DE3850527T2

DE3850527T2 - Glyphosat-tolerante 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimat-Synthase.

Info

Publication number: DE3850527T2
Application number: DE3850527T
Authority: DE
Inventors: Ganesh Murthy Kishore; Dilip Maganlal Shah
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1987-05-26
Filing date: 1988-05-25
Publication date: 1994-12-22
Anticipated expiration: 2008-05-26
Also published as: US4971908A; EP0293358B1; EP0293358A3; IL86500A0; AU1660188A; CN1032030A; ES2058338T3; DK285688A; ATE108203T1; DE3850527D1; NZ224782A; EP0293358A2; JPS6439984A; DK285688D0

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Jüngste Fortschritte in der Gentechnik erbrachten die erforderlichen Werkzeuge, um Pflanzen so zu transformieren, daß sie Fremdgene enthalten. Es ist nunmehr möglich, Pflanzen zu erzeugen, die einzigartige Charakteristika von agronomischer Bedeutung besitzen. Gewiß ist einer dieser vorteilhaften Züge die Herbizidverträglichkeit. Herbizidverträgliche Pflanzen könnten die Notwendigkeit des Pflügens zur Bekämpfung von Unkräutern verringern und dadurch die Kosten für den Bauern wirksam verringern.
Ein Herbizid, welches in dieser Hinsicht vielfachen Untersuchungen unterzogen worden ist, ist N-Phosphonomethylglycin.
Dieses Herbizid ist ein nicht-selektives Nachauflauf-Herbizid mit breitem Spektrum, welches zur Anwendung bei mehr als fünfzig Feldfrüchten registriert ist. Dieses Molekül ist eine Säure, die in wässeriger Lösung dissoziiert, um phytotoxische Anionen zu bilden. Mehrere anionische Formen sind bekannt. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Glyphosat" auf die Säure und deren Anionen.
Glyphosat hemmt den Shikimisäure-Stoffwechselweg, der einen Vorläufer für die Synthese von aromatischen Aminosäuren liefert. Insbesondere hemmt Glyphosat die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat und 3-Phosphoshikimisäure zu 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimisäure durch Inhibition des Enzyms 4-enolpyruvyl-3-phosphoshikimatsynthase.
Es hat sich gezeigt, daß Glyphosat-verträgliche Pflanzen erzeugt werden können, indem in das Genom der Pflanze die Fähigkeit inseriert wird, eine größere Menge an EPSP-Synthase zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung schafft ein Mittel zur Verbesserung der Wirksamkeit von Glyphosat-verträglichen Pflanzen durch Erzeugung mutierter EPSP-Synthase-Enzyme, die unter Beibehaltung ihrer katalytischen Aktivität eine geringere Affinität für Glyphosat aufweisen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenzen für die EPSP-Synthaseenzyme von E. coli 11303 und E. coli 11303 SM-1.
Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenzen für EPSP-Synthaseenzyme aus verschiedenen Pflanzen-, Bakterien- und Pilzarten.
Fig. 3 zeigt eine Plasmidkarte zur Ko-Integration des Pflanzentransformationsvektors pMON316.
Fig. 4 zeigt die Sequenz für den CaMV35S-Promotor, den synthetischen Multi-Linker und das NOS3'-Transkriptionsterminator/ Polyadenylierungssignal, welche bei den hier beschriebenen Vektoren verwendet werden.
Fig. 5 zeigt eine Plasmidkarte für den binären Pflanzentransformationsvektor pMON505.
Fig. 6 zeigt eine Plasmidkarte für den binären Pflanzentransformationsvektor pMON530.
Fig. 7 zeigt eine schematische Darstellung der Stempel- und Staubbeutel-cDNA-Klone der Tomaten-EPSP-Synthase.
Fig. 8 zeigt einen schematischen Vergleich der genomischen Klone der EPSP-Synthase von Petunie und Arabidopsis.
Fig. 9 zeigt die bei der Herstellung von Plasmid pMON851 verwendeten Schritte.
Fig. 10 zeigt die bei der Herstellung von Plasmid pMON857 verwendeten Schritte.
Fig. 11 zeigt repräsentative Inhibitionsdaten für Glyphosatverträgliche EPSP-Synthase gegen Wild-Typ-EPSP-Synthasen.
Fig. 12 zeigt die Glyphosatverträglichkeit der mutierten Mais-EPSP-Synthase der vorliegenden Erfindung gegenüber Wild-Typ- Mais-EPSP-Synthase.

DARLEGUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung schafft neue EPSP-Synthaseenzyme, die eine erhöhte Verträglichkeit gegenüber einem Glyphosat- Herbizid zeigen. Die gegenständlichen Enzyme dieser Erfindung besitzen eine Alanin-zu-Glycin-Substitution, wie nachstehend beschrieben.
Die vorliegende Erfindung wurde zum Teil durch die Entdeckung eines E. coli-Bakteriums, das ein verändertes EPSP-Synthase-Gen trug, ermöglicht. Dieser Organismus wurde auf folgende Weise erhalten.
Zellen von E. coli ATCC 11303 wurden in Medium A transferiert und bei 37ºC inkubiert.

MEDIUM A

10X MOPS¹-Medium 50 ml
50% Glucoselösung (50g/100 ml) 2 ml
100 mM Aminomethylphosphonat (Natriumsalz) 10 ml
Thiamin (5 mg/ml) pH 7,4 1 ml
100 mM Glyphosat (Natriumsalz) 10 ml
Entionisiertes Wasser auf 500 ml
10X MOPS-Medium:
pro 500 ml
1 M MOPS (209,3 g/l, pH 7,4) 200 ml
1 M Tricin (89,6 g/l, pH 7,4) 20 ml
0,01 M FeSO&sub4;·7H&sub2;O (278,01 mg/100 ml) 5 ml
1,9 M NH&sub4;Cl (50,18 g/500 ml) 25 ml
0,276 M K&sub2;SO&sub4; (4,81 g/100 ml) 5 ml
0,5 mM CaCl&sub2;·2H&sub2;0 (7,35 mg/100 ml) 5 ml
0,528 M MgCl&sub2; (10,73 g/100 ml) 5 ml
5 M NaCl (292,2 g/l) 50 ml
0,5% L-Methionin (500 mg/100 ml) 5 ml
Mikronährstoffe*
*Mikronährstoffe in 25 ml H&sub2;0
ZnSO&sub4; (2,88 mg/ml) 25 ul
MnCl&sub2; (1,58 mg/ml) 250 ul
CuSO&sub4; (1,6 mg/ml) 25 ul
CoCl&sub2; (7,14 mg/ml) 25 ul
H&sub3;BO&sub3; (2,47 mg/ml) 250 ul
NH&sub4;MO&sub7;O&sub2;&sub4; (3,71 mg/ml) 25 ul
¹MOPS - 3-N-Morpholino-propan-sulfonsäure
Nach einer Woche wurde eine Kultur erhalten, die in Anwesenheit hoher Konzentrationen von Glyphosat im Wachstumsmedium (10 mM oder höher) rasch wachsen konnte. Eine Analyse der EPSP-Synthase- Aktivität in den Extrakten dieser Kultur und ein Vergleich ihrer Glyphosatsensibilität gegenüber der von Wild-Typ E. coli ATCC 11303 zeigte, daß der mutierte Organismus eine veränderte EPSP- Synthase besaß. Die Glyphosatsensibilität der EPSP-Synthase von mutierten Zellen war deutlich verschieden von jener der Wild-Typ- Zellen. Dieses mutierte Bakterium wurde mit E. coli 11303 SM-1 bezeichnet. Das für die EPSP-Synthase codierende aroA-Gen dieses mutierten Bakteriums wurde wie folgt isoliert.
Die DNA aus diesem Bakterium wurde mittels des Verfahrens von Marmur (1961) isoliert. Southern-Hybridisierung unter Verwendung des E. coli K-12 aroA Gens (Rogers et al., 1983), da die Sonde zeigte, daß das aroA-Gen im mutierten Bakterium auf einem 3,5 Kb BGlII-HindIII-Fragment war. Dieses Fragment wurde in den Vektor pKC7 (Rao, R. N. & Rogers, 1979) kloniert, und das resultierende Plasmid wurde zur Transformation von E. coli verwendet. Transformierte Kolonien wurden auf ihre Fähigkeit, in Anwesenheit von Glyphosat (Medium A) zu wachsen, überprüft, und es zeigte sich, daß sie das 3,5 Kb BglII-HindIII-Insert durch Hybridisierung mit dem E. coli K-12 aroA-Gen enthielten. Dieser Klon wurde mit pMON9538 bezeichnet.
Die Nucleotidsequenz für das mutierte E. coli EPSP Synthase aroA-Gen wurde mittels der Methode von Sanger (1977) bestimmt, und die entsprechende Aminosäuresequenz für die codierte EPSP-Synthase wurde davon abgeleitet.
Alle in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen dargestellten Peptidstrukturen sind im üblichen Format gezeigt, wobei die Aminogruppe am N-Terminus links aufscheint und die Carboxylgruppe am C-Terminus rechts aufscheint. Gleichermaßen ist die Aminosäurenomenklatur für die im Protein gefundenen, natürlich vorkommenden Aminosäuren wie folgt: Alanin (Ala;A), Asparagin (Asn;N), Asparaginsäure (Asp;D), Arginin (Arg;R), Cystein (Cys;C), Glutaminsäure (Glu; E) , Glutamin (Gln;Q), Glycin (Gly;G), Histidin (His;H), Isoleucin (Ile;I), Leucin (Leu;L), Lysin (lys;K), Methionin (Met;M), Phenylalanin (Phe;F), Prolin (Pro;P), Serin (Ser;S), Threonin (Thr;T), Tryptophan (Trp;W), Tyrosin (Tyr;Y) und Valin (Val;V).
Die Aminosäure- und Nucleotid-Sequenzen für die oben beschriebenen mutierten und die Wild-Typ-EPSP-Synthaseenzyme von E. coli sind in Fig. 1 gezeigt. Die mutierte E. coli-EPSP- Synthasesequenz hat eine Alanin-zu-Glycin-Substitution an der Position 96.
Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz für die EPSP-Synthase aus verschiedenen Pflanzen-, Bakterien- und Pilzarten. Eine Untersuchung der Sequenzen und eine Ausrichtung zur Maximierung der Ähnlichkeit von Sequenzen zeigt einen Bereich von stark konservierten Aminosäureresten (durch den eingekastelten Bereich angedeutet) im Bereich der E. coli-EPSP-Synthase-Mutante, in dem eine Substitution von Alanin zu Glycin auftrat. Tatsächlich zeigen alle EPSP-Synthaseenzyme, von denen in der Literatur berichtet ist, und jene der vorliegenden Beschreibung ein Glycin an dieser Position in diesem stark konservierten Bereich.
Insbesondere tritt der Glycinrest, der bei der Herstellung der Glyphosat-verträglichen EPSP-Synthasen der vorliegenden Erfindung mit dem Alaninrest substituiert ist, an der Position 97 in der EPSP-Synthase von Aspergillus nidulans auf (Charles et al., 1986); an der Position 101 in der EPSP-Synthase der Petunie; an der Position 101 in der EPSP-Synthase der Tomate; an der Position 101 in der EPSP-Synthase von Arabidopsis thaliana; an der Position 104 in der EPSP-Synthase von Brassica napus; an der Position 96 in der EPSP-Synthase von E. coli K-12 (Duncan et al., 1984) und an der Position 96 in der EPSP-Synthase von Salmonella typhimurium (Stalker et al., 1985).
Es zeigte sich, daß das Alanin zur Glycin-Substitution in diesem hoch konservierten Bereich anderer Wild-Typ-EPSP-Synthaseenzyme eingeführt werden kann, um Glyphosat-verträgliche EPSP- Synthaseenzyme zu ergeben. Fig. 11 zeigt repräsentative Inhibitionsdaten für Glyphosat-verträgliche EPSP-Synthasen der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu Wild-Typ-EPSP-Synthasen.
Daher sieht die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt Glyphosat-verträgliche EPSP-Synthaseenzyme und ein Verfahren zur Herstellung solcher Enzyme vor, bei welchem ein Alaninrest für den zweiten Glycinrest im hoch-konservierten Bereich mit der Sequenz:
-L-G-N-A-G-T-A- oder in einer homologen Sequenz hievon substituiert wird, wobei sich die Sequenzen zwischen den Positionen 80 und 120 in der reifen Wild-Typ-EPSP-Synthaseaminosäuresequenz befinden. In den meisten Fällen befindet sich die obige Sequenz zwischen den Positionen 90 und 110 in der reifen EPSP-Synthase.
Bei einer Ausführungsform sind die Glyphosat-verträglichen EPSP-Synthase-codierenden Sequenzen zur weiteren Verbesserung der Wirksamkeit von Glyphosat-verträglichen transgenen Pflanzen geeignet. Verfahren zur Transformation von Pflanzen zwecks Glyphosat-Verträglichkeit sind in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 0218571 und in der U.S. Patentanmeldung mit dem Titel "Glyphosate-Resistant Plants", Ser. No. 879,814, eingereicht am 7. Juli 1986, geoffenbart, welche Offenbarungen hierin durch Hinweis insbesondere miteinbezogen sind. Die vorliegende Erfindung kann auf diese Weise durch Isolieren der Pflanzen- oder anderer EPSP-Synthase-codierender Sequenzen und Einführen der nötigen Veränderung in die für EPSP- Synthase codierenden DNA-Sequenz zum Erhalt des zuvor erwähnten Alanins zur Glycin-Substitution im translatierten EPSP-Synthaseenzym verwendet werden.
Gemäß einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine transformierte Pflanzenzelle und eine daraus regenerierte Pflanze vor, die ein Pflanzengen enthalten, das für ein Glyphosatverträgliches EPSP-Synthaseenzym codiert, welches die Sequenz
-L-G-N-A-A-T-A- oder eine homologe Sequenz davon enthält, die einen Alaninrest an ihrer Position 5 enthält, wobei sich die Sequenzen zwischen den Positionen 80 und 120 in der reifen EPSP-Synthaseaminosäuresequenz befinden. In den meisten Fällen befindet sich die obige Sequenz zwischen den Positionen 90 und 110 in der reifen EPSP-Synthase. Das Gen hat weiter eine DNA-Sequenz, die für ein Chloroplast- Transit-Peptid codiert, das am N-Terminus der reifen EPSP- Syhthase-Codiersequenz angehängt ist, wobei das Transitpeptid so ausgelegt ist, daß es den Eintritt des EPSP-Synthaseenzyms in den Chloroplasten einer Pflanzenzelle erleichtert.
Daher ist gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung auch ein Pflanzentransformations- oder Expressionsvektor vorgesehen, der ein Pflanzengen aufweist, das für ein Glyphosatverträgliches EPSP-Synthaseenzym mit der Sequenz:
-L-G-N-A-A-T-A- oder einer homologen Sequenz davon codiert, die einen Alaninrest an ihrer Position 5 enthält, wobei sich die Sequenzen zwischen den Positionen 80 und 120 in der reifen EPSP- Synthaseaminosäuresequenz befinden.
Die in Fig. 2 gezeigten EPSP-Synthasesequenzen repräsentieren einen breiten Evolutionsbereich von Ausgangsmaterialien für EPSP- Synthasen. Diese Daten zeigen, daß EPSP-Synthasepolypeptide aus Bakterien-, Pilz- und Pflanzenmaterial den zuvor erwähnten konservierten Bereich (-L-G-N-A-G-T-A-) enthalten. Die Fachwelt wird jedoch erkennen, daß eine bestimmte EPSP-Synthase von einem anderen Ausgangsmaterial erzeugt und von diesem isoliert werden kann, welches nicht die exakte Sequenz des konservierten Bereichs hat. Tatsächlich fand man, daß ein Alanin für das erste Glycin des konservierten Bereichs von Petunien-EPSP-Synthase inseriert werden kann, ohne daß damit Änderungen in der Glyphosatsensibilität verbunden sind.
Daher werden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Glyphosat-verträgliche EPSP-Synthasepolypetide, die hergestellt werden durch Substitution eines Alanins für das zweite Glycin in einer Sequenz, die zur Sequenz (-L-G-N-A-G-T-A-), die sich zwischen den Positionen 80 und 120 befindet, homolog ist, als Äquivalent zur vorliegenden Entdeckung angesehen und werden daher als in den Bereich der Erfindung fallend betrachtet.
Das Glyphosat-verträgliche EPSP-Synthase-Pflanzengen codiert für ein Polypeptid, welches ein Chloroplastentransitpeptid (CTP) enthält, das es dem EPSP-Synthase-Polypeptid (oder einem aktiven Teil davon) ermöglicht, in einen Chloroplasten im Inneren der Pflanzenzelle transportiert zu werden. Das EPSP-Synthasegen wird in mRNA im Kern transkribiert, und die mRNA wird in ein Vorläufer- Polypeptid (CTP/reife EPSP-Synthase) im Cytoplasma translatiert. Das Vorläufer-Polypeptid (oder ein Teil davon) wird in den Chloroplasten transportiert.
Geeignete CTPs zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung können aus verschiedenen Quellen erhalten werden. Am bevorzugtesten erhält man das CTP aus dem endogenen EPSP-Synthase-Gen der gegenständlichen, zu transformierenden Pflanze. Alternativ kann man auch ein CTP aus einem EPSP-Synthase-Gen einer anderen Pflanze verwenden. Obwohl zwischen den CTP-Sequenzen des EPSP-Synthase- Gens und des ssRUBISCO-Gens wenig Homologie vorhanden ist (vgl. z. B. Broglie, 1983), kann es sich zeigen, daß nicht-homologe CTPs in bestimmten Ausführungsformen funktionieren können. Geeignete CTP-Sequenzen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können durch Untersuchung der Chloroplastenaufnahme eines EPSP- Synthasepolypeptids, das das interessante CTP aufweist, leicht bestimmt werden, wie in Beispiel 18 nachstehend beschrieben.
Geeignete Pflanzen zur Ausübung der vorliegenden Erfindung umfassen Soyabohnen, Baumwolle, Luzerne, Ölsaatenraps, Flachs, Tomaten, Zuckerrübe, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Mais, Weizen, Reis und Salat, sind aber nicht auf diese eingeschränkt.
Promotoren, von welchen bekannt ist oder bei welchen es sich zeigt, daß sie die Transkription des EPSP-Synthase-Gens in Pflanzenzellen bewirken, können bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Promotoren können aus Pflanzen oder Viren erhalten werden und umfassen die 35S- und 19S-Promotoren von Blumenkohlmosaikvirus und Promotoren, die aus Pflanzengenen isoliert sind, wie EPSP-Synthase, ssRUBISCO-Gene und Promotoren, die aus T-DNA-Genen von Agrobacterium tumefaciens erhalten werden, wie Nopalin- und Mannopinsynthase. Der ausgewählte spezielle Promotor sollte eine ausreichende Expression bewirken können, um zur Produktion einer wirksamen Menge von EPSP-Synthasepolypeptid zu führen, um die Pflanzenzellen und die daraus regenerierten Pflanzen im wesentlichen resistent gegen Glyphosat zu machen. Die Fachleute werden erkennen, daß die Menge des zur Herbeiführung einer Toleranz nötigen EPSP-Synthasepolypeptids je nach dem Pflanzentyp variieren kann.
Die im EPSP-Synthase-Gen dieser Erfindung verwendeten Promotoren können gewünschtenfalls zur Änderung ihrer Expressionscharakteristika weiter modifiziert sein. Beispielsweise kann der CaMV35S-Promotor mit jenem Teil des ssRUBISCO-Gens ligiert sein, welches die Expression von ssRUBISCO in Abwesenheit von Licht unterdrückt, um einen Promotor zu schaffen, welcher in Blättern, aber nicht in Wurzeln aktiv ist. Der resultierende chimäre Promotor kann wie hierin beschrieben verwendet werden. Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck "CaMV35S"-Promotor Variationen des CaMV35S-Promotors, z. B. Promotoren, die mittels Ligation mit Operatorbereichen, Zufalls- oder gesteuerter Mutagenese, Addition oder Duplikation von Enhancersequenzen erhalten wurden.
Die mutierten EPSP-Synthasepolypeptide der vorliegenden Erfindung können entweder durch Polypeptidsynthese oder Isolierung und Mutagenese eines EPSP-Synthase-Gens hergestellt werden, um das oben beschriebene Glyphosat-verträgliche Molekül herzustellen. Da vorauszusehen ist, daß der größte Nutzen der vorliegenden Erfindung in der Herstellung Glyphosat-verträglicher Pflanzen liegt, können Nucleotidsequenzen (entweder cDNA oder genomische), die für die Glyphosat-verträgliche EPSP-Synthase codieren, auf folgende Weise leicht hergestellt werden.

