JPH0398580A - 十分な安定性を有するタンパク質分解作用酵素の水性酵素懸濁液組成物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は、殊にたとえば膵臓複合体のようなタンパク質
分解作用を有する酵素の、直接に適用しうる製剤の形の
水性酵素液体組成物に関する。

［従来の技術］ 酵素の液体製剤は、酵素適用の実地において特定の利点
を有している。この場合、重要な親点は安全性であ−）
　ｆ：　（Ｈ．Ｊ．Ｒｅｈｍ　＆　Ｇ．Ｒｅａｄ　Ｅｄ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋第７ａ巻″Ｅｎｚｙｍ
ｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第７２２頁、第７３１頁、
ＶＣＨ　ｌ　９　８　７午参照）。液体酵素製剤は、粉
塵がなく、従ってアレルギー反応の危険が減少するとい
う明白な利点を有する。他面では、微生物による汚染の
危険が増大するので、水性酵素液体組成物は通例防腐剤
を備えているかまたは微生物の戊長に関する“水活性（
　Ｗａｓｓｅｒａｋｔｉｖｉｔａｅｔ）”を低下する担
体を含有している。

もう１つの適用技術的利点は、技術水準の固体製剤と比
較して液体製剤の良好な配量性にある。しかし、微生物
学的汚染は数時間にわたる酵素液体組放物の品質悪化の
唯一の理由ではない。タンパク質分解酵素が、主要酵素
としてであれ、不純物としてであれ生きていると直ちに
、酵素の自己消化を考慮しなければならない。

それと結合した、たいてい迅速な活性損失は、膵臓プロ
テアーゼの存在の場合とくに高く、非常に僅かな水活性
でも殆んどさけられない。１つの打開策は、担体にプロ
テアーゼを共有結合で固定することである。担体結合酵
素の高い価格は別としても、固定化酵素の有用な適用は
、分解すべき基質の相対的可動性を前提とし、これはた
とえば皮革分野に適用する場合に不十分な程度にしか与
えられていない。これに対して、共有結合されてない、
たとえばマイクロカプセル、中空系および架橋ボリマー
ゲル中に封入された酵素混合物は、可溶性酵素と同様に
自己消化的に分解するかないしはプロテアーゼを分離す
る（Ｕｌｌｍａｎｎｓ　Ｅｎｃｙｋｌｏｐａｅｄｉｅ　
ｄｅｒ　ｔｅｃｈｎ．Ｃｈｅｍｉｅ，第４版、第ｌＯ巻
、第５４４頁、ＶｅｒｌａｇＣｈｅｍｔｅｌ　９　７　
５年参照）。

膵臓を処理する際の問題は、外ならぬ膵液がその動物起
源のためはじめから病原菌で高度に負荷されていること
によって、なおきびしくなる。

消化系統においては、周知のように、作用方向の異なる
酵素が共同作用する。従って、一般に工業的に使用され
る膵臓プロテアーゼ製剤は、随伴酵素としてアミラーゼ
（Ｅ．Ｃ．３．２１）およびリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１
、１．３）を含有しうる、トリブシン（Ｅ．Ｃ．３．４
．２１４），キモトリプシン（Ｅ．Ｃ．３４．４．５）
および種々のべプチダーゼ（たとえばＥ．Ｃ．３．４．
４．７）の固体混合物である。このような製剤は、たい
てい新しい膵臓搾出汁の塩沈殿によるかまたはインシュ
リン製造の残渣から製造される。全腺房（　Ｄｒｕｅｓ
ｅ）の極めて慎重な脱水によって、プロテアーゼが主と
して不活性な前駆物質として存在しかつとくに高いリパ
ーゼ含量を有するいわゆるパンクレアチンが得られる。

かかる製剤は、使用前に、差当り、たとえば自己溶解に
よるか、エンテロキナーゼまたは酸性真菌プロティナー
ゼ等の添加によって活性化しなければならない（旧−ｌ
ｍａｎｎｓ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｅ　ｄｅｒ　ｔ
ｅｃｈｎ．　Ｃｈｅｍｉｅ，第４版、第１０巻、第５１
５〜５３７頁、ＶｅｒｌａｇＣｈｅｍｉｅ　ｌ　９　７
　５手；　Ｋｉｒｋ　−　Ｏｔｈｍｅｒ，　Ｅｎｃｙｃ
ｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ第３判、第９巻、第１７３頁〜第２２４頁、
Ｗｉｌｅｙ　−　１ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ１９８０年
参照）。

