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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen
von N-geschütztem α-L-Aspartyl-L-phenylalanin.
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α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester (Aspartam) ist als
ausgezeichnetes Süßmittel bekannt, und es sind verschiedene
Verfahren zu seiner Herstellung vorgeschlagen worden. Da jedoch
α-L-Aspartyl-D-phenylalanin-methylester, der sein Diastereomer
ist, keine Süßkraft besitzt, ist bisher über keinen Versuch
berichtet worden, bei der Herstellung von Aspartam und seinen
verwandten Verbindungen D,L-Phenylalanin als
Phenylalaninkomponente zu verwenden. Bei den bekannten Verfahren, beispielsweise
bei dem Verfahren zur Herstellung von N-Formyl-α-L-aspartyl-L-
phenylalanin durch Kondensation von
N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid und Phenylalanin in Essigsäure (US-Patent 3,933,781)
oder in einem alkalischen wäßrigen Medium (EP-A-0 186 378),
wird L-Phenylalanin als Phenylalaninkomponente verwendet.
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Wenn es möglich gemacht wird, D,L-Phenylalanin, das weniger
teuer ist als L-Phenylalanin, für die Herstellung von Aspartam
zu verwenden, wird das Herstellungsverfahren bei der
industriellen Anwendung viel vorteilhafter, da es unnötig wird,
L-Phenylalanin durch optische Trennung von D,L-Phenylalanin oder in
einem komplizierten Verfahren durch asymmetrische Synthese zu
erhalten. Wenn jedoch D,L-Phenylalanin mit beispielsweise N-
geschütztem L-Asparaginsäureanhydrid kondensiert wird, werden
neben dem angestrebten N-geschützten
α-L-Aspartyl-L-phenylalanin (1) drei weitere Isomere, nämlich N-geschütztes α-L-
Aspartyl-D-phenylalanin (2), N-geschütztes β-L-Aspartyl-L-
phenylalanin (3) und N-geschütztes β-L-Aspartyl-D-phenylalanin
(4) erzeugt, wie durch die folgenden chemischen Formeln gezeigt
wird:
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Wenn es möglich wird, das angestrebte N-geschützte
α-L-Aspartyl-L-phenylalanin für sich allein aus einem Gemisch der vier
Isomeren abzutrennen, kann die abgetrennte Verbindung (1) durch
ein Verfahren in α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester
umgewandelt werden, das die Deformylierung in einer
Methanol/Chlorwasserstoffsäure-Lösung und die anschließende
Veresterung (US-Patent 3,933,781) in dem Fall umfaßt, in dem die
Schutzgruppe eine Formylgruppe ist, und somit kann ein
industriell vorteilhaftes Aspartam-Herstellungsverfahren geschaffen
werden.
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Wie jedoch vorstehend erwähnt, gibt es bislang weder
irgendeinen Bericht über die Verwendung von D,L-Phenylalanin für die
Herstellung von Aspartam und seine verwandten Verbindungen noch
sind irgendwelche Daten über die Eigenschaften, insbesondere
die Löslichkeit, von N-geschütztem α-L-Aspartyl-D-phenylalanin
und N-geschütztem β-L-Aspartyl-D-phenylalanin, die durch
Kondensation von N-geschütztem L-Asparaginsäureanhydrid und D-
Phenylalanin erzeugt werden, verfügbar, und deshalb gibt es
bislang noch kein industrielles Verfahren zur selektiven
Abtrennung des gewünschten N-geschützten
α-L-Aspartyl-L-phenylalanins aus dem Gemisch der vier Isomeren.
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Gemäß dem Stand der Technik ist die Entfernung des β-Isomeren
(N-geschütztes β-L-Aspartyl-L-phenylalanin), das als
Nebenprodukt gebildet wird, wenn N-geschütztes L-Asparaginsäureanhydrid
und L-Phenylalanin umgesetzt werden, beispielsweise in dem
Fall, in dem die Schutzgruppe eine Formylgruppe war, durch
separates Ausfällen des angestrebten N-Formyl-α-L-aspartyl-L-
phenylalanins aus einer Essigsäurelösung (US-Patent 3,933,781)
oder aus einer wäßrigen Lösung (EP-A-0 186 378) durchgeführt
worden, wobei N-Formyl-β-L-aspartyl-L-phenylalanin in der
Mutterlauge zurückbleibt. Diese Entfernung des β-Isomeren beruht
darauf, daß das α-Isomere in größerer Menge gebildet wird und
eine geringere Löslichkeit besitzt als das β-Isomere. Was die
gebildete Menge angeht, so beträgt bei diesen Verfahren die des
N-Formyl-β- L-aspartyl-L-phenylalanins nur etwa 1/3 bis 1/4 der
Menge des N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanins.