Für cDNA codierende Sequenzen

Die ganze RNA wird aus dem Ausgangsmaterial isoliert, welches Bakterien, Pilze und Pflanzengewebe umfaßt, aber nicht unbedingt auf diese beschränkt ist. PolyA-mRNA wird mittels oligo-dT- Cellulose-Chromatographie ausgewählt. Eine cDNA-Bibliothek wird dann hergestellt, wobei die polyA-mRNA verwendet wird. Die cDNA- Bibliothek wird dann überprüft, wobei eine zuvor klonierte EPSP- Synthasesequenz oder eine geeignete Oligonucleotidsonde verwendet wird- Geeignete Oligonucleotidsonden umfassen Sonden auf Basis des konservierten Bereichs mit der Aminosäuresequenz (L-G-N-A-G-T-A) oder Sonden auf Basis der Aminosäuresequenz anderer Teile des EPSP-Synthasemoleküls. Die durch Hybridisierung ausgewählten cDNA- Fragmente sind dann Sequenzen zur Bestätigung, daß das Fragment die EPSP-Synthase codiert und zur Bestimmung der DNA-Sequenz, die codiert und an die oben beschriebene konservierte Aminosäuresequenz angrenzt.
Der EPSP-Synthase-Klon wird dann durch Oligonucleotid- Mutagenese geändert, um die DNA-Substitution zu inserieren, die nötig ist, um zur Substitution von Glycin durch Alanin in der konservierten Aminosäuresequenz (L-G-N-A-G-T-A) zu führen. Die obige Vorgangsweise ergibt eine cDNA-Sequenz, die für die Glyphosat-verträgliche EPSP-Synthase der vorliegenden Erfindung auf Basis der Wild-Typ-EPSP-Synthase des gewählten Ausgangsmaterials codiert. Diese strukturelle Codiersequenz kann in funktionale chimäre Gen-Konstrukte inseriert und in geeignete Pflanzentransformationsvektoren inseriert werden, um zur Herstellung transformierter Pflanzenzellen und regenerierter Pflanzen unter Verwendung der hierin beschriebenen Methodik verwendet zu werden.

Genomischer EPSP-Synthase-Klon

Im allgemeinen zieht man es vor, das Pflanzengewebe der zu transformierenden Pflanzenart auch als Ausgangsmaterial für die DNA-codierende Sequenz für die Glyphosat-verträgliche EPSP- Synthase der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Auf diese Weise würde man leicht die Chloroplasten-Transitpeptid-Codiersequenz aus der zu transformierenden Pflanzenart erhalten. In einigen Fällen kann es von Vorteil sein, einen genomischen Klon aus der Pflanzenart zu verwenden, welcher die Introns aufweist, die man normalerweise im endogenen EPSP-Synthase-Gen findet. Die oben beschriebene allgemeinen Methode ist ebenso anwendbar, mit der Ausnahme, daß Sonden verwendet werden, um die genomische DNA-Bibliothek zu screenen, die aus dem ausgewählten Pflanzengewebe konstruiert worden ist. Detaillierte Beispiele, die diese Herstellung von cDNA und genomischen DNA-Glyphosat-verträglictien EPSP-Synthase- Konstrukten der vorliegenden Erfindung besser veranschaulichen, sind nachstehend angeführt.

HERSTELLUNG VON EPSP-SYNTHASE- PFLANZENTRANSFORMATIONSVEKTOREN

1. EPSP-SYNTHASE DER PETUNIE

A. Schaffung der MP4-G-Zellinie

Die Ausgangszellinie, als MP4-Linie bezeichnet, wurde von einer diploiden Mitchell-Petunie erhalten (vgl. z. B. Ausubel 1980). Die MP4-Zellen wurden in Murashige-und-Skoog (MS)- Nährmedien (GIBCO, Grand Island, N.Y.) suspendiert. Bei allen Transfers wurden 10 ml Suspensionskulturen in 50 ml frische Medien gegossen. Die Züchtungsdauer bis zum nächsten Transfer lag im Bereich von 10 bis 14 Tagen und beruhte auf einer visuellen Anzeige, daß sich die Kultur der Sättigung näherte.
Etwa 10 ml gesättigte Suspensionskultur (enthaltend etwa 5 x 10&sup6; Zellen) wurden in 50 ml MS Medien, die 0,5 mM Glyphosat enthielten, transferiert. Das Natriumsalz von Glyphosat wurde während der gesamten hier beschriebenen Experimente verwendet. Der Großteil der Zellen konnte sich in Anwesenheit des Glyphosats nicht reproduzieren. Die Zellen, die überlebten (auf weniger als 1% der Ausgangspopulation geschätzt) wurden in 0,5 mM Glyphosat gezüchtet und alle 10 bis 14 Tage in frische Glyphosat-hältige Medien transferiert.
Nach zwei Transfers wurden die überlebenden Zellen in frische Medien transferiert, die 1,0 mM Glyphosat enthielten. Nach zwei Transfers bei 1,0 mM wurden die überlebenden Zellen der Reihe nach in 2,5 mM Glyphosat, 5,0 mM Glyphosat und 10 mM Glyphosat transferiert.
Mittels einer Southern-Blot-Untersuchung (Southern, 1975) zeigte sich, daß die wie oben beschrieben hergestellten MP4-G- Zellen etwa 15-20 Kopien des EPSP-Synthase-Gens aufwiesen, was auf einen genetischen Prozeß mit der Bezeichnung "Genamplifikation" (vgl. z. B. Schimke 1982) zurückzuführen war. Obwohl während der Replikation irgendeiner Zelle spontane Mutationen aufgetreten sein könnten, gibt es kein Anzeichen dafür, daß während des Genamplifikationsprozesses irgendeine Mutation oder andere Modifikation des EPSP-Synthase-Gens aufgetreten ist. Der einzige bekannte Unterschied zwischen den MP4- und den MP4-G-Zellen ist der, daß die MP4-G-Zellen mehrfache Kopien eines EPSP-Synthase- Gens und möglicherweise andere Gene in dessen Nähe auf den Chromosomen der Zellen enthalten.

B. Reinigung und Sequenzierung von EPSP-Synthaseenzymen

Petunienzellen aus der MP4-G-Zellinie wurden mittels Vakuumfiltration geerntet, unter flüssigem N&sub2; gefroren und in einem Waring-Mischer zu einem Pulver gemahlen. Das Pulver wurde in 0,2 M Tris-HCl, pH 7,8, welches 1 mM EDTA und 7,5% Gew./Vol. Polyvinylpolypyrrolidon enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde bei etwa 20.000 x g 10 min lang zentrifugiert, um Zellabfall zu entfernen. Nucleinsäuren wurden durch Zugabe von 0,1 Volumen. 1,4% Protaminsulfat aus dem Überstand ausgefällt und verworfen.
Die rohe Proteinsuspension wurde durch fünf aufeinanderfolgende Schritte gereinigt (vgl. Mousdale 1984 und Steinrucken 1985), zu welchen (1) Ammoniumsulfatfällung, (2) Diethylaminoethylcellulose-Ionenaustauschchromatographie, (3) Hydroxyapatit-Chromatographie, (4) hydrophobe Chromatographie auf einem Phenylagarosegel und (5) Größenbestimmung auf einem Sephacryl S-200 Gel gehörten.
Das gereinigte EPSP-Synthase-Polypeptid wurde durch Edman- Abbau mit einem Model 470A Protein-Sequencer (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) unter Verwendung der in Hunkapiller 1983a beschriebenen Methoden in eine Reihe von individuellen Aminosäuren abgebaut. Jedes Aminosäurederivat wurde mittels Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert, wie von Hunkapiller 1983b beschrieben, wobei eine Cyanopropylsäule mit über 22.000 theoretischen Platten (IBM Instruments, Wallingford CT) verwendet wurde. Eine partielle Aminosäuresequenz für EPSP- Synthase der Petunie ist in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 EPSP-SYNTHASESEQUENZEN DER PETUNIE Aminosäure: mRNA-Strang Komplementärer DNA-Strang: Synthet. DNA-Sonden Genaue mRNA-Sequenz

C. Synthese der Sonden

Unter Verwendung des genetischen Codes wurde die in Tabelle 1 angezeigte Aminosäuresequenz verwendet, um die möglichen DNA- Codons zu bestimmen, die für jede angezeigte Aminosäure codieren können. Unter Verwendung dieser Information wurden drei verschiedene Sondenmischungen geschaffen und als EPSP-1, EPSP-2 und EPSP-3 bezeichnet, wie in Tabelle 1 gezeigt. In dieser Tabelle stellen A, T, U, C und G die Nucleotidbasen Adenin, Thymin, Uracil, Cytosin und Guanin dar. Die Buchstaben P, Q und N sind Variable; N bedeutet irgendeine der Basen; P bedeutet Purine (A oder G); Q bedeutet Pyrimidine (U, T oder C).
Alle Oligonucleotide wurden mittels der Methode von Adams 1983 synthetisiert. Immer, wenn eine unbestimmte Nucleotidposition (P, Q oder N) erreicht worden war, wurde eine Mischung der entsprechenden Nucleotide zur Reaktionsmischung zugesetzt. 20 pmol an Sonden wurden kurz vor ihrer Verwendung mit 100 uCi γ- [³²P]-ATP (Amersham) und 10 Einheiten Polynucleotidkinase in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA und 0,1 mM Spermidin markiert. Nach einstündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Sonden entweder auf einem 20% Acrylamid, 8M Harnstoffgel oder durch Leiten über eine 5 ml Sephadex G25-Säule in 0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, wieder gereinigt.

D. Herstellung von mRNA und Vortesten der Sonden

(a) Poly-A mRNA

Die Gesamt-RNA wurde aus den MP4 (glyphosatempfindlichen) und MP4-G (Glyphosat-resistenten) Zellinien isoliert, wie von Goldberg 1981 beschrieben. Die Gesamt-RNA wurde weiters durch einen CsCl- Polster, wie von Depicker 1982 beschrieben, sedimentiert. Die poly-A mRNA wurde mittels Oligo-DT-Cellulose-Chromatographie selektiert. Die Ausbeute an poly-A-RNA betrug 1,1 Mikrogramm (ug) pro Gramm MP4-Zellen und 2,5 ug/g MP4-G-Zellen.

(b) Gelverarbeitung der RNA

Zehn ug poly-A RNA aus den MP4- oder MP4-G-Zellinien wurden mit Ethanol ausgefällt und in 1 x MOPS Puffer (20 mM MOPS, pH 7,0, 5 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA, pH 8,0), der 50% Formamid und 2,2 M Formaldehyd enthielt, resuspendiert. Die RNA wurde durch 10minütiges Erhitzen auf 65ºC denaturiert. Ein Fünftel Volumen eines Beladungspuffers, der 50% Glycerin, 1 mM EDTA, 0,4% Bromphenolblau und 0,4% Xylolcyanol enthielt, wurde dann zugegeben. Die RNA wurde auf einem 1,3% Agarosegel, das 1,1 M Formaldehyd enthielt, fraktioniert, bis Bromphenolblau in der Nähe des Bodens war. HaeIII-verdaute ΦX174 DNA, mit ³²P markiert, wurde als Größenstandard mitlaufen gelassen. Die DNA-Marker zeigten für die RNA-Banden entsprechende Größen an.

(c) Transfer von RNA auf Nitrocellulose

RNA wurde auf Nitrocellulose (#BA85, Schleicher & Schuell, Keene, NH) transferiert, indem die Gele über Nacht unter Verwendung von 20X SSC (1X SSC ist 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) als Transferpuffer geblottet wurden. Nach dem Transfer wurden die Filter luftgetrocknet und in einem Vakuumofen 2-3 Stunden lang bei 80ºC gebacken.

(d) Vor-Hybridisierung mit radioaktiven Sonden

Filter wurden in 6 x SSC, 10 x Denhardt-Lösung (1 x Denhardt- Lösung ist 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin), 0,5% NP-40 und 200 ug/ml E. coli-Transfer- RNA bei 50ºC 4 Stunden lang vorhybridisiert. Die Hybridisierung wurde in der frischen Lösung, die 2 x 10&sup6; cpm/ml entweder der EPSP-1- oder der EPSP-2-Sonde enthielt, 48 Stunden lang bei 32ºC durchgeführt. Die EPSP-3-Sonde wurde nicht getestet, da sie ein Codon (ATA) enthielt, das im Petunien-Genom selten gefunden wird. Die in jedem Fall verwendete Hybridisierungstemperatur (32ºC) lag 10ºC unter der Dissoziierungstemperatur (Td), die für das Oligonucleotid mit dem niedrigsten GC-Gehalt in einer Mischung errechnet worden war. Die Td der Sonde wurde durch die Formel 2ºC x (A + T) + 4ºC x (G + C) annähernd berechnet.

(e) Filterwäsche

Die Filter wurden zweimal 15-20 min lang bei Raumtemperatur in 6 x SSC und danach 5 min lang bei 37ºC unter leichtem Schütteln gewaschen. Die Filter wurden dann in eine Kunststoffolie gepackt und 12-14 Stunden lang bei -70ºC mit zwei Verstärkerschirmen autoradiographiert. Die Filter wurden dann wiederum 5 min lang unter leichtem Schütteln bei einer Temperatur von 42ºC gewaschen. Die Filter wurden wiederum 12-14 Stunden lang autoradiographiert. Die Autoradiographien zeigten an, daß die Sonde EPSP-1 mit einer RNA von etwa 1,9 kb in der die poly-A-RNA der mP4-G-Zellinie enthaltenden Bahn hybridisierte. In der die poly-A-RNA aus der MP4-Zellinie enthaltenden Bahn wurde keine Hybridisierung mit dieser RNA festgestellt. Dieses Ergebnis wurde auf eine Überproduktion von EPSP-Synthase-MRNA durch die MP4-G-Zellinie zurückgeführt. Die Sonde EPSP-2, die sich von EPSP-1 durch ein einziges Nucleotid unterscheidet, zeigte kaum feststellbare Hybridisierung mit 1,9 kb mRNA der MP4-G-Zellinie, doch hybridisierte sie stark mit einer 1,0 kb mRNA aus beiden Zellinien. Die 1,0 kb DNA reichte jedoch nicht aus, um für ein Polypeptid von 50.000 Dalton zu codieren, und man nimmt an, daß eine der Sequenzen in der EPSP-2-Sonde mit einer gänzlich anderen Sequenz in der Bibliothek hybridisierte. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, daß eine degenerierte Sondenmischung EPSP-1 die richtige Sequenz für EPSP-Synthase enthielt. Diese Mischung wurde in allen nachfolgenden Hybridisierungsexperimenten mit degenerierten Sonden verwendet.

E. Herstellung der λgt 10 cDNA-Bibliothek

(a) Verwendete Materialien

AMV-reverse Transcriptase wurde von Seikagaku America, Inc. St. Petersburg, Florida, gekauft; das große Fragment der DNA- Polymerase I (Klenow Polymerase) stammte von New England Nuclear, Boston, MA; S1 Nuclease und tRNA stammten von Sigma; AcA 34 Säulenbettharz stammte von LKB, Gaithersburg, MD; EcoRI, EcoRI- Methylase und EcoRI-Linker stammten von New England Biolabs, Beverly MA; RNAsin (Ribonucleaseinhibitor) stammte von Promega Biotech, Madison, Wisc., und alle radioaktiven Verbindungen stammten von Amersham, Arlington, Hts., IL.
Der λgt10-Vektor (ATCC Nr. 40179) und zugehörige E. coli- Zellinien wurden von Thanh Huynh und Ronald Davis an der Stanford University Medical School geliefert (vgl. Huynh 1985). Dieser Vektor hat drei wichtige Charakteristika: (1) er hat eine einzige EcoRI-Insertionsstelle, wodurch es nicht nötig ist, einen Mittelteil der DNA von der Phagen-DNA zu entfernen, bevor die neue DNA inseriert wird; (2) DNA im Größenbereich von Null bis etwa 8.000 Basen kann unter Verwendung dieses Vektors kloniert werden; und (3) es kann eine Bibliothek hergestellt werden, indem E. coli MA150-Zellen (ATCC Nr. 53104) zum Entfernen von Klonen, die keine DNA-Inserte aufweisen, verwendet werden.

