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Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für α-L-
Aspartyl-L-phenylalanin-methylester (hier im folgenden als
"α-ApM" abgekürzt) oder für ein Hydrohalogenid desselben.
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Bezüglich der Herstellung von α-APM, der eine Substanz ist,
die als ein Süßstoff verwendbar ist und nach der in jüngster
Zeit eine wachsende Nachfrage wegen ihres starken süßen
Geschmacks und der Süßecharakteristiken von guter Qualität
bestanden hat,so ist eine Anzahl von Verfahren bereits
beschrieben worden, die sich auf die chemischen
Herstellungsverfahren beziehen. Hierbei sind Verfahren dominant, bei
denen ein N-geschütztes-L-Asparaginsäureanhydrid als ein
carbonsäure-aktiviertes Derivat von L-Asparaginsäure
verwendet wird. Es wird insbesondere als am vorteilhaftesten
angesehen, α-APM industriell durch Verwendung von N-Formyl-
L-asparaginsäureanhydrid herzustellen, das leicht in einem
einzigen Schritt erhalten werden kann, indem L-Asparaginsäure
mit Ameisensäure und Essigsäureanhydrid umgesetzt wird, weil
die Ausgangsmaterialien leicht und ökonomisch hergestellt
werden können und das Herstellungsverfahren relativ einfach
ist.
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Die vorstehenden Herstellungsverfahren für α-APM, bei denen
N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid verwendet wird, weisen die
Verwendung von L-Phenylalanin-methylester als das andere
Ausgangsmaterial auf, wie es typischerweise in der japanischen
Patentoffenlegungsschrift Nr. 1350/1971 beschrieben ist. Nach
Bildung von N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester
als ein Zwischenprodukt wird die Formylgruppe als eine
schützende Gruppe entfernt, damit α-APM geliefert wird. Eine
Vielfalt von Verfahren ist vorgeschlagen worden, die auf die
Kondensationsreaktion zwischen
N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid und L-phenylalanin-methylester, die Hemmung von
Isomeren und das Entfernen der Formylgruppe abstellen.
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Die Verfahren, bei denen L-phenylalanin-methylester als eines
der Ausgangsmaterialien ausgenutzt wird, beinhalten jedoch
mühselige Verfahren beim Verestern von L-phenylalanin zu
L-phenylalanin-methylester, um so die Kondensationsreaktion
mit N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid durchführen zu können.
Nebenbei hat es sich auch gezeigt als ein Ergebnis der
Untersuchungen der Erfinder der vorliegenden Erfindung, daß L-
phenylalanin-methylester in einer freien Form dazu neigt,
Selbstkondensation und Zyklisierung zu 2,5-Dibenzyl-3,6-
dioxopiperazin zu durchlaufen. Diese Tendenz bewirkt
verschiedene industrielle Probleme wie Ausbeuteverringerung und
Qualitätsverschlechterung von α-APM.
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Als ein Verfahren für die Herstellung von α-APM, bei dem
N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid ausgenutzt wird, war es
deshalb wünschenswert, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem
L-phenylalanin-methylester nicht als das andere
Ausgangsmaterial verwendet wird.
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Als Herstellungsverfahren, bei dem nicht zu
L-phenylalaninmethylester gegriffen wird, ist beschrieben worden, daß α-APM
hergestellt wird, indem N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid
direkter Kondensation mit L-Phenylalanin in Essigsäure
unterworfen wird, um N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin zu bilden,
die Formylgruppe entfernt wird, um α-Aspartyl-L-phenylalanin
zu erhalten, und dann das α-Aspartyl-L-phenylalanin in
Anwesenheit von Chlorwasserstoff in Methanol verestert wird
japanische Patentveröffentlichung Nr. 26133/1980); und als
eine Verbesserung für die Veresterung wird -L-Aspartyl-L-
phenylalanin mit einem Medium in Kontakt gebracht, das aus
Chlorwasserstoff, Methanol und Wasser zusammengesetzt ist,
um es zu verestern, woraufhin Kristallisation des
entstehenden α-APM als sein Hydrochlorid in einer festen Form
folgt (japanische Patentveröffentlichung Nr. 50200/1985).
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Das erstere Verfahren ist jedoch von dem Nachteil begleitete
daß die Veresterungsreaktion keine hohe Selektivität bezüglich
der zwei Carbonsäuregruppen besitzt, eine Veresterungsreaktion
der
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Bezugszeichenliste
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-Carbonsäuregruppe und/oder eine andere
Veresterungsreaktion sowohl von α- als auch β-Carbonsäuregruppen bis zu
wesentlichem Ausmaß zusätzlich zu der gewünschten Veresterung
der α-Carbonsäuregruppe eintritt und die Selektivität zu α-APM
deshalb reduziert wird. Andererseits hat es das letztere
Verfahren ermöglicht, die Selektivität zu α-APM zu verbessern,
indem die Veresterungsreaktion in einer wäßrigen Lösung von
Chlorwasserstoffsäure durchgeführt wird, um so das entstehende
α-APM als sein Hydrochlorid außerhalb des Systems
auszukristallisieren. Die Isolationsausbeute von α-APM ist jedoch sehr
niedrig, und zwar 50-60% (bezogen auf
α-L-Aspartyl-L-phenylalanin). Das letztere Verfahren wird deshalb nicht als
vollständig zufriedenstellend in der Ausbeute angesehen.
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Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist ein
Verfahren, mit dem α-APM mit einer hohen Selektivität und in einer
hohen Ausbeute aus α-L-Aspartyl-L-phenylalanin oder einem
N-geschützten-α-L-Aspartyl-L-Phenylalanin unter schonenden
Bedingungen hergestellt werden kann.