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In EP-A-0 149 263 ist auch die Abtrennung des α-L-Aspartyl-L-
phenylalanin-methylesters von
α-L-Aspartyl-D-phenylalaninmethylester durch selektive Kristallisation aus Wasser, aus
Alkohol oder aus wäßrig-alkoholischen Gemischen beschrieben.
EP-A-0 149 263 offenbart auch die Abtrennung von N-geschütztem
α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester von N-geschütztem α-L-
Aspartyl-D-phenylalanin-methylester durch selektive
Kristallisation und die Abtrennung von
α-L-Aspartyl-β-chlor-D,L-phenylalanin-methylester von β-L-Aspartyl-β-chlor-D,
L-phenylalanin-methylester durch selektive Kristallisation. EP-A-0 149
263 schlägt jedoch nicht die Herstellung von α-L-Aspartyl-L-
phenylalanin-methylester ausgehend von D,L-Phenylalanin unter
Anwendung der selektiven Kristallisation vor.
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Im Falle der Verwendung von D,L-Phenylalanin ist die Menge des
gebildeten N-geschützten α-L-Aspartyl-D-phenylalanins fast
gleich groß wie die des N-geschützten
α-L-Aspartyl-L-phenylalanins, so daß die Entfernung dieses Isomeren das größte
Problem darstellt.
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Als Ergebnis von Untersuchungen zur Lösung dieses Problems
wurde erfindungsgemäß gefunden, daß N-geschütztes
α-L-Aspartyl-L-phenylalanin in essigsauren Lösungsmitteln oder wäßrigen
Lösungsmitteln weniger löslich ist als N-geschütztes
α-L-Aspartyl-D-phenylalanin, so daß das erstere durch Kristallisation
für sich allein ausgefällt werden kann. Es wurde weiterhin
gefunden, daß, wenn N-geschütztes L-Asparaginsäureanhydrid und
D,L-phenylalanin in einem essigsauren Lösungsmittel oder einem
wäßrigen Lösungsmittel kondensiert werden, die Menge an
erzeugtem N-geschütztem β-L-Aspartyl-D-phenylalanin so gering wie die
an N-geschütztem β-L-Aspartyl-L-phenylalanin ist, und diese
beiden Nebenprodukte werden bei einem Kristallisationsvorgang
nicht ausgefällt, so daß es möglich ist, N-geschütztes α-L-
Aspartyl-L-phenylalanin für sich allein aus einem Gemisch der
vier Isomeren separat zu kristallisieren. Die vorliegende
Erfindung wurde auf der Basis dieser Erkenntnisse konzipiert.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Abtrennen von N-geschütztem α-L-Aspartyl-L-phenylalanin vorgesehen,
welches die selektive Kristallisation von N-geschütztem α-L-
Aspartyl-L-phenylalanin aus einer essigsauren Lösung von N-
geschütztem α-L-Aspartyl-L-phenylalanin umfaßt, die mindestens
N-geschütztes α-L-Aspartyl-D-phenylalanin als Verunreinigung
enthält, wobei die essigsaure Lösung eine Reaktionslösung ist,
die durch Kondensation von N-geschütztem
L-Asparaginsäureanhydrid und D,L-Phenylalanin in einem essigsauren Lösungsmittel
gebildet wurde.
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Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Verfahren zum
Abtrennen von N-geschütztem α-L-Aspartyl-L-phenylalanin vor, welches
die selektive Kristallisation von N-geschütztem α-L-Aspartyl-L-
phenylalanin aus einer wäßrigen Lösung von N-geschütztem α-L-
Aspartyl-L-phenylalanin, die mindestens N-geschütztes α-L-
Aspartyl-D-phenylalanin als Verunreinigung enthält, umfaßt,
wobei die wäßrige Lösung eine Reaktionslösung ist, die durch
Kondensation von N-geschütztem L-Asparaginsäureanhydrid und
D,L-Phenylalanin in einem wäßrigen Lösungsmittel unter
Einhalten eines pH-Wertes von 7 oder darüber und einer Temperatur von
30ºC oder darunter und durch anschließendes Ansäuern der
Reaktionslösung gebildet wurde.