水性酵素液体組成物を、活性損失のような欠点および汚
染を回避すると同時にそのかなりの利点を利用するとい
う願望は、種々の解決策、たとえば有機溶媒の混合（西
ドイツ国特許出願公開第１８０８８３４号、ハンガリー
国特許第２６４２号明細書、東ドイツ国特許第１００５
８号明細書）ないしは非水性液体組成物を生じた。これ
まで、それぞれの点で信じられた戊果は、殊にタンパク
質分解活性を有する酵素の場合、殊に膵臓酵素の場合に
記録することができなかったく西ドイツ国特許出願公開
第３７０４４６５号、米国特許第３７４１９０２号参照
）。有機媒体中の液体組成物における欠点は、乾燥形の
酵素の製造が殆んど避けることができずかつたとえばプ
ロピレンカーボネートのような適当な有機溶媒は意外に
高価であることである［発明を達成するための手段１ それ故相変らず、殊に膵臓複合体のタンパク質分解作用
酵素の十分な安定性を有する液体組成物を利用するとい
う課題が生じた。この場合一面では環境汚染の心配がな
いことに注意しなければならず、他面ではたとえば殊に
皮革工業における工業的適用の点でこれから高すぎるコ
スト上の負荷が生じてはならなかった。ところで、生じ
た課題は極めて有利には本発明方法によって解決しうろ
ことが判明した。本発明による水性酵素液体組成物の製
造方法は、水媒体中に存在する酵素を自体公知の方法で
、微細に分配して沈殿させ、水媒体中での密度調整によ
って沈積安定の微細分散の分配状態の酵素を製造するこ
とを要旨とする。

既述したように、本方法は、プロテアーゼ、タンパク質
分解作用を有する酵素複合体、およびタンパク質分解随
伴作用をする、アミラーゼ、リパーゼ等のような酵素の
水性酵素製剤における適用のために推奨される。膵臓複
合体（　Ｐａｎ−ｋｒｅａｔｉｓｃｈｅ　Ｋｏｍｐｌｅ
ｘ’）　　（パンクレアチン）がとくに挙げられる。

酵　　素 タンパク質分解作用を有する酵素とは差当りエンドペグ
チターゼ（″Ｐｒｏｔｅａｓｅｎ　”　Ｅ　．　Ｃ　．
３．４．）を表わし、その際本発明の関係では殊に工業
的に利用される酵素が重要である（Ｋｉ−ｒｋ−Ｏｔｈ
ｍｅｒ，ｌｏｃ．　ｃｉｔ．，第９巻、Ｋ．　Ａｕｎｓ
ｔｒｕｐｉｎＢ．　Ｓｐｅｎｃｅｒ版Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｒ　Ｂｉｏｃｈ−ｅ＋＋ｉｓ
ｔｒｙ．第３０（Ｉ）巻、第２３頁〜第４６頁、Ｎｏｔ
ｈ　Ｈｏｌｌａｎｄ　１　９　７　４年）。

プロテアーゼは次のように区別される：ａ）　動物起源
のもの、たとえば σ）　レンニン（Ｅ．Ｃ．３．４．２３．４）β）　膵
臓プロテアーゼ パンクレアチン、殊にトリプシン キモトリプシン（ｐＨ作用範囲約７〜１０）ペプシン（
Ｅ．Ｃ．３．４．２３．１）（ｐＨ作用範囲約１．５〜
４．０） カテプシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２３−　５）（ｐＨ作用
範囲約４．０〜５．０） ｂ）　植物起源のもの ａ）　パパイン（Ｅ．Ｃ．３．４．２２．１）　　（ｐ
Ｈ作用範囲約５．０〜８．０）β）　フイシン（Ｅ．Ｃ
．３．４．２２．３）　　（ｐＨ作用範囲約４．０〜９
．０）γ）　ブロメライ：／　（Ｅ．Ｃ．３．４．２２
４および３．４．２２．５）（ｐＨ作用範囲約５．０〜
７，０） Ｃ）　微生物起源のもの（　Ｌ．　Ｋｅａｙ″Ｐｒｏｃ
ｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”　．　　１　９　７　
１午、第１７頁〜第２１頁） α）　バチルス種から、たとえばＢ．スプチリス（ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）　、Ｂ．りヶニホルミス（Ｉｉｃ−ｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ）　、Ｂ．アルカロフィルス（ａｌｋ
−ａｌｏｐｈｉｌｕｓ）　、Ｂ．セルス（　ｃｅｒｕｓ
）　，　Ｂ．ナト（　ｎａｔｔｏ）　，　Ｂ．ブルガタ
ス（　ｖｕｌｇａｔｕｓ）、Ｂ．ミコイデス（　ｍｙｃ
ｃ　ｉｄｅｓ）。

