DD300232A5

DD300232A5 - Verfahren zur Herstellung von Alpha-L-Aspartylphenylananin-Methylester-Hydrochlorid durch Verwendung isolierter N-Formyl-L-Asparagin-Anhydride

Info

Publication number: DD300232A5
Application number: DD343152A
Authority: DD
Original assignee: Nutrasweet Co
Priority date: 1988-07-14
Filing date: 1990-07-30
Publication date: 1992-05-27
Also published as: CZ283231B6; CN1035183C; GR3018046T3; ES2079402T3; HU210688B; ZA905687B; EP0466963B1; KR920702341A; AU6182090A; EP0466963A1; ATE130010T1; CA2021180C; DK0466963T3; CN1058783A; HU904906D0; US4946988A; HUT59658A; JPH05500364A; CA2021180A1; RO108865B1

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung von a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid (a-APM(HCl) ). a-APM(HCl) ist ein Zwischenprodukt bei der Herstellung von Aspartam.{Alpha-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid; Zwischenprodukt fuer Aspartam}

Description

Dh vorliegende Erfindung betrifft nine Methode zur Herstellung von Alpha(a)-L-Aspartyl-L-

phenylalaninmethylesterhydrochlorid (a-APM(HCI)), das für die Herstellung von a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (a-APM (verwendet wird, einem Süßstoff mit etwa der 200fachen Süßkraft von Saccharose. Die Wirksamkeit dieser Verbindung, eines Dipeptide, ermöglicht es, Speisen und Getränke mit wesentlich geringeren Mengen als den dafür erforderlichen Zuckermengen zu süßen. Infolgedessen konnten Millionen von Verbrauchern ihre Kalorienaufnahme reduzieren, ohne dabei auf Süßes im Leben verzichten zu müssen. Die Verbindung weist auch nicht den unangenehmen Nachgeschmack auf, der von anderen Süßstoffen, z. B. Saccharin und Cyclamat, bekannt ist. Überdies bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Methode zur Erhöhung des a/ß-Verhältnisses von APM(HCI) sowie auf Methoden zur Herstellung eines Reaktionsgemisches von N-Formyl-a-L-aspartyl-L-phenylalanin (FAP) mit rührbarer Viskosität.

a-APM ist nicht neu und wurde in US-Patent 3,492,131 für Schlatter 1970 beschrieben. Seitdem sind zahlreiche weitere Patente, die andere Herstellungsverfahren und verwandte Verbindungen zum Gegenstand haben, erteilt worden, und es wurde viel über die Auswirkungen des Dipeptids auf die Erzeugung kalorienarmer Süßstoffe geschrieben. Bis jetzt jedoch erfordern die Herstellungsmethoden aufwendige Abtrennungs- und Wiedergewinnungsprozesse, deren Kosten folglich vom Verbraucher zu tragen sind. Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine Herstellungsmethode mit dem Betriebskomfort eines Eingefäßverfahrens und einer höheren Ausbeute des gewünschten Endproduktes.

a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylestor ist ein Dipeptid, das irr. wesentlichen aus zwei Aminosguren, L-Asparaginsäure und L-Phenylalanin, besteht. Es ist seit längerem bekannt, daß die Süßkraft des Dipeptids von der Stereochemie dieser einzelnen Aminosäuren abhängt. Jede dieser Aminosäuren kann entweder in Rechts- oder Linksform vorliegen, und es wurde festgestellt, daß die L-Aspartyl-L-phenylalaninester im Gegensatz zu den entsprechenden D-D-, D-L- und L-D-Isomeren süß sind. Kombinationen der Isomere, die das L-L-Dipeptid, D-Aspartyl-L-phenylalanin, L-Aspartyl DL-pheny !alanin und DL-Aspartyl-DL-phenylalanin enthalten, sind süß, aber nur halb so süß, da das Racemat die Hälfte der L-L-Anteile enthält. Das Dipeptid wird durch eine Additionsreaktion hergestellt, wobei L-Asparaginsäure mit L-Phenylalanin oder seinem Methylester verknüpft wird. Diese Additionsreaktion erfordert eine an die Asparaginsäurekomponente angelagerte Aminoschutzgruppe, z. B. Formyl, Acetyl, Acetoacetyl, Benzyl, substituiertes und nichtsubstituiertes Carbobenzoxy, t-Butoxycarbonyl und Hydrohalogenidsalz. Die Aminoschutzgruppe, in der Fachwelt oft als N-Schutzgruppe bezeichnet, wird zum Zwecke dieser Darlegung N-Formyl genannt, da die Formylkomponente in der vorliegenden Erfindung das Sperrmittal ist. N-Formyl-asparaginsäureanhydrid wird häufig als Ausgangsmaterial verwendet, dessen Herstellung ausführlich beschrieben WLfde (s. US-Patent 4,173,562).