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Das wäßrige Lösungsmittel (in der wäßrigen Lösung verwendetes
Lösungsmittel) oder das essigsaure Lösungsmittel (in der
essigsauren Lösung verwendetes Lösungsmittel), wie sie
erfindungsgemäß verwendet werden, sind nicht besonders eingeschränkt, und
es können beliebige Arten von Lösungsmitteln verwendet werden,
vorausgesetzt, daß sie nicht mit den vier Isomeren reagieren.
Als essigsaures Lösungsmittel können Essigsäure oder Gemische
von Essigsäure mit anderen organischen Lösungsmitteln oder
Wasser verwendet werden. Als wäßrige Lösungsmittel können Wasser
oder Gemische von Wasser und mit Wasser mischbaren organischen
Lösungsmitteln verwendet werden. Solche organischen
Lösungsmittel können beispielsweise aus Ethern, wie Diethylether, Dioxan
und Tetrahydrofuran, Kohlenwasserstoffen, wie Hexan und Toluol,
Alkylhalogeniden, wie Chloroform und Ethylendichlorid,
Essigsäureestern, wie Ethylacetat, Alkoholen, wie Methanol, Ethanol
und Isopropanol, Ketonen, wie Aceton, Carbonsäuren, wie
Essigsäure und Propionsäure, Amiden, wie Dimethylformamid, und
Säureanhydriden, wie Essigsäureanhydrid, ausgewählt werden.
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Das Mischungsverhältnis von Wasser zu organischem Lösungsmittel
oder das Mischungsverhältnis von Essigsäure zu Wasser oder
organischem Lösungsmittel ist bei dieser Erfindung nicht
kritisch; es kann jedes beliebige Mischungsverhältnis angewendet
werden, wenn die gemischten Lösungsmittel sich unter Bildung
eines einheitlichen Gemisches gegenseitig lösen und auch die
drei Isomeren mit Ausnahme des angestrebten N-geschützten α-L-
Aspartyl-L-phenylalanins gelöst werden.
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Es ist möglich, als Schutzgruppen für die Aminogruppe der
Asparaginsäurekomponente die zu verwenden, die üblicherweise für
Peptidsynthesen benutzt werden, wie Formyl, Acetyl,
Benzyloxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl u. dgl.
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Wenn eine N-geschütztes α-L-Aspartyl-L-phenylalanin
(angestrebte Substanz) und N-geschütztes
α-L-Aspartyl-D-phenylalanin enthaltende essigsaure Lösung oder wäßrige Lösung,
erforderlichenfalls nach Einengen der Lösung, abgekühlt wird,
scheidet sich die angestrebte Substanz ab, da ihre Löslichkeit
geringer ist als die des N-geschützten
α-L-Aspartyl-D-phenylalanins.
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Tabelle 1 zeigt die Löslichkeit der beiden Isomeren, bei denen
die Schutzgruppe Formyl ist, d.h. von N-Formyl-α-L-aspartyl-L-
phenylalanin und von N-Formyl-α-L-aspartyl-D-phenylalanin.
Tabelle 1
Material
Löslichkeit *
N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin
N-Formyl-α-L-aspartyl-D-phenylalanin
* Löslichkeit, gemessen bei Verwendung von
Essigsäure als Lösungsmittel. Einheit: g/dl
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Die Abkühlungstemperatur beträgt vorzugsweise -5 bis 50ºC. Der
Kristallisationsvorgang wird beendet, bevor sich die anderen
Isomeren abscheiden, und die abgetrennte angestrebte Substanz
wird von der Mutterlauge abfiltriert, dann gewaschen und nach
herkömmlichen Methoden getrocknet, wodurch N-geschütztes α-L-
Aspartyl-L-phenylalanin mit einer Reinheit von mindestens 90 %
erhalten wird.
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Wenn die angestrebte Substanz von der wäßrigen Lösung des
Isomerengemisches abgetrennt wird, ist es zu bevorzugen, den pH-
Wert der Lösung mit einer anorganischen Säure, wie
Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure usw., oder einer organischen Säure,
wie Zitronensäure oder Ameisensäure, auf 1,0 bis 3,5
einzustellen.
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Das obige Abtrennungsverfahren kann auf die selektive
Abtrennung der angestrebten Sustanz aus einer Lösung angewandt
werden, die N-geschütztes α-L-Aspartyl-L-phenylalanin (angestrebte
Substanz), N-geschütztes α-L-Aspartyl-D-phenylalanin, N-
geschütztes β-L-Aspartyl-L-phenylalanin und N-geschütztes β-L-
Aspartyl-D-phenylalanin enthält und die durch Umsetzen von N-
geschütztem L-Asparaginsäureanhydrid und D,L-Phenylalanin in
einem essigsauren Lösungsmittel oder einem wäßrigen
Lösungsmittel erhalten wurde.