β）　ストレプトコッカス種から γ）　ストレプトマイセス種から たとえばストレプトマイセスフラデアエ（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　Ｆｒａｄｉａｅ）　，　Ｓ．グリセウス
（Ｇｒｉｓｅｕｓ）　、Ｓ．レクタス（　ｒｅｃｔｕｓ
）ｄ）　アスペルギルス種から たとえばアスペルギルスフラブスーオリザエ（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ　Ｆｌａｖｕｓ−ｏｒｙｚａｅ）　、Ａ
．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）、Ａ．サイトリ（ｓａｉｔｏｒ
ｉ）　、Ａ．ユサミイイ（ｕｓａｍｆｉ） ｅ）　ムコール（　Ｍｕｃｏｒ）種およびリゾプス（Ｒ
ｈｉｚｏｐｕｓ）種から たとえばムコールブシルス（Ｍｕｃｏｒ　Ｐｕｓｉｌｌ
ｕｓ）、Ｍ，ミイトレイ　（ｍｉｅｔｒｅｉ）ｆ）　エ
ンドチア種から たとえばエンドチアパラシチ力（　ＥｎｄｏＬｈｉａｐ
ａｒａｓｉｔｉｃａ） ｇ）　　　｝ラメテス種から たとえばトラメテスサンギネア（　Ｔｒａｍｅｔｅｓ５
ａｎｇｕｉｎｅａ） 起源による相違の外に、作用部位（外対内酵素［Ｅｘｏ
　−　ｖｅｒｓｕｓ　−　Ｅｎｄｏ　−　Ｅｎｚｙｍｅ
］による相違およびプロテアーゼの“活性部位”に基づ
く相違（ＤＦＰによって阻害されるセリンプロテアーゼ
、スルフヒドリル酵素）も使用される。

さらに、酵素活性のｐＨ依存性も実際上著しく重要であ
る。従って、なかんずく実際上の観点の下で区ｆｆｌｆ
される。

ｉ）　たとえばｐＨ７．５〜ｌ３の範囲内に最適作用を
有するアルカリ性プロテアーゼ、殊にアルカリ性細菌プ
ロテアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．）（多くはセリン
タイプに属する）およびアルカリ性真菌プロテアーゼｉ
ｉ）　　ｐＨ６．０〜９．０の範囲内に最適作用を有す
る中性プロテアーゼ、 殊に中性細菌プロテアーゼ（Ｅ．Ｃ、３．４２４）（金
属酵素に属する）および真菌プロテアーゼ、たとえばバ
チルス・プロテアーゼ、プソイドモナス・プロテアーゼ
、ストレプトマイセス・プロテアーゼ、アスペルギルス
・プロテアーゼ。

ｉｉｉ）　　ｐＨ２．０〜５．０の範囲内に最適作用を
有する酸性プロテアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２３） 殊に酸性真菌プロテアーゼ、たとえばリゾプス（Ｒｈｉ
ｚｏｐｕｓ）　ｓｐｐ．　，アスベルギルス（　Ａｓｐ
−ｒｇｉｌｉｕｓ）　ｓｐｐ．、ペニシリウム（Ｐｅｎ
ｉｃｉＪＩｉｕｍ）ｓｐｐ．、ムコール（　Ｍｕｃｏｒ
）　ｓｐｐ．　，およびイムペックスラクチウス（　Ｉ
ｍｐｅｘ　Ｉａｃｔｅｕｓ）およびエンドチチア・パラ
ンチカ（　Ｅｎｄｏｔｈｉｔｉａｐａｒａｓ　ｉ　ｔ　
ｉｃａ） 工業的生産物の分析のためには基質として力ゼイ？　（
　ＬＯＥＨＬＥＩＮ−ＶＯＬＨＡＲＤＳＫＵＮＩＴＺ　
　ＬＡＳＫＯ−ＷＳＫＩ−による方法、下記参照）また
はヘモグロビン（　ＡＮＳＯＮによる方法、下記参照）
またはゼラチン（粘度測定法）が適当である。通常、タ
ンパク質分解作用はレーライン・７オルハルド法（“Ｌ
ｅｄｅｒ”　＋第２２巻、第１２１頁〜Ｉ！１２６頁（
１９７１年）におけるＴＥＧＥＷＡにより修正）により
測定される。この場合、試験条件（１時間、３７℃）下
でのレーライン・７才ルハルド単位（ＬＶＥ）は、カゼ
イン濾液２ＯｒｔｒＱ中で０．１　ｎ　　ＮａＯＨ　　
５．７　５ｘ　１　０−３ｒｍＱの等量に相当する加水
分解生成物の増加を惹起する酵素量に一致する。さらに
、アンンンのヘモグロビン法（　Ｍ．Ｌ．　Ａｎｓｏｎ
％Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｐｈｙｓｉｏ１、　、第２２巻、第
７９頁（１９３９年））による酵素のタンパク質分解作
用の測定も慣用である。

