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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf die Reinigung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester
(α-Neotam),
durch Auflösung
der Isomere von Neotam.
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Verwandter Stand der Technik
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N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester (α-Neotam)
ist ein hochpotenter Dipeptid-Süßstoff (etwa
8000 mal süßer als
Saccharose), der die Formel:
aufweist.
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Sein β-Isomer,
N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-β-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester
(β-Neotam)
hat die Struktur:
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Die
chemische Synthese von α-Neotam
ist in US-Patenten Nrn. 5,480,668, 5,510,508 und 5,728,862 offenbart.
Die US-Patent Nrn. 5,510,508 und 5,728,862 beschreiben die konventionelle
Synthese von α-Neotam
durch Hydrogenierung einer Mischung von Aspartam und 3,3-Dimethylbutyraldehyd
mit einem Katalysator, wie Pd auf Kohlenstoff.
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Eine
Anzahl anderer synthetischer Wege zum Neotam sind erforscht worden.
Gewisse dieser Wege, beispielsweise das Koppeln von Phenylalaninmethylester
an Neoasparaginsäureanhydrid
sind im US-Patent Nr. 6,077,962 offenbart, und Verfahren, die Z-Aspartam
(α- und β-Mischung)
als Ausgangsmaterial verwenden, sind in US-Patent Nr. 5,302,743
und JP 60-075497 offenbart, ergeben kein reines α-Neotam. Tatsächlich werden sowohl das gewünschte α-Isomer als
auch das unerwünschte β-Isomer von
Neotam erhalten. Da α-Neotam hauptsächlich bei
Nahrungsmitteln für
menschlichen Verzehr eingesetzt wird, ist es extrem wichtig, dass α-Neotam in einem hochaufgereinigten
Zustand vorliegt. Damit ist klar, dass ein Bedarf für eine Reinigungsstrategie besteht,
welche selektiv das reine α-Isomer
von Neotam erzeugt.
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Zusammensetzung
der Erfindung
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Diese
Erfindung ist auf ein Verfahren zum Reinigen von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl)-L-phenylalanin-1-methylester (α-Neotam)
gerichtet, das die Stufen umfasst: Zurverfügungstellen einer Mischung
aus (i) den α-
und β-Isomeren
von Neotam und (ii) einem organischen Lösungsmittel; Inkontaktbringen
der Mischung mit einem wässrigen
Metallion, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Mn2+, Ca2+ und Mg2+ besteht, so dass das β-Isomer mit dem Metallion ein
Chelat bildet, um einen Metallkomplex auszubilden, und Abtrennen
des Metallkomplexes vom α-Isomer
des Neotams.
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Detaillierte
Beschreibung
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Die
vorliegende Erfindung ist auf ein Reinigungsschema für N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl)-L-phenylalanin-1-methylester (α-Neotam)
gerichtet. Das Reinigungsschema der vorliegenden Erfindung ist besonders
zur Verwendung geeignet, wenn Neotam durch irgendein Verfahren hergestellt
wird, das zur Koexistenz von sowohl α- als auch β-Isomeren von Neotam führt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Mischung der α- und β-Isomeren
von Neotam in einem organischen Lösungsmittel mit einem wässrigen
Metallion, das ausgewählt
ist aus der Gruppe, die aus Cu2+, Zn+2, Fe2+, Fe3+, Mn2+, Ca2+ und Mg2+ besteht,
so kontaktiert, dass das β-Isomer
ein Chelat mit dem Metallion bildet und einen Metallkomplex ausbildet;
der Metallkomplex wird dann vom α-Isomer
des Neotams abgetrennt. Im Ergebnis erfolgt die Trennung zwischen
einem Komplex eines Isomers und der zwitterionischen Form des anderen
Isomers. Gemäß dem ersten
Schritt der vorliegenden Erfindung wird eine Mischung aus (i) den α- und β-Isomeren
von Neotam und (ii) einem organischen Lösungsmittel bereitgestellt.
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Die
Mischung kann die Form einer Reaktionsmischung annehmen, in welcher
Neoasparaginsäureanhydrid
mit Phenylalaninmethylester gekoppelt war, oder einer Reaktionsmischung,
bei der Z-Aspartam (Mischung von α-
und β-Aspartam) eingesetzt
wurde, um Neotam zu bilden. Alternativ kann die Mischung durch Zufügen eines
organischen Lösungsmittels
zu solch einer Reaktionsmischung oder zu einer Trockenmischung der α- und β-Isomere
von Neotam gebildet werden.
