DE3783958T3

DE3783958T3 - Verzögerte Abgabe von makromolekularen Polypeptiden.

Info

Publication number: DE3783958T3
Application number: DE3783958T
Authority: DE
Inventors: Deborah Ann Eppstein; Brian Bloor Schryver
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1986-05-23
Filing date: 1987-05-22
Publication date: 2003-08-07
Anticipated expiration: 2007-05-23
Also published as: EP0251476B1; CA1293443C; DE3783958T2; JP2594560B2; DE3783958D1; HK38997A; AU7333287A; ES2039437T5; EP0251476B2; EP0251476A1; ES2039437T3; JPS632930A; NZ220403A; ATE85214T1; AU608225B2; US4962091A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Wirkstoff-Zufuhrsystem zur Verabreichung makromolekularer Polypeptid-Wirkstoffe mit Molekulargewichten von ungefähr 10000 oder größer, insbesondere von Interferonen, mit gesteuerter Geschwindigkeit über einen längeren Zeitraum.
Das traditionelle und am verbreitetsten verwendete Verabreichungsverfahren von therapeutischen Mitteln ist dasjenige auf oralem Weg. Jedoch ist im Fall von großen Polypeptiden eine solche Zuführung aufgrund der Hydrolyse der Peptide durch Verdauungsenzyme nicht möglich. Die am häufigsten verwendeten Verfahren zur Verabreichung von therapeutischen Polypeptidmitteln sind die der wiederholten Injektion, intramuskulärer (IM), subkutaner (SC) oder intravenöser (IV) Infusion. Diese Verfahren sind in Situationen, in denen eine sehr beschränkte Anzahl von Injektionen erforderlich ist, annehmbar, aber für die chronische Verabreichung (z. B. wie bei der Insulintherapie) unerwünscht. Die Natur vieler der Erkrankungen, Störungen und Zustände, die für eine Verbesserung durch Polypeptidverabreichung empfänglich sind, ist jedoch eher chronisch als akut, was dementsprechend häufige Injektionen über einen längeren Zeitraum erfordert.
Es besteht deshalb ein Bedarf für ein wirksames und ökonomisches Zufuhrsystem für große Polypeptidmittel. Bioabbaubare Polymermatrizes, die aus Polymilchsäure oder Copolymeren von Polymilchsäure mit anderen Comonomeren, wie z. B. PolyGlycolsäure, gebildet werden, sind aufgrund ihrer Fähigkeit, sich in situ biologisch abzubauen, als Zufuhrsysteme mit verzögerter Freigabe für eine Vielfalt von Wirkstoffen verwendet worden. Siehe z. B. die US-Patente Nr. 4,293,539 und 4,419,340. Die Verwendung dieser Polymeren in Implantaten für die Zuführung mehrerer therapeutischer Mittel ist in wissenschaftlichen Publikationen und in der Patentliteratur offenbart worden. Siehe z. B. Andersen, L. C. et al., (1976), "An injectable sustained release fertility control system", Contraception 13: 375-384; Beck et al., (1979) "New long-acting injectable microcapsule contraceptive system". Am. J. Obstet. Gynecol. 140: 799-806; Volles et al., (1978) "Timed release depot for anti-cancer agents II", Acta Pharm. Svec. 15: 382-388, US-3,773,919 und die US- Patentanmeldung Serial No. 699,715, eingereicht am 8. Februar 1985. Eine retardierte Zuführung von Peptiden aus Poly(lactid-co-glycolid)-Systemen ist von Kent et al., (1982) "In vivo controlled release of an LHRH analog from injected polymeric microcapsules", Contracept. Deliv. Syst. 3: 58; von Sanders et al., (1984) "Controlled release of a luteinizing hormonereleasing hormone analogue from poly (d, 1-lactide-co-glycolide)-microspheres" (siehe auch europäisches Patent Nr. 0052510), J. Pharmaceut. Sci. 73: 1294-1297, von T. Chang, "Biodegradeable semipermeable microcapsules containing enzymes, hormones, vaccines and other biologicals", J. Bioengineering, 1, 25-32 (1976) und in der EPA-Anmeldung Nr. 82300416.3, eingereicht am 27. Januar 1982 (jetzt europäisches Patent Nr. 0058481) mitgeteilt worden. Ebenso beschreibt EP-134318 die gesteuerte Freigabe von Insulin über die Bildung von wässrigen Kanälen aus einer bio-abbaubaren Polymermatrix-Zusammensetzung. Jedoch war es aus Gründen, die weiter diskutiert werden, sehr schwierig, die Zuführung von großen Polypeptiden aus Polylactid-Matrices zu erreichen. Von den oben zitierten Publikationen offenbaren nur die beiden letztgenannten Vorrichtungen, die Polypeptide mit Molekulargewichten von 2500 oder größer enthalten.
Polylactid- und Poly(lactid-co-glycolid)-Polymere und -Copolymere (generisch anschließend als Polylactid- oder PLGA-Polymere bezeichnet) sind nicht in Wasser löslich. Im Gegensatz dazu sind die meisten Polypeptide in Wasser, aber nicht in organischen Lösungsmitteln löslich. Aus diesem Grund folgte die Herstellung von Polylactid-Vorrichtungen, in denen Polypeptidteilchen dispergiert sind, bis jetzt im allgemeinen einem von zwei grundsätzlichen Verfahren.
Ein Verfahren beinhaltet das Mischen der Komponenten mit dem Polylactid in geschmolzenem Zustand, gefolgt von Wärmeextrusion, Wärme- Pressen oder Gießen.
Das zweite Verfahren beinhaltet die Schaffung einer Lösung/Suspension des Polymers und Polypeptids in einem organischen Lösungsmittel, die dann zu einem Film oder einer Platte gegossen wird, und das Lösungsmittel wird verdampft. Das letztere Verfahren erfordert gewöhnlich ausgiebiges oder schnelles Rühren der Lösung/Suspension, um einen annehmbaren Grad an Einheitlichkeit der Polypeptidteilchen und der Homogenität der Polypeptid/Polylactid-Matrix nach Verfestigung zu erreichen. Das Verdampfen des Lösungsmittels findet über mehrere Stunden bis mehrere Tage statt, wenn der Film oder die Platte nicht unter Vakuum getrocknet wird, in welchem Fall stets Blasen gebildet werden, wenn der Festkörper trocknet. Zusätzlich sind auf diesem Weg hergestellte Polylactid-Formulierungen für die meisten therapeutischen Anwendungen nicht genügend einheitlich; aufgrund von Koaleszenz der wasserlöslichen Teilchen-Phase ist das Polypeptid ungleichmäßig als große Aggregate von Teilchen in dem Polylactid verteilt. Deshalb müssen auf diesem Weg hergestellte Formulierungen weiteren Homogenisierungsverfahren, wie z. B. Mahlen der Formulierung zu einem Pulver und Umbildung derselben unter Hitze oder Komprimieren oder Extrudieren der Formulierung unter Hitze unterzogen, werden. Die Temperatur, die für diese Vorgehensweisen erforderlich ist, ist gewöhnlich mindestens 70ºC.
Es ist auch bekannt, injizierbare Mikrokapseln aus Arzneistoff in Polylactid herzustellen. Derartige Mikrokapseln können durch grundsätzliche Verfahren, wie z. B. das im US-Patent Nr. 3,773,919 und in der US- Anmeldung Serial Nr. 699,715 und in dem europäischen Patent Nr. 0052510 dargelegte, hergestellt werden. Das letztere Verfahren beinhaltet das Lösen des Polymers in einem halogenierten Kohlenwasserstofflösungsmittel, das Dispergieren der wässrigen, Polypeptid-haltigen Lösung durch schnelles Rühren in der Polymer-Lösungsmittellösung und die Zugabe eines Koazervierungsmittels, das kein Lösungsmittel ist, was verursacht, dass der polymere Hilfsstoff aus dem halogenierten Kohlenwasserstofflösungsmittel auf dem dispergierten, Polypeptid-haltigen Wassertropfen ausfällt, wodurch er das Polypeptid verkapselt. Die resultierenden Mikrokapseln werden dann durch wiederholtes Waschen mit organischem Lösungsmittel getrocknet.
Jedoch sind große Polypeptide für physikalische und chemische Denaturierung und daraus folgendem Verlust biologischer Potenz durch Einwirkung von übermäßiger Wärme, Lösungsmitteln und Scherkräften besonders anfällig. Aus diesem Grund hat die Inkorporierung großer Polypeptide in Polylactid-Polymere bis jetzt entweder Kompromisse im Grad der Einheitlichkeit der Polypeptid/Polymer-Dispersion erforderlich gemacht oder ein beträchtlichen Verlust der biologischen Potenz des Polypeptids zum Ergebnis gehabt, oder beides. Die resultierenden Formulierungen sind im allgemeinen nicht-einheitliche Dispersionen, die unregelmäßig dimensionierte große Teilchen von Polypeptid mit reduzierter Potenz enthalten. Die Inkorporierung von großen und unregelmäßigen Polypeptidteilchen verursacht eine ungleichmäßige Arzneistoff zuführungsgeschwindigkeit und weist die Tendenz auf, die Mehrphasen- Freigabeprofile, die im allgemeinen mit pharmazeutischen Polylactid- Präparaten einhergehen, zu verschlimmern.