(b) cDNA-Erststrangsynthese

Poly-A-mRNA wurde wie im obigen Abschnitt D(a) beschrieben, hergestellt und in 50 mM Tris (pH 8,5), 10 mM MgCl&sub2;, 4 mM DTT, 40 mM KCl, 500 uM d(AGCT)TP, 10 ug/ml dT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; Primer und 27,5 Einheiten/ml RNAsin resuspendiert. In einem 120 ul-Reaktionsvolumen wurden 70 Einheiten reverse Transcriptase pro 5 ug poly-A-RNA zugegeben. Ein Reaktionsröhrchen enthielt γ-³²P-dCTP (5 uCi/120 ul Reaktionsmischung), um eine Überwachung von cDNA-Größe und Ausbeute zu ermöglichen und um einen Erststrangmarker zur Überwachung späterer Reaktionen zu schaffen. Um die mRNA- Sekundärstruktur zu zerbrechen, wurde mRNA in H&sub2;O 3 min lang bei 70ºC inkubiert, und das Röhrchen wurde auf Eis abgekühlt. Reverse Transcriptase wurde zugegeben, und die cDNA-Synthese wurde 60 min lang bei 42ºC durchgeführt. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von EDTA auf 50 mM beendet. Die cDNA-Ausbeute wurde mittels TCA- Fällungen von Proben, die zu Beginn der Reaktion und nach 60 min entfernt worden waren, überwacht. Nach der cDNA-Synthese existierte die cDNA als cDNA-RNA-Hybrid. Die cDNA-RNA-Hybride wurde durch 1,5minütiges Erhitzen- der Mischung in einem kochenden Wasserbad denaturiert und auf Eis gekühlt.

(c) Zweitstrang-DNA-Synthese

Einzelstrang-cDNA wurde zur Zweitstrangsynthese selbststarten gelassen. Sowohl Klenow-Polymerase als auch reverse Transcriptase wurden verwendet, um ss cDNA in ds cDNA überzuführen. Klenow- Polymerase wird zuerst verwendet, da man annimmt, daß seine 3'-5'- Exonuclease-Reparaturfunktion nicht-bündige DNA-Enden, die durch Self-Priming erzeugt worden sind, verdauen kann und dann diese bündigen Enden mit ihrer Polymeraseaktivität verlängern kann. Reverse Transcriptase wird zusätzlich zur Klenow-Polymerase verwendet, da man annimmt, daß reverse Transcriptase nicht so leicht vorzeitig aufhört, sobald sie an einen Matrizenstrang gebunden ist. Die Klenow-Polymerasereaktion fand in einem End- Volumen von 100 ul, exclusive Enzym, statt. Die Reaktionsmischung umfaßte 50 mM HEPES, pH 6,9, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 500 uM von jeweils dNTP und cDNA. Um die Reaktion zu starten, wurden 20 bis 40 Einheiten Klenow-Polymerase (gewöhnlich weniger als 5 ul) zugegeben, und die Röhrchen wurden 5 Stunden lang bei 15ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von EDTA zu 50 mM beendet. Die Mischung wurde mit Phenol extrahiert, und die Nucleinsäuren wurden ausgefällt, zentrifugiert und getrocknet.
Die reverse Transcriptase-Reaktion zur weiteren Verlängerung des anti-komplementären DNA-Stranges wurde durchgeführt, wie für die Reaktion zur ursprünglichen Synthetisierung von cDNA beschrieben, außer daß dT&sub1;&sub0;&submin;&sub1;&sub8; Primer und RNAsin fehlten, und 32 Einheiten reverse Transcriptase wurden in einer 120 ul-Reaktion verwendet. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von EDTA zu 50 mM beendet. Die Mischung wurde mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert, und die Nucleinsäure wurde ausgefällt, zentrifugiert und getrocknet.

(d) S1-Nucleasebehandlung

200 ul 2 x S1-Puffer (1x S1-Puffer ist 30 mM Natriumacetat, pH 4,4, 250 mM NaCl, 1 mM ZnCl&sub2;), 175 ul H&sub2;O und 525 Einheiten S1- Nuclease wurden in die Röhrchen zugegeben, die 125 ul des Zweitstrangsynthese-Reaktionsprodukts enthielten. Die Röhrchen wurden 30 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA auf 50 mM beendet. Die Mischung wurde mit einem gleichen Volumen von Phenol/Chloroform (1 : 1) extrahiert. Die wässerige Phase wurde mit Ethylether extrahiert, um restliches Phenol zu entfernen. Die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt und luftgetrocknet.

(e) EcoRI-Methylierungsrekation

Da die ds cDNAs von einer großen Vielfalt von mRNAs kopiert waren, enthielten vermutlich viele der ds cDNAs innere EcoRI- Restriktionsstellen. Es war erwünscht, solche Schnittstellen vor EcoRI-Schnitt zu schützen, um die Verwendung von EcoRI-Linkern mit stumpfem Ende zu ermöglichen, die danach mit EcoRI geschnitten wurden, um kohäsive Überhänge an den Enden zu schaffen.
Im Bemühen, den unerwünschten Schnitt innerer EcoRI-Stellen zu verhindern, wurde die ds cDNA unter Verwendung von EcoRI- Methylase methyliert. DNA-Pellets wurden in 40 ul 50 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, gelöst. Vier ul von 100 uM S-Adenosyl-L- methionin und 1 ul (80 Einheiten) EcoRI-Methylase wurden zugegeben. Die Röhrchen wurden 15 min lang bei 37ºC und danach 10 Minuten lang bei 70ºC inkubiert, um die Methylase zu inaktivieren.
Man entdeckte danach, daß es mit der unten beschriebenen Methylierungsreaktion nicht gelang, den EcoRI-Schnitt an einer inneren Stelle innerhalb des EPSP-Synthase-Codierbereichs zu verhindern, und zwar offenbar wegen des inaktiven Methylase- Reagens. Der Schnitt der inneren EcoRI-Stelle erforderte zusätzliche Schritte zur Isolierung einer cDNA von voller Länge, wie nachstehend beschrieben. Um diese zusätzlichen Schritte zu vermeiden, sollten die Methylierungsreagentien und Reaktionsbedingungen gleichzeitig auf der cDNA und auf DNA-Kontroll- Fragmenten verwendet werden, und der Schutz der Kontrollfragmente sollte durch EcoRI-Verdauung bestätigt werden, bevor der Verdau an der cDNA durchgeführt wird.

(f) DNA-Polymerase I-Auffüllreaktion

In das 45 ul (wie oben hergestellte) cDNA-enthaltende Röhrchen wurden 5 ul 0,1 M MgCl&sub2;, 5 ul 0,2 mM d(ACGT)TP und 10 Einheiten DNA-Polymerase I zugegeben. Das Röhrchen wurde 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA zu 25 mM beendet. Ein Mikrogramm ungeschnittene λgt10 DNA wurde als Träger zugegeben, und die Mischung wurde mit Phenol/Chloroform (1 : 1) extrahiert. Die Nucleinsäure in der Mischung wurde mit Ethanol ausgefällt, zentrifugiert und getrocknet.

(g) Ligation von EcoRI-Linkern mit methylierter ds cDNA

Etwa 400 pmol EcoRI-Linker (5'-CGGAATTCCG-3') wurden in 9 ul 20 mM Tris, pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT enthaltend 50 uCi γ³²P-ATP (5000 Ci/mmol) und 2 Einheiten T4-Polynucleotidkinase, gelöst. Die Oligonucleotide wurden 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, um zu ermöglichen, daß sie aneinander gebunden werden, wobei doppelsträngige, stumpfendige Linker geschaffen wurden. 2 Einheiten T4-Polynucleotidkinase und 1 ul 10 mM ATP wurden zugegeben und weitere 30 min lang bei 37ºC inkubiert. Die Linker wurden bei -20ºC gelagert. Das methylierte DNA-Pellet wurde in 400 pmol der mit Kinase behandelten Linker re-suspendiert. Die Ligation der EcoRI-Linker mit der methylierten DNA erfolgte durch Zugabe-von 1 ul T4-Ligase und zweitägiger Inkubation der Reaktionsmischung bei 12-14ºC.

(h) Verdau mit EcoRI zur Schaffung kohäsiver Enden

Zu 11 ul des Reaktionsprodukts von Abschnitt 1.E.(g) wurden 10 ml einer Lösung, die 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgSO&sub4;, 200 mM NaCl enthielt, zugegeben. T4-DNA-Ligase wurde durch 10minütige Inkubation bei 70ºC hitzeinaktiviert. Vierzig Einheiten EcoRI wurden zugegeben, und die Inkubation wurde 3 h lang bei 37ºC durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA auf 50 mM beendet. Die Probe wurde durch Zentrifugieren geklärt und auf eine AcA 34-Säule aufgetragen.

(i) AcA 34-Säulenchromatographie

Die freien Linker (jene, die nicht mit ds cDNA ligiert waren) wurden von der ds cDNA mit daran befindlichen Linkern entfernt, um zu verhindern, daß sie die Insertion der gewünschten ds cDNAs in die Klonierungsvektoren stören. AcA 34-Harz (eine Mischung aus Acrylamid und Agarosekügelchen, normalerweise zur Größenbestimmung verwendet), das in 2 mM Citratpuffer und 0,04% Natriumazid in Wasser vorgequellt worden war, wurde zur 1 ml-Markierung einer 1 ml Kunststoffspritze, die mit Glaswolle zugestöpselt war, zugegeben. Die Säule wurde mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 400 mM NaCl, äquilibriert. Die ds cDNA-Mischungen mit ligierten Linkern und freien Linkern (-45 ul) wurde auf 400 mM NaCl gebracht. 1 ul 0,5% Bromphenolblau-Farbstoff (BPB) wurde zugesetzt, und die Probe wurde auf die Säule aufgetragen, welche mit Äquilibrier-Puffer bei Raumtemperatur gelaufen wurde. Es wurden zehn 200 ul-Fraktionen gesammelt. Der BPB-Farbstoff eluierte normalerweise im sechsten Röhrchen oder später aus der Säule. Die Röhrchen 1 und 2 wurden vereinigt und als Ausgangsmaterial für ds cDNA zum Klonieren verwendet.

(j) Herstellung von λgt10-Klonen

Die ds cDNA wurde mit 1 ugEcoRI-geschnittener λgt10 DNA gemischt, mit Ethanol ausgefällt und zentrifugiert. Nach dem einmaligen Waschen des Pellets mit 70% Ethanol wurde das DNA- Pellet luftgetrocknet und in 4,5 ul 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, resuspendiert. Zum Zusammenfügen und Ligieren der cDNA-Inserts mit den linken und rechten Armen der λgt10 DNA wurde die Mischung 3 min lang auf 70ºC und danach 15 min lang auf 50ºC erhitzt. Die Mischung wurde auf Eis abgekühlt, und jeweils 0,5 ul 10 mM ATP, 0,1 M DTT und ausreichend T4-DNA-Ligase wurden zugegeben, um zumindest eine Vollständigkeit zu 90% zu gewährleisten. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 14ºC inkubiert, was die Insertion der ds cDNA in die EcoRI-Stelle der λgt10 DNA ermöglichte. Die resultierende DNA wurde unter Verwendung der von Scherer 1981 beschriebenen Methode in vitro in Phagenteilchen gepackt.

(k) Entfernung von Phagen ohne Inserts

Die Insertion einer cDNA in die EcoRI-Stelle von λgt10 führt zu einer Inaktivierung des C1-Gens. λgt10-Phagen mit inaktivierten C1-Genen (d. h., mit Inserts) replizieren normalerweise in E. coli MA150-Zellen. Dagegen können λgt10-Phagen ohne Inserts im MA150- Stamm von E. coli nicht replizieren. Dies ergibt ein Verfahren zum Entfernen von λgt10-Klonen, die keine Inserts besitzen.
Die Phagen in der Bibliothek wurden zuerst in E. coli- C600 (M&spplus;R&supmin;)-Zellen repliziert, was die λgt10 DNA modifizierte, um sie vor dem E. coli MA150-Restriktionssystem zu schützen. Eine relativ kleine Anzahl von E. coli C600-Zellen wurde infiziert und dann mit einem 20-fachen Überschuß von MA150 (M&spplus;R&supmin;)Zellen ausplattiert. Die Primärinfektion fand somit in den M&spplus;R&supmin;-Zellen statt, wo alle Phagen wachsen, doch fanden aufeinanderfolgende Replikationsrunden in den MA150-Zellen statt, was die Replikation von Phagen ohne Inserts verhinderte. Die amplifizierte Phagen- Bibliothek wurde von den Platten gesammelt, und nach dem Entfernen von Agar und anderen Kontaminanten durch Zentrifugieren waren die rekombinanten Phagen fertig zur Verwendung in Screening-Versuchen.

F. Screenen der cDNA-Bibliothek; Selektion von pMON9531

Etwa 600 Phagen (pro Platte) wurden auf quadratischen Platten (10 cm x 10 cm) von festem NZY Agar (Maniatis 1982) mit 0,7% Agarose ausgebreitet. Ein durchscheinender Rasen von E. coli MA150-Zellen wuchs auf den Platten. Flächen, in welchen die Phagen die E. coli-Zellen infizierten und töteten, wurden durch deutliche Stellen, "Plaques" genannt, angezeigt, welche gegen den Bakterienrasen nach einer Inkubation der Platten bei 37ºC über Nacht sichtbar waren. Auf diese Weise wurden sechs Platten präpariert. Die Plaques wurden etwa 30 min lang gegen vorgeschnittene Nitrocellulosefilter gedrückt. Dies bildete einen symmetrischen Abdruck der Plaques. Zur Befestigung der Phagen-DNA wurden die Filter 5 min lang mit 0,5 M NaOH und 2,5 M NaCl behandelt. Die Filter wurden dann nacheinander mit 1,0 M Tris-HCl, pH 7,5, und 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 2,5 M NaCl, zum Neutralisieren der NaOH behandelt. Sie wurden dann in Chloroform getränkt, um den Bakterienabfall zu entfernen. Sie wurden dann luftgetrocknet und 2 Stunden lang unter Vakuum bei 80ºC gebacken und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Filter wurden dann mit ³²P-markierter EPSP- 1-Sonde (2 x 10&sup6; cpm/Filter) hybridisiert, wie in Abschnitt 1.D(e) voranstehend beschrieben. Nach 48stündiger Hybridisierung wurden die Filter zweimal in 6x SSC bei Raumtemperatur 20 min lang und danach bei 37ºC 5 min lang gewaschen. Mit diesen Waschungen wurden nicht-spezifisch gebundene Sondenmoleküle entfernt, während die Sondenmoleküle mit der genau korrespondierenden Sequenz (die zu jener Zeit unbekannt war) an die Phagen-DNA am Filter gebunden blieben. Die Filter wurden nach der letzten Waschung mittels Autoradiographie analysiert. Nach dem ersten Screening erschienen sieben positive Hybridisiersignale als schwarze Flecken auf den Autoradiogrammen. Diese Plaques wurden von den Platten entfernt und auf den frischen Platten mit einer Dichte von 100-200 Plaques/Platte wieder ausplattiert. Diese Platten wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Vorgangsweise gescreent. Vier positive Hybridisierungsphagen wurden ausgewählt. Von jedem dieser vier Klone wurde DNA isoliert und mit EcoRI verdaut, um die Größen der cDNA-Inserts zu bestimmen. Der Klon, der das größte cDNA- Insert, etwa 330 bp, enthielt, wurde ausgewählt und mit λE3 bezeichnet. Das cDNA-Insert aus λE3 wurde in Plasmid pUC9 (Vieira 1981) inseriert, und das resultierende Plasmid wurde als pMON9531 bezeichnet.
Um zu bestätigen, daß der pMON9531-Klon die gewünschte EPSP- Synthasesequenz enthielt, wurde das Insert aus dem pMON9531-Klon mittels Verdau mit EcoRI entfernt. Dieses DNA-Fragment wurde dann durch die chemische Abbaumethode von Maxam (1977) sequenziert. Die aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz entsprach der partiellen EPSP-Synthase-Aminosäuresequenz, die in Tabelle 1 gezeigt ist.

G. Schaffung eines genomischen λF7-DNA-Klons

Um das gesamte EPSP-Synthase-Gen zu erhalten, wurde eine chromosomale DNA aus der MP4-G-Zellinie mit BamHI verdaut und in einen Phagenvektor kloniert, um eine Bibliothek zu schaffen, die unter Verwendung der partiellen EPSP-Synthasesequenz aus pMON9531 als Sonde gescreent wurde.