プロテアーゼは、なかんずく皮革製造の際、洗剤中およ
び浄化の際、糊抜において、カゼイン製造の際、肉解体
の際およびビールの安定化の際に工業的に使用される。

さらに、既述したように、タンパク分解作用を有する酵
素複合体およびタンパク質分解随伴作用を有する酵素も
重要である。これには、なかんずくアミラーゼ、殊にσ
−アミラーゼ（　Ｆｉｓｃｈｅｒ　ｕｎｄ　ＳＬｅｉｎ
，Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ″、ｇＪ２判、Ｐ．Ｄ．　Ｂｏ
ｙｅｒ等、第■巻、第３１３〜第３１４頁、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ参照）が属し、工業的製剤としては
通例随伴酵素としてプロテアーゼを含有している。α−
アミラーゼは動物、植物または微生物起源のものである
。望ましいものは、たとえば膵臓アミラーゼ、細菌およ
び真菌アミラーゼである。種々の起”源のα−アミラー
ゼ（つまりアミロースないしはアミａペクチンのσ−１
．４−グルコシド結合を分解するアミラーゼ）のｐＨ作
用範囲は、３．５〜９．０の範囲内にある。膵臓から得
られるσ−アミラーゼは５．５〜９．０のｐ｝Ｉ作用範
囲（至！ｐＨ約７、２）を有し、細菌から得られたもの
は４．５〜８．５の作用範囲（この場合至適ｐＨは液化
σ−アミラーゼについては６．５〜７．０であり、糖化
σ−アミラーゼについては４．８〜５．２である）を有
し、真菌かも製造されたものは３．５〜７．０の作用範
囲（至適ｐｌ４５．０）を有し、麦芽から製造されたも
のは４．５〜７．０の作用範囲（至適ｐ｝！４．７）を
有する（　Ｕｌｌｍａｎｎ，　Ｉｕｃ．　ｃｉｔ．第ｌ
Ｏ巻、第５０７頁参照）。

バチルス種、たとえばＢ、スブチリス、Ｂ．メセンテリ
クス（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｕｓ）　、Ｂ．ボリミクサ
（　ｐｏｌｙｍｉｘａ　）　、Ｂ．アミ口リケファシエ
ンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　、Ｂ．
リケニホルミス（　Ｉｉ−ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｊｓ　）
から、さらに真菌、殊にアスベノレキス種、！二ト，ｔ
ｌｆＡ．ニケノレ、Ａ．７ｆエニシス（　ｐｈｏｅｎｉ
ｃｉｓ）　、Ａ．オリザエ（　ｏｒｙｚａｅ）　、Ａ．
アワモリ（　ａｗａｍｏｒｉ）から、ムコール種、たと
えばＭ．ルウキンアヌス（　ｒｏｕｘｉａｎｕｓ）から
、リゾプス種、たとえばＲ．デルマール（　ｄｅｌｅｍ
ａｒ）、Ｒ９オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）　、Ｒ．ヤポニ
クス（　Ｊａｐ−ｏｎｉｃｕｓ）から、およびエンドマ
イセス種、たとえばＥ．７イブリゲル（　ｆｉｂｕｌｉ
ｇｅｒ）からの製造が次第に重要性を増している。アミ
ラーゼはなかんずく栄養分野［　Ｈ．−Ｊ．　Ｒｅｈｍ
　＆　Ｇ．　ＲｅｅｄＥｄ．，　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ　　ｓ第５巻、Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅ−ｍｉｅ
１９８３年；　Ｂ．　Ｓｐｅｎｃｅｒ　Ｅｄ．　，　　
Ｉｎｄｕｓｔ−ｒｉａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ″第３０巻Ｐａ−ｒｔｌ，第１３
９頁〜第１８６頁、第２１３頁〜第２６０頁、Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒｓ（　１　９　７　３年）参照］でデンプン液
化、麦芽製造において、エタノール製造、糊抜きにおい
て、製革その他において適用される。基質としてデンプ
ンを使用するσ一アミラーゼの活性は、サンドステット
（　Ｓａｎｄｓｔ−ｅｄｔ）　、クニーン（　Ｋｎｅｅ
ｎ　）　＆ブリシュ（　Ｂｉｉｓｈ　）の方法（　ｃ　
ｅｒｅａｌ　Ｃｈｅｍ．　，第１６巻、第１７２頁（１
９３９年）および米国農業省のＴｅ−ｃｈｎｉｃａｌ　
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ．　　１　０　２　４号）によって測
定することができる。この場合、ｌアミラーゼ単位（＝
ｌＳＫＢ単位）は、３０℃およびその他の規定反応条件
で、溶性デンブン１ｇを１時間内にデキストリン化する
ことのできるような酵素量である。

さらに、膵臓アミラーゼの活性の測定のためにはウイル
ステッター（　Ｗｉｌｌｓｔａｅｔｔｅｒ　）の方法が
利用される（　Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒｓ，　　Ｚ．
　Ｐｈｙ−ｓｉｏ１、Ｃｈｅｍ　　，第１２６巻、第１
４３頁（１９２３午））。この場合、ｌウイルステッタ
ー・アミラーゼ単位は、与えられた実験条件でデンプン
を、単分子の反応定数がｏ．ｏｉに等しいような速度で
分解するような酵素量の百倍と定義される。