Die Herstellung von homogeneren Formulierungen aus einem Guß durch bekannte Verfahren, wie z. B. Mischen der geschmolzenen Komponenten, Mahlen und Wärmehomogenisierungsverfahren, wie z. B. Kompression und Extrusion, können einen wesentlichen, oft nahezu vollständigen Verlust der biologischen Aktivität des Polypeptids zum Ergebnis haben. Zum Beispiel behält eine PLGA/Interferon-Formulierung, die durch Mischen unter Erwärmen und Extrusion unter milden Bedingungen gebildet wurde, weniger als 1% der ursprünglichen biologischen Aktivität des Interferons bei. (Siehe Beispiel 7 unten). Um den Verlust in der biologischen Aktivität während Herstellungsverfahren dieses Typs zu kompensieren, muss ein großer Überschuß an Polypeptid in die Formulierung inkorporiert werden.
Ein weiterer Nachteil von Formulierungen, die denaturierte Polypeptide enthalten, ist die gesteigerte Immunogenizität, die sie an den Tag legen. Antikörperbildung als Antwort auf das denaturierte Polypeptid kann dem gewünschten therapeutischen Effekt teilweise oder gänzlich zuwiderlaufen.
Dementsprechend gibt es einen Bedarf für eine homogene Polylactid- Vorrichtung, die eine gesteuerte und regelmäßige Zuführung makromolekularer Polypeptide gewährleistet und ohne signifikanten Verlust an biologischer Aktivität produziert werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoff-Zufuhrsystems für die gesteuerte Verabreichung eines wasserlöslichen makromolekularen Polypeptids an einen Säuger bereit. Das System umfasst eine Polymermatrix, umfassend nicht mehr als ungefähr 30 Gew.-% an Teilchen von denaturierbarem makromolekularem Polypeptid mit einem Molekulargewicht von mehr als 10000 und andere fakultative wasserlösliche Komponenten, die in einer Polylactid-Matrix dispergiert sind, worin im wesentlichen alle Teilchen von Polypeptid und anderen wasserlöslichen Komponenten einen Durchmesser von 10 um oder weniger aufweisen und einheitlich und diskret durch die Matrix hindurch dispergiert sind und worin das Polypeptid mindestens ungefähr 50% der biologischen Aktivität, die es vor der Herstellung der Matrix besaß, beibehält. Das Verfahren umfasst die Herstellung einer Mikrosuspension des Polypeptids und anderer wasserlöslicher Komponenten in der Polylactid-Lösung und das Sprühgießen oder Zerstäuben der Mikrosuspension.
Diese Vorrichtung gewährleistet ein ökonomisches und zuverlässiges Verfahren der Zuführung gesteuerter und regelmäßiger Mengen an biologisch aktiven makromolekularen Polypeptiden an Körperstellen, die in der Lage sind, intrazelluläre oder extrazelluläre Flüssigkeiten zur Überführung in die Vorrichtung verfügbar zu machen. Das System kann so konstruiert werden, dass es den Wirkstoff mit einer geeigneten Geschwindigkeit über längere Zeiträume im Bereich von weniger als einem Tag bis zu mehreren Monaten liefert. Im allgemeinen werden Wirkstoff-Freisetzungszeiträume von ungefähr 1 Woche bis 3 Monaten in Betracht gezogen.
Ein wichtiger Vorteil dieser Vorrichtung mit gesteuerter Freigabe beruht auf der Tatsache, dass sie mit einem nur kleineren Verlust an biologischer Aktivität des aktiven Polypeptidmittels produziert werden kann. Die Beibehaltung einer hohen biologischen Aktivität gestattet, dass die Vorrichtung so produziert werden kann, dass sie relativ geringe anfängliche Mengen des Polypeptids enthält.
Als Resultat der Beibehaltung hoher biologischer Aktivität des Peptids während der Produktion werden mehrere weitere Vorteile erreicht. Erstens tritt ein signifikanter ökonomischer Vorteil für den Hersteller bezüglich der Kosten an Wirkstoff, der in jede Dosierungsform oder in jedes Zufuhrsystem inkorporiert wird, ein. Zweitens ist aufgrund des relativ niedrigen Prozentsatzes an Polypeptid und anderen wasserlöslichen Komponenten in der Vorrichtung der Beitrag dieser Komponenten zur Hydratation des Systems in vivo minimiert, wodurch eine konstantere Polypeptid-Freigabegeschwindigkeit, als sie mit bisher bekannten bioabbaubaren Systemen erreicht werden kann, während der ganzen Einsatzlebensdauer der Vorrichtung gewährleistet wird. Drittens verringert die Abwesenheit von signifikanten Mengen an denaturiertem Polypeptid die Wahrscheinlichkeit unerwünschter Immunantworten an der Stelle der Polypeptidzuführung.
Ein weiterer Vorteil dieser Vorrichtung ist, dass sie unter geringem Verlust an aktivem Bestandteil produziert werden kann. Dies ist natürlich bei der Verringerung des Abfalls an aktivem Bestandteil von Nutzen. Anfänglich erreicht die Herstellung eine 80%-ige Inkorporierung an aktivem Bestandteils-Ausgangsmaterial in die Vorrichtung, vorzugsweise eine mindestens 90%-ige, am meisten bevorzugt eine im wesentlichen 100%-ige Inkorporierung.
Ein anderer wichtiger Vorteil des Verfahrens ist, dass es eine Vorrichtung mit gesteuerter Freigabe mit einer neuen physikalischen Struktur der Polymer/Polypeptid-Matrix produziert. Die Matrix umfasst eine sehr feine Dispersion oder Mikrosuspension von wasserlöslichen Komponenten in einem Polylactid-Polymer, worin im wesentlichen alle Teilchen von Wirkstoff und irgendwelchen anderen gegebenenfalls anwesenden wasserlöslichen Komponenten Durchmesser von 10 um oder weniger aufweisen. Diese Teilchen sind einheitlich und diskret durch das Polymer hindurch dispergiert, was eine im wesentlichen homogene Vorrichtung aus einem Guß bereitstellt. Wie bei vorher bekannten Systemen wird das biologisch aktive Polypeptid durch eine Kombination von Diffusions- und Auflösungsmechanismen freigesetzt, wenn die Vorrichtung hydratisiert wird und anschließend erodiert. Jedoch beruht das erfindungsgemäß hergestellte System im Gegensatz zu bekannten polymeren Matrix-Systemen, die Makromoleküle liefern, zur Freigabe der Makromoleküle aus dem System nicht auf der Bildung von wässrigen Kanälen oder Makroporen in der Matrix. Von dem Erfordernis der Makroporenbildung zum Stattfinden der Arzneistoff-Freigabe ist bekannt, dass es in einem Dreiphasen-Freigabeprofil resultiert, welches durch eine mittlere ruhige Phase, während der wenig oder kein Arzneistoff freigegeben wird, gekennzeichnet ist. Es kann auch ein ruhiger oder toter Zeitraum vor der Initialphase der Arzneistoff-Freigabe auftreten. Im Gegensatz dazu werden, da das Polypeptid und andere wasserlösliche Komponenten dieser Erfindung als sehr kleine und diskrete Teilchen in der Polylactid-Matrix anwesend sind, keine wässrigen Kanäle gebildet, und falls überhaupt, dann relativ spät im Freigabezeitraum. Als Ergebnis wird ein sehr regelmäßiges Freigabeprofil erreicht, welches dazu gebracht werden kann, mit einer sehr kleinen anfänglichen Verzögerungszeit zu beginnen, und welches über die Lebensdauer des Systems hinweg kontinuierlich ist.
Eine geeignet dimensionierte und geformte Vorrichtung der obigen Beschreibung kann zur Verabreichung eines makromolekularen Polypeptid- Wirkstoffs an einer Körperstelle verwendet werden, die in der Lage ist, ihre intrazellulären und/oder extrazellulären Flüssigkeiten für die Absorption durch das Implantat verfügbar zu machen.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Daten, die aus dem in Beispiel 3 beschriebenen Test erhalten wurden, und zeigt die Freigabeprofile von β-Interferon aus Wirkstoff-Freigabesystemen, die über einen Zeitraum von 60 bis 100 Tagen subkutan in Mäusen implantiert waren. Die Systeme wurden erfindungsgemäß wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben hergestellt.