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Andere erzielbare Vorteile ergeben sich aus der folgenden
Beschreibung.
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Die oben beschriebene Aufgabe und weitere Ziele der vorliegenden
Erfindung können durch das folgende Herstellungsverfahren für
α-APM gemäß der Erfindung erreicht werden:
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Ein Verfahren zur Herstellung von
α-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester oder dessen Hydrohalids (Hydrohalogenids), das
das Verestern von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin in Anwesenheit
eines Alkalimetallhalids oder Erdalkalimetallhalids in einem
Medium, das aus Schwefelsäure, Wasser und Methanol
zusammengesetzt ist, worin die Konzentration der Schwefelsäure 5-50
Gew.-%, bezogen auf die Summe der Schwefelsäure und Wasser
in dem Reaktionssystem, beträgt, die Konzentration des Methanols
3-35 Gew.-%, bezogen auf die Summe des Methanols und Wasser
in dem Reaktionssystem, ist, die Mengen von Schwefelsäure
und Methanol jeweils wenigstens 1 Äquivalent relativ zu dem
α-L-Aspartyl-L-phenylalanin sind und die Menge des
gleichzeitig existierenden Alkalimetallhalogenids oder
Erdalkalimetallhalogenids wenigstens 1 Äquivalent relativ zu dem α-L-
Aspartyl-L-phenylalanin ist, um dadurch zu gestatten, daß der
entstehende α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester als sein
entsprechendes Hydrohalogenid ausfällt, und dann das
Hydrohalogenid isoliert wird und, wenn die Herstellung des
Methylesters gewünscht wird, das Hydrohalogenid neutralisiert wird.
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Das Verfahren dieser Erfindung besitzt zahlreiche Vorteile.
Beispielsweise kann die Veresterungsreaktion von α-L-Aspartyl-
L-phenylalanin unter schonenden Bedingungen ablaufen gelassen
werden. Die Verwendung des Alkalimetallhalogenids oder
Erdalkalimetallhalogenids, insbesondere Magnesiumchlorid,
gestattet die Herstellung von α-APM mit einer hohen Selektivität
und in einer hohen Ausbeute. Da das entstehende α-APM als
sein Hydrohalogenid auskristallisiert, kann α-APM
Hydrohalogenid mit guter Qualität durch bloßes Durchführen von
Filtrieren nach der Reaktion erhalten werden. Die Reaktions-
und Trennverfahren sind einfach. Zusätzlich kann das
Ausgangsmaterial, d. h. α-L-Aspartyl-L-phenylalanin oder das
N-geschützte-α-L-Aspartyl-L-Phenylalanin, erhalten werden,
indem L-phenylalanin so wie es ist, eingesetzt wird, ohne daß
L-phenylalanin-methylester verwendet wird, dessen Stabilität
in einer Lösung schlecht ist, so daß der Gesamtprozeß
vereinfacht wird. Das vorliegenden Herstellungsverfahren für
α-APM hat einen hohen industriellen Wert.
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Bei der Veresterung von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin mit
Methanol in einem sauren Medium werden, was in der Sache selbst
liegt, neben α-APM α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-β-methylester,
bei dem die β-Carbonsäuregruppe von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin
verestert worden ist, sowie
α-L-Aspartyl-L-phenylalanindimethylester, bei dem die zwei Carbonsäuregruppen beide
verestert worden sind, gebildet.
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Die Reaktionen, die diese drei Arten von Veresterungsprodukten
aus den Ausgangsmaterialien bilden, sind
Gleichgewichtsreaktionen. Es ist deshalb notwendig, aus dem Reaktionssystem
α-APM allein selektiv aus den Veresterungsprodukten zu
entfernen, um die Selektivität für das gewünschte α-APM zu erhöhen.
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Es wurde deshalb so angesehen, daß es zu einer Verbesserung
für die Selektivität zu dem gelieferten α-APM führt,wenn die
Konzentration des in der Reaktionslösung gelösten α-APM
reduziert werden kann.
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Folgend der vorstehenden Methode haben die Erfinder der
vorliegenden Erfindung eine weitreichende Untersuchung in Richtung
auf die effiziente Herstellung von α-APM durch Veresterung
von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin in einer wäßrigen Lösung
von Schwefelsäure durchgeführt, obgleich solch eine
Veresterung vorher kaum praktisch durchgeführt worden war. Aber
das entstandene α-APM kristallisierte nicht als sein Sulfat
in verdünnter Schwefelsäure aus. Die Erfinder haben deshalb
weitere Arbeiten durchgeführt, um die Wirkungen zu untersuchen,
die durch die Zugabe verschiedener anorganischer Salze
erzielbar wären. Im Verlauf der weiteren Arbeiten wurde
überraschend gefunden, daß das entstehende α-APM nicht als sein
Sulfat selektiv kristallisiert, sondern als sein
Hydrohalogenid und darüberhinaus in einer hohen Ausbeute, wenn die
Veresterungsreaktion in Anwesenheit eines bestimmten
Metallhalogenids, d. h. eines Alkalimetallhalogenids oder
Erdalkalimetallhalogenids durchgeführt wird.
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Solch ein Phänomen war bis heute weder bekannt noch wurde es
erwartet. Darüberhinaus tritt solch ein Phänomen nicht ein,
egal welches andere Halogenid als Alkalimetallhalogenide und
Erdalkalimetallhalogenide man auch nimmt. Wenn andere
anorganische Salze verwendet wurden, wurde keine Kristallisation
beobachtet, selbst in der Sulfatform nicht.