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Die Umsetzung von N-geschütztem L-Asparaginsäureanhydrid und
D,L-Phenylalanin wird vorzugsweise bei einem Molverhältnis von
N-geschütztem L-Asparaginsäureanhydrid zu D,L-Phenylalanin von
0,4 bis 3,0 durchgeführt. Was die Art und Weise der Vermischung
von N-geschütztem L-Asparaginsäureanhydrid und D,L-Phenylalanin
in dem Fall angeht, daß in einem essigsauren Lösungsmittel
umgesetzt wird, so kann entweder das Verfahren, bei dem N-
geschütztes L-Asparaginsäureanhydrid zu der Lösung von
D,L-Phenylalanin zugesetzt wird, oder das Verfahren, bei dem
D,L-Phenylalanin zu der Lösung von N-geschütztem
L-Asparaginsäureanhydrid zugesetzt wird, angewandt werden, aber im allgemeinen
erbringt das letztere eine höhere Ausbeute. Im Falle der
Umsetzung in einem wäßrigen Lösungsmittel ist das erstere Verfahren
zu bevorzugen.
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Die Kondensationsreaktion läuft, wenn sie in einem essigsauren
Lösungsmittel durchgeführt wird, bei Raumtemperatur glatt ab,
aber es ist zu bevorzugen, die Umsetzung bei einer Temperatur
von 0 bis 60ºC durchzuführen. In dem Fall, daß die
Kondensationsreaktion
in einem wäßrigen Lösungsmittel durchgeführt wird,
wird vorzugsweise bei einer Temperatur von nicht höher als 30ºC
umgesetzt, wobei der PH-Wert der Lösung auf 7 oder darüber,
vorzugsweise auf 7 bis 12, gehalten wird.
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Es erübrigt sich zu sagen, daß das bei der obigen Umsetzung
verwendete D,L-Phenylalanin nicht unbedingt eine racemische
Modifikation sein kann.
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Für die selektive Abtrennung der angestrebten Substanz aus
einer essigsauren Lösung oder einer wäßrigen Lösung, die die
vier Isomeren enthält, nämlich N-geschütztes α-L-Aspartyl-L-
phenylalanin (angestrebte Substanz), N-geschütztes
α-L-Aspartyl-D-phenylalanin, N-geschütztes β-L-Aspartyl-L-phenylalanin
und N-geschütztes β-L-Aspartyl-D-phenylalanin, und die durch
die Kondensationsreaktion von N-geschütztem
L-Asparaginsäureanhydrid und D,L-Phenylalanin erhalten wurde, können dieselben
Arbeitsgänge wie im Falle der selektiven Abtrennung der
angestrebten Substanz aus einer essigsauren Lösung oder einer
wäßrigen Lösung, die die beiden Isomeren, nämlich N-geschütztes α-
L-Aspartyl-L-phenylalanin (angestrebte Substanz) und
N-geschütztes α-L-Aspartyl-D-phenylalanin, enthält, wie vorstehend
beschrieben, angewandt werden.
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Wenn die essigsaure Lösung oder die wäßrige Lösung der vier
Isomeren, erforderlichenfalls nach Einengen der Lösung, auf
vorzugsweise -5 bis 50ºC abgekühlt wird, scheidet sich die
angestrebte Substanz als erste ab, weil die angestrebte
Substanz die geringste Löslichkeit von den vier Isomeren besitzt.
In dem Fall, daß die Kondensationsreaktion in einem wäßrigen
Lösungsmittel durchgeführt wird, ist es zu bevorzugen, den pH-
Wert der Lösung vor der Kristallisation mit einer anorganischen
Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure usw., oder
einer organischen Säure, wie Zitronensäure, Ameisensäure usw.,
auf 1,0 bis 3,5 einzustellen.
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Die ausgefällte angestrebte Substanz wird durch geeignete
Maßnahmen, wie Filtration, von der Mutterlauge abgetrennt, ehe
sich die anderen Isomeren abscheiden, und die abgetrennte
Substanz wird gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise kann N-
geschütztes α-L-Aspartyl-L-phenylalanin mit einer Reinheit von
mindestens 90 % erhalten werden.