Definitionen

Der Ausdruck "biologisch aktives makromolekulares Polypeptid" bezieht sich auf irgendein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als ungefähr 10000 Dalton, das eine nützliche biologische Aktivität besitzt, wenn es einem Säuger verabreicht wird.
Der Ausdruck "worin das Polypeptid mindestens ungefähr 50% seiner biologischen Aktivität beibehält" bedeutet, dass mindestens ungefähr 50% des biologischen Aktivitätspotentials des Polypeptids bei Beendigung der Herstellung verbleiben, wie es innerhalb der Genauigkeit eines biologischen Assays für das spezielle Polypeptid, wie z. B. des in Beispiel 5 beschriebenen, bestimmt wird. Im allgemeinen beinhaltet der Assay das Versetzen des Polypeptid-Beladungsvorrates mit einer bekannten Konzentration an radioaktiv markiertem Polypeptid, das Extrahieren des Polypeptids aus dem produzierten System unter milden Bedingungen und das Bestimmen sowohl der relativen Radioaktivität (Zählereignisse pro Minute pro ml) als auch der relativen Einheiten/ml biologischer Aktivität des Beladungsvorrats und des extrahierten Polypeptids in einem biologischen Standardassay für das Polypeptid. Der biologische Assay wird in Reihenverdünnungstest-Vertiefungen der zu testenden Polypeptidproben gegen einen Bezugsstandard durchgeführt. Ein willkürlicher Endpunkt wird für die Einstufung der Testvertiefungen festgelegt, und der gleiche Endpunkt wird bei der Einstufung der Bezugsproben verwendet. Die Aktivität der Interferonproben wird, basierend auf dem log&sub1;&sub0; der Einheiten/ml biologischer Aktivität des Beladungsvorrats-Aquivalents für jede extrahierte Probe berechnet. Systeme, die die durch diese Erfindung produziert werden, zeigen relative log&sub1;&sub0;-Polypeptid-Aktivitätswerte, die die Hälfte oder mehr der log&sub1;&sub0;-Einheiten/ml des entsprechenden Polypeptid-Beladungsvorrats betragen. Die bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung behalten mindestens ungefähr 70% des biologischen Potentials des Polypeptids nach der Herstellung, bevorzugter mindestens 90%, am meisten bevorzugt im wesentlichen 100% des biologischen Potentials bei.
Der Ausdruck "im wesentlichen alle Teilchen von Polypeptid und anderen wasserlöslichen Komponenten" bezieht sich auf eine Menge von mindestens etwa 75% der Teilchen von so identifizierten Komponenten, geeigneter mindestens ungefähr 90%.
Der Ausdruck "wasserlöslich" wird hierin verwendet, um makromolekulare Polypeptide und andere fakultative pharmazeutisch annehmbare Komponenten zu bezeichnen, die mindestens "sehr geringfügig löslich" in der Definition sind, die in der United States Pharmacopeia, XX, Seite 1121, angegeben ist, d. h.. Wasserlöslichkeiten von mindestens 0,1 bis 1,0 mg/ml aufweisen.
Der Ausdruck "Mikrosuspension" wird hierin verwendet, um Teilchen von Polypeptid und anderen wasserlöslichen festen Komponenten zu beschreiben, von denen im wesentlichen alle einen Durchmesser von 10 um oder weniger aufweisen, die im wesentlichen einheitlich und diskret durch das Polymer hindurch dispergiert sind. Der Ausdruck "einheitlich und diskret dispergiert" wird verwendet, um anzuzeigen, dass die Teilchen einander nicht berühren, sondern einzeln von Polymer umgeben sind und ungefähr in gleichem Abstand voneinander vorliegen. Die Bestimmung der Größe und Verteilung der Teilchen an Polypeptid und anderen wasserlöslichen Komponenten kann durch eine Standard- Mikroskopüberprüfung, wie z. B. die in Beispiel 4 unten beschriebene, durchgeführt werden. Vorzugsweise weisen im wesentlichen alle Teilchen Durchmesser von 5 um oder weniger, und bevorzugter 1 um oder weniger, auf.
Der Ausdruck "Polylactid" wird hierin in einem generischen Sinne verwendet, um sowohl Homopolymere als auch Copolymere zu beschreiben, die von alpha-Hydroxycarbonsäuren, insbesondere α-Hydroxyessig(Milch-)- und α-Hydroxypropionsäure(Glycol)-Säuren abgeleitet sind. Sie werden gewöhnlich aus den cyclischen Estern von Milchsäuren hergestellt.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Schaffung einer homogenen Matrix eines Polylactids, in der eine im wesentlichen einheitliche Mikrosuspension eines biologisch aktiven makromolekularen Polypeptids inkorporiert ist. Die Matrix setzt das biologisch aktive Polypeptid frei, wenn sie an eine Körperstelle gegeben wird, die ihre intracelluläre und/oder extracelluläre Flüssigkeit zur Überführung in die Vorrichtung verfügbar machen kann die Matrix hydratisiert wird, wird das Polypeptid durch Diffusions- und Erosionsmechanismen freigegeben. Da die Polypeptide wasserlöslich sind, wird die Freigabegeschwindigkeit durch die Hydratationsgeschwindigkeit und die Polymererosion der Vorrichtung gesteuert.
Verfahren zur Herstellung von Polylactiden sind in der wissenschaftlichen und Patentliteratur gut dokumentiert. Die folgenden Patente stellen detaillierte Beschreibungen von geeigneten Polylactiden, ihren physikalischen Eigenschaften und Verfahren zur ihrer Herstellung bereit: US-3,773,919; US-4,293,539; US-3,435,008; US-3,442,871; US-3,468,853; US-3,597,450; US-3,781,349; US-3,736,646 und das europäische Patent Nr. 0 052510.
Die makromolekularen Polypeptide, die in die erfindungsgemäß hergestellte Vorrichtung inkorporiert werden können, sind biologisch aktive Moleküle mit Molekulargewichten von mehr als ungefähr 10000, am meisten bevorzugt mehr als ungefähr 15000. Die Wahl der Polypeptide, die gemäß der Ausübung dieser Erfindung zugeführt werden können, wird nur durch die Anforderung beschränkt, dass sie in einem wässrigen physiologischen Medium, wie z. B. Plasma, Interstitialflüssigkeit und den intra- und extracellulären Flüssigkeiten des subkutanen Raums und der Mukosagewebe wenigstens sehr geringfügig löslich sind. Der Ausdruck "sehr geringfügig löslich" bezieht sich auf eine Wasserlöslichkeit von mindestens ungefähr 0,1-1,0 mg/ml, wie oben definiert.