(a) Herstellung von chromosomalen MP4-G DNA-Fragmenten

MP4-G-Zellen wurden gefroren und in einem Mörser mit zerstoßenem Glas in Anwesenheit von flüssigem Stickstoff pulverisiert. Die pulverisierten Zellen wurden mit 8 ml/g kaltem Lysepuffer, welcher 8,0 M Harnstoff, 0,35 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,02 M EDTA, 2% Sarkosyl und 5% Phenol enthielt, gemischt. Die Mischung wurde zum Zerbrechen großer Klumpen mit einem Glasstab gerührt. Ein gleiches Volumen einer 3 : 1 Mischung aus Phenol und Chloroform, die 5% Isoamylalkohol enthielt, wurde zugegeben. Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde auf eine Endkonzentration von 0,5% zugegeben. Die Mischung wurde auf einer rotierenden Plattform 10-15 min lang bei Raumtemperatur gedreht. Die Phasen wurden durch 15minütiges Zentrifugieren bei 6.000 x g getrennt. Die Phenol/Chloroform-Extraktion wurde wiederholt. Natriumacetat wurde zur wässerigen Phase auf eine Endkonzentration von 0,15 M zugegeben, und die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in 1x TE (10 mM Tris- HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gelöst und in einem CsCl-Ethidiumbromid- Gradienten streifenartig ausgebildet. Die DNA wurde durch Punktieren der Seite des Röhrchens mit einer 16-Gauge-Nadel gesammelt. Das Ethidiumbromid wurde mit CsCl-gesättigtem Isopropanol extrahiert, und die DNA wurde ausgiebig gegen 1x TE dialysiert. Etwa 400 ug DNA wurden aus 12 g Zellen isoliert.
Chromosomale MP4-G DNA (10 ug) wurde mit 30 Einheiten BamHI in einem Puffer, der 10 mM Tris, pH 7,8, 1 mM DTT, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl enthielt, 2 Stunden lang bei 37ºC fertig verdaut. Die DNA wurde mit Phenol extrahiert, gefolgt von einer Extraktion mit Chloroform und einer Ausfällung mit Ethanol. Die DNA-Fragmente wurden in 1 x TE bei einer Konzentration von 0,5 ug/ul suspendiert.

(b) Klonieren von chromosomalen MR4-G DNA-Fragmenten in λMG14

DNA aus dem Phagen λMG14 (erhalten von Dr. Maynard Olson von der Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri) wurde mittels des in Maniatis 1982 beschriebenen Verfahrens hergestellt. 150 ug DNA wurde mit BamHI in einem Puffer, der 10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 1 mM DTT, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl enthielt, fertig verdaut. Die Vollendung des Verdaus wurde mittels Elektrophorese durch 0,5% Agarose-Gel überprüft. Die Phagen-DNA wurde dann zweimal mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde in 1x TE bei einer Konzentration von 150 kg/ml re-suspendiert. MgCl&sub2; wurde zu 10 mM zugesetzt und 1 h lang bei 42ºC inkubiert, um die kohäsiven Enden der λDNA wieder aneinander anlagern zu lassen. Die Anlagerung wurde mittels Ararose-Gel-Elektrophorese überprüft.
Nach der Anlagerung wurde die DNA über einen 38 ml (10-40%, Gew./Vol.) Saccharose-Gradienten in einem Beckman SW27- Ultrazentrifugenröhrchen geschichtet. Die Gradientenlösungen wurden in einem Puffer hergestellt, der 1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA, enthielt. 75 ug DNA wurde auf jeden Gradienten geladen. Die Proben wurden 24 Stunden lang bei 15ºC in einem Beckman SW 27-Rotor bei 26.000 U/min zentrifugiert. Die Fraktionen (0,5 ml) wurden von der Oberseite des Zentrifugenröhrchens gesammelt und mittels Gel-Elektrophorese auf das Vorhandensein von DNA überprüft. Die Fraktionen, die die zusammengefügten linken und rechten Arme von λDNA enthielten, wurden zusammen gepoolt, gegen TE dialysiert und mit Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde mit 70% Ethanol gewaschen und getrocknet. Die DNA wurde in TE bei einer Konzentration von 500 ug/ml gelöst.
Die gereinigten Arme der Vektor-DNA und die BamHI-Fragmente von MP4-G DNA wurden in einem Molverhältnis von 4 : 2 und 2 : 1 gemischt und unter Verwendung von T4 DNA Ligase in einem Ligasepuffer, der 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 1 mMATP enthielt, ligiert. Die Ligationen erfolgten bei 15ºC über Nacht. Die Ligation wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Ligierte Phasen-DNA, die MP4-G DNA-Inserts trug, wurde in vitro unter Verwendung von im Handel erhältlichen Verpackungsextrakten (Promega Biotech, Madison, WI) in Phagenkapside gepackt. Die verpackten Phagen wurden auf quadratische 10 cm x 10 cm- Platten von NZY-Agar in 0,7% Agarose mit einer Dichte von etwa 6000 Plaques pro Platte ausplattiert, wobei E. coli. C60O-Zellen verwendet wurden. Nach einer Inkubation bei 37ºC über Nacht hatten sich die Plaques gebildet, und die Platten wurden aus dem Inkubator entfernt und mindestens eine Stunde lang auf 4ºC gekühlt. Die Agarplatten wurden 30 Minuten lang gegen Nitrocellulosefilter gepreßt, um die Phagen auf die Filter zu überführen, und die Phagen-DNA wurde wie zuvor beschrieben an den Filtern fixiert. Jedes Filter wurde 40 Stunden lang bei 42ºC mit etwa 1,0 x 10&sup6; cpm/Filter des aus dem pMON9531-Klon isolierten 330 bp cDNA-Inserts hybridisiert, welches unter Verwendung der in Maniatis (1982) beschriebenen Vorgangsweise einer Nick-Translation unterzogen worden war. Die spezifische Aktivität der Sonde betrug 2-3 x 10&sup8; cpm/ug DNA. Die Hybridisierung erfolgte in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 x SSC, 5 x Denhardt-Lösung, 200 ug/ml tRNA und 0,1% SDS enthielt. Die Filter wurden in 1x SSC, 0,2% SDS bei 50ºC gewaschen und autoradiographiert. Mehrere positive Signale wurden beobachtet und mit Plaques auf der entsprechenden Platte in Übereinstimmung gebracht. Die ausgewählten Plaques wurden abgehoben, in SM Puffer suspendiert und mit NZY-Agar plattiert. Das Abdruckplatten-Screeningverfahren wurde bei geringeren Dichten wiederholt, bis alle Plaques auf den Platten positive Signale zeigten. Ein Isolat wurde zur weiteren Analyse ausgewählt und als XF7-Phagen-Klon bezeichnet.

H. Herstellung von pMON9543 und pMON9556

Die DNA aus λF7 wurde mit BamHI, BglII, EcoRI und HindIII (separat) verdaut. Die DNA wurde mit einer Nick-translatierten EPSP-Synthase-Sequenz aus pMON9531 in einem Southern blot- Verfahren hybridisiert. Dies zeigte an, daß die komplementäre Sequenz aus λF7 auf einem 4,8 kb BglII-Fragment war. Dieses Fragment wurde in Plasmid pUC9 (Vieira 1982) inseriert, repliziert, Nick-translatiert und verwendet, um als Sonde für die Petunien-cDNA-Bibliothek zu dienen, wobei Hybridisierungsbedingungen, wie in Abschnitt 1.(G) beschrieben, verwendet wurden und wobei 10&sup6; cpm pro Filter verwendet wurden. Ein cDNA-Klon mit einer Sequenz, die sich an die λF7-Sequenz band, wurde identifiziert und als pMON9543 bezeichnet.
Die DNA-Sequenzanalyse (Maxam 1977) zeigte an, daß pMON9543 das Stop-Codon oder den 3'-nicht-translatierten Bereich-des EPSP- Synthase-Gens nicht enthielt. Daher wurde die EPSP-Synthase- Sequenz aus pMON9543 entfernt, Nick-translatiert und als Sonde zum nochmaligen Screenen der cDNA-Bibliothek verwendet. Ein Klon, der mit der EPSP-Synthase-Sequenz hybridisierte, wurde identifiziert und als pMON9556 bezeichnet. Die DNA-Sequenzanalyse zeigte, daß das Insert in diesem Klon den gesamten 3'-Bereich des EPSP- Synthase-Gens, einschließlich eines polyadenylierten Schwanzes, enthielt. Das 5-EcoRI-Ende dieses Inserts paßte zum 3' EcoRI-Ende des EPSP-Synthase-Inserts in pMON9531. Eine ganze EPSP-Synthase- Codiersequenz wurde geschaffen, indem die EPSP-Synthase-Inserts aus pMON9531 und pMON9556 ligiert wurden.

I. Herstellung des pMON546-Vektors mit CaMV35S/EPSP-Synthase-Gen

Das EPSP-Synthase-Insert in pMON9531 wurde durch stellengerichtete Mutagenese (Zoller et al, 1983) unter Verwendung eines M13 Vektors (Messing 1981 und 1982) modifiziert, um eine BglII- Stelle im 5'-nicht-translatierten Bereich des EPSP-Synthase-Gens zu schaffen. Die modifizierte EPSP-Synthase-Sequenz wurde durch EcoRI- und BglII-Verdau isoliert und in den Vektor pMON530, einen binären Vektor für auf Agrobacterium basierende Pflanzentransformation, inseriert, um pMON536 zu erhalten. Das 1,62 kb EcoRI- EcoRI-Fragment aus pMON9556 wurde dann in pMON536 inseriert, um pMON546 zu erhalten. Da pMON530 bereits einen 35S-Promotor aus einem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) neben der BglII-Stelle enthielt, erzeugte dies ein chimäres CaMV35S/EPSP-Synthase-Gen in pMON546.
pMON530, ein Derivat von pMON505, das die 35S-NOS-Kassette trägt, wurde auffolgende Weise hergestellt:
Der CaMV35S-Promotor wurde aus dem pOS-1-Klon von CM4-184 als AluI (n 7143)-EcoRI* (n 7517)-Fragment isoliert, das zuerst in mit BamHI geschnittenes pBR322 inseriert wurde, mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt und dann mit EcoRI geschnitten wurde. Das Promotor-Fragment wurde dann mit BamHI und EcoRI aus pBR322 herausgeschnitten, mit Klenow-Polymerase behandelt und in die SmaI-Stelle von M13mp8 inseriert, so daß die EcoRI-Stelle des mp8-Multi-Linkers am 5'-Ende des Promotor-Fragments war. Die Nucleotidnummern beziehen sich auf die Sequenz von CM18541 (Gardner et al., 1981). Stellengerichtete Mutagenese wurde dann verwendet, um ein G am Nucleotid 7464 einzuführen, um eine BglII- Stelle zu schaffen. Das CaMV35S-Promotorfragment wurde dann aus dem M13 als ein 330 bp EcoRI-BglII-Fragment herausgeschnitten, welches den CaMV35S-Promotor, die Transkriptionsinitiierungsstelle und 30 Nucleotide der 5'-nicht-translatierten Leadersequenz enthält, aber keine der CaMV-Translationsinitiatoren und auch nicht das CaMV35S-Transkript-Polyadenylierungssignal, das sich 180 Nucleotide stromabwärts vom Beginn der Transkription befindet (Covey et al., 1981; Guilley et al., 1982), besitzt. Das CaMV35S- Promotor-Fragment wurde mit einem synthetischen Multi-Linker und dem NOS 3'-nicht-translatierten Bereich verbunden und in pMON200 inseriert (Fraley et al., 1985; Rogers et al., 1986), was pMON316 ergab, vgl. Fig. 3.
Das Plasmid pMON316 enthält unike Schnittstellen für BglII, ClaI, KpnI, XhoI und EcoRI, die sich zwischen dem 5'-Leader und den NOS-Polyadenylierungssignalen befinden. Das Plasmid pMON316 behält alle Eigenschaften von pMON200 bei. Die komplette Sequenz von CaMV35S-Promotor, Multi-Linker und NOS 3'-Segment ist in Fig. 4 angegeben. Diese Sequenz beginnt mit der XmnI-Stelle, die durch Klenow-Polymerase-Behandlung geschaffen worden ist, um die EcoRI- Stelle zu entfernen, die sich am 5'-Ende des CaMV35S-Promotor- Segments befindet.
Das Plasmid pMON530 (vgl. Fig. 6) ist ein Derivat von pMON505, hergestellt durch Transferieren des 2,3 kb Stul-HindIII- Fragments von pMON316 in pMON526. Das Plasmid pMON526 ist ein einfaches Derivat von pMON505, in welchem die SmaI-Stelle durch Verdau mit XmaI, Behandlung mit Klenow-Polymerase und Ligation entfernt ist. Das Plasmid pMON530 behält alle Eigenschaften von pMON505 und die CaMV35S-NOS-Expressionskassette bei und enthält nun eine unike Schnittstelle für SmaI zwischen dem Promotor und dem Polyadenylierungssignal.
Der binäre Vektor pMON505 ist ein Derivat von pMON200, in welchem der Ti-Plasmidhomologiebereich L1H durch ein 3,8 kb HindIII bis SmaI-Segment des Mini-RK2-Plasmids, pTJS75 (Schnmidhauser & Helinski, 1985) ersetzt worden ist. Dieses Segment enthält den RK2-Replikationsursprung, oriV, und den Transferursprung, oriT, zur Konjugation in Agrobacterium unter Verwendung des tri-parentalen Matings (Horsch & Klee, 1986).
Unter Bezugnahme auf Fig. 5 behält das Plasmid pMON505 alle wichtigen Charakteristika von pMON200 bei, inklusive dem synthetischen Multi-Linker zur Insertion der gewünschten DNA- Fragmente, dem chimären NOS-NPTII'-NOS-Gen für Kanamycin- Resistenz, die für die Selektion von E. coli und A. tumefaciens bestimmend ist, einem intakten Nopalin-Synthase-Gen zum leichten Erkennen von Transformanten und Erbgang bei der Folgegeneration, und pBR322-Replikationsursprung zum leichten Herstellen großer Mengen des Vektors in E. coli. Das Plasmid pMON505 enthält eine einzige T-DNA-Ende, die vom rechten Ende der pTiT37 Nopalin-Typ T- DNA stammt. Southern-Analysen zeigten, daß das Plasmid pMON505 und jegliche DNA, die es trägt, in das Pflanzengenom integriert sind, das heißt, das gesamte Plasmid ist die T-DNA, die in das Pflanzengenom inseriert ist. Ein Ende der integrierten DNA befindet sich zwischen der rechten Grenzsequenz und dem Nopalin-Synthase-Gen, und das andere Ende ist zwischen der Grenzsequenz und den pBR322- Sequenzen.
Das Plasmid pMON546 enthielt (1) das CaMV35S/EPSP-Synthase- Gen; (2) ein selektierbares Marker-Gen für Kanamycin-Resistenz (KanR); (3) ein Nopalin-Synthase (NOS)-Gen als zählbaren Marker; und (4) ein rechtes T-DNA-Ende, das die Wirkung hatte, daß das gesamte Plasmid von A. tumefaciens-Zellen als "Transfer-DNA" (T- DNA)-Bereich behandelt wurde.
Dieses Plasmid wurde in A. tumefaciens-Zellen, die ein Helferplasmid, pGV3111-SE, enthielten, inseriert. Das Helferplasmid codiert für bestimmte Enzyme, die nötig sind, um zu bewirken, daß DNA aus pMON546 in Pflanzenzellenchromosome inseriert wird. Es enthält auch ein Kanamycin-Resistenz-Gen, das in Bakterien funktioniert.
Eine Kultur von A. tumefaciens, welche pMON546 und pGV3111-SE enthielt, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt und erhielt die ATCC-Zutrittsnummer 53213. Gewünschtenfalls kann jedes dieser Plasmide aus dieser Zellkultur unter Verwendung der Standardmethodik isoliert werden. Beispielsweise können diese Zellen mit E. coli-Zellen gezüchtet werden, welche ein Mobilisierungsplasmid, wie pRK2013 (Ditta 1980), enthalten. Zellen, die Spc/StrR, KanS werden, werden pMON546 enthalten, während Zellen, die KanR, Spc/StrS werden, pGV3111-SE enthalten werden.