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Das Ausgangsmaterial ist α-L-Aspartyl-L-phenylalanin bei der
vorliegenden Erfindung. α-L-Aspartyl-L-phenylalanin kann
hergestellt werden, indem ein N-geschütztes-α-L-Aspartyl-L-
phenylalanin, das durch die Kondensation des entsprechenden
N-geschützten-L-Asparaginsäureanhydrids und L-Phenylalanin
erhalten worden ist, durch ein an sich in der Technik bekanntes
Verfahren ungeschützt gemacht wird. Hier können die
Formylgruppe, t-Butoxycarbonylgruppe und dergleichen als schützende
Gruppen genannt werden. Die Formylgruppe ist eine besonders
bevorzugte schützende Gruppe vom Standpunkt der Herstellung
des Ausgangsmaterials.
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Das Ausgangsmaterial α-L-Aspartyl-L-phenylalanin muß nicht
notwendigerweise eine hohe Reinheit aufweisen. Der Einschluß von
β-L-Aspartyl-L-phenylalanin, das von dem als Nebenprodukt bei
der Kondensation von N-Formyl-α-L-asparaginsäureanhydrid mit
L-phenylalanin, Phenylalanin, Asparaginsäure oder dergleichen
angefallenen β-Isomer abgeleitet worden ist, verursacht
keinerlei besondere Probleme, solange sein Gehalt auf einem Niveau
ist, das die Kristallisation eines zu bildenden α-APM
Hydrohalogenids nicht negativ beeinflußt. Insbesondere
verschlechtert der Einschluß von β-L-Aspartyl-L-phenylalanin in
einer beliebigen Menge bis zu etwa 30% nicht die
Kristallisation des α-APM Hydrohalogenids, und darüberhinaus
verursacht es nicht, daß von dem β-Isomer abgeleitete Verbindungen
auskristallisieren, wodurch die Qualität des α-APM
Hydrohalogenids, das isoliert werden soll, nicht verschlechtert
werden wird.
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Bei dem Verfahren dieser Erfindung ist es wesentlich, daß
α-L-Aspartyl-L-phenylalanin in Anwesenheit eines
Alkalimetallhalogenids oder Erdalkalimetallhalogenids in einem Medium
verestert wird, das aus Schwefelsäure, Wasser und Methanol
zusammengesetzt ist, so daß bewirkt wird, daß α-APM in der
Form eines Hydrohalogenids auskristallisiert.
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Die Zusammensetzung des Reaktionsmediums ist ein wichtiger
Faktor für die Kristallisation des entstehenden α-APM als ein
festes Hydrohalogenid von ihm. Die Konzentration von
Schwefelsäure ist 5-50 Gew.-%, wobei 8-40 Gew.-% bevorzugt werden,
wobei diese Konzentration definiert ist als Schwefelsäure/
(Schwefelsäure + Wasser)·100. Andererseits ist die
Konzentration von Methanol 3-35 Gew.-%, wobei 5-30 Gew.-%
bevorzugt werden, und diese Konzentration ist definiert als
Methanol/(Methanol + Wasser)·100. Schwefelsäure und
Methanol werden jeweils in einer Menge von wenigstens 1 Äquivalent
relativ zu dem Ausgangsmaterial, d. h. dem α-L-Aspartyl-L-
phenylalanin, verwendet.
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Die Veresterungsreaktion wird in Anwesenheit eines
Alkalimetallhalogenids oder Erdalkalimetallhalogenids, vorzugsweise eines
Alkalimetallchlorids oder Erdalkalimetallchlorids, spezieller
Lithiumchlorids, Natriumchlorids, Kaliumchlorids, Rubidiumchlorids,
Cäsiumchlorids, Berylliumchlorids, Magnesiumchlorids,
Calciumchlorids, Strontiumchlorids, Bariumchlorids oder dergleichen,
durchgeführt. Von diesen Metallchloriden wird insbesondere
Magnesiumchlorid bevorzugt. α-APM kann in noch einer höheren
Ausbeute erhalten werden, wenn Magnesiumchlorid verwendet wird.
Dies scheint anzudeuten, daß das Verfahren der vorliegenden
Erfindung nicht auf einer bloßen
Säure-Salz-Wechselwirkungsreaktion beruht, sondern daß Metallkationen auf die eine oder
andere Weise an der Reaktion teilnehmen.
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Beim Verwenden des Alkalimetallhalogenids oder
Erdalkalimetallhalogenids (hier im folgenden "Metallhalogenid" für beide aus
Gründen der Abkürzung genannt) ist es nicht unbedingt
notwendig, dieses vollständig in dem oben beschriebenen
Reaktionsmedium zu lösen. Es kann auch in einem suspendierten Zustand
benutzt werden. Es kann praktisch sinnvoll sein, zwei oder
mehr dieser Metallhalogenide in Kombination einzusetzen,
obgleich sie im allgemeinen einzeln verwendet werden.
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Das Metallhalogenid wird in einer Menge von wenigstens 1
Äquivalent, vorzugsweise wenigstens 1,1 Äquivalenten relativ zu
α-L-Aspartyl-L-phenylalanin verwendet. Obgleich die Reaktion
noch bei einem niedrigeren Metallhalogenidniveau
fortschreitet, sinkt die Selektivität zu α-APM. Es wird deshalb
nicht bevorzugt, das Metallhalogenid auf solch einem niedrigen
Niveau zu verwenden. Andererseits wird der oberen Grenze
des Metallhalogenids, das verwendet werden soll, keine
Beschränkung auferlegt. Es ist jedoch nicht günstig, dieses in zu
großer Menge zu verwenden. Die Verwendung des Metallhalogenids
in einer übermäßigen Menge kann die Trennung von α-APM
und dem Metallhalogenid in einigen Fällen komplizieren.
Deshalb wird es im allgemeinen in einer Menge von 20 Äquivalenten
oder weniger relativ zu α-L-Aspartyl-L-phenylalanin verwendet.