Eine besonders bevorzugte Klasse von Polypeptiden sind die natürlich vorkommenden und synthetischen Interferone. Interferone sind Polypeptide mit Monomer-Molekulargewichten im Bereich von ungefähr 15000 bis ungefähr 28000. Sie sind Proteine, die von Säugerzellen als Antwort auf Virusinfektion, Immunstimulation und andere Faktoren synthetisiert werden. Sie werden gegenwärtig als Mitglieder von einer von drei Hauptklassen gekennzeichnet: alpha- oder Leukozyten-Interferon (IFN-α), beta- oder Fibroblasten-Interferon (IFN-β) und gamma- oder Immuninterferon (IFN-). Ihre biologischen Eigenschaften schließen antivirale, anti-proliferative und immunmodulierende Aktivitäten ein, die zu ihrer klinischen Verwendung als therapeutische Mittel für die Behandlung von Virusinfektionen und malignen Erkrankungen geführt haben.
Interferone können aus natürlichen Quellen, wie z. B. Leukozyten, Lymphoblastoid-Zellen in kontinuierlicher Suspension oder Kultur und Fibroblastenkulturen erhalten werden. T-Lymphozyten können stimuliert werden, um gamma-Interferon zu produzieren. β-Interferon wird aus Säugerzellen, wie z. B. Fibroblastenzellen, abgeleitet. Wie hierin verwendet schließt "β-Interferon" oder "IFN-β" β-Interferon, das sowohl aus natürlichen Quellen, einschließlich Mensch, Rind, Hund, Katze, Schwein und Pferd, als auch durch rekombinante DNA-Techniken abgeleitet ist, ein. Es schließt auch modifizierte Formen von β-Interferon ein; z. B. durch Glykosylierung, Methylierung, Substitution und/oder Deletion einer beschränkten Anzahl von Aminosäuren. Wie hierin verwendet bezieht sich HuIFN-β auf Human-β-Interferon und rHuIFN-β bezieht sich auf HuIFN-β, das durch rekombinante Techniken erzeugt wurde. IFN-ßser-17 bezieht sich auf β- Interferon, in dem die siebzehnte Aminosäure durch Serin ersetzt worden ist.
Interferonkonzentrationen werden gewöhnlich als Standard-"Einheiten" ausgedruckt, die international akzeptiert und dokumentiert sind und zu der Potenz einer gegebenen Menge an Interferon, einer Virusreplikation und Standardbedingungen zu hemmen, in Beziehung stehen.
Zusätzlich zur Inkorporierung eines oder mehrerer biologisch aktiver makromolekularer Polypeptide kann die erfindungsgemäße Vorrichtung mit gesteuerter Freigabe andere wasserlösliche, pharmazeutisch annehmbare Komponenten enthalten. Die fakultativen wasserlöslichen Komponenten, die in die Polylactid-Matrix inkorporiert werden können, sind als Teilchen mit Durchmessern von ungefähr 10 um oder weniger anwesend. Wenn sie anwesend sind, werden sie innig mit den makromolekularen Polypeptiden gemischt und einheitlich und diskret durch das Polymer hindurch dispergiert.
Die meisten makromolekularen Polypeptide ziehen einen Nutzen aus der Gegenwart kleiner Mengen an Stabilisatoren, Puffern, Salzen und dgl. Wasserlösliche Komponenten, die bei der Ausübung dieser Erfindung nützlich sein können, schließen andere Wirkstoffe, Proteine oder andere Polypeptide, Stabilisatoren, Kohlehydrate, Puffer, Salze, Tenside und Weichmacher ein, sind aber nicht darauf beschrankt. Beispiele für geeignete Stabilisatoren schließen Human-Serumalbumin (HSA), Gelatine, Dextrose, andere Kohlehydrate ein. Beispiele für andere Kohlehydrate, die zur Inkorporierung in dieser Erfindung geeignet sind, schließen Saccharose, Maltose, Mannose, Glukose, Fruktose, Laktose, Sorbit und Glycerin ein. Geeignete Tenside schließen Tween (z. B. Tween-20, Tween- 80), Pluronic(R)-Polyole, wie z. B. Pluronic(R)-L101, L121 und F127, ein (siehe Standardwerke, wie z. B. Merck-Index, 10. Ausgabe, bezüglich weiterer Details dieser wohlbekannten Tenside). Unter den geeigneten Weichmachern sind die Polyethylenglycole, Glyceride und Ethylcellulose.
Die relativen Verhältnisse von makromolekularem Polypeptid und anderen wasserlöslichen Komponenten zu Polylactid und wasserunlöslichen Komponenten in der Matrix können abhängig von dem zu verabreichenden Polypeptid und der gewünschten Geschwindigkeit und Dauer der Freigabe variiert werden. Der makromolekulare Wirkstoff und andere wasserlösliche Komponenten können bis zu ungefähr 30 Gew.-% des Systems umfassen. Die genaue Menge hängt von solchen Faktoren wie der Potenz des speziellen Wirkstoffs, seinem physikochemischen und pharmakokinetischen Verhalten, seiner Stabilität und der gewünschten Dauer der Freigabe ab.
Eine bevorzugte Zusammensetzung für die Polylactid-Matrix umfasst, bezogen auf Gewicht:
(a) 80 bis 99,9999% Polylactid; und
(b) 0,0001 bis 20% biologisch aktives makromolekulares Polypeptid und andere fakultative wasserlösliche Komponenten. Für sehr aktive Polypeptide kann die Gesamtmenge an Polypeptid und anderen wasserlöslichen Komponenten so niedrig wie 10%, 5%, 2% oder weniger des Gesamtgewichts der Matrix ausmachen.
Die vorliegende Erfindung ist für die gesteuerte Zuführung von Interferonen gut geeignet. Die in der Polylactid-Matrix inkorporierte Menge an Interferon beträgt vorzugsweise 20% oder weniger, abhängig vom speziellen Interferon und den anderen oben aufgeführten Faktoren. Eine derzeit bevorzugte Zusammensetzung umfasst, bezogen auf Gewicht:
(a) 90 bis 99,999% Polylactid; und
(b) 0,001 bis 2% HuIFN-β,
und kann bis zu ungefähr 10% an anderen wasserlöslichen Komponenten einschließen.
Eine bevorzugtere Zusammensetzung umfasst, bezogen auf Gewicht:
(a) 95 bis 99,9% Polylactid;
(b) 0,01 bis 0,1% HuIFN-β,
und kann bis zu ungefähr 5% an anderen wasserlöslichen Komponenten einschließen.
Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung umfasst, bezogen auf Gewicht:
(a) 97,47% Poly(lactid-co-glycolid) mit einem Molverhältnis von 50 : 50 und einer Grenzviskosität von ungefähr 0,64 dl/g;
(b) 0,03% HuIFN-β;
(c) 1,25% Human-Serumalbumin; und
(d) 1,25% Dextrose.
Das bevorzugte Interferon zur Inkorporierung in die vorangehenden Systeme ist rHuIFN-ßser-17.