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Jegliches
organische Lösungsmittel,
welches einen unterschiedlichen Grad an Lösungskraft für den Metallkomplex
des β-Isomers
und des α-Isomers
von Neotam aufweist, ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
geeignet. Geeignete organische Lösungsmittel
beinhalten ohne Beschränkung
Glycerin, Toluol, Chloroform, Dichlormethan, Butylacetat, Ethylacetat
und Mischungen derselben. Ein Durchschnittsfachmann wird leicht
erkennen, dass, um so größer der
Unterschied zwischen den Löslichkeiten
des Metallkomplexes des β-Isomers
und des α-Isomers
von Neotam in einem gegebenen Lösungsmittel
sind, desto so nützlicher das
Lösungsmittel
für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung sein wird.
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Gemäß dem zweiten
Schritt der vorliegenden Erfindung wird die Mischung mit wässrigem
Metallionen so kontaktiert, dass das β-Isomer von Neotam mit dem Metallion
ein Chelat bildet, um einen Metallkomplex auszubilden. Die Metallionen
beinhalten Cu2+, Zn+2,
Fe2+, Fe3+, Mn2+, Ca2+ und Mg2+. Bevorzugterweise das Metallion Cu2+. Der Durchschnittsfachmann wird leicht
erkennen, dass jegliches Metallion, das zur Ausbildung eines Metallkomplexes
mit dem β-Isomer
von Neotam in der Lage ist, zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
geeignet ist. Typischerweise wird eine 1 bis 2 äquivalente Menge und vorzugsweise
eine äquimolare Menge
von Metallion im Vergleich zur Menge an vorhandenem β-Isomer verwendet.
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Typischerweise
wird das Kontaktieren der Mischung mit wässrigen Metallionen durch Hinzufügen, zur Mischung
der α- und β-Isomere,
einer wässrigen
Lösung,
welche ein Metallsalz, wie etwa ein Sulfat, Chlorid oder Nitrat
darin aufgelöst
enthält.
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Nach
Zugabe der Metallionen zur Lösung
wird der pH optional oder vorzugsweise in einem Bereich von etwa
2 bis etwa 9 eingestellt, bevorzugtererweise von etwa 3 bis etwa
8 und am bevorzugtesten von etwa 4 bis etwa 7. Die Bildung eines
Metallkomplexes des β-Isomers
von Neotam wird bei diesen pH-Bedingungen maximiert.
Typischerweise wird der pH durch Zugabe einer Säure, einer Base oder von beiden
eingestellt.
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Gleichzeitig
mit der Ausbildung des Metallkomplexes des β-Isomers wird ein, eine wässrige Schicht und
eine organische Schicht umfassendes, biphasisches System erzeugt.
Die organische Schicht enthält hauptsächlich den
Metallkomplex des β-Isomers
von Neotam, weil die wässrige
Schicht hauptsächlich
das α-Isomer
von Neotam enthält.
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Gemäß dem dritten
Schritt der vorliegenden Erfindung wird der Metallkomplex vom α-Isomer von
Neotam abgetrennt.
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Das
Abtrennen kann durch jegliche bekannte Mittel erzielt werden, ohne
Beschränkung
einschließlich Flüssig/Flüssig-Extraktion, Fest/Flüssig-Extraktion
und Chromatographie. Durchschnittsfachleute werden leicht erkennen,
dass der Metallkomplex als Feststoff oder in Lösung vorliegen kann, abhängig von
den verwendeten organischen Lösungsmitteln,
den Reinigungsbedingungen etc. Gleichermaßen können Fachleute leicht erkennen,
dass das α-Isomer
zu diesem Zeitpunkt in Lösung
vorliegt. Falls eine Flüssig/Flüssig-Extraktion
ausgeführt
werden soll, d. h. sowohl der Metallkomplex als auch das α-Isomer in
Lösung
sind, können
ein einfacher Trenntrichter, ein Durchlaufextraktor oder eine Gegenstromvorrichtung
verwendet werden. Falls eine Chromatographie verwendet werden soll,
ist jegliche stationäre
Phasen/Lösungsmittel-Kombination
geeignet, welche die Auflösung
des α-Isomers
gestattet.