Die Gewinnung von isoliertem N-Formyl-asparaginsäureanhydrid hat jedoch zu relativ geringer Ausbeute geführt, wenn ein großer Überschuß von Methansäure als Lösungsmittel verwendet wird. Ein zweifacher Überschuß an Methansäure erfordert z. B. die Zugabe von Toluen oder anderen Lösungsmitt >j|n, um die Anhydridlöslichkeit zu senken, wozu umfangreiche Schritte zur Lösungsmittelrückgewinnung notwendig sind.

Die Additionsreaktion findet in einem Lösungsmittel statt und stellt bei verschiedenen patentierten Prozessen für die Erzeugung von a-L-Aspariyl-L-phenylalaninmethylester (a-APM) einen gemeinsamen Schritt dar; s. US-Patent 3,962,207 für Uchiyama, US-Patent 4,173,562 für Bachmann und EPO-Patent 127,411 für Yaichi u.a., auf die alle hierin Bezug genommen wird. Bei der Additionsreaktion der beiden Aminosäuren entstehen als Zwischenprodukt zwei Isomere, deren Stereochernie letztendlich die Süßkraft des betreffenden Moleküls bestimmt. Das Alpha(a)-Isomer ist das gewünschte Produkt, da isolierte Fraktionen reinen a-APM etwa die 130-200fache Süßkraft von Zucker besitzen. Die Beta(ß)-Isomer-Fraktion hingegen besitzt nicht diese Süßkraft. Die Erfindung hat das Ziel, die Herstellung von a-APM(HCI) zu verbessern, wodurch die Produktionskosten gesenkt und die Ausbeute an α-Isomer, dem gewünschten Endprodukt, erhöht werden sollen. Die α- und ß-lsomere von APM sind nachstehend aufgeführt:

Alpha-Isomer

COjCH₃

Beta-Isomer	H	COjCH₃
COj		I
I	CONH-C-H
HjN-C-H	I
I	CH₂-
CHj

CONH-C-H

H₂N-C-H CH₂- 0

I CH₂

I CO₂H

Es zeigte sich, daß die Bildung von α- und Q-Isomeren und ihre entsprechenden Verhältnisse aus der Additionsreaktion davon abhängt, welches Lösungsmittel für die Reaktion verwendet wird, bei welcher Temperatur die Reaktion stattfindet und welche Menge Lösungsmittel eingesetzt wird. Gemäß US-Patent 4,173,562 für Bachmann, ist ein a/ß-lsomeren-Verhältnis von 75:25 erreichbar, wenn als Lösungsmitte! Ethansäure in der Additionsreaktion bei 50°C verwendet wird.

Das Molverhältnis von Ethansäure zu Phenylalanin muß mindestens 10:1 betragen. Das a/ß-lsomeren-Verhältnis fällt deutlich auf 69/31 ab, wenn das Molverhältnis Ethansäure/L-Phenylalanin auf 6:1 zurückgeht. Die vorliegende Erfindung zeigt, daß das a/ß-Verhältnis auf etwa 80/20 erhöht werden kann, wenn die als Lösungsmittel in der Additionsreakticn verwendete Ethansäure partioll durch einen Alkylester, einen gehinderten Alkohol oder eine entsprechende Mischung ersetzt wird. In dieser Darlegung der bedeutet der hier verwendete gehinderte Alkohol entweder einen sekundären oder einen tertiären Alkohol.

Ein mit der Verwendung dieser Lösungsmittel bei diesem Verfahren in Zusammenhang stehendes Problem liegt darin, daß sich nach einer Reaktionszeit von 0,5-3 Stunden das Reaktionsgemisch verfestigt und äußerst schwierig zu rühren, einzudicken, zu deformylieren oder aus dem Reaktor zu entfernen ist. Aus mindestens zwei Gründen ist ein rührbares System notwendig. Erstens wird durch das Rühren gesichert, daß die Reaktanten vollständig umgesetzt werden. Zweiten? muß Lösungsmittel später durch Destillation entfernt werden.

Ein weiteres Problem auf diesem Gebiet besteht bisher darin, daß bei einigen Technologien 25% des a-APM oder mehr verlorengeht, weil es in der ursprünglichen Reaktionslösung verbleibt; s. US-Patent 4,173,562. Ein weiteres Problem bei dem erwähnten Patent besteht darin, daß N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid aus einem Reaktionsgemisch von Asparaginsäure, einem großen Überschuß an Methansäure und Ethansäureanhydrid hergestellt wird. Die überschüssige Methansäure muß später durch Destillation entfernt und von der Ethansäure separiert werden, was die Kosten für das Endprodukt erhöht. US-Patent 3,962,207 beschreibt ein ähnliches Verfahren, bei dem L-Asparaginsäureanhydridhydrochlorid mit L-Phenylalaninmethy!ester verknüpft wird. Bei dem erwähnten Prozeß besteht ein Problem darin, daß eine große Menge L-Phenylalaninmethylester notwendig ist, was die Kosten des Verfahrens erhöht. Weiterhin führt dies zur Bildung beträchtlicher Mengen von Tripeptiden, die entfernt werden müssen, wozu teure und aufwendige Trennverfahren erforderlich ist. Bei der vorliegenden Erfindung besteht diese Notwendigkeit nicht.