Herstellungsverfahren

Die erfindungsgemäßen Zufuhrsysteme können durch irgendein Verfahren, das die gewünschte Mikrosuspensionskonformation erreicht und die biologische Aktivität des makromolekularen Polypeptids im wesentlichen beibehält, produziert werden. Ein bevorzugtes Verfahren beinhaltet das Sprühgießen einer Mikrosuspension des Polypeptids in einer Lösung des Polylactids. Der erfahrene Chemiker kann sich verschiedene Verfahren vorstellen, durch die die Mikrosuspension hergestellt werden kann. Zwei neue und nützliche Verfahren werden unten beschrieben. (Der Fachmann versteht, dass Lösungsmittel, die von Aceton und Methylenchlorid verschieden sind, verwendet werden können, vorausgesetzt, dass das Protein mit dem Lösungsmittel kompatibel und darin unlöslich ist.)

Aceton-Verfahren

Eine wässrige, gepufferte Lösung des makromolekularen Polypeptids und anderer fakultativer wasserlöslicher Komponenten (Puffer) wird bei Raumtemperatur zu einer Lösung des gewählten Polylactids in Aceton gegeben. Die resultierende Mischung wird bei hoher Geschwindigkeit unter Verwendung eines Standard-Laboratoriums-Wirbelmischers ungefähr 5 bis 120, vorzugsweise ungefähr 10 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit gewirbelt. Ein Niederschlag des Polymers, Polypeptids und anderer Komponenten wird gebildet, der dann ungefähr 0,5 bis 30 Minuten, vorzugsweise ungefähr 10 Minuten, bei 500 bis 1000, vorzugsweise 700 · g zentrifugiert wird. Der resultierende Überstand von Aceton und Wasser wird entfernt, zusätzliches Aceton wird hinzugefügt, und die Mischung wird bei hoher Geschwindigkeit gewirbelt, bis das Polymer, z. B. PLGA, im Pellet gelöst ist, was eine Mikrosuspension von Polypeptid und anderen wasserlöslichen Komponenten in der Lösung von Polymer in Aceton zurückläßt.

Methylendichlorid-Verfahren

Eine wässrige, gepufferte Lösung des Polypeptids und anderer fakultativer wasserlöslicher Komponenten wird zu einer Lösung des gewählten Polylactids in Methylendichlorid gegeben. Die resultierende Mischung wird ungefähr 10 bis 180 Sekunden, vorzugsweise ungefähr 60 Sekunden, bei hoher Geschwindigkeit gewirbelt, bis eine weiße Emulsion gebildet ist. Die Emulsion wird sofort in eine Spritzpistole oder eine andere geeignete Sprühvorrichtung überführt und wie unten beschrieben sprühgegossen.