さらに、タンパク質分解随伴活性を有するリバーゼ（Ｅ
．Ｃ．３．１、１．３）に対する適用も本発明方法の範
囲に入る。グリセリンエステルを水エマルジョン中で分
解する公知のカルポキシルエステラーゼがリパーゼと指
称されるこの場合、次のものが区別される： 膵臓酵素複合体中にエステラーゼ、プロテアーゼおよび
アミラーゼと共に工業的に重要な随伴酵素として含まれ
ている膵リパーゼ。至適ｐＨ（オリーブ油に対して）は
、７〜８．５の範囲内にあり、活性範囲はｐＨ６．５〜
９．５である。リパーゼは一般に、殊に随伴プロテアー
ゼによるタンパク質分解様の分解に対して極めて不安定
であるとされている。さらに、たとえばゾンイドモナス
−７ラギイイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉｉ
）、ァスペルギルスｓｐ（たとえばＡ．　ｌｕｃｈｕｅ
ｎｓｉｓ）カンジダ・シリンドラセア（　Ｃａｎｄｉｄ
ａ　ｃｙｌｉｎｄ−ｒａｃｅａ）　ｓゲオトリクムカン
ジドム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）　、
７ミコラランギノサ（　ＨｕｍｉｃｏｌａＩａｎｇｕｉ
ｎｏｓａ）　，ムコールプシルス（　Ｍｕｃｏｒ　ｐｕ
−ｓｉｌｌｕｓ）　、ペニシリウムｓｐ．　　（たとえ
ばｐ．ｃｈ−ｒｙｓｏｇｅｎｕｍ．　Ｐ．　ｏｘａｌｉ
ｃｕｍ　）　、リゾプス　ｓｐ．　　（Ｒ．　ｎｉｇｅ
ｒｉｃａｎｓ，　Ｒ．　Ｏｒｙｚａｅ）　ｏこれらのリ
パーゼは、通例ｐＨ＞　７　．　０の至適ｐＨを有する
。慣例では、基質としてオリーブ油を用いるリパーゼの
活性測定が実施され、さらにトリアセチンおよびトリブ
チリンを用いる測定も実施される［　Ｍ．　Ｓｅｍｅｒ
ｉｖａ等、　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ″、第ｌＯ巻
、第２１４３頁（１９７１午）；１９７８午Ｒ，　Ｒｕ
ｙｓｓｅｎおよびＡ．　Ｌａｕ−ｖｅｒｓ編集“Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ，　　（　Ｆ
　ＩＰ）ｎ参照］。

脂肪分解活性をキロリバーゼ単位（単位一ＫＬＣＡ）で
表わす限り、標準条件（４０°０，ｐＨ−５．５）下で
基質としてトリブチリンを用いて作業する（　Ｍ．　Ｓ
ｅｍｅｒｉｖａ，上記引用文献参照）リバーゼは、その
不安定性が許容する限り、なかんずく廃物除去、製革工
業および栄養分野において使用される。

本発明方法のとくに望ましい対象は、膵臓複合体である
。膵臓中では、トリプシノーゲン含量は全タンパク質含
量の約２３重量％、キモトリブシン含量は約１０−１４
％に達する。膵臓複合体のとくに重要な酵素は既に上述
されている。さらに、ウシ膵臓からは、酵素リボヌクレ
アーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．７．１６）、デソキシリポヌ
クレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．４．５）、キモトリプシ
ノーゲンＢおよびキモトリプシノーゲンＣならびにトリ
ブシノーゲンが単離される。膵臓複合体からの酵素の単
離は、文献に詳細に記載されている（たとえばＵｌｌｍ
ａｎｎ，第１０巻、Ｉｏｃ．　ｃｉｔ，第５３５頁〜第
５３７頁参照）。

方　　法 Ａ．膵臓複合体からの単離 本発明方法は、部分的に技術水準の単離法に準拠するこ
とができる（　Ｕｌｌｍａｎ　，第ｌＯ巻、１ｏｃ．　
ｃｉｔ，第５３６頁〜第５３７頁参照）。

１．　　抽　　出 単離は有利には、主としてブタまたはウシの屠殺直後の
膵臓から出発する。たとえば約１００個の膵臓を１つの
バッチで、屠殺後直ちに脂肪および結合組織をできるだ
け良好に腺房から除去し、腺房組織を、たとえば肉挽き
機を用いて均質にする。それに直接引き続いて、有利に
はほぼ２倍量（約６００の０．２５ｎの硫酸で５℃で１
８〜２４時間抽出する。濾過７ロツクの添加後、有利に
は包装材圧縮機により圧搾する。圧搾板は投棄すること
ができる。

２．方法 膵臓からの十分に脂肪を有しない搾出汁を、大量の硫酸
ナトリウムまたは硫酸アンモニウム（“Ａ塩″）で、有
利には迅速な添加により室温で沈殿させる。固体の無水
Ａ塩の添加量は有利には、搾出汁に対して約５０±２重
量％である。

強力に撹拌する（たとえば７エースギャ撹拌機を用いて
）ことにより、沈殿物を微細な分配度になるまで打砕す
るのが有利である。しかし多くの場合この手段は不要で
ある。それというのもＡ塩の迅速な添加のため膵臓酵素
の沈殿は容易に微細な形で行なわれるからである。