GLYPHOSAT-VERTRÄGLICHE PETUNIENPFLANZEN

Blattscheiben mit einem Durchmesser von 6 mm (1/4 Zoll) wurden von oberflächensterilisierten Petunienblättern entnommen. Sie wurden 2 Tage lang auf MS104 Agar-Medium gezüchtet, um an den Wundflächen eine partielle Zellwandbildung zu fördern. Sie wurden dann in eine Kultur von A. tumefaciens-Zellen getaucht, die sowohl pMON546 als auch GV3111-SE enthielt, welche über Nacht bei 28ºC in Luria-Nährlösung gezüchtet worden waren, und leicht geschüttelt. Die Zellen wurden aus der Bakteriensuspension entfernt, trocken geblottet und verkehrt auf Filterpapier inkubiert, welches über "Nurse"-Kulturen von Tabakzellen placiert worden war, wie bei Horsch (1980) beschrieben. Nach 2 oder 3 Tagen wurden die Scheiben auf Petri-Schalen übertragen, welche MS-Medien mit 500 ug/ml Carbenicillin und 0, 0,1, 0,25 oder 0,5 mM Glyphosat (Natriumsalz) enthielten, und zwar ohne "Nurse"-Kulturen.
Kontrollgewebe wurde geschaffen, wobei A. tumefaciens-Zellen verwendet wurden, die das Helfer-Plasmid pGV3111-SE und einen anderen Pflanzentransformationsvektor, pMON505, enthielten, der einen T-DNA-Bereich mit einem NOS/NPTII/NOS Kanamycin-Resistenz- Gen und einem NOS-selektierbaren Marker-Gen, das mit pMON546 identisch war, aber ohne das CaMV35S/EPSP-Synthase-Gen, enthielt.
Innerhalb von 10 Tagen nach der Übertragung in die Glyphosathältigen Medien erschien ein aktiv wachsendes Callusgewebe am Rand aller Scheiben auf der Kontrollplatte, die kein Glyphosat enthielt. Auf 0,1 mM Glyphosat-enthaltenden Medien war zwischen den Kontrollscheiben und dem transformierten Gewebe nur wenig Unterschied zu bemerken. Bei 0,25 mM Glyphosat bestand sehr wenig Calluswachstum bei Kontrollscheiben, während beträchtliches Wachstum von transformiertem Gewebe stattfand. Bei 0,5 mM Glyphosat bestand kein Calluswachstum bei den Kontrollscheiben, während eine beträchtliche Anzahl von Calli bei den transformierten Scheiben wuchsen. Dies bestätigt, daß das CaMV35S/EPSP-Synthase-Gen den transformierten Zellen eine Glyphosat-Resistenz verlieh.
Transformierte Petunienpflanzen wurden durch Regeneration aus den oben beschriebenen transformierten Blattscheiben mittels der in Horsch et al. (1985) beschriebenen Vorgangsweise erzeugt. Die erhaltenen transformierten Pflanzen enthielten den pMON546-Vektor, welcher hier zuvor beschrieben worden ist, welcher den CaMV 35S Promotor verschmolzen mit dem Wild-Typ-Petunien-EPSP-Synthase-Gen enthält.
Vier individuelle repräsentative transgene Sämlinge wurden ausgewählt, gezüchtet, und zusammen mit vier individuellen, nichttransformierten (Wild-Typ)-Petuniensämlingen in der nachstehend beschriebenen Testweise getestet.
Die Pflanzen wurden in einem Wachstumsmedium in einer Wachstumskammer bei 26ºC mit 12 Stunden Licht pro Tag gezüchtet. Die Pflanzen wurden wöchentlich mit einem löslichen Dünger gedüngt und nach Bedarf bewässert. Die Pflanzen wurden mit einer gleichmäßigen und reproduzierbaren Abgaberate von Herbizid unter Verwendung eines automatischen Bahnsprühers besprüht. Die verwendete Glyphosatlösung wurde als Pfund Glyphosatsäureäquivalente pro Acre (4047 m²), als Glyphosat-isopropylaminsalz mit einem ionischen grenzflächenaktiven Mittel gemischt, gemessen.
Vier individuelle Wild-Typ-(nicht-transformierte) Petunienpflanzen wurden zur Verwendung als Kontrollpflanzen ausgewählt. Vier individuelle transformierte Pflanzen, die den pMON546-Vektor enthielten, wurden durch Kanamycin-Resistenz, wie in Horsch et al. (1985) beschrieben, ausgewählt.
Die Kontrollpflanzen und die transformierten Pflanzen wurden mit dem Isopropylaminsalz von Glyphosat mit der in Tabelle 2 nachstehend angeführten Anwendungsmenge besprüht; die Versuchsergebnisse, die erhalten wurden, sind auch in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2 Pflanzenreaktion auf Besprühen mit Glyphosat Pflanzenart Glyphosat-Dosis* äußeres Erscheinungsbild Kontrolle¹ vollkommen tot, die Pflanzen zeigten sehr schnell Chlorose und Ausbleichung, verwelkten und starben Chimäre wächst gut, Synthase etwas Chlorose in neuen Blättern, die mit normaler Morphologie wachsen, Pflanzen erscheinen gesund und begannen zu blühen
* Säurequivalent
¹ Wild-Typ-Pflanze oder transformiert mit Kontrollvektor (pMON505)
Wie in Tabelle 2 angezeigt, wurden die Kontrollpflanzen getötet, wenn sie mit 0,8 Pfund/Acre Glyphosat besprüht wurden. Dagegen waren die Petunienpflanzen, die transformiert worden waren, gesund und lebensfähig nach dem Besprühen mit 0,8 Pfund/Acre. Die transformierten Pflanzen sind resistenter gegen Glyphosateinwirkung als die nicht-transformierten Kontrollpflanzen.

Glyphosat-tolerante Petunien-EPSP-Synthase

Ein Pflanzentransformationsvektor, der eine Glyphosattolerante Petunien-EPSP-Synthase-Mutante trug, wurde auf folgende Weise hergestellt.
Plasmid pMON342 trägt die "reife" Wild-Typ-Petunien-EPSP- Synthasecodiersequenz (ohne Chloroplast-Transit-Peptid), exprimiert aus dem Doppelphagen-Lambda-pL-Promotor. Dieses Plasmid stammt von pMON9544 und pMON9556.
Um eine unike NcoI-Stelle und ein ATG-Translationsinitiierungssignal in die Wild-Typ- Petunien-EPSP-Synthase-cDNA direkt außerhalb der Codiersequenz für das reife Protein einzuführen und gleichzeitig die Chloroplasten-Transit-Peptidcodiersequenz zu entfernen, wurde M8017 (das M13mp9-Klon des 300 bp EcoRI cDNA-Fragments) einer stellengerichteten Mutagenese unter Verwendung der Vorgangsweise von Zoller und Smith (1983) und des folgenden Mutagenese-Primers:
unterzogen. Ein mutierter Phagenklon wurde isoliert, welches eine NcoI-Stelle enthielt. Das Vorliegen der oben beschriebenen Mutation wurde durch Sequenzanalyse bestätigt. Dieser M13mp9-Klon wurde als M8019 bezeichnet.
Das Plasmid pMON6001 ist ein Derivat von pBR327 (Soberon et al., 1980), welches die E. coli K12 EPSP-Synthase-Codiersequenz trägt, welche aus zwei Tandem-Kopien eines synthetischen Phage-Lambda pL-Promotors exprimiert wird. Das Plasmid pMON6001 wurde auf folgende Weise konstruiert. Zuerst wurde pMON4 (Rogers et al., 1983) mit ClaI verdaut, und das 2,5 kb Fragment wurde in ein pBR327, das ebenfalls mit ClaI geschnitten worden war, inseriert. Das resultierende Plasmid pMON8 enthält die EPSP-Synthase- Codiersequenz, die sich in derselben Richtung wie das Beta- Lactamase-Gen von pBR327 liest.
Zur Konstruktion von pMON25, einem Derivat von pMON8 mit uniken Restriktions-Endonucleasestellen, die sich neben der E. coli -EPSP-Synthase-Codiersequenz befinden, wurden die folgenden Schritte unternommen. Ein Deletionsderivat von pMON4 wurde durch Schneiden mit BstEII und Re-Ligation hergestellt. Dem resultierenden Plasmid pMON7 fehlt das 2 kb BstEII-Fragment von pMON4. Danach wurde ein 150 bp HinfI bis NdeI-Fragment, das für das 5'- Ende des EPSP-Synthase-offenen Leserahmens codiert, nach Verdau von pMON7 mit NdeI und HinfI und Elektroelution nach elektrophoretischer Trennung auf einem Acrylamid-Gel isoliert. Dieses Stück wurde zum gereinigten 4,5 kb BamHI-NdeI-Fragment von pMON8 zugegeben, welches den 3'-Teil der EPSP-Synthase-Codiersequenz und einen synthetischen Linker mit der Sequenz:
enthält. Das resultierende Plasmid pMON25 enthält die EPSP- Synthase-Codiersequenz, der unike BamHI und BglII-Stellen, synthetische Ribosombindungsstellen und unike XbaI und Ncol- Stellen vorangehen, wobei letztere das ATG-Translations- Initiatorsignal der Codiersequenz enthält.
Zur Konstruktion von pMON6001 wurde pMON25 mit BamHI verdaut und mit einem synthetischen DNA-Fragment, welches eine partielle Phagen-lambda-pL-Sequenz (Adams und Galluppi, 1986) mit BamHI- klebenden Enden enthält:
Das resultierende Plasmid pMON60O1 trägt zwei Kopien der synthetischen Phagen-lambda-pL-Promotorfragmente als direkte Wiederholungen in der BamHI-Stelle von pMON25 in der richtigen Orientierung zur Förderung der Transkription der EPSP-Synthase- Codiersequenz.
Das Plasmid pMON6001 wurde mit Ncol und EcoRI geschnitten, und das 3 kb-Fragment wurde aus einem Agarose-Gel isoliert. Dieses Fragment wurde mit dem kleinen 100 bp NcoI-EcoRI-Fragment, gereinigt von M8019, gemischt. Nach Ligation und Transformation wurde ein Klon identifiziert, welches das kleine 100 bp Ncol- EcoRI-Fragment enthielt, welches dem 5'-Ende der "reifen" EPSP- Synthase der Petunie entspricht. Dieses Konstrukt wurde als pMON9544 bezeichnet.
Das Plasmid pMON9544 wurde mit EcoRI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das EcoRI-Fragment von pMON9544 wurde mit pMON9556-DNA gemischt, die mit EcoRI geschnitten worden war, um ein 1,4 kb-Fragment-freizusetzen, das für den 3'-Teil der Petunien-EPSP-Synthase-Codiersequenz codiert. Nach Ligation und Transformation wurde ein Klon identifiziert, welcher eine E. coli aroA-Mutation komplementieren konnte und das 1,4 kb-Fragment von pMON9556 trug. Dieses Plasmid wurde als pMON342 bezeichnet.
Die EcoRI-Stelle am 3'-Ende der EPSP-Synthase in pMON342 wurde durch eine CIaI-Stelle ersetzt, um die Konstruktion zu erleichtern. Dies wurde durch partiellen Verdau mit EcoRI, gefolgt von Verdau mit Mungobohnen-Nuclease zum Stumpfmachen der Enden erreicht. ClaI-Linker (5'-CATCGATG-3', New England Biolabs) wurden an die stumpfen Enden durch Ligation mit T4 DNA-Ligase angefügt. Die Mischung wurde mit Clal verdaut, um klebende Enden zu erzeugen, und das 5 kb-EcoRI-Teilverdaute wurde aus einem Agarose- Gel isoliert und mit T4 DNA-Ligase ligiert. Dieses Plasmid wurde als pMON9563 bezeichnet.
Ein mutagenes 29-Nucleotid-Desoxyoligonucleotid mit der folgendne Sequenz
wurde synthetisiert, um das Alanin zur Glycin-Substitution an der Position 101 einzuführen, wobei ein automatischer DNA-Synthesizer (Applied Biosystems, Inc.) verwendet wurde. Das Desoxyoligonucleotid wurde durch präparative Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese gereinigt.
Das 770 bp EcoRI-HindIII-Fragment von pMON9563 wurde in einen EcoRI-HindIII-verdauten M13mp10-Bakteriophagenvektor (New England Biolabs) subkloniert. Die einzelsträngige Matrizen-DNA wurde aus dem Subklon hergestellt, wie im M13-Klonier- und Sequenzierungshandbuch von Amersham, Inc. (Arlington Height, IL.) beschrieben.
Die Oligonucleotid-Mutagenesereaktionen wurden durchgeführt, wie von Zoller und Smith (1983) beschrieben. Einzelsträngige M13mp10 Matrizen-DNA (0,5 picomol, pmol), die das 770 bp EcoRI- HindIII-Fragment des pMON9563-Klons enthielt, wurde mit 20 pmol des oben beschriebenen 29-mer Desoxyoligonucleotids und 1 ul von 10x Puffer DTT (pH 7,5) in einem Gesamtvolumen von 10 ul gemischt. Diese Mischung wurde 5 min lang auf 70ºC erhitzt, 20 min lang auf Raumtemperatur (23ºC) gestellt, und dann 20 min lang auf Eis gegeben. Während der Anlagerungsreaktion wurde die Enzym/Nucleotid-Lösung durch Zugabe der folgenden Komponenten hergestellt: 1 ul 10x Puffer B (0,2 M Tris-HCl, 0,1 M MgCl&sub2;, 0 1 M DTT, pH 7,5), je 1 ul 10 mM dNTPs, 1 ul 10 mM rATP, 3 Einheiten T4-DNA- Ligase, 2 Einheiten des großen Fragments von DNA-Polymerase I und H&sub2;O auf ein Gesamtvolumen von 10 ul. Diese Lösung wurde bis zur Verwendung auf Eis gehalten.
Nach 20minütiger Inkubation auf Eis wurden 10 ul der Enzym/ Nucleotid-Lösung zur angelagerten DNA zugegeben, gemischt und über Nacht auf 15ºC gehalten. Drei Einheiten T4-DNA-Ligase wurden wiederum zugegeben, um die Komplettierung der Verlängerungsreaktion zu gewährleisten, um geschlossene, kreisförmige DNA-Moleküle zu ergeben. Dieses Konstrukt wurde als M9551 bezeichnet. Das 770 bp EcoRI-HindIII-Fragment von M9551 wurde in pMON9563 zwischen den EcoRI- und HindIII-Stellen inseriert, wobei es das entsprechende Wild-Typ-Fragment ersetzte. Dieses Plasmid wurde als pMON9566 bezeichnet.
Plasmid pMON53O-DNA wurde mit BglII und ClaI verdaut, zu welchen das 330 bp BglII-EcoRI EPSP-Synthase-3'-Fragment von pMON536 und das gereinigte 1,4 kb EcoRI-ClaI EPSP-Synthase-5'- Fragment aus pMON9566 hinzugefügt wurde, wonach mit T4-DNA-Ligase behandelt wurde. Nach der Transformation wurde ein Plasmid isoliert, das die intakte mutierte EPSP-Synthase-Codiersequenz der Petunie (mit der Codiersequenz für das Chloroplast-Transit-Peptid) angrenzend an den CaMV35S-Promotor trug. Dieses Plasmid wurde als pMON567 bezeichnet. Das Plasmid pMON567 wurde in A. tumefaciens- Zellen inseriert, die das Helfer-Plasmid pGV3111-SE enthielten.
Eine Kultur von A. tumefaciens-Zellen, die pMON567/pGV3111-SE enthielt, wurde mit von Tabakpflanzen (Nicotiana tobacam CV H425) entnommenen Blattscheiben in Kontakt gebracht, wie von Horsch (1985) beschrieben. Die Agrobacterium-Zellen inserierten das mutierte EPSP-Synthase-Gen in die Chromosomen der Pflanzenzellen. Kanamycin-resistente Pflanzenzellen wurden ausgewählt und mittels der Vorgangsweise von Horsch (1985) zu differenzierten Pflanzen regeneriert.
Die Folgegenerationen dieser Pflanzen wurden vermehrt und zu einem Rosettendurchmesser von etwa 10 cm gezüchtet, was einem Pflanzenalter von etwa vier Wochen entsprach. Die Pflanzen wurden mit Glyphosat in einer Menge entsprechend 2,0 und 3,6 Pfund Säure Äquiv./Acre besprüht. Die Wirkung von Glyphosat auf die transformierten Pflanzen wurde nach 7 und 14 Tagen aufgezeichnet. Die Wirkung wurde auf eine numerische Skala von 0-10 übersetzt, wobei O eine vollständige Tötung bedeutet und 10 für die normale, unbesprühte Pflanze steht. Die nachstehenden Daten zeigen, daß mit dem Glyphosat-verträglichen EPSP-Synthase-Gen der Petunie transformierte Tabakpflanzen eine beträchtliche Verträglichkeit selbst gegen diese großen Glyphosat-Mengen aufweisen. Die Werte repräsentieren die beste Transformante für sowohl Wild-Typ-EPSP- Synthase- als auch Glyphosat-verträgliche EPSP-Synthase-Gene. TABELLE 3 Relative Wirkung von Glyphosat¹ Tag Pfund/Acre
¹ O bedeutet vollständige Tötung, und 10 bedeutet keine Wirkung.
² Glyphosat-verträgliche Petunien-EPSP-Synthase.
³ WildTyp-EPSP-Synthase.

II. EPSP-Synthase der Tomate

Komplementäre DNA (cDNA)-Bibliotheken wurden wie folgt aus poly-A plus RNA hergestellt, die aus reifen Tomatenstempeln oder Staubbeuteln isoliert worden war, und zwar mittels einer Modifikation der Verfahren von Huynh et al.(1985) und Gubler et al.(1983):

Erststrangsynthese

Die unten angeführten Mengen sind jene, die zur Herstellung einer reifen Stempel-cDNA-Bibliothek verwendet wurden, wobei die Staubbeutel-cDNA-Bibliothek auf ähnliche Weise hergestellt wurde.
10 ul von 400 ug/ml Actinomycin D (Sigma Chemical) in 50% Ethanol wurden in jedem Reaktionsröhrchen in einer Savant-Speed- Vacuum-Zentrifuge eingetrocknet. Die folgenden Reagentien wurden diesem Röhrchen zugesetzt (die Reagentien wurden in der angeführten Reihenfolge zugesetzt): Vol. Substanz Endkonz. /Menge autoklaviertes Wasser auf letztlichErststrangpuffer vgl. unten reverse Transkriptase 40 Einheiten&sup4;
¹ Sigma Chemical, St. Louis, MO.
² Collaborative Research, Lexington, MA.
&sub3; Promega Biotech, Madison, WI.
&sup4; Life Sciences, St. Petersburg, FL.
&sup5; Amersham, Arlington Heights, IL.
Die Reaktionsmischung wurde 60 min lang bei 42ºC inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde auf Trockeneis gefroren und bei -20ºC gelagert.
10 X Erststrangpuffer
500 mM Tris-HCl, pH 8,3
300 mM KCl
100 mM MgCl&sub2;
4 mM Dithiothreitol, DTT
Die Menge der synthetisierten cDNA wurde mittels Ausfällung eines Teils der Reaktionsmischung mit Trichloressigsäure und Scintillationszählung als -1,31 ug bestimmt.

