JPH01104171A - α−１・６−グルコシダーゼの安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はα−１，６−グルコシダーゼの安′、ｌ　”ｉ
　ｈ法に関するものである。

（従来技術） α−１，６−グルコシダーゼは澱粉またはこの派生物中
の　α−１，６−グルコシド結合あるいは（ｒｉよび）
プルランのα−１，６−グルコシド結合などを加水分解
する酵素の総称であり、その基質特異性の差からプルラ
ナーゼあるいはインアミラーゼと呼ばれる酵素がある。

α−１，６−グルコシダーゼはβ−アミラーゼと併用し
て、澱粉からマルトースを収量よく製造するのに使用し
たり、また、最近、酵素法による澱粉からのグルコース
の製造において、グルコアミラーゼと併用して、グルコ
ースを増収する目的に使用されている。

（発明が解決しようとする問題点） α−１，６−グルフシダーゼは、バシルス属、クレプシ
ラ属、シュードモナス属など、種々の細菌や、ストレプ
トマイセス属などの放線菌により生産されることが知ら
れているが、一部の微生物の生産するものを除き、一般
に、耐酸性や耐熱性などの安定性に劣ることが問題であ
った。特に、本酵素をグルコアミラーゼと併用する場合
、グルコアミラーゼは、工業的には、ｐＨ４〜５、温度
約６０°Ｃで２〜３日間使用されるため、このような酸
性と高温で長時間、活性を保持できるプルラナーゼは少
なく、これまで、バシルス・アンドプルリティカス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ
）のプルラナーゼが知られているのみである（特公昭６
２−２５０３６　　はか）。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は、従来知られているα−１，６−グルコシダ
ーゼの安定化法について、鋭意、研究を行ってきた結果
、α−１，６−ゲルコジダー論を用いる反応を、アルミ
ニウム塩の存在下で行うと、該酵素の安定性が著しく向
上できることを認めた。本発明はこの知見に基づいてな
されたものである。

すなわち、本発明は、α−１，６−グルコシダーゼを用
いる反応を、アルミニウム塩の存在下で行うことを特徴
とする　α−１，６−グルコシダーゼの安定化法に関す
るものである。

以下に、本発明の内容を更に具体的に説明する。

本発明において使用されるアルミニウム塩としては、例
えば、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、硫酸アル
ミニウムアンモニウム、硝酸アルミニウム、硫酸アルミ
ニウム　カリウムなどの無機酸塩のほか、酢酸アルミニ
ウム、乳酸アルミニウムなどの有機酸塩など、通常、水
溶性の塩が挙げられる。しかし、アルミニウム塩は強い
酸性を示しくｐＨ２〜４）、α−１，６−グルコシダー
ゼは直ちに失活するため、ｐＨを低くとも４以上に、Ｌ
げる必要かある。しかし、ｐｎを上げるとアルミニウム
塩は、分解して、水不溶性の水酸化アルミニウムを沈澱
するという問題がある。このため、該酵素に安定なｐＨ
で、水溶性を維持できるアルミニウム溶液について検討
してきた結果、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、
硫酸アルミニウムカリウム、硫酸アルミニウム　アンモ
ニウムなどの水溶液または水懸濁液に、糖、グリセリン
、乳酸ナトリウムなどのいずれかを存在させて、ｐＨを
調整するか、あるいは乳酸アルミニウムの溶液をｐｉ調
整して使用するのが適当であることを認めた。

特に、乳酸アルミニウムを使用するときは、高濃度の溶
液を調製することができる。

（発明の効果） アルミニウム塩として、例えば、塩化アルミニウムや硫
酸アルミニウムアンモニウムを使用スる場合の濃度は、
通常、ｌＸｌ０−’〜ｌＸｌ０−’モル、望ましくは、
ｌＸ１０−’〜５ＸＩＯ−’モル程度であり、乳酸アル
ミニウムを使用する場合は、通常、ＩＸ　１０−’　〜
Ｉ　Ｘ　１０−’モル程度で顕著な効果を示す。すなわ
ち、使用する塩の種類や酵素の起源により、適宜、濃度
を変更する必要があるが、極めて薄い濃度で、しかも、
狭い濃度範囲において顕著な効果を示すことが認められ
た。例えば、５％プルランを基質として、ｐＨ４，５，
６０℃で反応させたとき、多くのバシルス属や、クレブ
シラ属のプルラナーゼは１時間以内に失活するが、３Ｘ
１０−３モル適当量のアルミニウム塩が共存したときは
、少なくとも３日間活性を保持した。

アルミニウム塩は反応時に酵素と同時に添加してもよく
、また、あらかじめ、酵素剤に添加、処理してもよい。

本発明はバシルス属、クレブシラ属、シュードモナス属
などの細菌、ストレプトマイセス属放線菌など、種々の
微生物の生産するα−１，６−グルコシダーゼに適用す
ることができる。例えば、クレブシラ・ニューモニア（
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏ−ｎｉａｅ）、バ
シルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）、バシルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ノ
イシルス拳セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ
）、バシルス・セレウス・ヴアリエークス・ミコイデス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ−ｖａｒ、　ｎｙｃ
ｏｉｄｅｓ）、ノ望シルスーアシドプルリテイカス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｉｔｉｃｕｓ
）、シュードモナス０アミロデラモサ（Ｐｓｅｕｄｏｌ
ｌｌｏｎａｓ　ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）などの生
産するα−１，６−グルコシダーゼなどが挙げられる。