Bildung der Wirkstoff-Zufuhrsysteme

Die erfindungsgemäß hergestellten Wirkstoff-Zufuhrsysteme werden so gebildet, dass das feste Polypeptid/Polylactid-Matrixendprodukt die erforderliche Mikrosuspensions-Morphologie, in der im wesentlichen alle Teilchen von Polypeptid und anderen wasserlöslichen Komponenten Durchmesser von 10 um oder weniger aufweisen und einheitlich und diskret durch die Matrix hindurch dispergiert sind, besitzt, um sicherzustellen, dass die flüssige Mikrosuspension von wasserlöslichen Komponenten in der Polymerlösung nach Verfestigung der Formulierung nicht zu einer Suspension von größeren Teilchen koalesziert, ist es vorzuziehen, die Mikrosuspension sofort mit einer Spritzpistole oder einer anderen geeigneten Vorrichtung unter Verwendung geeigneter Bedingungen auf eine nicht-klebrige Oberfläche sprühzugießen. Die Spritzpistole wird vorzugsweise ungefähr 10 bis 15 cm von der Oberfläche der Folie entfernt gehalten, und der Film wird mit konstanter Bewegung aufgesprüht, um einen gleichmäßigen Film zu erreichen. Geeignete nicht-klebrige Oberflächen schließen Polypropylen, Teflon, Nylon, Polyethylen oder Derivate derselben und andere Materialien mit ähnlichen nicht-klebrigen Eigenschaften ein. Polypropylen, Teflon und Polyethylen werden bevorzugt. Der sprühgegossene Film kann so dünn wie ungefähr 5 um und so dick wie 1000 um gemacht werden. Für Filme, die dicker als ungefähr 100 um sind, ist es vorzuziehen, dass man zwischen wiederholtem Sprühgießen von Schichten einige Zeit trocknen lässt. Dünnere Filme (ungefähr 10 bis 50 um) werden bevorzugt, wenn es wünschenswert ist, die Einwirkung eines organisches Lösungsmittels auf das Polypeptid zu minimieren. Im allgemeinen sollte man den resultierenden Film vollständig trocknen lassen, bevor er zur Endvorrichtung oder zum Endsystem mit gesteuerter Freigabe verarbeitet wird. Abhängig von der Dicke des Films variiert die Trocknungszeit zum Erreichen vollständiger Trockenheit von weniger als 1 Stunde bis zu ungefähr 3 Tagen, und sie kann, nachdem sich die Matrix bis zu dem Punkt verfestigt hat, wo keine Blasen verursacht werden, durch Trocknen unter Vakuum verkürzt werden, falls gewünscht.
Für viele Polypeptide ist die parenterale Injektion ein bevorzugter Weg der Verabreichung. Die Polypeptid/Polylactid-Matrixformulierung kann durch Zerstäuben der flüssigen Mikrosuspension und Trocknen der resultierenden Mikroteilchen in einem Gegenstrom oder Wirbel von Luft oder Inertgas in eine injizierbare Form gebracht werden. Die resultierenden Teilchen können direkt injiziert oder in eine kompatible und pharmazeutisch annehmbare injizierbare Losung oder Suspension inkorporiert werden.
Die Systeme mit gesteuerter Zuführung können strukturell mit einem inerten, pharmazeutisch annehmbaren Material, wie z. B. einem feinen Seidennetzwerk, Teflonnetzwerk oder anderem chirurgisch inerten Material verstärkt werden. Es ist besonders vorteilhaft, ein Verstärkungsmaterial zu inkorporieren, wenn es vorausgesehen wird, dass die Vorrichtung mit gesteuerter Freigabe aus ihrer aktiven Zuführungsstelle zurückgewonnen werden muss. Verstärkte Vorrichtungen können durch Sprühen der Polypeptid/Polylactid-Mikrosuspension auf das Verstärkungsmaterial, welches bevorzugt auf einer nicht-klebrigen Oberfläche ruht, hergestellt werden. Man lässt den Film dann kurz trocknen, und er kann umgedreht und auf der anderen Seite besprüht werden. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis ein Film der gewünschten Dicke erreicht wird. Vorzugsweise wird die Textur des Verstärkungsmaterials vollständig von einer glatten Schicht des Polymers bedeckt.
Der durch wie oben beschriebenes Sprühgießen erhaltene polymere Film kann zu irgendeinem festen Gegenstand, der für die beabsichtigte Verwendungsstelle geeignet ist, geformt werden. Zum. Beispiel kann der Film in Stücke bekannter Dimensionen geschnitten und als einzelne Abschnitte subkutan implantiert werden. Alternativ kann der Film in eine zylindrische Vorrichtung gewünschter Dimensionen gerollt werden. Mehrfache Filmschichten können laminiert und mit einem Schneidwerkzeug geschnitten werden, um Vorrichtungen von buchstäblich jeder Größe und Gestalt zu schaffen. Der Zusammenhalt der Schichten kann durch leichtes Besprühen oder Aufbürsten mit einem bzw. eines geeigneten Lösungsmittels für das Polymer zwischen der Laminierung von Schichten oder durch Einbringen in Lösungsmitteldampf sichergestellt werden.
Die Vorrichtungen mit gesteuerter Freigabe können so konstruiert werden, dass sie das biologisch aktive makromolekulare Polypeptid und jegliche begleitenden Wirkstoffe mit einer gesteuerten Geschwindigkeit über einen längeren Zeitraum im Bereich von weniger als einem Tag bis zu mehreren Monaten liefern. Beispiele für Vorrichtungen, die subkutan über einen Zeitraum von 60 bis 100 Tagen therapeutisch nützliche Spiegel von β-Interferon lieferten, werden in den Beispielen 1 und 2 beschrieben und in Fig. 1 gezeigt. Die tatsächliche Geschwindigkeit und Dauer der Freigabe kann innerhalb der Ausübung dieser Erfindung durch die Wahl des Polylactid-Polymers (z. B. Wahl von Monomer oder Comonomeren, Molverhältnis und Grenzviskosität) oder -Copolymers, durch die Form und Gestalt der Vorrichtung (z. B. flach, gerollt. Einzelschicht oder Mehrfachschicht) und in einem geringeren Ausmaß durch die Menge an Wirkstoff, der inkorporiert wird, variiert werden.
Die in die Vorrichtung inkorporierte Menge an Wirkstoff kann zwischen 0,0001 und 30 Gew.-% des polymeren Systems variieren. Die optimale Menge für irgendein gegebenes System hängt von der Potenz des Stoffes, dem gewünschten physiologischen Effekt, der beabsichtigten Länge der Behandlung und der Geschwindigkeit der Freigabe des Wirkstoffes ab. Vorzugsweise enthalten die Vorrichtungen ungefähr 0,0001 bis 20 Gew.-% des makromolekularen Polypeptids.
Die Größe der Vorrichtung hängt gleichermaßen von der Menge an Wirkstoff, die sie enthält, dessen Freigabegeschwindigkeit und der beabsichtigten Dauer der Behandlung ab. Zum Beispiel würde die Vorrichtung, wenn es bekannt ist, dass eine spezielle Polypeptid/Polylactid- Formulierung das Polypeptid mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 10&sup6; Einheiten pro Tag freisetzt, und die gewünschte Behandlungsdauer 60 Tage ist, eine Beladung von mindestens 6 · 10&sup7; Polypeptid-Einheiten erfordern. Basierend auf dem Gewichtsprozentsatz an Polypeptid im System kann die erforderliche Größe der Vorrichtung berechnet werden.
Die folgenden Herstellungen und Beispiele werden zur weiteren Erläuterung der Ausübung dieser Erfindung bereitgestellt und sollen deren Bereich nicht auf irgendeine Art und Weise beschränken.

BEISPIEL 1

Herstellung von Vorrichtungen mit gesteuerter Freigabe, die Interferon enthalten (Aceton-Verfahren)

A. Herstellung einer IFN/PLGA-Mikrosuspension

1 g D,L-PLGA (Molverhältnis 50 : 50, Grenzviskosität 0,64 dl/g) wurde bei Raumtemperatur in 50 ml Aceton gelöst. 0,3 mg rekombinantes HuIFN-β in 1 ml Puffer (12,5 mg HSA und 12,5 mg Dextrose enthaltend) wurden zu dem PLGA in Aceton gegeben, und die resultierende Mischung wurde ungefähr 30 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit gewirbelt. Der Niederschlag von PLGA, HSA, IFN und möglicherweise Dextrose, der sich bildete, wurde dann 10 Minuten bei 700 · g zentrifugiert. Der Überstand von Aceton und Wasser wurde mit einer Pipette entfernt, und die zurückbleibende Flüssigkeit wurde mit einem Baumwolltupfer entfernt. 10 ml Aceton wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde bei hoher Geschwindigkeit gewirbelt, bis die PLGA im Pellet gelöst war, was eine Mikrosuspension von HuIFN-β, HSA und Dextrose in einer Lösung von PLGA in Aceton zurückließ.