U.S. Serial No. 156,268 beschreibt ein Eingefäßverfahren für die Herstellung von a-APM, wo die bei der Bildung von formyliertem L-Asparaginsäureanhydrid entstehenden Nebenprodukte auch als Lösungsmittel für die Additionsreaktion mit L-Phenylalanin dienen.

Darstellung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von a-APM(HCI). In diesem Verfahren wird N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid gebildet und vor der Verknüpfung mit L-Phenylalanin von den Nebenprodukten der Reaktion isoliert. Die Isolierung wird beendet, indem das N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid filtriert wird, um überschüssige Methansäure zu entfernen. Da die verwendete Menge Methansäure minimal ist, sind zusätzliche Lösungsmittel zur Minderung der Löslichkeit von N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid nicht erforderlich. Höhere Ausbeuten an a-APM(HCI) sind durch die Verwendung von isoliertem N-Formyl-L-asparaginsureanhydrid möglich. Eine Verdünnung der Additionsreaktion mit einem Ester oder gehinderten Alkohol ist für die Verbesserung der Ausbeute an a-APM(HCI) in diesem Fall ebenfalls ein wirksames Mittel. Zunächst wird N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid erzeugt, indem in einem Reaktionsvorgang, der dem in der Fachwelt bekannten ähnlich ist, Asparaginsäure mit Ethansäureanhydrid und Methansäure eine Verbindung eingeht (s. US-Patent Nr.3,933,7G1; 3,962,207 und 4,173,562). Erfindungsgemäß wird jedoch nur eine geringe Menge Methansäure verwendet (1,33-1,35 Moläquivalente pro Mol Asparagin-di-säure), wobei die überschüssige Methansäure durch verschiedene Verfahren, z. B. Filtration oder Zentrifugieren, entfernt worden kann.

Das N-Formyl-Asparaginsäureanhydrid kann dann in Ethansäure suspendiert oder gelöst werden und mit L-Phenylalanin (L-Phe) verknüpft werden. Wahlweise wird ein Alkylester oder gehinderter Alkohol der Additionsreaktion zugesetzt, wodurch das a/ß-Verhältnis positiv beeinflußt wird. Während ein Ester normalerweise durch Reaktion eines Alkohols mit einem Anhydrid hergestellt wird, greift der gehinderte Alkohol das N-Formyl-asparaginsäureanhydrid bei der Reaktion unerwarteterweise nicht an. Ethansäure wird ebenfalls als Lösungsmittel für die Reaktion zugesetzt. Diese Additionsreaktion kann mit wenig oder ohne Rühren durchgeführt werden, um die Viskosität des Reaktionsgemisches geringzuhalten und zu einem rührbaren Endreaktionsgemisch zu kommen.

Das entstehende Dipeptid wird dann durch Destillation und Deformylierung mit HCI konzentriert und durch Angleichung der Konzentrationen von Methanol, Wasser und HCI an Mengen, die für eine hohe Ausbeute von a-APM(HCI) wirksam sind, verestert. Das a-APM(HCI) wird aus dem Reaktionsgemisch ausgefällt, zur Bildung von a-APM isoliert und mit einer Base neutralisiert.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit einem verbesserten Verfahren für die Herstellung von a-APM(HCI). Zunächst wird L-Asparaginsäure mit einer geringen Menge Methansäure (mindestens 1,33 Moläquivalente auf der Basis von Asparaginsäure) und Ethansäureanhydrid (mindestens etwa 2,0 Mol-äquivalente auf der Basis von Asparaginsäure) in Anwesenheit eines Katalysators, z.B. Magnesiumoxid, gemischt, was zur Bildung von N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid führt. Als Katalysator eignen sich u. a. Oxide, Hydroxide und Salze von Metallen, die in den US-Patenten 4,508,912 und 4,550,180 aufgeführt sind und auf die hier verwiesen wird. Diese Reaktion läuft bei einer Temperatur bis etwa 52⁰C ab. Bei etwa 50°C sollte das Gemisch mindestens etwa 2,5 Stunden lang, am besten jedoch etwa 6 Stunden lang gerührt werden. Die verwendete Menge Methansäure sollte 1,33-1,35 Moläquivalente auf der Basis von Asparaginsäure betragen.

Das Endreaktionsgemisch wird dann auf 10-20°C abgekühlt, der entstandene Feststoff wird isoliert. Die Isolierung wird durch Zentrifugieren oder Filtrieren und Auswaschen mit Ethansäure abgeschlossen. Das feste N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid wird isoliert, wobei möglicherweise Ethansäure im Gemisch verbleibt. Das isolierte Anhyrid wird einem Alkylester, einem gehinderten Alkohol oder einem geeigneten Gemisch aus beiden sowie zusätzlicher Ethansäure zugesetzt. Die sich bildende wird dann - möglichst in äquimolaren Mengen - mit L-Phenylalanin umgesetzt.