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Wie vorstehend erläutert, kann gemäß dem Abtrennungsverfahren
nach der vorliegenden Erfindung die Trennung von N-geschütztem
α-L-Aspartyl-L-phenylalanin und N-geschütztem α-L-Aspartyl-D-
phenylalanin, die in der Vergangenheit unbekannt war, sehr
leicht vollzogen werden. Das Abtrennungsverfahren nach der
Erfindung macht es außerdem möglich, für die Bildung des
Zwischenproduktes bei der Herstellung von Aspartam, wofür bei den
bekannten Verfahren L-Phenylalanin verwendet worden ist, D,L-
Phenylalanin zu verwenden, das weniger teuer ist als
L-Phenylalanin.
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Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die
folgenden, keinerlei Einschränkung bedeutenden Beispiele
ausführlicher beschrieben.
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In den nachstehend angeführten Beispielen wurde die
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (nachstehend abgekürzt als
HPCL bezeichnet) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
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Säule: YMC-Packung A-312 (ODS), 6 mm φ x 150 mm
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Mobile Phase: 15 % Methanol, 0,2 M NaH&sub2;PO&sub4; (pH 4,5)
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Fließrate: 1,0 ml/min
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Temperatur: 40ºC
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Nachweis: 210 nm
BEISPIEL 1:
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N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin (0,30 g (0,97 mmol)) und
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N-Formyl-α-L-aspartyl-D-phenylalanin (0,30 g (0,97 mmol))
wurden
in 12 ml 1 n NaOH gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde
durch Zusetzen von 6 n HCl auf 3,0 eingestellt. Nach einer
Stunde wurde der pH-Wert auf 1,4 herabgesetzt, und die Lösung
wurde bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen.
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Die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Saugfiltration
abgetrennt, mit einer kleinen Menge kaltem Wasser gewaschen und im
Vakuum getrocknet, wobei 0,20 g Kristalle erhalten wurden. Das
Ergebnis der HPCL-Analyse des Produktes zeigte, daß es N-
Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin mit einer Reinheit von von
98,7 % war.
BEISPIEL 2:
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N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin (0,50 g (1,62 mmol)) und
N-Formyl-α-L-aspartyl-D-phenylalanin (0,50 g (1,62 mmol))
wurden bei einer Temperatur von 70ºC in 10 ml Essigsäure gelöst,
und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 3 Tage stehengelassen.
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Die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Saugfiltration
abgetrennt, mit einer kleinen Menge Essigsäure gewaschen und im
Vakuum getrocknet, wobei 0,30 g Kristalle erhalten wurden. Die
HPLC-Analyse bestätigte, daß die erhaltenen Kristalle N-Formyl-
α-L-aspartyl-L-phenylalanin mit einer Reinheit von 96,9 %
waren.
BEISPIEL 3:
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1,50 g (10,5 mmol) N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid wurden zu
15 ml Eisessig zugegeben, und die Lösung wurde auf 45ºC erhitzt
und gerührt. Zu der Lösung wurden über einen Zeitraum von 20
Minuten 1,68 g (10,2 mmol) D,L-Phenylalanin zugegeben, und die
gemischte Lösung wurde bei derselben Temperatur eine Stunde
stetig gerührt und dann bei Raumtemperatur 3 Tage
stehengelassen.
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Die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Saugfiltration
abgetrennt, mit einer kleinen Menge Essigsäure gewaschen und im
Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 0,68 g. Das Ergebnis der
HPLC-Analyse zeigte, daß das Produkt N-Formyl-α-L-aspartyl-L-
phenylalanin mit einer Reinheit von 94,6 % war.
BEISPIEL 4:
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N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid (3,00 g (21,0 mmol)) wurde zu
15 ml Eisessig zugesetzt, und die Lösung wurde auf 45ºC erhitzt
und gerührt. Zu dieser Lösung wurden über einen Zeitraum von 20
Minuten 1,68 g (10,2 mmol) D,L-Phenylalanin zugegeben, und die
gemischte Lösung wurde bei derselben Temperatur eine Stunde
stetig gerührt und dann 4 Tage bei Raumtemperatur
stehengelassen.
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Die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Saugfiltration
abgetrennt, mit einer kleinen Menge Essigsäure gewaschen und im
Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 0,77 g. Das Ergebnis der
HPLC-Analyse zeigte, daß dieses Produkt N-Formyl-α-L-aspartyl-
L-phenylalanin mit einer Reinheit von 95,3 % war.
