JPH0329391B2

JPH0329391B2 -

Info

Publication number: JPH0329391B2
Application number: JP62262301A
Authority: JP
Priority date: 1987-10-16
Filing date: 1987-10-16
Publication date: 1991-04-24
Also published as: JPH01104170A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は安定なα−１，６−グルコシダーゼ組
成物に関するものである。（従来の技術） α−１，６−グルコシダーゼは澱粉またはその
派生物中のα−１，６−グルコシド結合あるいは
（および）プルランのα−１，６−グルコシド結
合などを加水分解する酵素の総称であり、その基
質特異性の差からプルラナーゼあるいはイソアミ
ラーゼと呼ばれる酵素がある。 α−１，６−グルコシダーゼはβ−アミラーゼ
と併用して、澱粉からマルトースを収量よく製造
するのに使用したり、また、最近、酵素法による
澱粉からのグルコースの製造において、グルコア
ミラーゼと併用して、グルコースを収する目的に
使用されている。（発明が解決しようとする問題点） α−１，６−グルコシダーゼは、バシルス属、
クレブシラ属、シユードモナス属など、種々の細
菌や、ストレプトマイセス属などの放線菌により
生産されることが知られているが、一部の微生物
の生産するものを除き、一般に、耐酸性や耐熱性
などの安定性に劣ることが問題であつた。特に、
本酵素をグルコアミラーゼと併用する場合、グル
コアミラーゼは、工業的には、PH４〜５、温度約
60℃で２〜３日間使用されるため、このような酸
性と高温で長時間、活性を保持できるプルラナー
ゼは少なく、これまで、バシルス・アシドプルリ
テイカス（Bacillus acidopullulyticus）のプル
ラナーゼが知られているのみである（特公昭62−
25036ほか）。（問題点を解決するための手段）本発明者は、従来知られているα−１，６−グ
ルコシダーゼの安定化法について、鋭意、研究を
行つてきた結果、α−１，６−グルコシダーゼは
アルミニウム塩の存在下で著しく安定化され、か
つ長期間安定に保存できるることを認めた。本発
明はこの知見に基づいてなされたものである。すなわち、本発明はα−１，６−グルコシダー
ゼに、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、硫
酸アルミニウム・アンモニウム、及び硫酸アルミ
ニウム・カリウムから選ぶアルミニウム塩にグリ
セリン及び乳酸ナトリウムから選ぶ化合物との混
合物を存在させた安定なα−１，６−グルコシダ
ーゼ組成物に関するものである。以下に、本発明の内容を更に具体的に説明す
る。本発明において使用されるアルミニウム塩とし
ては、例えば、塩化アルミニウム、硫酸アルミニ
ウム、硫酸アルミニウムアンモニウム、硝酸ア
ルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムなどの
無機酸塩のほか、酢酸アルミニウム、乳酸アルミ
ニウムなどの有機酸塩など、通常、水溶性の塩が
挙げられる。しかし、アルミニウム塩の水溶液は
強い酸性（PH２〜４）を示し、α−１，６−グル
コシダーゼは直ちに失活するため、PHを低くと
も、程度に上げる必要がある。しかし、PHを上げ
ると、アルミニウム塩は分解して、水不溶性の水
酸化アルミニウムを生成するという問題がある。
このため、該酵素に安定なPHで水溶性を維持でき
るアルミニウム溶液について検討してきた結果、
塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、硫酸アル
ミニウムアンモニウム、硫酸アルミニウムカ
リウムなどの溶液または懸濁物に、糖、グリセリ
ン、乳化ナトリウムなどを存在させて、PHを調整
するか、あるいは乳酸アルミニウムの溶液をPH調
整して該酵素と混合するのが適当であることを認
めた。特に、乳酸アルミニウムを使用するとき
は、高濃度の溶液が調整でき、また安定した溶解
物を得ることができる。（発明の効果） α−１，６−グルコシダーゼに添加されるアル
ミニウム塩は、同酵素の使用時における濃度が１
×1^-4〜１×10^-2モル程度になるのが望ましいが、
酵素の種類とその濃度により適宜変更する必要が
ある。そして、このような混合物の存在下におい
て、α−１，６−グルコシダーゼは長期間安定し
て保存することができ、また、PH４〜５、温度60
℃の、酸性、かつ高温下の反応においても、長時
間活性を保持することができる。例えば、バシル
ス・ズブチリスのプルラナーゼについて、５％プ
ルランを基質として、PH4.5、温度60℃で反応さ
せた場合、アルミニウム塩が存在していない酵素
の場合、１時間以内に失活するのに対し、アルミ
ニウム塩を存在させた酵素では、少なくとも３日
間活性を保持していた。本発明は細菌、放線菌など、種々の微生物の生
産するα−１，６−グルコシダーゼに適用するこ
とができる。例えば、クレブシラ・ニユーモニア
（Klebsiella pneumoniae）、バシルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis）、バシルス・ステアロセ
ーモフイラス（Bacillus stearothermophilus）、
バシルス・セレウス（Bacillus cereus）、バシル
ス・セレウス・ヴアリエータス・ミコイデス
（Bacillus cereus var.mycoides）、バシルス・ア
シドプルリテイカス（Bacillus
acidopulluliticus）、シユードモナス・アミロデ
ラモサ（Pseudononas amyloderamosa）などの
生産するα−１，６−グルコシダーゼが挙げられ
る。以下に、実施例により本発明の詳細を説明す
る。実施例１コーン・ステイープ・リカー10％、乳糖２％、
燐酸二カリ0.3％、硫酸マグネシウム（７水塩）
0.1％、硝酸ナトリウム0.25％、ツイーン60 0.3
％、硫酸銅５×10^-5M、塩化マンガン2.5×
10^-6M、塩化カルシウム１×10^-3M、硫酸亜塩１
×10^-4M、硫酸第一鉄１×10^-5Mの組成からなる
培地（PH7.0）を、常法により殺菌後、バシル
ス・ズブチリスTU（Bacillus subtilis TU）
FERM−BP684を接種し、30℃で４日間振盪培
養した。培養後、遠心分離して得た上澄液に、硫
酸アンモニウムを70％飽和になるように加えて酵
素を沈澱させ、遠心分離して回収した酵素を、蒸
溜水で透析したものを原酵素液として使用した該酵素２ml（25単位）に、0.4M硫酸アルミニ
ウムアンモニウムと1.2M乳酸ナトリウムの等
量混合液（水酸化ナトリウムでPH５に調整）１ml
を添加した組成物（アルミニウム濃度として6.6
×10^-2）を調製した。該組成物は、アルミニウム
無添加のものと比較して活性の低下は少なく、長
期間安定であつた。該酵素組成物および対照酵素、各0.13単位に、
プルラン５％、酢酸緩衝液（PH4.5）0.01M、塩
化カルシウム0.01Mになるように加え、全量１ml
で、60℃で反応させた。経時点に一定量をとり、
生成した還元糖（マルトトリオース）をグルコー
スとして定量した。得られた結果を第１表に示
す。表から明らかなように、アルミニウム塩を添加
した酵素組成物は、対照酵素に比べ、長時間活性
を保持した。