必要に応じ、生放物を特定の所望活性に調整／Ｉｇ準化
するため、等張Ａ塩溶液（たとえば水６１．７＃ｇに対
しＡ塩３８．３７２ｇ）で希釈する。

固体Ａ塩ないしは水の添加によって、水性酵素製剤の１
．２２〜１．２３の密度を調整することができる。膵臓
複合体を用いた経験は、狭い密度範囲内、すべての結果
によれば１．２２〜１．２３の密度範囲内でのみ酵素懸
濁液は十分に沈積安定にとどまることを示唆する。それ
で、必要な狭い密度範囲の維持は、本発明にとり本質的
である。この規則は、上述したような他の起源の酵素の
粗抽出物についても言える。

３．別の調整 殊に膵臓起源の培養濾液を本発明により等張調節するこ
とによって、数日ないし数週間の時間の要求を確実に考
慮する沈積安定な組成物を利用することができるので、
この場合工業的利用のための前提条件が満足されている
。それでも、沈積安定性の損害は、担持液（水）の蒸発
ないしは強い温度変化、それと結合した密度変化ないし
は密度変動によって起りうる。この場合、酵素懸濁液の
破壊（分離ないしは沈積）が生じる。しかし、実地の十
分な要求は、完全に沈積安定で均質な酵素製剤を目指す
。意外にもキサンタンを主体とする少なくとも１つの濃
稠化剤の使用によってのみ高電解質含有酵素懸濁液（た
とえばＡ塩含量３８．３重量％）の十分な濃稠化の達戒
に戊功する。殊にキサンタン［Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｖ
ｉｄ　Ｂ　−　１　４　５　９　，　Ｋｅｌｔｒｏｌ　
Ｆ．　Ｋｅ−ｌｚａｎ；　　Ｋｉｒｋ　−　Ｏｔｈｍｅ
ｒ，　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｒ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第３判、第１２巻、第６
２頁〜第６６頁、Ｊ．　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　ｌ
　９　８　０年、Ｒｅｓｓ　＆　Ｗｅｌｃｈ　，　Ａｎ
ｇｅｗ　Ｃｈｅｍｉｅ，第８９巻、第２２８頁〜第２３
９頁（１９７７午）参照１ないしはキサンタンを主体と
する他の濃稠化剤が有利であることが立証されている。

たとえば、特殊な変性キサンタン誘導体（たとえばＫＩ
Ａ９　６　，　ａｍｉｏｎ　Ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙｓａ
ｃｃｈａｒｉｄ　ｄ　，　Ｆａ．Ｋｅ−１ｃｏ．サンジ
エゴ、米国）を用いる濃稠化は、３８．３重量％のＡ塩
溶液０．１〜５％、とくに０．１−１％の濃度で２　０
　０−　１　０　０　０ｍＰａ．ｓの粘度を生じる。

通例、固体Ａ塩３８．３重量％の溶液中でキサンタンな
いしはその誘導体０．１〜５％（重量）溶液を用いる濃
稠化は、キサンタンをせん断下、たとえば極めて迅速（
周速度１〜５ｍ／ｓｅｃ使用）に混入する場合、非常に
良好な結果が得られる。このキサンタン溶液は、望まし
くは沈殿のために使用したＡ塩溶液と等張である。該溶
液は、Ａ塩で沈殿させた膵臓搾出汁に添加して、それに
より所望の酵素最終活性を調節することができる。それ
にも拘らず、非等張条件の場合、たとえばｌ−１．５の
広い密度範囲内でさ尤も得られる濃稠化は、沈積安定の
酵素組成物を得るのに十分であることが判明した。Ａ塩
で沈積した膵臓懸濁液を濃稠化等張Ａ塩溶液で希釈する
場合に約５０％の粘度減少が生じることが認められる。

１００〜５　０　０　　ｍＰａ．ｓの残存粘度は、完全
な沈積および活性安定の均質な酵素製剤を得るのに十分
である。

Ｂ．他のプロテイナーゼ含有粗抽出物からの単離 膵臓搾出汁の代りに、たとえば真菌または細菌培養液か
らの他のプロテイナーゼ含有培養液を使用することもで
きる（酵素起源に対する上述の記載参照）。

さらに、本発明による方法は真菌ブロテイナーゼ／膵臓
ブロテイナーゼないしは細菌プロテイナーゼ／膵臓プロ
テイナーゼの組合せに適用することも可能である。この
場合、たとえば２つの方法が存在する： ａ）　異なる培養液を５〜ｌＯ℃で混合し、直ちにＡ塩
での沈殿を実施する。引き続き、場合により濃稠化され
たＡ塩溶液を用いて等張希釈することにより所望の最終
活性を調節する。

