 kg Ammoniumsulfat versetzt und dadurch die Enzyme gefällt. Die Enzymsuspension (31 400 LVE), mit der Dichte 1,22 bis 1,23 g/cm3, wird mit der isotonischen Ammoniumsulfatlösung aus Beispiel 1 auf die gewünschte Aktivität verdünnt. Man erhält Enzympräparationen, welche mehrere Tage absetzstabil sind.
Aktivitätsverlust der Enzymsuspension nach 6 Wochen Standzeit bei 25 Grad C: 4,3%.
Im Vergleich:
Aktivitätsverlust der reinwäßrigen Pilzprotease (ohne Fällung) nach 6 Wochen Standzeit bei 25 Grad C: 62%.
Beispiel 4
50 kg flüssiger Pankreassaft (aus Beispiel 2), mit der Aktivität 30 100 LVE und einer Temperatur von 10 Grad C, und 50 kg flüssiger Pilzproteasensaft (aus Beispiel 3) mit der Aktivität 32 000 LVE und der Temperatur 10 Grad C, werden in einem Rührkessel gemischt. Unmittelbar nach dem Mischen werden zügig 50 kg Ammoniumsulfat unter Rühren zugegeben und dadurch die Enzyme ausgefällt. Man erhält eine Enzymsuspension mit der Aktivität 61 200 LVE. Die Dichte liegt zwischen 1,22 und 1,23 g/cm3. Durch Verdünnen mit isotonischer Ammoniumsulfatlösung aus Beispiel 1, kann die gewünschte Aktivität eingestellt werden.
Aktivitätsverlust der Enzymmischung (ohne Fällung) nach 6 Wochen bei 25 Grad C: 74%.
Aktivitätsverlust der Enzymsuspension (gefällt) nach 6 Wochen bei 25 Grad C: 10,1%.
Beispiel 5
50 kg flüssige wäßrige Bakterienprotease (43 200 LVE, 10 Grad C) aus Bacillus licheniformis und 50 kg flüssiger Pankreaspreßsaft aus Beispiel 2 (31 100 LVE, 10 Grad C), werden in einem Rührkessel vermischt und mit 50 kg Ammoniumsulfat versetzt. Dadurch werden die Enzyme ausgefällt. Man erhält eine Enzymsuspension mit einer Aktivität von 35 400 LVE. Diese hat eine Dichte von 1,22-1,23 g/cm3 und kann durch Verdünnen mit isotonischer Ammoniumsulfatlösung (Beispiel 1) auf die gewünschte Aktivität eingestellt werden. Nach 6-wöchigem Stehen bei 25 Grad C, ist die Aktivität um 12% abgefallen. Im Gegensatz dazu, ist die Aktivität einer nicht gefällten Enzymmischung unter gleichen Bedingungen um 88% abgefallen.
Beispiel 6
  • a) 3 kg Pankreasenzymfällung (Dispersion aus Beispiel 2 mit der Aktivität 29 600 LVE/g) wird mit 26,6 kg isotonischer Ammoniumsulfatlösung vermischt. Man erhält eine für 3 Tage absetzstabile Enzymsuspension mit der Aktivität 3000 LVE. Das Produkt verliert nach 6 Wochen Standzeit bei 25 Grad C 8,7% an Aktivität.
  • b) 3 kg Pilzproteasefällung (Dispersion aus Beispiel 3 mit der Aktivität 31 400 LVE/g) wird mit 28,4 kg isotonischer Ammoniumsulfatlösung vermischt. Man erhält eine für 4 Tage absetzstabile Enzymsuspension mit der Aktivität 3000 LVE. Diese hat nach 6 Wochen Standzeit 5,5% an Aktivität verloren.
30 kg Pankreasproteasesuspension aus Beispiel 6a, mit der Aktivität 3000 LVE, werden mit ebenfalls 30 kg Pilzproteasedispersion aus Beispiel 6b, mit der Aktivität 3000 LVE, versetzt. Die Mischung besitzt eine Aktivität von 3000 LVE und eine Dichte von 1,22 g/cm3. Nach 6-wöchigem Stehen bei 25 Grad C, ist die Aktivität um 9,8% abgefallen. Im Vergleich dazu verliert eine nicht gefällte Mischung der gleichen Enzyme unter entsprechenden Bedingungen 88% an Aktivität.