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Nach
Abtrennen des Metallkomplexes vom α-Isomer kann die das α-Isomer enthaltende
wässrige
Lösung
optional angesäuert
werden. Vorzugsweise wird in solch einem Schritt ein pH von etwa
2 bis 3 erzielt. Dieser Ansäuerungsschritt
wird typischerweise durch Zugeben einer Säure zur wässrigen, α-Neotam enthaltenden Lösung erreicht
und hilft bei der Reinigung des α-Neotams.
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Nach
Abtrennen des Metallkomplexes vom α-Isomer kann die α-Isomerlösung behandelt
werden, um Neotamkristalle zu bilden. Optional kann die Lösung konzentriert
oder weiterverarbeitet werden und dann so behandelt werden, dass
sich α-Neotamkristalle ausbilden.
Solche Behandlungen beinhalten, ohne Beschränkung, das Zugeben von Wasser
oder das Zugeben eines anderen Lösungsmittels,
das dazu führt,
dass sich α-Neotamkristalle bilden.
Weiterhin können
andere Additive, welche die Bildung von α-Neotamkristallen erleichtern,
zugesetzt werden. Ein Beispiel eines solchen Additivs sind α-Neotamkeimkristalle.
Zusätzlich
können
die Behandlungen, die Auswahl und Aufrechterhaltung einer geeigneten
Temperatur oder eines Temperaturbereichs beinhalten, bei dem die
Behandlungen durchzuführen
sind. Optional können
diese Behandlungen auch die Auswahl und das Aufrechterhalten eines
geeigneten pHs oder pH-Bereichs beinhalten, an dem die Behandlungen
durchgeführt
werden sollen. Die Beispiele, die nachfolgen, sollen als Illustration
gewisser bevorzugter Ausführungsformen
der Erfindung dienen und implizieren keine Beschränkung der
Erfindung.
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Beispiel 1
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Das α-Isomer von
Neotam (2,7 mmol, 1,0 g) und das β-Isomer
von Neotam (0,90 mmol, 0,33 g) wurden trocken kombiniert. Glycerin
(20%, wässrig
in Gew./Gew.), wurde den Peptiden zugesetzt, um eine Suspension zu
bilden. Hexan (12,5 ml) und Ethylacetat (33 ml) wurden der Suspension
zugegeben. Die Mischung wurde gerührt, während 1 M wässriges Kupfersulfat (0,9 mmol,
0,9 mol) zugegeben wurde. Der pH wurde mit 1 M wässrigem Natriumhydroxid auf
5 eingestellt. Es entwickelte sich ein klares, biphasisches System.
Durch HPLC wurde das α : β-Verhältnis für die wässrige Schicht
als 14,3 : 1 bestimmt. Das α : β-Verhältnis für die organische
Schicht war 2,27 : 1.
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Beispiel 2
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Das α-Isomer von
Neotam (2,7 mmol, 1,0 g) und das β-Isomer
von Neotam (2,7 mmol, 1,0 g) wurden in Methanol (10 ml) aufgelöst. Es wurde
der sich ergebenden Lösung
Wasser zugesetzt. Butylacetat (25 ml) wurde dieser Mischung zugesetzt,
gefolgt von 1 M wässrigem
Kupfersulfat (2,7 mmol, 2,7 ml). Der pH wurde mit 1 M wässrigem
Natriumhydroxid auf 6 eingestellt. Es entwickelte sich ein klares
biphasisches System. Durch HPLC wurde das α : β-Verhältnis für die wässrige Schicht als 0,75 : 1
bestimmt. Das α : β-Verhältnis für die organische
Schicht war 0,876 : 1. Diesem System wurde mehr Methanol (5 ml)
zugegeben. Die Feststoffe wurden abgetrennt, und es wurde in der
wässrigen
Schicht kein β-Isomer
entdeckt, während
das α : β der organischen
Schicht 0,9 : 1 betrug.