ｂ）　細菌ないし真菌ブロテイナーゼ製剤（Ａ塩沈殿）
を、膵臓懸濁液と類似であるが別個に製造する。引き続
き、膵臓製剤に等張真菌ないしは細菌プロテイナーゼ製
剤を加え、場合により標準化のため等張希釈し、場合に
より濃稠化した等張Ａ塩溶液で安定化する。

双方の場合に、沈積安定ならびに活性安定の組成物が得
られる。全酵素懸濁液の場合、高い電解質含量に基づき
、一般に微生物学的安定化は必要でない。他面において
、慣用の防腐剤の添加（技術水準参照）は技術的理由か
らは妨げにならない。

すべての酵素に対し、これまで存在している経験によれ
ば、液状媒体は沈積安定性を達或するためには、１．２
２〜ｌ９２３の密度範囲を有しなければならない。この
ことは、濃稠化剤を用いる最終調整についても言える。

次の実施例は、本発明方法の説明のために役立つもので
ある。

密度の測定は２０℃の適当なメスシリンダ中に定義され
た体積量を正確に秤取することによって行なわれる。

［実施例］ 例　　ｌ 密度１　．２　２〜１　．２　３　ｇ／ｃｍ３（２　０
°Ｃ）を有する等張液の製造 撹拌容器中に水道水６１．７７２９を装入し、無水の硫
酸アンモニウム３８．３ｋｇを加える。全塩量が溶解す
るまで撹拌する。１．２２〜１．２３の密度が得られな
い場合には、この密度を塩または水の添加によって調節
することができる例　　２ 膵臓酵素を主体とする水性液体酵素組成物の製造 膵臓を粉砕、活性化および抽出した後に生じるような３
０１００ＬＶＥの活性を有する搾出汁ｌＯＯｋｇを撹拌
容器に装入し、硫酸アンモニウム５０ｋｇを加える。膵
臓酵素の沈殿が行なわれる。膵臓酵素懸濁液（２　９　
６　０　０　ＬＶＥ）は２８０００　〜３２０００ＬＶ
Ｅ／ｇ（密度１．２　２＝　１　．２　３ｇ／ｃｍ３）
　（７）平均活性ヲ有スル。

例ｌからの等張アンモニウム塩溶液の添加によって、所
望のＬＶＥ活性を調節することができる。酵素製剤を希
釈するほど、沈殿する酵素の沈積はますます迅速に行な
われる。

１０００〜３０００ＬＶＥ： 数時間ないしは数日後の沈積 ″３０００〜９０００ＬＶＥ： １週ないしは数週間後の沈積 約１６０００ＬＶＥから二十分に沈積安定−２５℃でも
６週間後の純水性膵臓酵素溶液の活性損失＝８１％ 一２５°Ｃで６週間後の膵臓からの沈殿した酵素懸濁液
の活性損失：８６９％ 例　　３ ３２０００ＬＶＥの活性を有する、アスペルギルス・バ
ラシチカス（　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｓｉ
−ｒｉｃｕｓ　）からの真菌プロテアーゼの澄明な水溶
液ｌ００ｋｇに、ｌ６゜Ｃで硫酸アンモニウム５０ｈｇ
を加え、これにより酵素を析出させる。密度１　．２　
２　〜１　．２　３　ｙ／ｃｒａ３を有する酵素懸濁液
（３１４００ＬＶＥ）　を、例１からの等張硫酸アンモ
ニウム溶液で所望の活性に希釈する。数日間沈積安定で
ある酵素製剤が得られる。

２５℃で６週間の放置時間後の酵素懸濁液の活性損失：
４．３％ 比較して： ２５℃で６週間の放置時間後の純水性真菌プロテアーゼ
（沈殿なし）の活性損失：６２％例　　４ 活性３０１００ＬＶＥおよび温度１０゜Ｃを有する液状
膵液（例２かも）５０＃ｇおよび活性３２０００および
温度１０℃を有する液状真菌プロテアーゼ液（例３から
）５０＃ｇを、撹拌容器中で混合する。混合の直後に、
硫酸アンモニウム５０ｋｇを手早く添加し、これにより
酵素を沈殿させる。活性６１２００ＬＶＢを有する酵素
懸濁液が得られる。密度は１．２２〜１．２３　ｇ／ｃ
ｒＲ３の間である。例ｌからの等張硫酸アンモニウム溶
液で希釈することによって、所望の活性を調節すること
ができる。

２５゜Ｃで６週間後の酵素混合物（沈殿なし）の活性損
失：７４％ ２５℃で６週間後の酵素懸濁液（沈殿）の活性損失：ｌ
０．１％ 例　　５ バチルス・リケニホルミス（　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からの液状水性細菌プロテア
ーゼ（４３２００ＬＶＥ１　ｔｏ゜Ｃ）５０ｋｇおよび
例２かもの液状膵臓搾出汁（３　１　１００ＬＶＥ，１
０℃）５０ｋｇを、撹拌容器中で混合し、硫酸アンモニ
ウム５０７２ｇを加える。これにより、酵素は沈殿する
。３５４００ＬＶＥの活性を有する酵素懸濁液が得られ
る。この懸濁液は１．２２〜１．２３ｇ／ｃｍ３の密度
を有し、等張硫酸アンモニウム溶液（例ｌ）で希釈する
ことによって所望の活性に調節することができる。２５
゜Ｃで６週間放置した後、活性は約１２％低下した。