Es zeigte sich, daß der Alkylester und/oder der gehinderte Alkohol das a/ß-Verhältnis erhöhen, wenn bei den zugegebenen Mengen mindestens etwa 1,2 Mol einem Mol L-Phenylalanin entspricht. Das a/ß-Verhältnis wächst mit zunehmenden Mengen Ester oder Alkohol, bis die Molmenge von Ester, Alkohol oder Kombinationen aus beiden etwa das 4,7facho der Molmenge von L-Phenylalanin beträgt. Dann ist ein Sättigungswert erreicht, bei dem das Isomerenverhältnis unabhängig von der weiteren Zugabe von Ester oder Alkohol konstant bleibt.

Der für die Additionsreak'ion verwendete Alkylester sollte möglichst aus der Grupe Methylacetat, Ethylacetat, Isopropylacetat, n-Butylacetat und Isopropylformiat ausgewählt werden. Methylacetat (MeOAc) ist ein bevorzugter Alkylester. Bei Verwendung von Methylacetat sollte die zugegebene Menge - in Mol ausgedrückt - das 1,2- bis 4,/fache der L-Phenylalanin-Menge ausmachen. Zu den in Frage kommenden gehinderten Alkoholen gehören Isopropylalkohol und sekundärer oder tertiärer Butylalkohol. Isopropylalkohol Ist der bevorzugte gehinderte Alkohol. Dies sind die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wobei keinesfalls die Verwendung anderer Alkylester oder gehinderter Alkohole eingeschränkt oder der Anwendungsbereich der Erfindung begrenzt werden soll.

Die Additionsr6aklion wird dann durchgeführt, indem das erwähnte Gemisch etwa 4-6 Stunden bei einer Temperatur von etwa 0°C-60°C, möglichst zwischen 15 und 40°C, gerührt wird. Ein Problem bei der Additionsreaktion besteht darin, daß mit Bildung von N-Formyl-L-aspartyl-L-phonylalanin das Gemisch bzw. die Trübe sich allmählich verfestigt, d.h. an Viskosität zunimmt, bis das Rühren äußerst schwierig oder gar unmöglich wird. Eine derart hochgradige Viskosität macht das Rühren sehr schwierig und hemmt den Wärmeaustausch, was die unten beschriebene Destillation von Ethansäure, Estern und/oder gehindertem Alkohol verhindert. Es zeigte sich, daß die kurz vor oder während der Additionsreaktion zugesetzte Ethansäure das Festwerden verhindert, d. h. die Viskosität senkt. Dies ist wichtig, da das Mischen das vollständige Umsetzen sichert. Säure und Ester müssen überdies durch Destillation vor der Deformylierung aus dem Gemisch entfernt werden. Das Reaktionsgemisch muß rührbar sein, um die Reaktion effektiv zu beenden.

Die Menge der zugesetzten Ethansäure hängt von der Menge des synthetisierten N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrids ab. Wenn das N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid durch Filtration in Anwesenheit von Ethansäure isoliert wird, kann bereits etwas Ethansäure vorliegen. Die Gesamtmenge von Ethansäure im System sollte -- in Mol ausgedrückt - etwa das 6- bis 16fache von L-Phenylalanin, möglichst aber das 11,1fache von L-Phenylalanin betragen. Es ist dabei nicht erforderlich, Ethansäure in einer Menge zuzusetzen, die das 11,1fache des zugesetzten L-Phenylalanin baträgt. Ausreichend ist eine geringere Menge, bei der die Gesamtmolmenge der im System vorhandenen Ethansäure etwa das 11,1-fache von L-Phenylai<ii;in beträgt. Ein weiterer einmaliger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Herabsetzung der Viskosität des Additionsreaktionsgemisches durch gesteuertes Rühren desselben. Es zeigte sich, daß die Viskosität des Additionsreaktionsgemisches drastisch abnimmt, wenn während der Additionsreaktion das Rührgerät angehalten oder seine Laufgeschwindigkeit verlangsamt wird. In einem großen Reaktor (Durchmesser 10 Fuß [3,04 m]), der mit einem mechanischen Rührwerk mit 5Fuß [1,52m] langen Schaufeln versehen ist, reduziert sehr langsames Rühren (z.B. 5-40Umdrehungen pro Minute) und periodisches Rühren (z. B. kurzzeitiges Laufen des Rührwerks alle 5-15 Minuten) im Vergleich zu Reaktionen bei einer Rührwerksgeschwindigkeit von etwa 60 oder mehr Umdrehungen pro Minute (U/min) drastisch die Viskosität des Additionsreaktionsgemischs.