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Bei dem Verfahren der vorliegen Erfindung besteht keine
besondere Beschränkung für die Reihenfolge der Beschickung des
Ausgangsmaterials, des Reaktionsmediums und des Metallhalogenids.
Beispielsweise werden das Ausgangsmaterial, d. h. α-L-Aspartyl-
L-phenylalanin und Metallhalogenid in ein Reaktionsgefäß
eingebracht, in das ein Medium, das aus Schwefelsäure, Wasser
und Methanol in vorherbestimmten Mengen besteht, vorher
eingebracht worden ist. Danach wird die Veresterungsreaktion bei
einer vorherbestimmten Temperatur durchgeführt.
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Die Temperatur der Veresterungsreaktion kann 0-60ºC,
vorzugsweise 10-50ºC, sein. Ungünstig niedrige
Reaktionstemperaturen verlangsamen die Veresterungsreaktion. Wenn die
Temperatur übermäßig erhöht wird, wird die Spaltung von
Peptidbindungen beschleunigt und gleichzeitig wird die
Löslichkeit von α-APM Hydrohalogenid erhöht. Als eine Folge
davon wird die Ausbeute an α-APM gesenkt. Es ist deshalb
nicht günstig, die Veresterungsreaktion bei irgendeiner
ungünstig niedrigen oder übermäßig hohen Temperatur
durchzuführen.
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Bei dem Verfahren dieser Erfindung wird das entstehende α-APM
nachfolgend als sein Hydrohalogenid von dem Reaktionssystem
auskristallisieren gelassen. Nach der Reaktion und
nachfolgendem wahlweisem Kühlen wird α-APM deshalb als sein
Hydrohalogenid durch Zentrifugieren, Filtrieren oder
dergleichen isoliert.
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Bei der vorliegenden Erfindung kann α-L-Aspartyl-L-phenylalanin,
das sich nach dem Entfernen der schützenden Gruppe durch
Behandeln des N-geschützten-α-L-Aspartyl-L-phenylalanins in der
wäßrigen Lösung von Schwefelsäure oder der methanolhaltigen
wäßrigen Lösung von Schwefelsäure gebildet hat, auch direkt
als ein Ausgangsmaterial für die Veresterung verwendet werden,
ohne daß es isoliert wird.
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Die schützende Gruppe des
N-geschützten-α-L-Aspartyl-L-phenylalanins, das Ausgangsmaterial für das obige Verfahren, ist
vermutlich ziemlich leicht durch Säurehydrolyse entfernbar.
Spezieller gesagt, die Formylgruppe, t-Butoxycarbonylgruppe
oder dergleichen können hier genannt werden. Die Formylgruppe
ist insbesonders geeignet, wenn die Zubereitung des
Ausgangsmaterials parallel in Betracht gezogen wird.
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Als ein Herstellungsverfahren für N-Formyl-α-L-aspartyl-L-
phenylalanin gilt, daß es hergestellt werden kann in einer
guten Ausbeute durch ein Verfahren, das früher von den
Erfindern der vorliegenden Erfindung entwickelt worden ist,
und zwar durch Kondensieren von
N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid und L-Phenylalanin in Wasser und nachfolgendes
Bewirken, daß das Kondensationsprodukt um pH 3 auskristallisiert.
Es ist nicht absolut wesentlich, daß dieses N-Formyl-α-L-
aspartyl-L-phenylalanin einen hohen Grad an Reinheit aufweist.
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Der Einschluß des β-Isomeren, und zwar N-Formyl-β-aspartyl-L-
phenylalanin und in einigen Fällen L-Phenylalanin, (N-Formyl)-
L-asparaginsäure, verursacht keinerlei besonderes Problem,
solange ihr Gehalt auf Niveaus bleibt, die die
Kristallisation eines zu bildenden α-APM Hydrohalogenids nicht
gegenteilig beeinflussen. Insbesondere verschlechtert der Einschluß
von N-Formyl-β-L-aspartyl-L-phenylalanin in irgendeiner Menge
bis zu etwa 30% nicht die Kristallisation des α-APM
Hydrohalogenids und verursacht darüberhinaus nicht, daß
Verbindungen, die von dem β-Isomer abgeleitet sind,
auskristallisieren, wodurch die Qualität des zu isolierenden α-APM
Hydrohalogenids nicht verschlechtert werden wird.
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Das vorstehend beschriebene Verfahren, bei dem N-Formyl-α-L-
aspartyl-L-phenylalanin als das Ausgangsmaterial verwendet
wird, umfaßt einen Schritt, bei dem Formylgruppe entfernt
wird, und einen weiteren Schritt, bei dem das gebildete α-L-
Aspartyl-L-phenylalanin durch die Entfernung der Formylgruppe
verestert wird. Vor allem der Entfernungsschritt der
Formylgruppe, der vor der Veresterung durchgeführt wird, wird in
einer wäßrigen Lösung von Schwefelsäure oder einer
methanolhaltigen wäßrigen Lösung von Schwefelsäure durchgeführt.