これとは異なり、沈殿しなかった酵素混合物の活性は同
じ条件下で約８８％低下した。

例　　６ ａ）＃臓酵素沈殿物（活性２９６００ＬＶＥ／グを有す
る例２からの分散液）　３　＃ｇに、等張硫酸アンモニ
ウム溶液２６．６＃ｇを混合する。活性３　０　０　０
　ＬＶＥを有する、３日間沈積安定の酵素懸濁液が得ら
れる。生戒物は、２５゜Ｃで６週間の放置時間後に８．
７％の活性を失なった。

ｂ）真菌プロテアーゼ沈殿物（活性３１４００ＬＶＥ／
９を有する例３からの分散液）３ｋｇに、等張硫酸アン
モニウム溶液２８．４　　ｋｇを混合する。活性３００
０ＬＶＥを有する４日間沈積安定の酵素懸濁液が得られ
る。この懸濁液は、６週間の放置時間後に５．５％の活
性を失なりＩこ　。

活性３０００ＬＶＥを有する、例６ａからの膵臓プロテ
アーゼ懸濁液３０７２ｇに、活性３０００ＬＶＥを有す
る例６ｂからの真菌プロテアーゼ懸濁液同じ＜３０ｋｇ
を加える。混合物は３０００ＬＶＥの活性および１　．
２　２　ｇ／ｃｍ３の密度を有する。２５゜Ｃで６週間
放置した後、活性は約９．８％低下した。これに対して
、同じ酵素の沈殿させなかった混合物は相応する条件下
で８８％の活性を失なう。

例　　７ 完全に沈積安定で、直ちに使用しうる、良流動性の水性
酵素製剤の製造 ａ）撹拌容器中に水６０．７ｋｇを装入し、７エースギ
ャ撹拌機（周速度２〜３ｍ／ｓｅｃ）を用いてキタンサ
ンを主体とする濃稠化剤（たとえばＫＩＡ９６、Ｋｅｌ
ｃｏ社）ｌａｇを混入する。溶液の粘度が＞１０００ｍ
Ｐａに増加したら、硫酸アンモニウム３８．３ｋｇを加
える。硫酸アンモニウムが十分に溶解してしまうまで撹
拌する。この場合、粘度は４８０ｍＰａに低下する。

ｂ）例４からの沈殿した酵素懸濁液（６１２００ＬＶＥ
；′真菌酵素）３ｋｇを、例７ａからの濃稠化された硫
酸アンモニウム溶液５８．２７ｌｇを加え、フェースギ
ャ撹拌機を用いて均質に混合する。活性３　０　０　０
　ＬＶＥ８よび２　７　０　　ｍ．Ｐａｓの粘度を有す
る完全に沈積安定の酵素懸濁液が得られる。沈殿させな
かった酵素混合物の場合２５°Ｃで６週間放置した後に
７４％の活性低下が観察され、相応する濃稠化された酵
素懸濁液はたんに９．２％の活性損失を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水媒体中に存在する酵素を微細に分配して沈殿させ
   、その後同じ水媒体中で密度調整により、沈積安定の微
   細分散の分配状態の酵素を製造することを特徴とする十
   分な安定性を有するタンパク質分解作用酵素の水性液体
   組成物の製造方法。 ２、水媒体中に存在する酵素が主としてプロテアーゼ（
   Ｅ．Ｃ．３．４）である、請求項１記載の方法。 ３、微細分配の沈殿を不活性塩の添加によって生起させ
   る、請求項１または２記載の方法。 ４、沈殿を硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用
   いて生起させる、請求項３記載の方法。 ５、調整によって達成される水媒体の密度が１．２２〜
   １．２３の範囲内にある、請求項１から４までのいずれ
   か１項記載の方法。 ６、微細分配の酵素懸濁液をさらに沈積安定化するため
   、キサンタンを主体とする濃稠化剤を加える、請求項１
   から５までのいずれか１項記載の方法。 ７、キサンタンを主体とする濃稠化剤を、硫酸アンモニ
   ウムまたは硫酸ナトリウム含有等張水溶液の形で加える
   、請求項６記載の方法。 ８、キサンタンを主体とする濃稠化剤を含有する溶液を
   、せん断力の作用下に撹拌混入することによって製造す
   る、請求項７記載の方法９、キサンタンを主体とする濃
   稠化剤が溶液０．１〜１重量％である、請求項８記載の
   方法。 １０、別個に製造した酵素懸濁液を安定な組成物に混合
   する、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。