【表】ここで、α−１，６−グルコシダーゼ活性は以
下のようにして測定した。 0.1M酢酸緩衝液に溶解した２％プルラン液
（PH5.0）0.5mlに適当量の酵素液を加え、蒸留水
で全量１mlとし、40℃で反応させる。この条件下
で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当
する還元力を生成する酵素量を１単位とした。参考例１クレブシラ・ニユーモニア（Klebsiella
pneumoniae）の生産するプルラナーゼ（英国
ABM社製、商品pulluzyme）を蒸溜水に対し透
析した酵素液１ml（約500単位）に、2M乳酸アル
ミニウム（水酸化ナトリウムでPH5.8に調整した
溶液）を、それぞれ０、0.25、0.50、0.75、1.00
mlを加え、蒸留水で全量２mlとした組成物を調製
保存した。一週間後に測定した活性は第２表に示
す通りであつた。

【表】表から明らかなように、アルミニウム塩の存在
下で保存したものは、無添加のものに比べ、高い
活性を保持した。なお、乳酸アルミニウムは試験
した２×10^-4〜５×10^-3Mにおいて、同酵素に対
する阻害および賊活作用は認められていない。乳酸アルミニウム無添加および上記調製酵素組
成物、各0.37単位とプルラン５％、酢酸緩衝液
（PH4.5）0.01Mを含む混合液１mlを、60℃で反応
させた。反応46時間目に生成した還元糖（マルト
トリオース）をグルコースとして定量した。得ら
れた結果は、第３表に示す通りであつた。

【表】表から明らかなように、アルミニウム塩を含む
酵素組成物は、対照の酵素に比べ高いプルラン分
解活性を示し、また反応時だけにアルミニウム塩
を加えた場合（第２段）に比べても、高い分解活
性を示した。参考例２実施例１で調製した酵素、それぞれ40単位に、
乳酸アルミニウムを０、0.25あるいは0.5Mにな
るように加えた組成物（２ml）を調製した。各酵素組成物の一定量（酵素量およびアルミニ
ウム塩の終濃度は第４表に記載）に、プルラン５
％、酢酸緩衝液（PH4.5）、塩化カルシウム0.01M
になるように加えた反応液１mlを60℃で反応させ
た。反応45時間目に生成した還元糖（マルトトリ
オース）をグルコースとして定量した。得られた
結果を第４表に示す。表から明らかなように、アルミニウム塩を含む
酵素組成物は、対照酵素に比べ高い分解活性を示
した。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１ α−１，６−グルコシダーゼに、塩化アルミ
ニウム、硫酸アルミニウム、硫酸アルミニウム・
アンモニウム、及び硫酸アルミニウム・カリウム
から選ぶアルミニウム塩にグリセリン及び乳酸ナ
トリウムから選ぶ化合物との混合物を存在させた
安定なα−１，６−グルコシダーゼ組成物。