以下に、実施例により本発明の詳細な説明する実施例　
１ クレブシラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ）の生産するプルラナーゼ（英国、Ａ
ＢＭ社製、商品名Ｐｕｌｌｕｚｙｍｅ）　０．　３　単
位に、プルランｌＯ％、酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）０．
１Ｍ。

塩化アルミニウム３Ｘ１０−’Ｍになるように加え。

全量を水で２１１１１とし、６０℃で反応させた。対照
として、塩化アルミニウム無添加のものを同時に反応さ
せた。そして、経時的に一定量をとり、生成した還元糖
（マルトトリオース）をソモギー・ネルフン法によりグ
ルコースとして定量した。得られた結果を第１表に示す
。

第　　１　　表 反応時間　　　　　還元糖量（ｍｇ／ｍ１）（時）　　
　　対照　　塩化アルミ添加１　　　　　１、０８　　
　　２．０７３　　　　　１．１１　　　　３．３０５
　　　　　１、１０　　　　３．８５２４　　　　　１
．１１　　　　６．６４４ｇ　　　　　　１．１１　　
　　７．５５表から明らかなように、この酵素は、塩化
アルミニウムが存在しないとき、ｐＨ４，５，６０’Ｃ
という条件下では、１時間以内に失活するが、３×１０
−４モル量の塩化アルミニウムが存在したときは、酵素
の安定性が著しく改善されるため、高い分解性を示した
。

ここで、α−１，６−グルコシダーゼ活性は以下のよう
にして測定した。

０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解した２％プルラン液（ｐＨ５
，０）０．５ｍｌに適当量の酵素液を加え、蒸留水で全
ｆｉ１ｍｌとし、４０°Ｃで反応させる。　この条件下
で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当する。

・量元力を生成する酵素１ｔを１単位とした。

実施例２ コーン・ステイープ・リカー１０％、乳！２％、燐酸二
力９０．３％、硫酸マグネシウム（７水塩）０．１％、
硝酸ナトリウム０．２５％、ツイーン６００．３％、硫
酸銅５Ｘ１０−５Ｍ、塩化マンガン２．５Ｘ１０”＠Ｍ
、塩化カルシウムＩＸ１０−’Ｍ、硫酸亜鉛ｌＸｌ０−
’Ｍ、硫酸第一鉄ｌＸｌ０−’Ｍからなる培地（ｐＨ７
，０）を、常法により殺菌後、バシルス・ズブチリスＴ
Ｕ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＴＵ）　Ｆ
　Ｅ　ＲＭ　−ＢＰ　６８４を接種し、３０℃で４日間
振盪培養した。培養後、遠心分離して得た上澄を酵素液
として使用した。　該酵素の０．２３単位をプルラン５
％、酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）０．０１Ｍ、塩化カルシ
ウム　ｌＸｌ０−’Ｍ１塩化アル化工ルミニウムｌＸｌ
０−４〜５Ｘ１０に加え、全ｆｆ１１ｍ１で６０℃で反
応させた。反応４８時間目に生成した還元糖量をグルコ
ースとして定量した。ａ；結果は第２表に示す通りであ
った。

表から唄≦かなように、塩化アルミニウムの存−一、−
：゛ 在により、プルラナーゼの安定性が著しく改善された。

第　　２　　表 塩化アルミニウム　　反応時間（時） （ＸＩＯ−’Ｍ）　　　　　６　　４６　　７０無添加
　　　　　３．３ｇ　　５．６３　６．４２１　　　　
　　４．４０　６．６６　７．９５２　　　　　　４．
５８　　ｇ、６３　９．９１３　　　　　　５．１１　
７．９２　９．１８４　　　　　　３．１７　６．１６
　７．６９実施例３ 本実施例においては、塩化アルミニウムの代わりに、硫
酸アルミニウム　アンモニウムを使用シた。反応に使用
した酵素は実施例２で使用したと同じ酵素である。得ら
れた結果を第３表に示す。

アンモニウム（Ｘ　１０−’Ｍ）　　１　　４１　　６
５Ｇ　　　　　　　　　　　　２．８２　４．６１　５
．７４３　　　　　　　　　　　２．１３　７．２２　
７．５４４　　　　　　　　　　　２．２９　８．２８
　９．０３実施例４ 実施例２において調製した酵素を硫酸アンモニウム７０
％飽和になるように加えて酵素を沈澱させ、遠心分離に
より回収し、蒸溜水で透析したものを酵素液として使用
した。