BEISPIEL 5:
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N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid (2,63 g (18,4 mmol)) wurde zu
13 ml Eisessig zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 60ºC
gerührt. Zu dieser Lösung wurden über einen Zeitraum von 20
Minuten 2,94 g (17,8 mmol) D,L-Phenylalanin zugesetzt, und die
gemischte Lösung wurde bei derselben Temperatur eine Stunde
gerührt und dann weiterhin bei Raumtemperatur über Nacht
gerührt.
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Die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Saugfiltration
abgetrennt, mit einer kleinen Menge Essigsäure gewaschen und im
Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 1,24 g. Durch
HPLC-Analyse
wurde bestätigt, daß das Produkt N-Formyl-α-L-aspartyl-L-
phenylalanin mit einer Reinheit von 92,0 % war.
BEISPIEL 6:
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D,L-Phenylalanin (1,73 g (10,4 mmol)) wurde zu 15 ml Eisessig
zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 35ºC gerührt. Zu dieser
Lösung wurden über einen Zeitraum von 30 Minuten 1,50 g (10,5
mmol) N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid zugesetzt, und die
gemischte Lösung wurde bei derselben Temperatur eine Stunde
gerührt und dann 5 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen.
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Die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Saugfiltration
abgetrennt, mit einer kleinen Menge Essigsäure gewaschen und im
Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 0,56 g. Das Ergebnis der
HPLC-Analyse zeigte, daß das Produkt N-Formyl-α-L-aspartyl-L-
phenylalanin mit einer Reinheit von 94,8 % war.
BEISPIEL 7:
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N-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid (1,50 g (10,5 mmol)) wurde zu
einem 20 ml Eisessig und 5 ml Ethylacetat enthaltenden
gemischten Lösungsmittel zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 45ºC
gerührt. Zu dieser Lösung wurden über einen Zeitraum von 70
Minuten 1,73 g (10,4 mmol) D,L-Phenylalanin zugesetzt, und die
gemischte Lösung wurde bei derselben Temperatur eine Stunde
gerührt und dann 4 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen.
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Die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Saugfiltration
abgetrennt, mit einer kleinen Menge Essigsäure gewaschen und im
Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 0,34 g. Das Ergebnis der
HPLC-Analyse zeigte, daß das Produkt N-Formyl-α-L-aspartyl-L-
phenylalanin mit einer Reinheit von 91,3 % war.
BEISPIEL 8:
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Eisessig (10 ml) und Essigsäureanhydrid (1,6 ml) wurden zu 2,36
g (15,0 mmol) N-Acetyl-L-asparaginsäure zugesetzt, und das
Gemisch wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden gerührt. Die
erhaltene aufgeschlämmte Reaktionslösung wurde auf 40ºC erhitzt, und
über einen Zeitraum von 90 Minuten wurden 2,47 g (15,0 mmol)
D,L-Phenylalanin dazugegeben. Die gemischte Lösung wurde auf
Raumtemperatur abgekühlt, dann mit 10 ml Diethylether und 5 ml
Hexan versetzt und bei Raumtemperatur 6 Tage stehengelassen.
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Die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Saugfiltration
abgetrennt, mit einer kleinen Menge Essigsäure gewaschen und im
Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 0,72 g. Das Produkt
wurde durch HPLC-Analyse als
N-Acetyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin mit einer Reinheit von 91,5 % identifiziert.
BEISPIEL 9:
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D,L-Phenylalanin (4,00 g (24,2 mmol)) wurde zu 30 ml Wasser
zugesetzt, und die Lösung wurde mit 5 n NaOH auf einen pH-Wert
von 12 eingestellt und auf -10ºC abgekühlt. Zu dieser Lösung
wurden über einen Zeitraum von 30 Minuten 3,98 g (27,8 mmol) N-
Formyl-L-asparaginsäureanhydrid zugegeben. Während dieses
Zeitraumes wurden der pH-Wert der Lösung auf 11 bis 13 und die
Temperatur auf -5 bis -10ºc gehalten. Nach einer Stunde wurde die
Temperatur der Lösung auf Raumtemperatur gesteigert, und ihr
pH-Wert wurde mit 1 n HCl auf 3,0 herabgesetzt. Eine Stunde
danach wurde der pH-Wert der Lösung mit 1 n HCl weiterhin auf
1,0 herabgesetzt.
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Die Lösung wurde über Nacht stehengelassen, und die
abgeschiedenen Kristalle wurden durch Saugfiltration abgetrennt, mit
einer kleinen Menge Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Die Ausbeute betrug 2,87 g. Das Ergebnis der HPLC-Analyse
zeigte, daß das Produkt N-Formyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanin
mit einer Reinheit von 97,1 % war.