B. Sprühgießen der IFN-PLGA-Mikrosuspension

Die resultierende IFN/PLGA-Mikrosuspension, die wie in Absatz A beschrieben erhalten worden war, wurde unter Verwendung komprimierter Luft bei 1 kgcm&supmin;² mit einer Spritzpistole auf eine saubere Polyethylenfolie gesprüht. Die Spritzpistole wurde 10-15 cm von der Oberfläche der Folie entfernt gehalten, und der Film wurde mit konstanter Bewegung aufgesprüht, um einen gleichmäßigen Film der PLGA-Formulierung, der ungefähr 50 um dick war, zu erreichen.

C. Verstärkung des Films

Unter Verwendung der IFN/PLGA-Mikrosuspension aus Absatz A wurde ein sprühgegossener Film mit Seidenverstärkung wie folgt hergestellt:
Feines gewobenes Seidennetzwerk wurde über einen Rahmen gespannt, und auf den gespannten Teil wurde eine Lösung von 100 mg/ml PLGA (Molverhältnis 50 : 50, Grenzviskosität 0,64) in Aceton aufgebürstet. Man ließ das feuchte Netzwerk trocknen, und dann wurden wiederholte Auftragungen von PLGA-Lösung aufgebürstet, bis die Poren im Seidennetzwerk vollständig gefüllt waren. Das Netzwerk wurde dann getrocknet, auf eine Polyethylenfolie gegeben, und die IFN-PLGA-Mikrosuspension wurde darauf sprühgegossen. Nach einstündigem Trocknen wurde das beschichtete Netzwerk umgedreht, mit der beschichteten Seite nach unten, und wieder mit der IFN/PLGA-Mikrosuspension besprüht, wobei man eine Polymerschicht von ungefähr 100 um Dicke auftrug. Nach weiterem einstündigem Trocknen wurde die vorher beschichtete Seite wieder besprüht, man ließ sie trocknen, drehte sie um, und die zweite Seite wurde wieder besprüht. Der resultierende Film hatte eine Dicke von 300 um.
D. Die in den Abschnitten B und C erhaltenen Filme wurden 18 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Sie wurden dann von der Polyethylenfolie entfernt und 3 Tage bei Raumtemperatur getrocknet.

E. Vorrichtungsgestaltung

Unter Verwendung des wie in den Abschnitten A-D oben beschrieben erhaltenen sprühgegossenen Films wurden die Vorrichtungen mit gesteuerter Freigabe wie folgt gebildet:
a. Flache Filmabschnitte, 1 · 2 cm, wurden aus dem nicht- verstärkten Film ausgeschnitten.
b. Flache Filmabschnitte, 1 · 2 cm, wurden aus dem verstärkten Film ausgeschnitten.
c. Flache Filmabschnitte, 3 · 5 cm, wurden aus dem nicht- verstärkten Film ausgeschnitten, auf einen 18-Gauge-Draht aufgerollt, und der Film wurde durch ein sehr leichtes Auftragen von Aceton mit einem Baumwolltupfer auf die endgültigen 5 mm Länge oder durch Einbringen in Acetondampf befestigt. Der Draht wurde entfernt, und die Rollen wurden in Scheiben von 5 oder 10 mm Länge geschnitten.
d. Flache Filmabschnitte, 3 · 5 cm, wurden aus dem verstärkten Film ausgeschnitten, auf einen 18-Gauge-Draht aufgerollt, und der Film wurde durch ein sehr leichtes Auftragen von Aceton mit einem Baumwolltupfer auf die endgültige 5 mm Länge oder durch Einbringen in Acetondampf befestigt. Der Draht wurde entfernt, und die Rollen wurden in Scheiben von 5 oder 10 mm Länge geschnitten.
Die Freigabeprofile dieser Vorrichtungen, als sie subkutan über einen Zeitraum von 100 Tagen in Mäuse implantiert waren, werden in Fig. 1 als Vorrichtungen 1, 2 und 3 für die Gestaltungen a, b bzw. c gezeigt und identifiziert.

BEISPIEL 2

Herstellung von Vorrichtungen mit gesteuerter Freigabe, die Interferon enthalten (Methylendichlorid-Verfahren)

1 g D,L-PLGA (Molverhältnis 50 : 50, Grenzviskosität 0,64 dl/g) wurde in 4 ml Methylendichlorid gelöst. 0,3 mg rekombinantes HuIFN-β in 1 ml Puffer, der 12,5 mg/ml Human-Serumalbumin (HSA) und 12,5 mg/ml Dextrose enthielt, wurden zu der gelösten PLGA-Lösung gegeben. Die resultierende Mischung wurde ungefähr 60 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit gewirbelt, bis eine weiße Emulsion gebildet war. Die Emulsion wurde sofort in eine Spritzpistole »überführt und auf einen Polyethylenfilm aufgesprüht und auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt D, beschrieben getrocknet.
Vorrichtungen mit gesteuerter Freigabe wurden durch Aufrollen von 3 cm · 5 cm-Filmabschnitten auf einen 18-Gauge-Draht, wobei das Ende der Rolle durch Einbringen in Aceton befestigt wurde. Entfernen des Drahts und Schneiden von jeder Rolle in Scheiben von 5 und 10 mm Länge gebildet.
Das Freigabeprofil dieser Vorrichtungen, als sie subkutan über einen Zeitraum von 60-100 Tagen in Mäusen implantiert waren, wird als Vorrichtung 4 in Fig. I gezeigt.

BEISPIEL 4

Bestimmung der Teilchengröße und -verteilung

PLGA/IFN-Filme, wie in den Beispielen 1 und 2 oben beschrieben hergestellt, wurden analysiert, um die Teilchengröße des Interferons und anderer Makromoleküle (Human-Serumalbumin und Dextrose) in jeder Formulierung gemäß den folgenden Verfahren zu bestimmen:

A. PLGA/IFN-Filme, wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt

1 g D,L-PLGA (Molverhältnis 50 : 50, Grenzviskosität 0,64 dl/g) wurde bei Raumtemperatur in 5 ml Aceton gelöst. 0,3 mg rekombinantes HuIFN-β in 1 ml Puffer, der 12,5 mg HSA und 12,5 mg Dextrose enthielt, wurden zur PLGA in Aceton gegeben, und die Mischung wurde ungefähr 10 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit gewirbelt. Der Niederschlag von PLGA, HSA, IFN und möglicherweise Dextrose, der sich bildete, wurde dann 10 Minuten bei 700 · g zentrifugiert. Der Überstand von Aceton und Wasser wurde mit einer Pipette entfernt, und die verbleibende Flüssigkeit wurde mit einem Wattetupfer entfernt. 10 ml Aceton wurden hinzugefügt, und die resultierende Mischung wurde bei hoher Geschwindigkeit gewirbelt, bis die PLGA im Pellet gelöst war, was einen IFN-, HSA-, Dextrose-Niederschlag, suspendiert in in Aceton gelöster PLGA, zurückließ. Ein Tropfen der Suspension wurde auf einem Glasobjektträger mit Bedeckungsscheibe unter einem Polarisations-Lichtmikroskop bei 100x-Vergrößerung unter Verwendung eines Okular-Fadenkreuzes mit 10 um-Unterteilungen betrachtet.
Die Teilchengrößen der festen makromolekularen Komponenten (IFN, HSA, Dextrose), die in der PLGA-Aceton-Lösung suspendiert waren, lagen im Bereich von weniger als oder gleich der Nachweisgrenze (ungefähr 100 bis 500 Nanometer) bis 100 um. Teilchen mit Durchmessern von mehr als 10 um waren zu weniger als 10% der Gesamtanzahl von Teilchen vorhanden, und die meisten der Teilchen hatten Durchmesser von weniger als 1 um. Von weniger als 10% der sichtbaren Teilchen konnte beobachtet werden, dass sie mindestens ein anderes Teilchen berührten.

B. PLGA/IFN-Filme, wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt

Ein Tropfen der PLGA/IFN-Mikrosuspension, nach dem in Beispiel 2 oben beschriebenen Verfahren hergestellt, wurde auf einem Glasobjektträger mit Bedeckungsscheibe unter einem Lichtmikroskop bei einer 100x-Vergrößerung unter Verwendung eines Okular-Fadenkreuzes mit 10 um- Unterteilungen betrachtet. Bei 100x-Vergrößerung wurden keine Teilchen beobachtet, was anzeigte, dass das ganze IFN und HSA Teilchengrößen von weniger als oder gleich der Nachweisgrenze (100 bis 500 Nanometer) aufwies.

C. Berechnung der spezifischen biologischen Interfon-Aktivität

Die Radioaktivität von drei 1 bis 50 ul-Aliquoten jeder unverdünnten Interferonprobe wird durch Zählen in einem Packard gamma-Zähler bestimmt. Aus dem. Ergebnis in Zählereignissen pro Minute (CPM) werden die Zählereignisse pro Einheitsvolumen bestimmt (CPM/ml). Die IFN-Aktivität (IFN- Einheiten/ml) jeder Probe, bestimmt gemäß dem in den obigen Abschnitten A und B beschriebenen Verfahren, wird durch den CPM/ml-Wert für die Probe dividiert, was die Aktivität des IFN in Einheiten/CPM ergibt.
Der Einheiten/CPM-Wert für jede Probe, der durch Extraktion aus einem produzierten Polylactidsystem erhalten wird, wird durch den Einheiten/CPM-Wert für das entsprechende Ausgangsvorrats- Interferonmaterial (Beladungsvorrats-IFN), das verwendet wurde, um die produzierten Polylactid/Interferon-Systeme herzustellen, geteilt, um das Verhältnis von spezifischer Aktivität von extrahiertem Interferon zu der spezifischen Aktivität von Beladungsvorrats-IFN zu ergeben. Das so erhaltene Verhältnis wird mit dem IFN-Einheiten/ml-Wert für das Beladungsvorrats-IFN multipliziert, was das Beladungsvorrats-IFN- Einheiten/ml-Äquivalent der extrahierten IFN-Probe ergibt.
Der log&sub1;&sub0; des Beladungsvorrats-IFN-Einheiten/ml-Äquivalents für jede extrahierte Probe wird als relative log&sub1;&sub0;-IFN-Aktivitat (RLIA) bezeichnet. Von den RLIA-Werten für jede Gruppe von getesteten Proben wird der Durchschnitt genommen und mit dem log&sub1;&sub0;-IFN-Einheiten/ml-Wert des entsprechenden Beladungsvorrats verglichen. Zusätzliche Genauigkeit kann durch eine lineare Regressionsanalyse von RLIA-Werten gewonnen werden, welche aus einer Reihe von Systemen erhalten werden, die in einem Testtier, wie z. B. Mäusen, implantiert und in regelmäßiger Folge zu mehreren Zeitpunkten über den Testzeitraum, z. B. einem Monat, zurückgewonnen wurden. Der Y-Abschnitt der Kurve, die aus einer graphischen Darstellung von RLIA-Werten (Y-Achse) gegen Implantationstage (X-Achse) bestimmt wird, zeigt die Aktivität des Interferons in den produzierten Systemen vor der Implantation an.

D. Ergebnisse

Die Systeme mit gesteuerter Freigabe weisen RLIA-Werte nach der Herstellung, aber vor der in-vivo-Anwendung, auf, die die Hälfte oder mehr der log&sub1;&sub0;-IFN-Einheiten/ml des entsprechenden Polypeptid- Beladungsvorrats sind.
Interferon/Polylactid-Systeme, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben hergestellt, zeigen, wenn sie wie in diesem Beispiel beschrieben getestet werden, im wesentlichen keinen Verlust an biologischer Aktivität des inkorporierten Interferons; d. h., die Durchschnitts- RLIA-Werte nach der Herstellung, aber vor der Implantation, sind im wesentlichen von den log&sub1;&sub0;-IFN-Einheiten/ml des IFN-Beladungsvorrats, aus dem sie hergestellt wurden, nicht unterscheidbar.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoff-Zufuhrsystems zur gesteuerten Verabreichung eines makromolekularen Polypeptids an einen Säuger, wobei das System eine Polymermatrix umfasst, die nicht mehr als etwa 30 Gewichtsprozent an Teilchen eines denaturierbaren makromolekularen Polypeptids mit einem Molekulargewicht von mehr als 10000 und andere fakultative wasserlösliche Komponenten dispergiert in einem Polylactid umfasst, wobei im Wesentlichen alle Polypeptid-Teilchen und anderen wasserlöslichen Komponenten Durchmesser von 10 um oder weniger aufweisen und gleichförmig und diskret in der gesamten Matrix dispergiert sind und wobei das Polypeptid mindestens etwa 50 Prozent der biologischen Aktivität beibehält, die es vor der Herstellung der Matrix besaß; wobei das Verfahren die Herstellung einer Mikrosuspension des Polypeptids und anderer fakultativer wasserlöslicher Komponenten in der Polylactid-Lösung und das Sprühgießen oder Zerstäuben der Mikrosuspension umfasst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Polypeptid aus Cytokinen, Lymphokinen, Monokinen und Interferonen ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, in dem das Polypeptid Interleukin-1 oder Interleukin-2 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, in dem das Polypeptid beta- Interferon ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Polypeptid ein Immunstimulator oder ein Immundepressivum ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Polypeptid ein Plasminogenaktivator ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Polypeptid ein Wachstumshormon ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Polypeptid Rinder- Wachstumshormon ist.

9. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, in dem das System ein biokompatibles inertes Verstärkungsmaterial enthält.

10. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, in dem das Polylactid ein Poly(lactid-co-glycolid)-Copolymer mit einem Molverhältnis von Lactid- zu Glycolid-Einheiten zwischen etwa 100 : 0 und 30 : 70 ist.