木酢素０．０５単位を、プルラン５％、酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４，５）Ｏ，ＯＩＭ、塩化カルシウムＩ　Ｘ　１０−
’Ｍ、乳酸アルミニウム０．５Ｘ１０−’〜５Ｘ１０−
３Ｍ加え、全ｆｆ１１ｍ１で６０℃で反応させた。反応
４２および６６時間目に、生成した還元糖をグルコース
として定量した。得られた結果を第４表に示す。

乳酸ア、（レー蓮：ニウム　　反応時間（時）（ｘ　１
０−３Ｍ）　　　　　　４２　　　６６０　　　　　　
　　　　　　１．５９　　　１．５９０．５　　　　　
　　　　　３．４９　　　５．２１１　　　　　　　　
　　　　　　ｇ、７１　　　９．９９２　　　　　　　
　　　　　９．２５　　１２．７３　　　　　　　　　
　　　９．３３　　１２．３４　　　　　　　　　　　
　１０．９２　　　１２．９５　　　　　　　　　　　
　９．８０　　１２．９表から明らかなように、乳酸ナ
トリウムを使用した場合、比較的広い濃度範囲で効果を
示した。

実施例５ 本実施例では、α−１，６−グルコシダーゼとして、シ
ュードモナス・アミロデラモサ（Ｐｓｕｕｄｏｍｏ−ｎ
ａｓ　ａｍｙｌｏｄｅｌａｍｏｓａ）のイソアミラーゼ
を用いて試験した結果について記載する。

本酵素はアミロペクチンの長鎖の分岐（α−１゜６−グ
ルコシド結合）を分解することができるが、プルランの
α−１，６−グルコシド結合は分解するにあり、６０°
Ｃでは急速に失活するｒ　Ｋ、　Ｙｏｋｏｂａｙａ−ｓ
ｉ他、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａ　Ａｃｔａ　２１２，４５ｇ（１９７０）］。本酵
素の精製標品は生化学工業（株）よ。

り入手することができる。

本酵素に対するアルミニウム塩による安定性を試験する
ために、植物β−アミラーゼと併用して、澱粉からのマ
ルトースの生成試験を行った。この場合、β−アミラー
ゼによる影響を無くするために、β−アミラーゼは基質
に対して十分量を加えた。

可溶性澱粉５％、酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）０、ＯＩＭ
、　大麦β−アミラーゼ（フィンランド国、フィンシコ
ガー社製、商品名Ｓｐｅｚｙｍｅ　ＢＢＡ）４．２単位
、前記シュードモナス属イソアミラーゼ１００単位、硫
酸アルミニウム　アンモニウムまたは乳酸アルミニウム
を３ＸＩＯ−’〜５×１０−’Ｍ、全量１ｍｌで、６０
℃で反応させた。対照として、アルミニウム塩無添加で
同時に反応させた。経時的に→）定量をとり、生成した
還元糖（マルト−ス）をゾモギー・不ルソン法により定
量シた。得られた結果を第５表に示す。

第　　５　　表 アルミ塩　β−アミ　イソア　　反応時間（時）（ｘ　
ｌｏ−’　Ｍ）　　ラーゼ　ミラーゼ　２２４６無添加
　　　＋　　　　　　　２６．４　３０．８無添加　　
　＋　　　＋　　　　２７．６　３１．８ＡＩＮＩ（４
（ＳＯ４）ｔ ３　　　　　＋　　　　＋　　　　２５．０３２．１５
　　　　　＋’　　　　＋　　　　３３．０３６．２乳
酸アルミ ３　　　　　＋　　　　＋　　　　３１．８　３４．６
５　　　　　＋　　　　＋　　　　３３．２３７．８１
０　　　　　＋　　　　＋　　　　３２．２３６．８表
から明らかなように、アルミニウム塩が存在したきは、
存在しない場合にくらべ、長時間にわたり活性が維持さ
れ、高い収用でマルトースが得られた。

実施例６ 実施神１′２’：’８ｊ調製した酵素を、グルコアミラ
ーゼ：ｌ　　　、ｆ７ と併用゛して液化澱粉の糖化試験を行った。

ＤＥ約１２の液化澱粉３０％、グルコアミラーゼ（フィ
ンシュガー社製、商品名Ｓｐｅｚｙｍｅ　ＧＡ２００）
　０．　０３％（／固形分）、α−１，６−グルコシダ
ーゼ０．４　単位（／基質ｇ）、塩化カルシウム０．Ｏ
ＩＭ、硫酸アルミニウム　アンモニウム５ＸｌＯ−’Ｍ
の組成の下、ｐＨ４，５，６０℃で糖化反応を行った。

得られた結果は第６表に示す通りであった。

表から明らかなように、アルミニウム塩を添加するとα
−１，６−グルコシダーゼの安定性が増加するため、高
い収量でグルコースが得られた。

第６表 アルミ塩　α−１，６−クル　グルコース含量−−９３
，４

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. α−１，６−グルコシダーゼを用いる反応をアルミニウ
   ム塩の存在下で行うことを特徴とするα−１，６−グル
   コシダーゼの安定化法。