In Laborgefäßen (Rundkolben 4Zoll/101,6mm Durchmesser mit 3Zoll/7,62 mm langen Schaufeln) verursachen 200-300U/min ein sehr dickes Reaktionsgemisch, während Rühren bei 5-15U/min ein leicht rührbares niedrigviskoses Reaktiosngemisch ergibt. Auch wenn der Rührapparat etwa 1 Stunde nach Zugabe von L-Phe zum Reaktionsgemisch abgeschaltet und nach der Reaktion, d. h. nach etwa 6Stunden, wieder eingeschaltet wird, entsteht ein Reaktionsgemisch mit niedriger Viskosität. In einer großtechnischen Anlage jedoch dürfte es schwierig sein, nach Ruhepausen von einer Stunde den Rührapparat wieder in Gang zu setzen, weil sich ein Bodenkörper bildet und verfestigt. Deshalb sind langsames und periodisches Rühren vorzuziehen. Die hier verwendeten Begriffe „rührbar" odar „niedrigviskos" bedeuten - bezogen auf die Additionsreaktionsgemische - eine Flüssigkeit, die gerührt ode/ in ein Glas oder Reaktionsgefäß gegossen werden kann. Solche Flüssigkeiten haben im allgemeinen eine Viskosität unter etwa 15000 Centipoise (cp), zweckmäßigerweise zwischen 1000 und lOOOOcp, vorzugsweise jedoch zwischen 150 und 500 cp.

Die Rülirmittel sind für die Anwendung der vorliegenden Erfindung nicht entscheidend. Jedes Standardrührmittel ist einsetzbar, z.B. Edelgaseinspritzung, Schütteln, Schleudern des Reaktors, mechanische Rührwerke usw. Dabei sind mechanische Rührwerke vorzuziehen. Die genaue Konstruktion des Rührwerks ist ebenfalls nicht entscheidend. Sowohl bei Schaufel- als auch bei Blattrühren sollte die Rührgeschwindigkeit möglichst bei 5 bis etwa 40 U/min, vorzugsweise aber bei etwa 20U/min liegen. Da sich die Geschwindigkeit der Schaufelspitze in Meter pro Sekunde (m/sec) bei einer bestimmten Anzahl von Umdrehungen pro Minute in Abhängigkeit von der Schaufellänge ändert, erwies sich, daß die Angabe „Umdrehungen pro Minute" bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung die Geschwindigkeit des Rührwerks genauer angibt. Jede Rührgeschwindigkeit unter etwa 40 U/min ist für die Reduzierung der Viskosität des Reaktionsgemirches zulässig. Es sollte jedoch erwähnt werden, daß bei Laborgeräten (4-Zoll-/101,6mm/Kolben) eine Rührgeschwindigkeit von 40 bis 150 U/min ein rührbares Reaktionsgemisch ergibi. Die durch obige Erfindung hergestellten α- und ß-lsomere von N-Formyl-a-L-aspartyl-L-phenylalanin (α/β F-AP) können mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) analysiert werden, und dabei zeigt sich, daß diese Verfahren eine ungewöhnlich hohe a/ß-Ausbeute von etwa 79,5:20,5 ergeben.

Wahlweise werden Ethansäure und alle Ester (Methylacetat, Isopropylformiat usw.) oder gehinderter Alkohol vor der unten beschriebenen Deformylierung aus dem Reaktionsgemisch entfernt. Die Ethansäure und die Ester werden unter Vakuum bei etwa 381 bis 635mm Quecksilbersäule destilliert. Die Vakuumdestillation wird vor der Zugabe /on HCI zur Deformylierung von α/β F-AP durchgeführt. Ethansäure, Ester und/oder Alkohol werden zurückgewonnen und zur Verwendung für die nachfolgenden Additionsreaktionen in den Kreislauf zurückgeführt.

Die α- und ß-lsomere von N-Formyl-L-aspartyl-L-pehnylalanin werden dann deformyliert. Chlorwasserstoffsäure und eventuell Methanol werden dem Isomerengemisch zugesetzt, um α/β F-AP zu deformylieren, wad zur Bildung von a/ß-AP führt. Üborchüssiges Methanol reagiert auch mit übriggebliebener Ethansäure und Methansäure im Reaktionsgemiscrvund bildet Methylacetat und Methylformiat, die wesentlich niedrigere Siedepunkte als Ethansäure oder Methansäure haben und desha.b durch Destillation bei niedrigeren Temperaturen aus dem System entfernt werden können.

Das entstandene Gemisch aus a/ß-AP und verschiedenen Methylestern wird dann durch Einstellung der Konzentration von HCI, Methanol und Wasser auf Mengen, die für eine hohe Ausbeute an Q-APM(HCI) ausreichen, verestert. Die Methanolkonzentration sollte 1 bis 10Ma.-%, möglichst jedoch 3 bis 5 Ma.-% betragen. Die HCI-Konzentration sollte 9 bis etwa 18Ma.-%, möglichst etwa 12,5 bis etwa 14,5Ma.-% betragen. Die Wasserkonzentration sollte etwa 32 bis 50 Ma.-%, möglichst jedoch 37 bis etwa 42 Ma.-% betragen. Nach entsprechender Einstellung der Konzentrationen von Wasser, HCI und Methanol wird das Reaktionsgemisch vorsichtig bei einer Temperatur unter etwa 35⁰C und möglichst bei Umgebungstemperatur (20-30°C) gerührt. Die Veresterung ist nach etwa 4 bis 10Tagen, meist nach 6Tagen, abgeschlossen.