Beispiel 7 Herstellung einer völlig absetzstabilen, sofort gebrauchsfähigen, gut fließenden wäßrigen Enzympräparation
  • a) In einem Rührkessel werden 60,7 kg Wasser vorgelegt und mit einem Zahnscheibenrührer (Umfanggeschwindigkeit 2-3 m/s) werden 1 kg eines Verdickungsmittels auf Xanthanbasis eingearbeitet (z.B. K1A96, Fa. Kelco). Ist die Viskosität der Lösung auf < 1000 mPa×s angestiegen, werden 38,3 kg Ammoniumsulfat zugegeben. Man rührt so lange, bis sich das Ammoniumsulfat weitgehend gelöst hat. Die Viskosität fällt dabei auf 480 mPa×s ab.
  • b) 3 kg der gefällten Enzymsuspension aus Beispiel 4 (61 200 LVE; Pilzenzym) wird nun zu 58,2 kg der verdickten Ammoniumsulfatlösung aus Beispiel 7a) gegeben und mit dem Zahnscheibenrührer homogen vermischt. Man erhält eine völlig absetzstabile Enzymsuspension mit der Aktivität 3000 LVE und einer Viskosität von 270 mPa×s. Beobachtet man bei einer nicht gefällten Enzymmischung nach 6 Wochen Stehen bei 25 Grad C einen Aktivitätsabfall von 74%, zeigt die entsprechende verdickte Enzymsuspension lediglich 9,2% Aktivitätsverlust.

Claims (15)

1. Verfahren zur Herstellung wäßriger Flüssigformulierungen von proteolytisch wirksamen Enzymen mit ausreichender Stabilität, dadurch gekennzeichnet, daß die in wäßrigem Milieu vorliegenden Enzyme in feiner Verteilung gefällt werden, worauf durch Dichteangleichung in demselben wäßrigen Milieu ein absetzstabiler feindisperser Verteilungszustand der Enzyme hergestellt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in wäßrigem Milieu vorliegenden Enzyme im wesentlichen Proteasen (E.C.3.4) darstellen.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme mikrobiologischen Ursprungs sind.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in wäßrigem Milieu vorliegenden Enzyme Hydrolasen aus der Gruppe der Amylasen (E.C.3.2.1) und Lipasen (E.C.3.1.1.3) mit proteolytischer Begleitaktivität darstellen.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die in wäßrigem Milieu vorliegenden Enzyme dem pankreatischen Komplex angehören.
6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die in wäßrigem Milieu vorliegenden Enzyme in Form von Extrakten aus der üblichen Enzymgewinnung eingesetzt werden.
7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zur feinen Verteilung führende Fällung durch Zusatz von Inert-Salz bewirkt wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Fällung mit Ammonsulfat oder Natriumsulfat bewirkt wird.
9. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die durch Angleichung erreichte Dichte des wäßrigen Milieus im Bereich 1,22 bis 1,23 liegt.
10. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur weiteren Absatzstabilisierung der feinverteilten Enzymsuspension Verdickungsmittel auf Xanthanbasis zugesetzt werden.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Verdickungsmittel auf Xanthanbasis in Form einer wäßrigen, isotonischen Ammonsulfat- oder Natriumsulfat-enthaltenden Lösung zugesetzt werden.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Verdickungsmittel auf Xanthanbasis- enthaltende Lösung durch Einrührung unter Einwirkung von Scherkräften hergestellt wurde.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Verdickungsmittel auf Xanthanbasis 0,1 bis 1 Gew.-% der Lösung betragen.
14. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß Mischungen von Enzymen verschiedener Herkunft gemeinsam gefällt und aufgearbeitet werden.
15. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß getrennt hergestellte Enzymsuspensionen zu stabilen Formulierungen gemischt werden.
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