In einer spezifischen Ausführungsform wird dieser Schritt
durchgeführt, indem N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin in
eine wäßrige Lösung oder methanolhaltige wäßrige Lösung,
die Schwefelsäure in einer Menge von wenigstens 1 Äquivalent
relativ zu dem N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin enthält,
eingebracht wird und dann das Reaktionsgemisch unter Rühren
über eine vorherbestimmte Zeitperiode erhitzt wird. Die
wäßrige Lösung von Schwefelsäure wird in einem Bereich von
etwa 3-70 Gew. -% in Werten der Konzentration verwendet, die
durch Schwefelsäure/(Schwefelsäure + Wasser)·100 definiert
ist. Wenn Methanol enthalten ist, gibt es keine besondere
Beschränkung für die Menge des Methanols, das verwendet werden
soll. Zieht man die Menge des zu verwendenden Methanols in dem
nachfolgenden Veresterungsschritt in Betracht, so ist es jedoch
vorzuziehen, dieses in einer Menge einzusetzen, die nicht die
Menge übersteigt, die in dem Veresterungsschritt verwendet
werden soll. Es ist natürlich möglich, das Entfernen der
Formylgruppe in Anwesenheit von Methanol in einer Menge
durchzuführen, die größer als die Menge ist, die in dem nachfolgenden
Veresterungsschritt verwendet werden soll. Dies erfordert
jedoch ein Extraverfahren für die Rückgewinnung von Methanol
durch Konzentration in dem nachfolgenden Veresterungsschritt.
Die Verwendung von Methanol in solch einer großen Menge wird
deshalb nicht als günstig im Hinblick auf die Effizienz der
Arbeit angesehen.
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Die Reaktionstemperatur des Schrittes, in dem die Formylgruppe
entfernt wird, kann von 30ºC-70ºC, vorzugsweise 40ºC-60ºC,
reichen. Wenn die Reaktionstemperatur zu niedrig ist,
ist eine ungebührlich lange Zeitperiode für die Entfernung
der Formylgruppe erforderlich. Wenn die Temperatur
andererseits zu hoch ist, besteht die Tendenz, daß Nebenreaktionen
wie Spaltung von Peptidbindungen leicht auftreten. Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit von der
Konzentration von Schwefelsäure, ihrer zu verwendenden Menge, der
Reaktionstemperatur usw. und kann nicht vollständig
spezifiziert angegeben werden. Sie wird jedoch üblicherweise
in einer Periode durchgeführt, die von 0,5 Stunden bis 20
Stunden dauert. Die Formylgruppe wird durch das obige
Verfahren von N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin so entfernt,
daß α-L-Aspartyl-L-phenylalanin gebildet wird. Es ist unnötig
zu erwähnen, daß dann, wenn das Entfernen der Formylgruppe
in einer methanolhaltigen wäßrigen Lösung von Schwefelsäure
durchgeführt wird, nicht nur Entformylierung sondern auch
eine Veresterungsreaktion eingeleitet wird, obgleich der Grad
der letzteren Reaktion in Abhängigkeit von Reaktionsbedingungen
variiert. α-L-Aspartyl-L-phenylalanin, das in dem ersten
Schritt gebildet worden ist, befindet sich in einem gelösten
Zustand in dem Reaktionsgemisch. Das so gebildete α-L-Aspartyl-
L-phenylalanin wird dem nächsten Veresterungsschritt ohne
Isolation unterworfen.
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α-L-Aspartyl-L-phenylalanin, das auf die vorstehende Weise
erhalten worden ist und seinen Ester in einigen Fällen enthalten
kann, wird dann in Anwesenheit des Metallhalogenids in einem
Medium verestert, das aus Schwefelsäure, Wasser und Methanol
besteht, wodurch es zu einem α-APM Hydrohalogenid umgewandelt
wird.
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Die Konzentration und die Menge von Schwefelsäure und Methanol
und die Art des Metallhalogenids in dem Veresterungsschritt
sind die gleichen wie die oben beschriebenen Bedingungen für
die Herstellung eines α-APM Hydrohalogenids von α-L-Aspartyl-
L-phenylalanin als einem Ausgangsmaterial. Und zwar kann
die Konzentration von Schwefelsäure vorzugsweise 5-50 Gew.-%
sein, wobei 8-40 Gew. -% noch stärker bevorzugt sind,
wobei die Konzentration als Schwefelsäure/(Schwefelsäure + Wasser)
·100 definiert ist. Andererseits kann die Konzentration von
Methanol vorzugsweise 3-35 Gew.-% sein, wobei 5-30 Gew.-%
stärker bevorzugt werden und wobei die Konzentration als
Methanol/(Methanol + Wasser)·100 definiert ist. Vorzugsweise
können Schwefelsäure und Methanol jeweils in einer Menge von
wenigstens 1 Äquivalent relativ zu dem Ausgangsmaterial, d. h.
N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin, verwendet werden. Als
das Metallhalogenid wird ein Metallchlorid bevorzugt, und zwar
speziell Lithiumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid,
Rubidiumchlorid, Cäsiumchlorid, Berylliumchlorid, Magnesiumchlorid,
Calciumchlorid, Strontiumchlorid, Bariumchlorid und dergleichen.
Magnesiumchlorid wird besonders bevorzugt. Solch ein
Metallhalogenid kann in einer Menge von wenigstens 1 Äquivalent,
vorzugsweise wenigstens 1,1 Äquivalenten, relativ zu dem
N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin verwendet werden.
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In einer spezifischen Ausführungsform kann der
Veresterungsschritt durchgeführt werden, indem, als einem wahlweisen
Verfahren, das Reaktionsgemisch, das in dem vorhergehenden Schritt,
und zwar dem
Entfernungsschritt der Formylgruppe, erhalten worden ist, gekühlt wird,
Schwefelsäure, Wasser, Methanol und Metallhalogenid bis zu
ihren vorherbestimmten Konzentrationen oder in ihren
vorherbestimmten Mengen eingebracht werden, und dann die
Veresterungsreaktion durchgeführt wird.
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Die Reaktionstemperatur der Veresterung kann von 0ºC bis 60ºC
reichen, wobei 10ºC bis 50ºC bevorzugt werden.
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Das durch die vorstehende Veresterungsreaktion gebildete
α-APM kristallisiert als sein Hydrohalogenid danach von dem
Reaktionssystem aus. Nach der Reaktion und dem anschließenden
wahlweisen Kühlen wird α-APM deshalb als sein Hydrohalogenid
durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dergleichen isoliert.