Das entstandene Hydrochloridsalz von a-L-Aspartyt-L-phenyl-alaninmethylester (a-APM(HCI)) ist dann leicht vcm ß-lsomer zu trennen, da a-APM HCI 2H₂O in wäßrigen Lösungen eine peringere Löslichkeit als ß-APM(HCI) aufweist (s. US-Patent Nr. 3,798,207 für Ariyoshi). Das α-Isomer fällt aus der Lösung aus und wird durch Filtrieren, Zentrifugieren, Dekantieren oder ein anderes herkömmliches Verfahren separiert.

a-APM(HCI) wird dann mit einer Base neutralisiert und bildet APM, das dann durch die auf diesem Gebiet bekannten Kristallisationsverfahren wiedergewonnen wird.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung veranschaulichen. Sie haben lediglich erklärenden Charakter und sollen in keiner Weise durch die aufgeführten Einzelheiten den Grundgedanken und den Anwendungsbereich der Erfindung einengen. Fachleuten au' diesem Gebiet erschließen sich durch diese Darlogung die Materialien und Methoden.

Beispiel 1

Magnesiumoxid (0,121 g; 0,003mol) wurde in 19,3g (0,4mol) 95%iger Methansäure unter Stickstoff gelöst. Danach wurde Ethansäureanhydi id (69,3g; 0,655 mol) der Lösung zugesetzt und 10-15 Minuten gerührt. Die Temperatur des Gemisch stieg auf 4O⁰C L-Asparaginsäure (39,93g; 0,30 mol) wurde dem Gemisch zugesetzt und die entstandene Trübe etwa 6Stunden bei etwa 5O⁰C gerührt. Dabei wurde N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid gebildet, wie mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) nachgewiesen wurde. Das Gemisch wurde dann filtriert und mit 30g Ethansäure gewaschen, um das N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid zu isolieren. Die Ausbeute von N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid aus !--!.'-Asparaginsäure betrug 80%. Das N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid enthält etwas Ethansäure, die als Lösungsmittel beim Additionsprozeß verbleibt. Methvlacetat (46,35g; 49,8ml) und Ethansäure (159,8g; 152,1 ml) w rden dem N-Forrnyl-L-asparaginsäureanhydrid (41,1 g; einschließlich 4,36g Ethansäure) zugesetzt. L-Phenylalanin (39,65g; 0,24mol) wurde obigem Gemisch zugegeben und etwa 5Stunden bei etwa 25⁰C gerührt. Die HPLC-Analyse wies in N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin etwa 78% α-Isomer und etwa 22% ß-lsomer nach. Das Gemisch wurde unter einem Vakuum von 508mm Quecksilbersäule bei 60-73⁹C destilliert, um 120ml Lösungsmittel zu entfernen. N-Formyl-aspartyl-L-phenylalanin wurde Methanol (58,5ml) und 35%ige HCI (26,7 ml) zugesetzt, das Gemisch auf 60"C erhitzt und 30 Minuten gerührt. Um Methylformiat und Methylacetat zu entfernen, wurde das Gemisch bei atmosphärischem Druck und einer Temperatur von etwa 70-75⁰C destilliert. Unter Zugabe von weiteren 108 ml Methanol wurde die Destillation fortgesetzt. Die Destillation wurde bei atmosphärischem Druck solange durchgeführt, bis die Temperatur 85⁰C betrug; danach wurde ein Vakuum hergestellt, bis die Temperatur auf 30⁰C absank. Chlorwasserstoffsäure (32,4ml), Wasser (21,7ml) und Methanol (9ml) wurden zugesetzt, das Gemisch bei Zimmertemperatur (22°C-27°C) 6Tage lang gerührt, währenddessen sich Chlorwasserstoffsäuresalz des a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester bildete und ausfällte. Mit gesättiger Salzlösung (50ml) wurde das Produkt gewaschen. Das Produkt, weißes kristallines a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochloriddihydrat, wog 58,8g und enthielt 72Ma.-% a-L-Aspartyl-L-phenylalanin, eine 60%igo Ausbeute im Vergleich zur Ausgangsmenge von L-Phenylalanin.

Beispiel 2

N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid wurde durch Filtration und Auswaschen mit Ethansäure isoliert. Als Lösungsmittel wurden verschiedene Alkylester und gehinderte Alkohole in unterschiedlichen Mengen verwendet, um den Einfluß der Ester und Alkohole außer Methylacetat auf das a/ß-lsomeren-Verhältnis zu bestimmen. Die einzelnen Ester und Alkohole, die eingesetzten Mengen sowie das durch Verwendung jedes Lösungsmittels erzielte a/ß-lsomeren-Verhältnis sind in Tabelle 1 aufgeführt. N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid (28,6g; 0,20mol) wurde mit 100ml Ethansäuro und 0,90mol des entsprechenden Hilfslösungsmittels in Stickstoffatrnosphäre aufgeschlämmt.