Reinigung des Erststrangs

Biogel P60 (100-200 mesh, Bio Rad, Richmond, CA), vorgequellt in 10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA, pH 8,0, (TE), wurde verwendet, um eine Säule in eine mit Silizium behandelte Pasteur-Pipette, die mit silikonisierter Glaswolle zugestöpselt war (Bettvolumen = 1 ml) zu gießen. Die Säule wurde mit mehreren Volumina von 1 mM Tris, pH 7,6/0,01 mM EDTA gewaschen. Die Säule wurde kalibriert, indem 90 ul der gleichen Lösung plus 10 ul Säulenmarkierungspuffer (siehe unten) über die Säule laufen gelassen wurden. Das Leervolumen wurde mittels der den blauen Farbstoff enthaltenden Fraktion bestimmt. Weiterer Puffer wurde der Säule zugesetzt, um den roten Farbstoff zu eluieren.
Das Erststrangreaktionsgemisch wurde zweimal mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert. 0,5 ul 2% Bromphenolblau wurde der cDNA zugesetzt, und sie wurde auf die Säule geladen, und das Leervolumen wurde gesammelt. Säulenmarkierungspuffer Blue Dextrans (2 M Dalton, Sigma) Phenolrot (oder Bromphenolblau zu gelöst und

Zweitstrangsynthese und Methylierung

Der erste Strang wurde in eine Savant-Speed-Vacuum-Zentrifuge auf ca. 10 ul getrocknet. Vol. Substanz Erste Konz./Menge des ersten Strangs Zweitstrangpuffer Wasser auf Endvolumen Pol Verd. von
NEB = New England Biolabs, Beverly MA
BRL = Bethesda Research Labs, Gaithersberg, MD
Die Reaktionsmischung wurde 60 min lang bei 14ºC und dann 60 min lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Folgendes wurde zugesetzt:
0,5 ul 5 mM dNTP
1 ul T4DNA Polymerase (NEB)
Die Reaktionsmischung wurde 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Folgendes wurde zugesetzt: S-Adenosyl L-Methionin (Sigma) Methylase EDTA
5 ul wurden von der Reaktionsmischung entfernt und zu 260 ng Wild-Typ-lambda-DNA (NEB) als Kontrolle für die Methylierung zugegeben.
Die Reaktionsmischungen wurden 45 min lang bei 37ºC inkubiert.
Sowohl die Haupt- als auch die Testreaktionsmischung wurden 10 min lang zur Inaktivierung der Enzyme auf 68ºC erhitzt.
Messungen von in Trichloressigsäure unlöslichem Material zeigten an, daß -500 ng an ds cDNA (doppelsträngige cDNA) bei der Reaktion erzeugt wurden.
10X Zweitstrangpuffer: Stammlösung Stammlösung Stammlösung Ammoniumsulfat Stammlösung Beta-NAD Stammlösung

Untersuchung auf Vollständigkeit der Methylierung

Folgendes wurde dem hitzebehandelten Test-Methylierungsansatz zugesetzt:
2 ul 100 mM Tris-HCl, pH 7,6/100 mM MgCl&sub2;/1,0 M NaCl
12 ml Wasser
1 ul EcoRI (20 Einheiten BRL)
0,5 ul pUC19 (0,5 ug, NEB)
Die Reaktionsmischung wurde 1 h lang bei 37ºC inkubiert.
Die Produkte wurden auf einem Agarose-Minigel mit unverdautem pUC19 laufen gelassen, wobei mit EcoRI und HindIII verdautes Lambda als Größenmarkierungen verwendet wurde. Das pUC19 in der Reaktionsmischung verdaute vollständig, was andeutete, daß die EcoRI gründlich arbeitete, die Lambda-DNA war ganz unverdaut, was zeigte, daß sie durch die Methylierungsreaktion geschützt worden war. Dies zeigt, daß die Methylase bei der Blockierung der EcoRI- Stellen in der cDNA gegen Verdau wirksam war.

ds cDNA-Reinigung

Die Zweitstrangreaktionsmischung wurde zweimal mit einem gleichen Volumen von Phenol, welches über eine P-60-Säule laufen gelassen wurde, wie oben beschrieben, extrahiert, und das Leervolumen wurde gesammelt und lyophilisiert. Die cDNA wurde in 3 ul 1 mM Tris-HCl, pH 7,5/0,01 mM EDTA, gelöst.

Ligation von Linkern mit cDNA

Folgendes wurde in einem Mikrozentrifugenröhrchen gemischt:
3 ul ds cDNA (500 ng)
2,5 ul Phosphorylierte EcoRI-Linker (NEB, 250 ng)
1 ul 10 mM ATP
1,5 ul Wasser (auf ein Endvol. von 10 ul)
1 ul T4 DNA-Ligase (-400 Einheiten NEB)
Die Reaktionsmischung wurde 12 h lang bei 14ºC inkubiert.
10 x Ligationspuffer
300 mM Tris-HCl, pH 7,6 100 mM MgCl&sub2; 50 mM DTT

Entfernung der Linker

Die folgenden Reagentien wurden zugesetzt:
2 ul 100 mM Tris-HCl, pH 7,6/100 mM MgCl&sub2;/1,0 M NaCl
6 ul Wasser
Die Reaktionsmischung wurde 10 min lang zur Inaktivierung der Ligase auf 68ºC erhitzt.
Das folgende Reagens wurde zugesetzt:
2 ul EcoRI (40 Einheiten, NEB)
Die Reaktionsmischung wurde 2,5 h lang bei 37ºC inkubiert.
Die Reaktionsmischung wurde zur Inaktivierung von EcoRI 10 min lang auf 68ºC erhitzt.

Größenanalyse der geschnittenen cDNA und Trennung von den Linkern

5 u1 Beladungspuffer wurden zur verdauten cDNA/EcoRI-Linker- Reaktionsmischung zugegeben. Die Probe wurde auf einem 0,8% Sea- Plaque-Agarose (FMC Corp., Rockland, MD)/TEA (40 mM Tris-Acetat, pH 8,2/1,6 mM EDTA)-Minigel, welches 0,3 ug/ml Ethidiumbromid enthielt, einer Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde mit 4 V/cm laufen gelassen, bis der Bromphenolblau-Farbstoff 4 cm gewandert war. Mit Hind III und EcoRI verdaute Lambda-DNA wurde als Größenmarkierer verwendet. Die Markierer wurden mittels UV- Fluoreszenz sichtbar gemacht, und ein Gelfragment, das cDNA in einem Größenbereich von -600 bp bis größer als 10 kb enthielt, wurde entfernt.
Beladungspuffer:
250 mM EDTA, pH 7
0, 2% Bromphenolblau
50% Glycerin

Reinigung, Ligation und Verpackung

Durch Wägen und Annahme einer Dichte von 1,0 g/ml wurde das Volumen der Gelschnitte als -500 ul bestimmt. 140 ul 20 mM Tris- HCl (pH 7,5)/200 mM NaCl/1,0 mM EDTA und 20 ul 5 M NaCl wurden zum Gelfragment zugegeben. Die Mischung wurde 15 min lang auf 68ºC erhitzt und zweimal mit 500 ul Phenol extrahiert. Die DNA wurde mittels Chromatographie auf einer EluTip D-Säule (Schleicher & Schuell, Keen, NH) gemäß den Anleitungen der Erzeuger von Verunreinigungen gereinigt. Das Endvolumen betrug 450 ul. Die Menge der Radioaktivität in der Probe wurde mittels Scintillationszählung eines aliquoten Teils bestimmt, und es wurde festgestellt, daß 70 ng cDNA im eluierten Volumen enthalten waren.
2 ml (2 ug) Lambda-gt-10-Arme (Vector Cloning Systems, San Diego, CA) wurden zur cDNA zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 2 Volumen kalten Ethanols. Die Probe wurde 15 min lang auf -80ºC gekühlt, und der Niederschlag wurde 15 min lang in einer Mikrozentrifuge pelletisiert. Das Röhrchen wurde geleert und mit 200 ul -20ºC 70% Ethanol gespült, wobei darauf Bedacht genommen wurde, das Pellet nicht zu stören. Das Pellet wurde 30 min lang luftgetrocknet.
Folgendes wurde zugesetzt:
7,2 ul Wasser
1 ul 10 X Ligationspuffer
1 ul ATP
0,8 ul T4 DNA-Ligase
Die Reaktionsmischung wurde 20 h lang bei 14ºC inkubiert.
10 x Ligationspuffer
200 mM Tris-HCl, pH 7,6
100 mM MgCl&sub2;
50 mM Dithiothreitol (DTT)
Ein Viertel (2,5 ul) der Ligationsreaktionsmischung wurde in vitro unter Verwendung von Gigapack Verpackungsextrakten (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA) nach den Anleitungen des Herstellers in einen Phagen verpackt. Nachfolgendes Ausplattieren des Phagen zeigte, daß diese Reaktionsmischung 10&sup6; rekombinante Plaque-bildende Einheiten (PFU) enthielt. Die Verpackung der gesamten Ligationsmischung würde daher 4 x 10&sup6; PFU erzeugen. Der Rest der Ligationsmischung wurde für eine zukünftige Verwendung bei -20ºC gelagert.
Plaque-Abhebungen aus den zwei Bibliotheken wurden mit einem ³²P-markierten Fragment aus pMON6145, das die komplette Codiersequenz der Petunien-EPSP-Synthase enthielt, untersucht. pMON6145 ist ein Derivat des Plasmids pGEM2 (Promega Biotech, Madison, WI), welches in der Anmeldung S.N. 879,814, auf die zuvor Bezug genommen und die mit einbezogen ist, beschrieben ist, welches einen cDNA-Klon kompletter Länge der Petunien-EPSP- Synthase trägt. Zwei Hybridisierplaques wurden aus jeder Bibliothek isoliert. Karten der Inserts dieser Phagen sind in Fig. 7 gezeigt. Die großen EcoRI-Fragmente der beiden Stempel-Klone (P1 und P2) wurden in pUC19 (New England Biolabs) subkloniert, und die kleinen EcoRI-Fragmente wurden in pUC119 subkloniert, wobei die Plasmide 9591, 9589, 9595 bzw. 9596 gebildet wurden.
pUC119 wird konstruiert, indem das 476 bp Hgi AI/Dra I- Fragment von Bacteriophage M13 isoliert wird und die Enden des Framgents mit T4 DNA-Polymerase (New England Biolabs) stumpf gemacht werden. Dieses Fragment wird dann in pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985) inseriert, welches mit NdeI verdaut und mit Klenow- DNA-Polymerase (New England Biolabs) aufgefüllt worden ist. Das resultierende Plasmid (pUC119) kann zur Herstellung von einzelsträngiger DNA verwendet werden, wenn Zellen, die das Plasmid beinhalten, mit einem defekten Phagen, wie R408 (Stratagene Cloning Systems) infiziert werden.
Um eine NcoI-Stelle und ein ATG-Translationsinitiierungscodon an der Stelle, die als Anfang des reifen Enzyms zur in vitro- Expression in E. coli vorausgesagt ist, einzuführen, wurde das 1,6 kb EcoRI/HindIII-Fragment von pMON9591 in EcoRI/HindIII-verdautes M13mp18 (New England Biolabs) kloniert, was einen Phagen mit der Bezeichnung M9568 erzeugt. Dieses Klon wurde mit dem Oligonucleotid:
wie zuvor beschrieben mutagenisiert. Die Sequenzierung bestätigte den Erfolg der Mutagenese, und der resultierende Phage wurde mit M9575 bezeichnet. Das 1,6 kb EcoRI/HindIII-Fragment dieses Phagen wurde in EcoRI/HindIII verdautes pMON6140 inseriert. Dieses Plasmid wurde mit pMON9717 bezeichnet. Das Plasmid pMON6140 ist ein Derivat von pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI), das dasselbe cDNA-Klon voller Länge der Petunien-EPSP-Synthase trägt, wie zuvor für pMON6145 beschrieben.
Die in vitro-Transkription und Translation von pMON9717 erzeugte kein aktives Enzym. Nachfolgende Sequenzierung der cDNA, aus der dieser Klon hergestellt wurde (pMON9591), zeigte eine einzige Nucleotiddeletion in der Codiersequenz, was zu einer Rahmenverschiebung in der Codiersequenz führen würde. Der diese Deletion enthaltende Bereich wurde durch den entsprechenden Bereich aus pMON9589 ersetzt, indem das 900 bp BamHI/HindIII- Fragment von pMON9717 mit dem entsprechenden pMON9589-Fragment ausgetauscht wurde. Dieses Plasmid wurde mit pMON9718 bezeichnet. Die in vitro-Analyse von pMON9718 zeigte, daß es für aktive Tomaten-EPSP-Synthase codierte.
Ein Vektor für hochgradige Expression in E. coli wurde konstruiert, um die Tomaten-EPSP-Synthase weiter zu charakterisieren. Das NcoI/HindIII-Fragment von pMON9718, das die Codiersequenz für Tomaten-EPSP-Synthase enthielt, wurde in NcoI/HindIII-verdautes pMON5521 inseriert. Dies brachte die Tomaten-EPSP-Synthase- Codiersequenz unter die Kontrolle des E. coli-RecA-Promotors (Horii et al., 1980; Sancar et al., 1980). Dieses Plasmid wurde mit pMON9719 bezeichnet. Das Plasmid pMON9719 konnte den EPSP- Synthase-Mangel einer E. coli aroA Mutante (SR481) komplementieren, was die Synthese von aktiver EPSP-Synthase bewies.
Um eine Alanin-zu-Glycin-Substitution an der Position 101 der reifen Tomaten-EPSP-Synthase einzuführen, wurde die Wild-Typ-EPSP- Synthase-Codiersequenz im Phagen M9568 mit dem Oligonucleotid
mittels des Verfahren von Zoller und Smith (1983) mutagenisiert, wie oben beschrieben. Der Phage wurde dann mit dem Oligonucleotid
mutagenisiert, um eine NcoI-Stelle und ein Translationsinitierungscodon einzuführen, wie zuvor beschrieben. Das resultierende Konstrukt wurde mit M9580 bezeichnet. Das EcoRI/BamHI-Fragment von M9580, welches den mutagenisierten Bereich enthält, wurde in pMON9718, das mit EcoRI und BamHI verdaut worden war, inseriert. Dieses Plasmid wurde mit pMON9728 bezeichnet. Zur Expression in E. coli wurde das NcoI/HindIII-Fragment von pMON9728 in NcoI/HindIII- verdautes pMON5521 (oben beschrieben) inseriert, was ein Plasmid erzeugte, das mit pMON9729 bezeichnet wurde. Daher sind die Plasmide pMON9719 und pMON9729 ähnliche Plasmide, in welchen die Wild-Typ-EPSP-Synthase und die Glyphosat-verträgliche EPSP- Synthase (gly(101)-ala) der Tomate unter der Kontrolle des recA- Promotors von E. coli stehen. E. coli SR481-Zellen, die pMON9719 oder pMON9729 beinhalten, wurden unter Bedingungen gezüchtet, die die Expression des RecA-Promotors herbeiführen. Die Zellen wurden einer Lyse unterzogen, und die Extrakte wurden auf EPSP-Synthase- Aktivität untersucht.
Im speziellen wurde die Bakterienzellpaste zweimal mit 0,9% Kochsalzlösung gewaschen, in Puffer (100 mM Tris-HCl, 5 mM Dithiothreitol, 1 mM EDTA, 10% Glycerin und 1 mM Benzamidin HCl) suspendiert, und zweimal durch die French Pressure Cell bei 100 psi hindurchgeleitet. Der Zellextrakt wurde von den Zellen durch 10minütiges Zentrifugieren bei 15.000 x g bei 5ºC getrennt. Er wurde unter Verwendung von Sephadex G-50 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) entsalzen. Der entsalzene Extrakt wurde wie folgt auf EPSPSynthase-Aktivität untersucht:
Zu einer Untersuchungsmischung (40 ul), die Shikimat-3- phosphat (2 mM), ¹&sup4;C-Phsophoenolpyruvat (1 mM, 1,2 mCi/mMol), Ammoniummolybdat (0,1 mM), Kaliumfluorid (5 mM) in 50 mM HEPES- KOH, pH7, enthielt, wurden 10 ul des Extrakts zugegeben und 2 min lang bei 25ºC inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von 50 ul 90% Ethanol/0,1 M Essigsäure, pH 4,5, abgeschreckt. 70 ul der Reaktionsmischung wurden auf eine SynchroPak AX100 HPLC- Säule (0,4 x 25 cm) geladen, und die Säule wurde mit 0,5 M Kaliumphosphat, pH 5,5 mit 1 ml/min eluiert. Die Radioaktivität des Elutionsmittels wurde unter Verwendung eines Radiomatic Flo- One Beta-Instruments (Radiomatics, Florida) überwacht. Die EPSP- Synthase-Aktivität wurde durch Messung der Konversion von ¹&sup4;C-PEP zu ¹&sup4;C-EPSP-Synthase bestimmt, welche beide unter den obigen Chromatographiebedingungen wiedergelöst sind. Der Proteingehalt des Extrakts wurde mittels der Methode von Bradford (Biorad Labs, California) bestimmt. Die spezifische Aktivität des Extrakts wird als Nanomol der gebildeten EPSP-Synthase/min/mg Protein ausgedrückt.
Die Untersuchungsergebnisse zeigen, daß pMON9719-enthaltende Zellen eine EPSP-Synthase-Aktivität von etwa 1600 Nanomol der gebildeten EPSP-Synthase/Minute/mg Protein hatten. Dieses Enzym war jedoch gegenüber Glyphosat ziemlich empfindlich, wie durch eine I&sub5;&sub0; von 12 uM Glyphosat angezeigt. Obwohl pMON9729-enthaltende Zellen (gly(101)-ala) eine EPSP-Synthase-Aktivität von 390 Nanomol/Minute/mg Protein hatten, war dieses Enzym sehr Glyphosatverträglich, wie durch einen I&sub5;&sub0;-Wert von 32 mM Glyphosat angezeigt.
Ein Pflanzentransformationsvektor, der eine Glyphosatresistente Form von Tomaten-EPSP-Synthase in transgenen Pflanzen erzeugen kann, wird wie folgt konstruiert:
Eine BgIII-Stelle wird vor dem ATG-Translationsinitiierungscodon von Tomaten-prä-EPSP-Synthase erzeugt, indem an pMON9596 eine stellengerichtete Mutagenese durchgeführt wird. Die Mutagenese wird mittels der Methode von Kunkel (1985) unter Verwendung des Oligodesoxynucleotids:
durchgeführt. Die Alanin-zu-Glycin-Substitution wird in die Codiersequenz für M9568 durch stellengerichtete Mutagenese, genau wie oben beschrieben, eingebracht. Das 700 bp EcoRI/BamHI-Fragment des resultierenden Phagen wird dann in EcoRI/BamHI-verdautes pMON9718 transferiert, wobei es das entsprechende Wild-Typ- Fragment ersetzt.
Das 70 bp BglII/EcoRI-Fragment des veränderten pMON9596 wird dann . . mit dem 1,6 kb EcoRI/HindIII-Fragment des M9718-Derivats zu BglII/HindIII-verdautem pMON550 vereinigt. pMON550 ist ein Derivat von pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985), das durch Inserieren des synthetischen DNA-Fragments:
in mit HindIII und Kpn I verdautes pUC19 erzeugt worden ist. Dies rekonstituiert ein komplettes Tomaten-EPSP-Synthase-Vorläufer-Gen, das Alanin zur Glycin-Substitution einschließt.
Zur Insertion in einen Pflanzentransformationsvektor wird eine geeignete Stelle am 3'-Ende der Codiersequenz durch Verdau mit HindIII geschaffen, wobei die Enden stumpf gemacht werden und ein ClaI-Linker (New England Biolabs) inseriert wird. Das 1,7 kb BglII/ClaI-Fragment dieses Plasmids wird dann in einen BGlII/ClaI- verdauten Pflanzentransformationsvektor, wie pMON316, inseriert. Das resultierende Plasmid hat die Tomaten-EPSP-Synthase-Vorläufer- Codiersequenz mit dem Alanin zur Glycin-Substitution an der Position 101 der reifen EPSP-Synthase-Sequenz unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors. Eine Transformation von Pflanzen, wie der Tomate, mit diesem Vektor führt zur Erzeugung eines hohen Grades des Glyphosat-verträglichen Enzyms, was zu Glyphosat-verträglichen Pflanzen führt.