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Das so isolierte α-APM Hydrohalogenid kann in freies α-APM
durch Neutralisieren mit einem kaustischen Alkali,
Alkalicarbonat oder Alkalibicarbonat in einem wäßrigen Medium
durch ein an sich in der Technik bekanntes Verfahren umgewandelt
werden.
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Die vorliegende Erfindung wird im folgenden noch näher durch
die folgenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1:
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α-L-Aspartyl-L-phenylalanin (14,0 g) wurde zu einem Medium
hinzugegeben und in diesem gelöst, das aus 9,6 g Methanol,
21,2 g konzentrierter Schwefelsäure und 44,4 g Wasser bestand.
Magnesiumchloridhexahydrat (30,5 g) wurde dann zu der
entstandenen Lösung hinzugegeben, woraufhin eine
Veresterungsreaktion bei 20-25ºC folgte. Nach dem ablaufen lassen der
Reaktion über drei Tage wurden ausgefällte Kristalle durch
Filtrieren aufgesammelt und dann mit gekühltem Wasser
gewaschen. Das Gewicht eines so erhaltenen nassen Kuchens
betrug 20,3 g. Als ein Ergebnis einer Analyse des nassen
Kuchens durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
wurde gefunden, daß der Gehalt an α-APM (umgewandelt in
seine freie Form) 12,0 g war (Ausbeute: 81,6%, bezogen auf
α-L-Aspartyl-L-phenylalanin).
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Ein Teil der so erhaltenen Kristalle wurde in Wasser gelöst,
woraufhin eine Zugabe einer wäßrigen Lösung von Bariumchlorid
folgte. Ausfällung wurde kaum beobachtet. Die Lösung wurde
jedoch trüb mit einer wäßrigen Lösung von Silbernitrat. Der
nasse Kuchen wurde zur Reinigung von Wasser umkristallisiert
und erhaltene Kristalle wurden getrocknet. Als ein Ergebnis
einer Elementaranalyse an einer Probe der so getrockneten
Kristalle wurde bestätigt, daß die Kristalle
α-APM·HCl-dihydrat waren.
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Elementaranalysedaten (%):
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Berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub3;N&sub2;O&sub7;Cl: C, 45,84; H, 6,32;
N, 7,64; Cl, 9,67. Gefunden: C, 45,68; H, 6,45;
N, 7,60; Cl, 9,74.
Beispiel 2
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Wasserfreies Magnesiumchlorid (19,0 g) wurde in ein Medium
gegeben, das aus 25,5 g konzentrierter Schwefelsäure, 72,5 g
Wasser und 8 g Methanol bestand. Dann wurde α-L-Aspartyl-L-
phenylalanin (28,0 g) hinzugegeben und in der Lösung gelöst,
worauf eine Reaktion by 30-35ºC folgte. Nachdem eine
Zeit einer bestimmten Zeitperiode nach dem Beginn der Reaktion
vergangen war, begann α-APM Hydrochlorid auszukristallisieren.
Nach Fortführen der Reaktion über zwei Tage bei der gleichen
Temperatur wurde das Reaktionsgemisch auf 20ºc abgekühlt.
So ausgefällte Kristalle wurden durch Filtrieren aufgesammelt
und dann mit gekühltem Wasser gewaschen, wodurch ein nasser
α-APM·HCl Kuchen erhalten worden war, der 24,6 g freies
α-APM enthielt. Ausbeute: 83% (bezogen auf α-L-Aspartyl-L-
phenylalanin).
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Der so erhaltene nasse Kuchen aus α-APM Hydrochlorid wurde
in 400 ml Wasser gelöst, wozu eine 20%ige wäßrige Lösung
von Natriumcarbonat allmählich tropfenweise hinzugegeben
wurde, um die erstere Lösung zu neutralisieren. Das
entstandene Gemisch wurde auf 5ºC abgekühlt und nach Rühren
derselben über 30 Minuten bei der gleichen Temperatur wurde
das Gemisch filtriert. So aufgesammelte Kristalle wurden
mit gekühltem Wasser gewaschen und dann im Vakuum getrocknet,
um freies α-APM zu erhalten. Ausbeute: 21,2 g [α]D20: 15,6
(c=4, 15N Ameisensäure). Als ein Ergebnis einer Analyse
durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ergab sich,
daß es nur α-APM war, was gefunden wurde. Es wurden keine
Verunreinigungen entdeckt.
Vergleichsbeispiel 1:
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Die Verfahren von Beispiel 2 wurden mit der Ausnahme
nachgearbeitet, daß 7,3 g Chlorwasserstoff anstelle von
Magnesiumchlorid verwendet wurden. Nach ablaufen lassen der Reaktion
bei 30ºC über zwei Tage wurde das Reaktionsgemisch durch
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie analysiert. Als
ein Ergebnis wurde gefunden, daß die Ausbeute von α-APM
nur so niedrig wie 32% war, (bezogen auf α-L-Aspartyl-L-
phenylalanin).
Beispiel 3:
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Die Verfahren von Beispiel 2 wurden mit der Ausnahme
nachgearbeitet, daß die Menge des verwendeten Methanols und die
Reaktionszeit und -temperatur geändert wurden auf 4,8 g
und drei Tage bei 30ºC in entsprechender Reihenfolge.
α-APM Hydrochlorid wurde in einer Isolationsausbeute von
76,3% erhalten (bezogen auf α-L-Aspartyl-L-phenylalanin.
Beispiel 4:
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Die Verfahren von Beispiel 2 wurden mit der Ausnahme
nachgearbeitet, daß die Menge des Wassers auf 113,5 g geändert
wurde und die Reaktion bei 30-35ºC über vier Tage
durchgeführt wurde. α-APM Hydrochlorid wurde in einer
Isolationsausbeute von 79,6% erhalten.