Den betreffenden Reaktionsgemischen wurde L-Phenylalanin (33,04g; 0,20mol) zugesetzt und anschließend mit 20ml Ethansäure gespült. Jedes Gemisch wurde bei Zimmertemperatur (22°C-27°C) etwa 5Stunden lang gerührt. Mit fortschreitender Additionsreaktion wurden die Trüben dickflüssiger und voluminöser. Jede Trübe wurde dann etwa 1 Stunde bei etwa 5O⁰C gehalten, und eine Mischung aus Methanol und Wasser im Verhältnis 10:1 wurde zugesetzt, bis sich alle Feststoffe gelöst hatten. Jedes Gemisch wurde gewogen, 1 g aliquote Teile abgenommen und durch HPLC analysiert. Die bei jedem Lösungsmittel entstandene a/ß-Verhältnisse sind aus Tabelle 1 ersichtlich.

Tabelle 1

Lösungsmittel	Menge	Alpha/Beta-Verhältnis
Methylacetat	71,5ml	79:21
Ethylacetat	88,0ml	80:20
Isopropylacetat	105,5 ml	81:19
n-Butylacetat	118,5 ml	81:19
Methylfcrmiat	55,5 ml*}.	76:24
Isopropylformiat	71,0ml	78:22
Isopropylalkohol	69,0 ml	77:23
sec-Butylalkohol	82,5ml	78:22
tert-Butylalkohol	85,0 ml	79:21
Ethansäure, allein	51,5ml	76:24

Beispiel 3

N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid wurde nach dem in Beispiel 1 do gelegten Verfahren hergestellt und aus dem Anfangsreaktionsgemisch durch Filtration und Waschen mit Ethansäure isoliert. 13,3g (0,1 mol) N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid wurden mit 34,41 g (0,405mol) Methylacetat und anschließend mit 14,57g (0,09mol) L-Phenylalanin versetzt. Nach etwa dreistündigem Rühren blieb die Trübe über Nacht bei Zimmertemperatur (20°C-25°C) stehen. Das entstandene Gemisch wurde in einer Mischung von Methanol und Wasser im Verhältnis von 9:1 gelöst. Das a/ß-lsomeren-Verhältnis von N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin betrug nach HPLC 80:20.

Claims

1. Methode zur Herstellung von a-APM-Hydrochlorid, < adurch gekennzeichnet, daß folgende Schritte erfolgen:

(a) Formylierung von L-Asparaginsäure in einem aus Methansäure und Ethansäureanhydrid bestehenden Reaktionsgemisch zu N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid;

(b) Isolierung des N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrids;

(c) Verbindung des N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrids mit L-Phenylalanin bei einer effektiven Temperatur zu c^ß-N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-lsomeren;

(d) Deformylierung der erwähnten Isomere durch Zusatz einer effektiven Menge Chlorwasserstoffsäure;

(e) Entfernen der restlichen Ethansäure und Methansäure aus dem Reaktionsgemisch;

(f) Veresterung der deformylierten Isomere durch Zusatz effektiver Menge Methanol, Wasser und Chlorwasserstoffsäure zum Reaktionsgemisch zu α- und ß-APM-Hydrochlorid, aus dem das a-APM-Hydrochlorid ausfällt und

(g) Isolierung des a-APM-Hydrochlorids.

2. Die Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (c) in Anwesenheit einer zugesetzten Menge Ethansäure durchgeführt wird, die für die Reduzierung der Viskosität besagten Reaktionsgemisches bis zum Erreichen seiner Rührbarkeit ausreicht.

3. Die Methode nach Anspruch 2, cJadurch gekennzeichnet, daß der Additionsschritt in Anwesenheit einer geeigneten Menge eines Alkylesters, eines gehinderten Alkohols oder eines entsprechenden Gemisches durchgeführt wird. I

4. Die Methode nach Anspruch 1,2, oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Additionsschritt (c) außerdem die Vakuumdestillation von im Reaktionsgemisch vorliegender Ethansäure, gehindertem Alkohol und Estern, die vor dem Deformylierungsschritt im Reaktionsgemisch vorliegen (d), umfaßt; daß der Deformylierungsschritt (d) weiterhin die Zugabe einer Menge Methanol zur Veresterung von Methansäure und Ethansäure im Reaktionsgemisch umfaßt; und Schritt (e) die Entfernung des entstandenen Methylacetats und Methylformiats umfaßt.

5. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung (e) durch atmosphärische Destillation erfolgt.

6. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung (e) durch Vakuumdestillation erfolgt.

7. Die Methode nach Anspruch 4, die weiterhin die Neutralisierung des isolierten a-APM-Hydrochlorids mit einer Base zu APM umfaßt.

8. Die Methode aus Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte vorliegende Molmenge der Ethansäure mindestens das Sfache der Molmenge von L-Phenylalanin beträgt.

9. Die Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte vorliegende Molmenge der Ethansäure etwa das 11fache der Molmenge von L-Phenylalanin beträgt.

10. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die bei Schritt (c) zugesetzte Molmenge des Alkylesters mindestens das 1,2fache der Molmenge von L-Phenylülanin beträgt.

11. Die Methode nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylester Methylacetat, Ethylacetat, Isopropylacetat, n-Butylacetat, Iscpropylformiat oder ein entsprechendes Gemisch ist.

12. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die bei Schritt (c) zugesetzte Molmenge an gehindertem Alkohol mindestens das 1,2fache der Molmenge von L-Phenylalanin beträgt.

13. Die Methode nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der gehinderte Alkohol Isopropylalkohol, sekundärer Butylalkohol, tertiärer Butylalkohol oder ein entsprechendes Gemisch ist.

14. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die bei Schritt (c) zugesetzte Molmenge des Gemischs von Alkylester und gehindertem Alkohol mindestens das 1,2f,ache der Molmenge von L-Phenylalanin beträgt.

15. Die Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Additionsschritt (c) ohne Umrühren erfolgt.

16. Die Methode aus Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß beim Additionsschritt (c) solange gerührt wird, bis ein rührbares Endreaktionsgemisch entsteht.

17. Die Methode nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Umrühren mit einem mechanischen Rührwerk erfolgt.

18. Die Methode nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das mechanische Rührwerk mit einer Umdrehungszahl unter 40U/min betrieben wird.

19. Die Methode nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das mechanische Rührwerk während der gesamten Reaktion periodisch betrieben wird.

20. Die Methode nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Umrühren besteht aus:

(a) kräftigem Rühren etwa eine halbe Stunde lang nach der Zugabe von L-Phenylalanin, und

(b) anschließendem langsamen oder periodischen Rühren.

21. Die Methode nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Rühren mit einem mechanischen Rührwerk erfolgt und:

(a) kräftiges Rühren bei einer Rührwerksgeschwindigkeit von etwa 60 U/min,

(b) langsames Rühren bei einer Rührwerksgeschwindigkeit von etwa 20U/min und

(c) periodisches Rühren bei Betrieb des Rührwerks für jeweils mindestens 1 Minute nach jeweils 15 Minuten erfolgt.

22. Eine Methode zur Herstellung von N-Formyl-L-asparagisäureanhydrid, das im wesentlichen von Nebenprodukten für die Verwendung zur Herstellung von a-APM-Hydrochlorid isoliert wurde, wobei besagte Methode, dadurch gekennzeichnet ist, daß sie folgende Schritte umfaßt: Formylierjng von L-Asparaginsäure in einem aus Ethansäureanhydrid und einer Menge Methansäure bestehenden Reaktionsgemisch zu N-Formylasparaginsäureanhydrid, sowie Isolierung des N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrids ohne Zugabe von Lösungsmitteln.

23. Die Methode nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Methansäure nicht 1,35 Moläquivalente pro Mol L-Asparaginsäure überschreitet.

24. Eine Methode zur Herstellung von a-APM-Hydrochlorid, dadurch gekennzeichnet, daß sie einschließt:

(a) Formylierung von L-Asparaginsäure in einem ersten Reaktionsgemisch aus Methansäure und Ethansäureanhydrid zu N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid;

(b) Isolierung des N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrids;

(c) Verknüpfung des N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrids mit L-Phenylalanin in Gegenwart von (i) Ethansäure und (ii) einer geeigneten Menge eines Alkylesters, eines gehinderten Alkohols oder eines entsprechenden Gemische bei einer Temperatur von etwa 5⁰C bis etwa 4O⁰C zu a,ß-l\'-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-lsomeren;

(d) Vakuumdestillation von Ethansäure und Methylacetat aus dem Reaktionsgemisch;

(e) Deformylierung besagter Isomere durch Zugabe wirksamer Mengen von HCI und Methanol;

(f) Vakuumdestillation von Methansäure und Ethansäure aus dem Reaktionsgemisch;

(g) Veresterung der deformylierten Isomere zu α,β-APM-Hydrochlorid durch Zusatz effektiver Mengen von Methanol und HCI zum Reaktionsgemisch, wobei a-APM-Hydrochlorid ausfällt; und

(h) Isolierung von a-APM-Hydrochlorid.

25. Die Methode nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß (1) das Molverhältnis von Ethansäure zu L-Phenylalanin mindestens etwa 11:1 beträgt, und (2) Methanol der Reaktion während der Vakuumdestillation (f) in Mengen zugesetzt wird, die die Entfernung von Ethansäure und Methansaure durch Bildung entsprechender Methylester begünstigen.

26. Die Methocö nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von gehindertem Alkohol, Alkylester oder entsprechenden Gemischen zu L-Phenylalanin mindestens etwa 1,2:1 beträgt.

27. Die Methode nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylester entweder Methylacetat, Ethylacetat, Isopropylacetat, n-Butylacetat, Isopropylformiat oder entsprechende Gemische darstellt.

28. Die Methode nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der gehinderte Alkohol entweder Isopropylalkohol, sekundärer Butylalkohol, tertiärer Butylafkohol oder entsprechende Gemische darstellt.

29. Die Methode nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Additionsschritt (c) unter solchen Rührbedingungen erfolgt, daß ein rührbares Endreaktionsgemisch entsteht.

30. Die Methode nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Rühren mit einem mechanischen Rührwerk bei einer Geschwindigkeit unter etwa 30U/min durchgeführt wird.