III. EPSP-SYNTHASE VON ARABIDOPSIS

Eine Arabidopsis thaliana-genomische Bank wurde durch Klonieren von größenfraktionierter (15-20 kb), mit MboI- teilverdauter DNA in BamHI- und EcoRI-verdautem Lambda EMBL3 (Stategene Cloning Systems, San Diego, CA) hergestellt. Etwa 10.000 Phagen-Plaques aus dieser Bibliothek wurden mit einer ³²P- markierten Petunien-EPSP-Synthase-Sonde (pMON9566, früher hierin beschrieben) untersucht. Eine stark hybridisierende Plaque, mit E1 bezeichnet, wurde gereinigt. Southern Blots der EPSP-Synthase- Sonde zur Phagen-DNA identifizierten zwei Fragmente, die sehr stark hybridisierten. Das erste Fragment war ein 1,0 kb HindIII- Fragment, und das andere war ein 700 bp BamHI-Fragment. Diese Fragmente wurden in das Plasmid pUC119 subkloniert und mit pMON574 und pMON578 bezeichnet.
Die DNA-Sequenzen für die beiden Inserts wurden dann mittels der Methode von Sanger (1977) bestimmt. Die Sequenzdaten zeigten an, daß der Phage tatsächlich das EPSP-Synthase-Gen von Arabidopsis enthielt, und zwar durch die starke Homologie mit der Petunien-EPSP-Synthase-Sequenz. Das 700 bp BamHI-Fragment wurde als Hybridisierungssonde gegen den Phagen und Arabidopsisgenomische DNA verwendet, um Restriktionsfragmente zu identifizieren, die zum Klonieren des gesamten EPSP-Synthase-Gens geeignet waren. Zwei hybridisierende BglII-Fragmente von 6,0 kb und 3,2 kb wurden im E1-Phagen-Klon identifiziert. Diese Fragmente wurden separat in pMON550 subkloniert, um DNA für weitere Experimente bereitzustellen, und wurden mit pMON582 bzw. pMON583 bezeichnet. Zwei zusätzliche Subklone wurden aus den Klonen pMON582 und pMON583 hergestellt. Das Plasmid pMON584 ist das 1,8 kb EcoRI bis BamHI-Fragment, das das 5'-Ende des Arabidopsis-EPSP-Synthase-Gens in pUC118 enthält, welches aus pUC18 auf eine Weise hergestellt wird, die zur Herstellung von pUC119 aus pUC19 analog ist. Das Plasmid pMON589 ist das 2,8 kb BamHI bis BglII-Fragment, das das 3'-Ende des Arabido sis-EPSP-Synthase-Gens in pUC119 enthält. Eine Sequenzenbestimmung aus der BamHI-Stelle von pMON584 und aus der BamHI-Stelle von pMON589 vervollständigte die Sequenz der Codierbereiche des Gens, vgl. Fig. 8.
Die Codiersequenz wurde geändert, so daß die exprimierte Arabidopsis-EPSP-Synthase das Alanin für die Glycin-Substitution an der Position 101 des reifen Enzyms inkludieren würde. Das Plasmid pMON578 wurde mit dem Oligonucleotid:
mittels der Methode von Kunkel (1985) mutagenisiert. Ein Teil des resultierenden Plasmids pMON594 wurde sequenziert, um die Mutation zu bestätigen.
Eine Clal-Stelle ist direkt vor der Translationsinitiierungsstelle notwendig, um das Arabidopsis-EPSP-Synthase-Gen in Pflanzentransformations/Expressions-Vektoren zu inserieren. Ein 370 bp SnaBI/BamHI-Fragment von pMON584, das die Translationsinitiierungstelle und 65 bp von 5'-nicht-translatierten Bereich beinhaltete, wurde in EcoRV/BamHI-verdautes Bluescript KS (Stratagene Cloning Systems, San Diego, Kalifornien) kloniert, wobei pMON9734 gebildet wurde. Dieses Fragment kann nun mit ClaI und BamHI aus pMON9734 entfernt werden.
Das ganze Arabidopsis-Gen wurde für Pflanzentransformationsexperimente wie folgt rekonstruiert: das 3,0 kb BamHI bis BglII- Fragment, das die 3'-Hälfte des Gens enthielt, wurde aus pMON583 herausgeschnitten und in die unike BamHI-Stelle von pMON9734 inseriert. Dieses Plasmid pMON588 hat eine unike BamHI-Stelle in der Mitte des Gens. Das 800 bp BamHI-Fragment aus pMON594 wurde dann in die unike BamHI-Stelle von pMON588 inseriert. Dieses resultierende Plasmid, pMON598, enthält das ganze EPSP-Synthase- Gen mit der Alanin-zu-Glycin-Substitution an der Position 101 des reifen Proteins. Das ganze Gen wurde aus pMON598 als ein 3,5 kb ClaI bis EcoRI-Fragment heausgeschnitten und in ClaI/EcoRI- geschnittenes pMON857 kloniert. Dieses neue Plasmid, pMON600, enthält das ganze Arabidopsis-Gen unter der Transkriptionskontrolle des CaMV35S-Promotors und beinhaltet das 3'-Ende des Nopalin-Synthase-Gens. Das Plasmid wurde dann in A robacterium A208ASE eingeführt, das das "entschärfte" Ti-Plasmid pTiTe7SE enthielt.
Das Plasmid pMON857 wurde wie folgt hergestellt. Die DNA- Codiersequenz für ein Typ IV-Gentamicin-3-N-acetyltransferase (AAC(3)-IV)-Enzym wurde aus dem Plasmid pLG62 herausgeschnitten (Gritz und Davies, 1984). Die DNA-Sequenz dieses AAC(3)-IV-Enzyms wurde in der Literatur berichtet (Brau et al., 1984). Das Plasmid pMON825, welches die DNA umfaßt, das den offenen Leserabmen (Open Reading Frame, ORF) des AAC(3)-IV-Enzyms enthält, wurde auf folgende Weise hergestellt.
Ein 143-Basenpaar (bp) TaqI-Fragment, das den Amino-Terminus- Teil des ORF des AAC(3)-IV-Gens überspannt, wurde aus pLG62 herausgeschnitten und in die AccI-Stelle des Plasmids pUC8 kloniert (Vieira et al., 1982), wobei pMON823 geschaffen wurde. Danach wurde ein 1316 bp SacI-PstI-Fragment aus pLG62, das den Rest des ORF enthielt, in pMON823, das zuvor mit SacI und PstI- Endonucleasen geschnitten worden war, kloniert. Dieses Plasmid wurde mit pMON824 bezeichnet. Das Plasmid pMON824 enthält die rekonstruierte Codiersequenz der Typ IV-Gentamicin-3-N- acetyltransferase mit einer EcoRI-Stelle unmittelbar vor dem Beginn des ORF. Ein 1300 bp EcoRI-Fragment, das den gesamten ORF enthält, wurde dann aus pMON824 geschnitten und in die EcoRI- Stelle von pMON530 kloniert. Dieses Plasmid wurde mit pMON825 bezeichnet. Das Plasmid pMON825 enthält den gesamten AAC(3)-IV-ORF unmittelbar vor dem NOS 3'-Transkriptionsterminator/Polyadenylierungssignal.
Unter Bezugnahme auf Fig. 9 wurde das Plasmid pMON825 mit den Enonucleasen SmaI und GblII geschnitten. Die aus dem BglII-Schnitt resultierenden Überhänge wurden durch Behandlung mit Klenow- Polymerase und den vier Nucleotidtriphosphaten gefüllt. Die glatten Enden wurden durch Behandlung mit DNA-Ligase ligiert, und das resultierende Plasmid wurde mit pMON840 bezeichnet. Das Plasmid pMON840 wurde mit der Endonuclease EcoRI geschnitten. Die Überhänge wurden durch Behandlung mit Klenow-Polymerase und den vier Nucleotidtriphosphaten gefüllt. Die glatten Enden wurden durch Behandlung mit DNA-Ligase ligiert, und das resultierende Plasmid wurde mit pMON841 bezeichnet. Durch die obige Vorgangsweise wurden die BglII, SmaI und EcoRI-Restriktionsstellen aus dem chimären CaMV35S/AAC(3)-IV/NOS-Gen entfernt.
Andere Restriktionsstellen wurden durch stellengerichtete Mutagenese auf folgende Weise entfernt. Das 2170 bp PstI-Fragment von pMON841 wurde in PstI-geschnittenes pUC119 eingeführt, wodurch ein Konstrukt erzeugt wurde, das mit pMON843 bezeichnet wurde. Die EcoRV-Stelle in der CaMV35S-Promotorsequenz wurde durch stellengerichtete Mutagenese (Zoller, 1983) deletiert, wobei das Oligonucleotid:
verwendet wurde, wodurch das Plasmid pMON844 erzeugt wurde. Die Sequenzierung bestätigte, daß pMON844 die oben beschriebene EcoRV- Deletion enthielt.
Das NOS/NPTII/NOS-Gen in pMON505 wurde durch Schneiden von pMON505 mit StuI und HindIII entfernt. Es wurde durch das 2220 bp EcoRI (Klenow-gefüllt) HindIII-Fragment aus pMON844 ersetzt, das das CaMV35S/AAC(3)-IV/NOS-Gen enthielt. Dieses Plasmid wurde mit pMON845 bezeichnet. Es wurde nachfolgend durch Sequenzenanalyse festgestellt, daß das CaMV35S/AAC(3)-IV/NOS-chimäre Gen, das in pMON845 vorhanden ist, eine Fremdsequenz vor dem Beginn der CaMV35S-Promotorsequenz enthielt, die vom NOS-Promotor von pMON825 getragen wird. Die XmaI-Stelle am Beginn des CaMV35S-Promotors von pMON844 wurde durch stellengerichtete Mutagenese zu einer HindIII- Stelle geändert, wobei das Oligonucleotid:
verwendet wurde, wodurch das Plasmid pMON849 erzeugt wurde. Das EcoRI/HindIII-Fragment von pMON845 (welches das CaMV35S/AAC(3)- IV/NOS-Gen enthielt) wurde durch das kleinere 1900 bp EcoRI/HindIII-Fragment von pMON849 ersetzt, das dasselbe chimäre Gen trug. Dieses Plasmid wurde mit pMON851 bezeichnet. Fragmente von drei Plasmiden wurden verwendet, um einen Mehrzweck- Klonierungsvektor zu konstruieren, wobei das CaMV35S/AAC(3)- IV/NOS-Gen als selektierbarer Marker verwendet wurde und eine CaMV35S/NOS3'-Kassette enthielt. Unter Bezugnahme auf Fig. 10 wurde die CaMV35S/NOS3'-Kassette aus pMON849 und pMON530 hergestellt. Insbesondere wurde pMON849 mit BamHI geschnitten, wobei die AAC(3)-IV/NOS-Sequenz entfernt wurde, während die CaMV35S-Sequenz belassen wurde. Das 294 bp BglII/BamHI-Fragment aus pMON530, das den Multilinker und NOS3' enthielt, wurde in das BamHI-geschnittene pMON849 ligiert, wodurch pMON853 erzeugt wurde.
Das Tn7 Spc/Str-Resistenz-Gen wurde aus pMON120 erhalten. Das 1600 bp EcoRI/Aral-Fragment von pMON120, das das Spc/Str-Gen enthielt, wurde in EcoRI- und XmaI-geschnittenes pUC9 kloniert, wodurch das Plasmid pMON854 erzeugt wurde.
Das Plasmid pMON856 wurde durch Ligation der folgenden drei Fragmente hergestellt:
Fragment Nr. 1:
Das 7770 bp EcoRI bis Bcll-Fragment aus pMON851, das das CaMV35S/AAC(3)-iV/NOS-selektierbare Marker-Gen, das RK2- Replikon, den pBR322 Replikationsursprung, und die rechte Randsequenz aus dem Plasmid pTiT37 von Agrobacterium tumefaciens enthält.
Fragment Nr. 2:
Das 630 bp HindIII bis BamHI-Fragment aus pMON853, das die CaMV35S/NOS3'-Kassette und den Multilinker enthält.
Fragment Nr. 3:
Das 1630 bp HindIII bis BamHI-Fragment aus pMON854, das das Spc/Str-Resistenz-Gen enthält.
Fremdsequenz- und Restriktionsstellen zwischen dem selektierbaren Markergen und dem Spc/Str-Gen wurden aus pMON856 auf folgende Weise entfernt. Das Plasmid pMON856 wurde mit StuI und XbaI geschnitten. Die XbaI-Stelle wurde durch Behandlung mit Klenow-Polymerase und den vier Nucleotidtriphosphaten gefüllt. Nachfolgende Ligation erzeugte das Plasmid pMON857, das ein geeigneter Pflanzentransformationsvektor ist, der das CaMV35S/AAC(3)-IV/NOS-selektierbare Marker-Gen enthält.
Das Agrobacterium, welches das pMON600-Plasmid beinhaltet, wurde verwendet, um Ex-Pflanzen von Brassica napus zu transformieren. Drei Gentamicin-resistente Calli wurden erhalten. Alle drei dieser Calli erwiesen sich als wachstumsfähig auf 0,5 mM Glyphosat, einer Konzentration, die einen Wild-Typ-Callus tötet. Proteine wurden aus Proben der Calli extrahiert und auf EPSP- Synthase-Aktivität untersucht. Alle drei der Calli enthielten EPSP-Synthase-Aktivität, die gegen 0,5 mM Glyphosat resistent war.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die mit pMON600 transformierten Calli eine Glyphosat-resistente Form der EPSP-Synthase enthalten. Die EPSP-Synthase in den Extrakten war weiters durch Titieren der Resistenz gegen Glyphosat gekennzeichnet. Die I&sub5;&sub0; des Enzyms betrug 7,5 mM, dies ist um mehrere Größenordnungen höher als man für irgendeine Wild-Typ-Pflanzen-EPSP-Synthase gefunden hat. Wenn man die Unterschiede in den Versuchsbedingungen in Betracht zieht (pflanzenextrakte, die noch immer die endogene (Wild-Typ-) EPSP- Synthase enthalten gegenüber Extrakten aus überproduzierenden E. coli), so unterscheidet sich diese I&sub5;&sub0; nicht wesentlich von den Werten, die für die Petunien- und Tomaten-Enzyme, welche dieselbe Substitution von Glycin durch Alanin tragen, gefunden wurden (16 bzw. 32 mM).
Mit dem Plasmid pMON600 transformierte Pflanzen werden durch Transformation von Stengel-Expflanzen und Züchtung unter selektiven Bedingungen, die die Sproßbildung gegenüber der Kallusbildung begünstigen, erzeugt. Die resultierenden Pflanzen werden die Glyphosat-verträgliche Form von Arabidopsis EPSP- Synthase enthalten und eine erhöhte Verträglichkeit gegenüber Glyphosat-Herbiziden zeigen.

IV. EPSP-SYNTHASE VON BRASSICA NAPUS

Die cDNA für EPSP-Synthase von Brassica napus wurde aus einer Bibliothek isoliert, die aus von B. napus-Wurzelspitzen isolierter RNA konstruiert worden war. Die Bibliothek wurde unter Verwendung des im Handel erhältlichen Amersham cDNA-Synthese-Kits (Amersham Corp., Arlington Hts., IL) und Lambda gt10 von Vector Cloning Systems (San Diego, CA) konstruiert. Die Bibliothek wurde mit einem Insert aus pMON578, die einen Teil des Arabidopsis-EPSP- Synthase-Gens enthält, überprüft, und hybridisierende Plaques wurden isoliert und ihre Inserts in Bluescript-Plasmide (Vector Cloning Systems, San Diego, CA) und einzelsträngige Phagen subkloniert. Die Sequenz eines Teils eines der cDNA-Klone (pMON9752, enthaltend eine 1600 bp cDNA) wurde bestimmt. Unter Bezugnahme auf Fig. 2 hat das aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Protein eine starke Homologie zur Petuniensequenz in dem Bereich, der dem reifen Protein entspricht. Bemerkenswerterweise sind die Aminosäuren 94-107 des Petunienenzyms identisch mit den Aminosäuren 97-110 des reifen Brassica napus-Enzyms (eine Drei- Aminosäuren-Insertion in Brassica gegenüber der Petunie in der Nähe des Amino-Terminus ist für den Unterschied in der Nummerierung verantwortlich, vgl. Fig. 2).
Das Brassica napus-Enzym wurde geändert, um das Glycin in der Position 104 (die Gly 101 bei der Petunie entspricht) in ein Alanin zu ändern, und zwar durch stellengerichtete Mutagenese unter Verwendung des Oligonucleotids:
gemäß der Methode von Kunkel (1985).
Isolierte Ausgangs-cDNA-Klone enthielten nicht die komplette Sequenz des Amino-terminalen Chloroplasten-Transit-Peptids von B. napus-EPSP-Synthase. Die verbleibende Sequenz wird durch Überprüfung der cDNA-Bibliothek isoliert, bis ein diesen Bereich enthaltender Klon erhalten wird, oder durch Isolieren eines Klons aus einer Bibliothek von B. napus genomischer DNA durch Hybridisierung mit einem B. napus cDNA-Klon. Zur Expression in Pflanzen wird eine BglII oder eine andere praktische Stelle direkt vor dem normalen Translationsinitiierungscodon erzeugt, wie es bei den Petunien- und Tomaten-Sequenzen gemacht wurde. Dieser Bereich wird dann mit der cDNA, die mutagenisiert worden war, damit sie die Alanin-zu-Glycin-Substitution an einer üblichen HindIII-Stelle enthält, vereinigt. Das veränderte Gen wird dann in einen Pflanzentransformationsvektor, wie pMON530 inseriert, wodurch die Codiersequenz unter die Kontrolle des CaMV35S-Promotors gebracht wird. Der resultierende Vektor wird zur Erzeugung transgener Pflanzen verwendet, die eine verbesserte Verträglichkeit gegenüber Glyphosatherbizid aufweisen.