Beispiele 5 bis 8:
-
α-APM Hydrochlorid wurde getrennt erhalten, indem eine Reaktion
auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme
durchgeführt wurde, daß anstelle von Magnesiumchlorid
verschiedene andere Metallchloride getrennt verwendet wurden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle 1
Beisp. Nr. Metallchlorid Art Verwendete Menge Reaktion (ºC/Tage) Isolationsausbeute von α-APM·HCl* Lithiumchlorid Kaliumchlorid Berylliumchlorid Natriumchlorid * Bezogen auf L-Aspartyl-L-phenylalanin
Beispiel 9:
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In ein Medium, das aus 30 g konzentrierter Schwefelsäure, 97,8 g
Wasser und 9,6 g Methanol bestand, wurden 35,8 g α-L-Aspartyl-L-
phenylalanin, das 22 Gew.-%
-
Bezugszeichenliste
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-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthielt,
eingebracht und darin gelöst. Nach Zugabe von 23,3 g
wasserfreiem
Magnesiumchlorid in die entstandene Lösung wurden die
Inhalte bei 30-35ºC vier Tage lang reagieren gelassen. Das
Reaktionsgemisch wurde danach auf 20ºc gekühlt und auf diese
Weise ausgefällte Kristalle wurden durch Filtrieren
aufgesammelt. Die Kristalle wurden mit gekühltem Wasser
gewaschen, wodurch α-APM Hydrochlorid erhalten wurde. Als ein
Ergebnis einer Analyse durch
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wurde gefunden, daß das Hydrochlorid 23,4 g α-APM
enthielt (umgewandelt in seine freie Form). Ausbeute: 79,6%
(bezogen auf α-L-Aspartyl-L-phenylalanin).
-
Der so erhaltene Kuchen enthielt kaum
β-L-Aspartyl-L-phenylalanin und davon abgeleitete Verbindungen.
Beispiel 10:
-
Ein Medium, das aus 21,2 g konzentrierter Schwefelsäure,
60,6 g Walser und 9,6 g Methanol zusammengesetzt war, wurde
auf 50ºC erhitzt, woraufhin eine Zugabe von 15,4 g (0,05 Mol)
N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin bei 50-55ºC über
30 Minuten folgte. Die Reaktion wurde weitere zwei Stunden
durchgeführt, um die Formylgruppe zu entfernen.
-
Das Reaktionsgemisch wurde auf 20ºC abgekühlt, und es wurden
14,3 g wasserfreies Magnesiumchlorid hinzugegeben, woraufhin
eine Reaktion bei 20-25ºC über vier Tage folgte. Mit dem
Fortschreiten der Reaktion fielen Kristalle aus α-APM
Hydrochlorid nach und nach aus. Nach der Reaktion wurden die
ausgefällten Kristalle durch Filtrieren aufgesammelt und mit
gekühltem Wasser gewaschen. Gewicht des nassen Kuchens:
19,4 g. Als ein Ergebnis einer Analyse des nassen Kuchens
durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wurde
gefunden, daß der Gehalt an α-APM (umgewandelt in seine freie
Form) 11,8 g war. Ausbeute: 80,2% (bezogen auf N-Formyl-α-L-
aspartyl-L-phenylalanin). Ein Teil des nassen Kuchens wurde
zur Reinigung von Wasser umkristallisiert und die entstandenen
Kristalle wurden im Vakuum getrocknet. Ergebnisse einer
Elementaranalyse an einer Probe der so getrockneten Kristalle
waren in Übereinstimmung mit denjenigen von α-APM·HCl Dihydrat.
-
Elementaranalysedaten (%):
-
Berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub3;N&sub2;O&sub7;Cl: C, 45,84; H, 6,32; N, 7,64;
Cl, 9,67. Gefunden: C, 45,62; H, 6,54; N, 7,51; Cl, 9,68.
-
Ein Teil der Probe wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst,
woraufhin eine Zugabe einer wäßrigen Lösung von Bariumchlorid
folgte. Die Lösung war jedoch nicht wesentlich getrübt. Sie
wurde jedoch getrübt mit einer wäßrigen Lösung von
Silbernitrat, was dadurch bestätigte, daß die Probe Hydrochlorid war.
Beispiel 11:
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Ein Medium, das aus 25.5 g konzentrierter Schwefelsäure und
72,5 g Wasser zusammengesetzt war, wurde auf 50ºC erhitzt,
woraufhin eine allmähliche Zugabe von 30,8 g (0,1 Mol)
N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin über etwa 1 Stunde folgte.
-
Die Reaktion wurde weitere drei Stunden bei 50-60ºC
durchgeführt, um die Formylgruppe zu entfernen, so daß α-L-Aspartyl-
L-phenylalanin gebildet wurde. Das Reaktionsgemisch wurde
dann auf 20ºC abgekühlt und es wurden 9,6 g Methanol und 18,7 g
wasserfreies Magnesiumchlorid hinzugegeben. Das
Reaktionsgemisch wurde auf 30ºC erhitzt, woraufhin eine Reaktion bei
30-35ºC über vier Tage folgte. Mit dem Fortschreiten der
Reaktion fielen Kristalle aus α-APM Hydrochlorid nach und nach
aus. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch auf 20ºC
abgekühlt und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtrieren
aufgesammelt und mit gekühltem Wasser gewaschen, um einen
nassen α-APM·HCl-Kuchen zu erhalten, der 23,9 g α-APM enthielt
(umgewandelt in seine freie Form). Ausbeute: 81,4% (bezogen auf
N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin).