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Beispiel 3
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Zu
einer Parr-Flasche, die eine Lösung
von Z-Aspartam (α : β 3 : 1, 4,0
g, 9,34 mmol), wurden 3,3-Dimethylbutyraldehyd (1,18 ml, 9,40 mmol),
Methanol (50 ml), Wasser (10 ml) und 0,25 g Pd/C (4% Palladium auf
Kohlenstoff, 50% nass) zugegeben. Nach 5 min Rühren wurde die Mischung bei
100 psi bei Raumtemperatur für
4 h hydrogeniert. Die Mischung wurde durch ein Celitebett gefiltert
und das Bett wurde mit Methanol (60 ml) gewaschen. Das Filtrat und
die Waschungen wurden vereinigt und konzentriert. Die Mischung wurde in
200 ml 0,2 M Kupfersulfat/Ethylacetat/Methanol (10 : 9 : 1) aufgelöst. Der
pH wurde durch Zugabe von 1,0 M wässrigem Natriumhydroxid auf 5,0
bis 6,0 eingestellt. Nach Trennung wurde die organische Schicht
mit Wasser (2 × 30
ml) extrahiert. Die wässrige
Schicht wurde mit Ethylacetat (2 × 30 ml) extrahiert. Die organische Schicht
enthielt β-Neotam,
und die wässrige
Schicht enthielt α-Neotam.
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Die
wässrigen
Schichten, die α-Neotam
enthielten, wurden vereinigt und mit 1,0 M Salzsäure auf pH 3,0 angesäuert und
wieder mit Ethylacetat (4 × 30
ml) extrahiert. Die extrahierten organischen Schichten wurden über wasserfreiem
Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert, konzentriert und aus Ethanol/Hexan
kristallisiert. Reines (mittels HPLC: 99%) α-Neotam (1,35 g, 51% Ausbeute) wurde
erhalten.
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Das
Cu++-chelierte β-Neotam in den organischen Schichten
wurde vereinigt und konzentriert. Der Rückstand wurde in 10 ml 1 :
1 Methanol/Natriumphosphat (1,0 M, pH 8,0) aufgelöst. Das
Präzipitat
wurde durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde konzentriert,
mit 1 M Salzsäure
bis auf einen pH von 3,0 angesäuert
und mit Ethylacetat (3 × 15
ml) extrahiert. Die Ethylacetatextrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat
getrocknet, gefiltert, konzentriert und aus Ethanol/Hexan kristallisiert.
Es wurde β-Neotam
(0,52 g, 58%), welches 5% α-Neotam
mittels HPLC enthielt, erhalten.
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Beispiel 4
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Zu
einer Mischung von α-Neotam
(3 g) und β-Neotam
(1 g) in 45 ml Ethylacetat wurde 50 ml einer 250 M wässrigen
Lösung
von Zinkchlorid und 5 ml Methanol zugegeben. Dann wurde der pH der
Mischung mit 100 mM wässrigem
Natriumhydroxid auf etwa 6,0 bis 6,5 eingestellt. Nach Trennung
wurde die organische Schicht mit Wasser (2 × 30 ml) extrahiert. Die wässrige Schicht
wurde mit Ethylacetat (2 × 30
ml) extrahiert. Die organische Schicht enthielt β-Neotam und die wässrige Schicht
enthielt α-Neotam.
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Die
wässrigen
Schichten, die α-Neotam
enthielten, wurden vereinigt und mit 1,0 M Salzsäure bis auf pH 3,0 angesäuert und
wieder mit Ethylacetat (4 × 30
ml) extrahiert. Die extrahierten organischen Schichten wurden über wasserfreiem
Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert, konzentriert und aus Ethanol/Hexan
kristallisiert. Reines (durch NMR: > 98%) α-Neotam (1,95 g, 65%
Ausbeute) wurde erhalten. Das Zn++-chelierte β-Neotam in
organischen Schichten wurde vereinigt und konzentriert. Der Rückstand
wurde in 20 ml 1 : 1 Methanol/Natriumphosphat (1,0 M, pH 9,0) aufgelöst. Das
Präzipitat
wurde durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde konzentriert,
mit 1,0 M Salzsäure
auf pH 3,0 angesäuert
und mit Ethylacetat (3 × 20
ml) extrahiert. Die Ethylacetatextrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat
getrocknet, gefiltert, konzentriert und aus Ethanol/Hexan kristallisiert.
Es wurde β-Neotam
(0,54 g, 54%), welches 5 bis 10% α-Neotam
mittels NMR enthielt, erhalten.
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Andere
Variationen und Modifikationen dieser Erfindung ergeben sich für den Fachmann.
Diese Erfindung ist nicht beschränkt,
außer
wie in den nachfolgenden Ansprüchen
dargestellt.