Herstellung eines Glyphosat-verträglichen Mais-EPSP-Synthase-Gens und Glyphosat-verträglicher Maiszellen

Konstruktion eines Glyphosat-verträglichen Mais-Gens Maissamen wurden 12 h lang in Wasser getränkt, die die Scutella beinhaltenden Embryos wurden aus den Samen herausgeschnitten, und die RNA wurden aus diesem Material mittels der Methode von Rochester et al. (1986) gereinigt. PolyA-mRNA wurde durch Chromatographie auf Oligo-dT-cellulose aus der RNA isoliert und zur Konstruktion einer cDNA-Bibliothek, wie zuvor beschrieben, verwendet. Die Bibliothek wurde mit einer ³²P- markierten RNA-Sonde überprüft, die in vitro aus mit HindIII linearisiertem pMON9717 synthetisiert worden war. Die Sonde wurde mit T7 RNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) gemäß den Anleitungen der Hersteller synthetisiert. Hybridisierende Plaques wurden isoliert, re-plattiert, und Nitrocellulose-Abzüge von den Platten wurden mit derselben Sonde überprüft. Plaques, die einzelne Klone darstellten, die stark mit der Tomaten-Sonde hybridisierten, wurden isoliert, vermehrt, und zur Herstellung von DNA verwendet. Es zeigte sich, daß der Klon Lambda-zld ein 1,8 kb EcoRI-Insert enthielt. Das Insert dieses Phagen wurde in die EcoRI-Stelle von Bluescript KS+ (Strategene, San Diego, CA) subkloniert, um pMON9935 zu bilden. Die komplette Sequenz dieses cDNA-Klons wurde bestimmt und ist in Fig. 2 gezeigt. Um zukünftige Konstruktionen zu erleichtern, wurde eine Xba I-Stelle direkt vor dem ersten ATG- Initiierungscodon dieses Klons erzeugt, und zwar durch 0ligonucleotid-vermittelte Mutagenese mittels der Methode von Kunkel unter Verwendung des Oligonucleotids
wodurch das Plasmid pMON9950 erzeugt wurde. Das pMON995O wurde mit Xba I verdaut und re-ligiert, um das 126 pb Xba I-Fragment am 5'- Ende der cDNA zu eliminieren, wobei pMON9951 gebildet wurde. Um eine Codiersequenz für eine Glyphosat-verträgliche Form von Mais- EPSP-Synthase zu erzeugen, wurde pMON9951 mutiert, und zwar mittels der Methode von Kunkel unter Verwendung des Oligonucleotids:
was pMON996O ergab. Diese Mutagenese verändert ein GGA-Codon zu einem GCT-Codon, wobei der zweite Glycinrest in der konservierten Sequenz -L-G-N-A-G-T-A- zu einem Alanin im resultierenden Protein umgeändert wird. Der Glycinrest ist Aminosäure 163 der vorausgesagten Mais-Prä-EPSP-Synthase. Diese würde der Aminosäure 95-105 des reifen Proteins entsprechen, was von der genauen Transit- Peptidase-Schnittstelle abhängt, die nicht bestimmt wurde.
Um zu demonstrieren, daß durch diese Veränderung eine Glyphosat-verträgliche Form von Mais-EPSP-Synthase erzeugt wurde, wurde Protein aus pMON9951 und pMON9960 hergestellt, und zwar durch in vitro-Transkription mit T7 RNA-Polymerase, gefolgt von einer in vitro-Translation wie folgt: Plasmid-DNA (pMON9951 und pMON9960), die die komplette EPSP-Synthase-cDNA enthielt, wurde mit EcoRI linearisiert. Die linearisierte Plasmid-DNA wurde in vitro mit T7 Polymerase transkribiert, wie im wesentlichen von Krieg et al., 1984, beschrieben. Der Standard-Reaktionspuffer enthielt 40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 2 mM Spermidin, 80 E RNAsin Ribonuclease-Inhibitor, je 0,5 mM von ATP, GTP, CTP und UTP in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 100 ul. Das erhaltene RNA-Pellet wurde in 20 ul sterilem Wasser re-suspendiert und bei -80ºC gelagert. Eine Standard-Translationsreaktion enthielt 100 ul mit Nuclease behandeltes Kaninchen-Reticulocyt-Lysat, 5,7 ul einer 19-Aminosäuremischung (minus Methionin) zu je 1 mM, 5,7 ul RNA (gesamte RNA-Transkripte stammend aus 0,63 ug Plasmid-DNA), 16 ul RNAsin (20E/ul) Ribonuclease-Inhibitor und 58,3 ul [³&sup5;S]-Methionin (14-15 mCi/ml). Die in vitro-Translationsprodukte wurden bei -80ºC gefroren gelagert.
Die Produkte der in vitro-Translation wurden dann auf EPSP- Synthase-Aktivität wie hier beschrieben untersucht. Unter Bezugnahme auf Fig. 12 zeigte das Produkt von pMON9951 eine leicht nachweisbare EPSP-Synthase-Aktivität in Abwesenheit von Glyphosat. Wenn die Untersuchung in Anwesenheit von 1,0 mM Glyphosat wiederholt wurde, wurde keine Aktivität nachgewiesen. Demgegenüber zeigte das mutierte Prä-Enzymprodukt von pMON9960 einen hohen Grad an Glyphosat-Verträglichkeit, wobei es bei 1 mM Glyphosat nur leicht gehemmt, bei 10 mM Glyphosat zu 25% gehemmt war und bei 100 mM Glyphosat noch immer eine nachweisbare Aktivität aufwies.
Zur Expression in Maiszellen wird die Codiersequenz der Glyphosat-verträglichen, mutierten Form von Mais-Prä-EPSP-Synthase aus pMON9960 herausgeschnitten und zwischen einem Promotor, der dafür bekannt ist, daß er in Maiszellen funktioniert, wie dem CaMV35S-Promotor, und der Poly-A-Ädditionsstelle des Nopalin- Synthase-Gens inseriert. Zusätzlich kann ein Intron, wie das erste Intron des Mais-ADH1-Gens, im 5'-untranslatierten Bereich der Expressionseinheit inkludiert werden, was die Expression des chimären Gens verbessern kann (Callis, et al. 1987).
Diese Expressionseinheit wird dann in einen Vektor inseriert, der ein Neomycin-Phosphotransferase-Gen unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors enthält, oder einen ähnlichen Vektor mit einem Marker-Gen, das die Selektion von transformierten Maiszellen berücksichtigen kann. Dieser Vektor oder ein ähnlicher Vektor, der irgendeine andere Glyphosat-resistente Codiersequenz verwendet, die wie in den Ansprüchen und Beispielen dieser Anmeldung beschrieben konstruiert worden ist, wird dann, wie im nachfolgenden Beispiel beschrieben, in Maiszellen eingeführt.- Herstellung von Mais-Protoplasten Protoplasten werden aus einer Suspensionslinie von Black Mexican Sweet (BMS)-Mais BMSI (ATCC 54022), wie von Fromm et al. (1985 und 1986) beschrieben, hergestellt. Die BMSI-Suspensionszellen werden in BMS-Medium gezüchtet, welches MS-Salze, 20 g/l Saccharose, 2 mg/l (2,4-Dichlorphenoxy)-essigsäure, 200 mg/l Inositol, 130 mg/l Asparagin, 1,3 mg/l Niacin, 0,25 mg/l Thiamin, 0,25 mg/l Pyridoxin, 0,25 mg/l Calciumpantothenat, pH 5,8, enthält. 40 ml Kulturen in 125 Erlenmeyerkolben werden bei 26ºC mit 150 U/min geschüttelt. Die Kultur wird alle drei Tage mit einem gleichen Volumen an frischem Medium verdünnt. 1 bis 2 Tage nach der Zugabe von frischem Medium werden Protoplasten von aktiv wachsenden Zellen isoliert. Zur Isolierung der Protoplasten werden Zellen bei 200 x g in einer Ausschwing-Tischzentrifuge pelletisiert. Der Überstand wird als konditioniertes Medium zur Züchtung der Protoplasten aufbewahrt. 6 ml gepackte Zellen werden in 40 ml 0,2 M Mannit/50 mM CaCl&sub2;/10 mM Natriumacetat, welches 1% Cellulase, 0,5% Hemicellulase und 0,02% Pectinase enthält, re-suspendiert. Nach 2stündiger Inkubation bei 26ºC werden die Protoplasten durch Filtration durch ein 60 um Nylonmaschengitter abgetrennt, bei 200 x g zentrifugiert und einmal in derselben Lösung ohne Enzyme gewaschen.
Transformation von Mais-Protoplasten unter Verwendung einer Elektroporierungstechnik Die Protoplasten werden durch Waschen in einer 2 mM Kaliumphosphat, pH 7,1, 4 mM Calciumchlorid, 140 mM Natriumchlorid und 0,2 M Mannit enthaltenden Lösung für die Elektroporation vorbereitet. Nach dem Waschen werden die Protoplasten in derselben Lösung bei einer Konzentration von 4 x 10E6 Protoplasten pro ml resuspendiert. Ein halber ml der Protoplasten-hältigen Lösung wird mit 0,5 ml der gleichen Lösung, die 50 Mikrogramm supergecoilte Plasmid-Vektor-DNA enthält, gemischt und in eine 1 ml Elektroporationskuvette gegeben. Die Elektroporation erfolgt wie von Fromm et al. (1986) beschrieben. Wie beschrieben wird von einem 122 oder 245 microFarad-Kondensator, der auf 200 V geladen war, ein elektrischer Impuls abgegeben. Nach 10 min bei 4ºC und 10 min bei Raumtemperatur werden die Protoplasten mit 8 ml eines Mediums, das MS-Salze, 0,3 M Mannit, 2% Saccharose, 2 mg/l 2,4-D, 20% konditioniertes BMS-Medium (siehe oben) und 0,1% niedrigschmelzende Agarose enthält, verdünnt. Nach 2 Wochen im Dunklen bei 26ºC wird ein Medium ohne Mannit, welches Kanamycin enthält, zugegeben, so daß eine Endkonzentration von 100 mg/l Kanamycin erhalten wird. Nach weiteren 2 Wochen werden Mikrocalli aus der Flüssigkeit entfernt und auf eine Membranfilterscheibe über Agarose-verfestigtem Medium, das 100 mg/l Kanamycin enthält, placiert. Kanamycinresistente Calli, die aus transformierten Maiszellen bestehen, treten nach 1-2 Wochen auf.

Glyphosat-verträgliche Maiszellen

Wie von Fromm et al. (1986) beschrieben, können transformierte Maiszellen durch Züchtung in Kanamycin-hältigem Medium nach Elektroporation mit DNA-Vektoren, die chimäre Kanamycin-Resistenz- Gene, bestehend aus dem CaMV35S-Promotor, dem NPTII-Codierbereich und dem NOS 3'-Ende, enthalten, ausgewählt werden. Diese Zellen würden auch die Glyphosat-verträgliche Form von EPSP-Synthase erzeugen und würden höhere Mengen an Glyphosat vertragen.
Alternative Methoden zum Einführen des Plasmids in Mais oder andere Monocot-Zellen würden die Hochgeschwindigkeits- Mikroprojektil-Methode von Klein et al. (1987) oder die Injektionsmethode von de la Pena et al. (1987) einschließen, jedoch nicht auf diese eingeschränkt sein.
Die oben beschriebenen Ausführungsformen sind angeführt, um die Ausübung der vorliegenden Erfindung besser zu erläutern. Es sei verstanden, daß diese Ausführungsformen nur zum Zwecke der Illustration dienen und den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen.

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Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Glyphosat-verträglichen 5- Enolpyruvyl-3-phosphoshikimat- (EPSP-) -Synthaseenzymen, bei welchem der zweite Glycinrest in der Aminosäuresequenz:

-L-G-N-A-G-T-A- oder in einer homologen Sequenz davon durch einen Alaninrest substituiert wird, wobei sich die Sequenzen zwischen den Positionen 80 und 120 in einer reifen Wild-Typ-EPSP- Synthasesequenz befinden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Glyphosat-verträgliche EPSP-Synthase aus einer EPSP-Synthase einer Wild-Typ-Pflanze hergestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Glyphosat-verträgliche EPSP-Synthase aus einer EPSP-Synthase von Wild-Typ-Bakterien hergestellt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Glyphosat-verträgliche EPSP-Synthase aus einer EPSP-Synthase von Wild-Typ-Pilzen hergestellt wird.

5. Glyphosat-verträgliches 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimat- (EPSP-) -Synthaseenzym, welches die Aminosäuresequenz:

-L-G-N-A-A-T-A- oder eine homologe Sequenz davon enthält, die einen Alaninrest an der Position 5 enthält, wobei sich die Sequenzen zwischen den Positionen 80 und 120 in einer reifen EPSP-Synthasesequenz befinden.

6. Glyphosat-verträgliches EPSP-Synthaseenzym nach Anspruch 5, wie in Fig. 1 dargestellt.

7. Glyphosat-verträgliche EPSP-Synthase nach Anspruch 5, hergestellt mittels des Verfahrens nach Anspruch 2, 3 oder 4, worin die Wild-Typ-EPSP-Synthase ausgewählt ist aus der Gruppe der EPSP- Synthasen bestehend aus Aspergillus nidulans, Petunie, Tomate, Mais, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, E. coli K-12 und Salmonella typhimurium, wie in Fig. 2 dargestellt.

8. Pflanzengen, das für ein Glyphosat-verträgliches EPSP- Synthaseenzym nach Anspruch 5 kodiert.

9. Pflanzentransformationsvektor mit einem Gen, das für eine Glyphosat-verträgliche &sup5;-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimat (EPSP-) -Synthase mit der Sequenz:

- L-G-N-A-A-T-A- oder einer dazu homologen Sequenz, die einen Alaninrest an der Position 5 enthält, wobei die Sequenzen sich zwischen den Positionen 80 und 120 der reifen EPSP-Synthasesequenz befinden, kodiert.

10. Vektor nach Anspruch 9, welcher ein für eine Glyphosatverträgliche Pflanzen-EPSP-Synthase kodierendes Gen enthält.

11. Vektor nach Anspruch 9, welcher ein für eine Glyphosatverträgliche bakterielle EPSP-Synthase kodierendes Gen enthält.

12. Vektor nach Anspruch 9, welcher ein für eine Glyphosatverträgliche Pilz-EPSP-Synthase kodierendes Gen enthält.

13. Transformierte Pflanzenzelle, die ein Gen nach Anspruch 8 enthält.

14. Transformierte Pflanzenzelle nach Anspruch 13, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tomatenpflanze, Tabakpflanze, Ölsaatenraps, Flachspflanze, Soyabohne, Sonnenblume, Zuckerrübe, Luzerne (Alfalfa), Baumwollpflanze, Reispflanze und Maispflanze.

15. Transformierte Tomatenpflanzenzelle nach Anspruch 13.

16. Transformierte Tabakpflanzenzelle nach Anspruch 13.

17. Transformierte Ölsaatenrapszelle nach Anspruch 13.

18. Transformierte Flachspflanzenzelle nach Anspruch 13.

19. Transformierte Soyabohnenzelle nach Anspruch 13.

20. Transformierte Sonnenblumenzelle nach Anspruch 13.

21. Transformierte Zuckerrübenzelle nach Anspruch 13.

22. Transformierte Luzernenzelle nach Anspruch 13.

23. Transformierte Maispflanzenzelle nach Anspruch 13.

24. Pflanze enthaltend transformierte Pflanzenzellen nach Anspruch 13.

25. Pflanze nach Anspruch 24, wobei die Pflanze eine Tomatenpflanze ist.

26. Pflanze nach Anspruch 24, wobei die Pflanze eine Tabakpflanze ist.

27. Pflanze nach Anspruch 24, wobei die Pflanze Ölsaatenraps ist.

28. Pflanze nach Anspruch 24, worin die Pflanze eine Flachspflanze ist.

29. Pflanze nach Anspruch 24, wobei die Pflanze eine Sonnenblume ist.

30. Pflanze nach Anspruch 24, wobei die Pflanze eine Zuckerrübe ist.

31. Pflanze nach Anspruch 24, wobei die Pflanze eine Luzerne ist.

32. Samen, erzeugt von einer Pflanze nach Anspruch 24.

33. Samen nach Anspruch 32, wobei die Pflanze eine Tomatenpflanze ist.

34. Samen nach Anspruch 32, wobei die Pflanze eine Tabakpflanze ist.

35. Samen nach Anspruch 32, wobei die Pflanze Ölsaatenraps ist.

36. Samen nach Anspruch 32, wobei die Pflanze eine Flachspflanze ist.

37. Samen nach Anspruch 32, wobei die Pflanze eine Sonnenblume ist.

38. Samen nach Anspruch 32, wobei die Pflanze eine Zuckerrübe ist.

39. Samen nach Anspruch 32, wobei die Pflanze eine Luzerne ist.

40. DNA-Sequenz, die für eine Glyphosat-verträgliche EPSP- Synthase nach Anspruch 5 kodiert.

41. DNA-Sequenz nach Anspruch 40, die weniger als zwanzig Kilobasen an Länge hat.

42. DNA-Sequenz nach Anspruch 41, die für eine Glyphosatverträgliche EPSP-Synthase nach Anspruch 6 kodiert.

DNA-Sequenz nach Anspruch 40, die für eine Glyphosatverträgliche EPSP-Synthase nach Anspruch 7 kodiert.