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Das so erhaltene α-APM Hydrochlorid wurde in 400 ml Wasser
gelöst, worauf eine tropfenweise Zugabe einer 20%igen wäßrigen
Lösung von Natriumcarbonat folgte, um den pH der Lösung auf
5,2 anzuheben. Die Lösung wurde auf 5ºC gekühlt und dann
filtriert, um Kristalle aufzusammeln. Nach dem Waschen der
Kristalle mit gekühltem Wasser wurden sie im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 20,6 g [α]D20: 15,8 (c=4, 15N Ameisensäure).
Vergleichsbeispiel 2:
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Es wurde eine Reaktion auf die gleiche Weise wie in Beispiel 11
mit der Ausnahme durchgeführt, daß 7,3 g Chlorwasserstoff
anstelle von Magnesiumchlorid verwendet wurden. Ausfällen von
α-APM Hydrochlorid als Kristalle wurde kaum beobachtet, selbst
wenn die Reaktion bei 30ºC zwei Tage durchgeführt wurde. Als
ein Ergebnis einer Analyse des Reaktionsgemisches durch
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wurde gefunden, daß die
Ausbeute an α-APM niedrig war und 26% betrug (bezogen auf
N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin).
Beispiel 12:
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Ein Medium, das aus 25,5 g konzentrierter Schwefelsäure, 72,5 g
Wasser und 4,8 g Methanol zusammengesetzt war, wurde auf 50ºC
erhitzt, woraufhin eine allmähliche Zugabe von 30,8 g (0,1 Mol)
N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin über etwa 30 Minuten
folgte. Danach wurden die Inhalte zwei Stunden bei 50-55ºC
umgesetzt, um die Formylgruppe zu entfernen. Das so erhaltene
Reaktionsgemisch wurde dann auf 20ºC abgekühlt und nach Zugabe
von 16,8 g wasserfreiem Magnesiumchlorid wurde eine Reaktion
über fünf Tage bei 30-35ºC durchgeführt. Nach der Reaktion
wurde das Reaktionsgemisch auf 20ºC abgekühlt und die so
ausgefällten Kristalle wurden durch Filtrieren aufgesammelt und dann
mit gekühltem Wasser gewaschen, um einen nassen Kuchen aus
α-APM Hydrochlorid zu erhalten.
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Als ein Ergebnis einer Analyse durch
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wurde gefunden, daß der nasse Kuchen
22,1 g α-APM enthielt (umgewandelt in seine freie Form).
Ausbeute: 75,1% (bezogen auf N-Formyl-α-L-aspartyl-L-
phenylalanin).
Beispiel 13:
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Ein Medium, das aus 25.5 g konzentrierter Schwefelsäure,
113,5 g Wasser und 12,8 g Methanol zusammengesetzt war, wurde
auf 50ºC erhitzt, worauf eine allmähliche Zugabe von 30,8 g
(0,1 Mol) N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin über etwa 30
Minuten folgte. Danach wurden die Inhalte zwei Stunde bei
50-60ºC umgesetzt, um die Formylgruppe zu entfernen. Das
so erhaltene Reaktionsgemisch wurde dann auf 20ºC abgekühlt,
und es wurden 28,0 g wasserfreies Magnesiumchlorid
hinzugegeben, woraufhin eine Reaktion bei 30-35ºC über fünf Tage
folgte. So ausgefällte Kristalle wurden durch Filtrieren auf
gesammelt und dann mit gekühltem Wasser gewaschen, um einen
nassen α-APM·HCl-Kuchen zu erhalten, der 21,5 g α-APM
enthielt (umgewandelt in seine freie Form). Ausbeute: 73,1%
(bezogen auf N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin)
Beispiele 14-16:
-
α-APM Hydrochlorid wurde getrennt erhalten, indem eine Reaktion
auf die gleiche Weise wie in Beispiel 10 mit der Ausnahme
durchgeführt wurde, daß anstelle von wasserfreiem
Magnesiumchlorid verschiedene andere Metallchloride getrennt verwendet
wurden. Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.
Tabelle 2
Beisp. Nr. Metallchlorid Art Verwendete Menge Reaktion (ºC/Tage) Isolationsausbeute von α-APM·HCl* Lithiumchlorid Kaliumchlorid Natriumchlorid * Bezogen auf L-Aspartyl-L-phenylalanin
Beispiel 17:
-
In ein Medium, das aus 30 g konzentrierter Schwefelsäure, 97,8 g
Wasser und 9,6 g Methanol zusammengesetzt war, wurden bei 50-55ºC
über etwa 30 Minuten 38,5 g
N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin, das 20 Gew.-% N-Formyl-β-L-aspartyl-L-phenylalanin
enthielt, eingegeben, woraufhin eine Reaktion bei 50-60ºC
über zusätzliche zwei Stunden folgte, um die Formylgruppe zu
entfernen. Das Reaktionsgemisch wurde dann abgekühlt und
nach einer Zugabe von 23,0 g wasserfreiem Magnesiumchlorid
wurden die Inhalte bei 30-35ºC sechs Tage umgesetzt. Das
Reaktionsgemisch wurde auf 20ºC abgekühlt und so ausgefällte
Kristalle wurden durch Filtrieren aufgesammelt, um α-APM
Hydrochlorid zu erhalten. Als ein Ergebnis einer Analyse
durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wurde
gefunden, daß das Hydrochlorid 21,9 g α-APM enthielt (umgewandelt
in seine freie Form). Ausbeute: 74,4% (bezogen auf
N-Formylα-L-aspartyl-L-phenylalanin).
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Es sei bemerkt, daß Verbindungen, die von dem ß-Isomeren
abgeleitet waren, kaum in dem so erhaltenen Kuchen enthalten
waren.