DE2844777C2

DE2844777C2 -

Info

Publication number: DE2844777C2
Application number: DE2844777A
Authority: DE
Inventors: Gerald Lee Kirkwood Mo. Us Bachman
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1977-10-14
Filing date: 1978-10-13
Publication date: 1988-01-07
Also published as: JPS614400B2; JPS5463045A; BE871263A; US4111925A; DE2844777A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von α-L- Aspartyl-L-phenylalanin gemäß den voranstehenden Patentansprüchen.

Aus der US-PS 39 33 781 ist ein Verfahren zur Herstellung bestimmter Alkylester des α-L-Aspartyl-L-phenylalanins bekannt, worin α-L-Aspartyl-L- phenylalanin als Vorstufensubstanz eingesetzt wird.

Gemäß dem Verfahren aus US-PS 39 33 781 wird α-L-Aspartyl-L-phenylalanin mit einem Alkanol verestert; die Bildung des gewünschten Esters erfolgt nach der folgenden Reaktion 1:

Bedeutet R in der obigen Reaktion Methyl, dann entsteht als Produkt α-L- Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (nachfolgend als α-APM bezeichnet), der als Süßstoff schon vielfach verwendet wurde. Der Einfachheit halber wird α- APM im folgenden als Beispiel für die Esterart verwendet, die sich gemäß Reaktion 1 bildet. Somit wird α-APM nur zur Erläuterung der Erfindung herangezogen, ohne die Erfindung auf diese Verbindung einzuschränken.

In der US-PS 39 33 781 werden verschiedene Trenn- und Reinigungsstufen zur Herstellung von α-APM in praktisch reiner Form beschrieben. So ist es z. B. nach der Veresterung von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin gemäß Reaktion 1 normalerweise erwünscht, das α-APM von den folgenden, ebenfalls bei der Veresterungsreaktion gebildeten unerwünschten Nebenprodukten abzutrennen:

(nachfolgend als "Diester" bezeichnet) und

(nachfolgend als "Aspartylester" bezeichnet).

Wird α-APM hergestellt, dann bedeutet R in den obigen Formeln Methyl.

Der hier verwendete Begriff "Alkylester des α-L-Aspartyl-L-phenylalanins" umfaßt die obenerwähnten verschiedenen Esterformen, die bei der Veresterung des α-L-Aspartyl-L-phenylalanins entstehen. Insbesondere umfaßt der Begriff die angestrebte, in Reaktion 1 dargestellte Esterform, den Diester und den Aspartylester.

Aufgrund der Ähnlichkeit der vorhandenen Stoffe sind die Abtrennungs- und Reinigungsstufen zur Gewinnung von α-APM in praktisch reiner Form schwierig. Eine völlige Abtrennung ist oftmals unmöglich, so daß in diesen Abtrennungs- und Reinigungsstufen das α-APM nicht mit voller Ausbeute hergestellt werden kann.

Die Entstehung unerwünschter Ester und die unvollständige Herstellung des α- APM in den Trennungs- und Herstellungsstufen führen in Verfahren zur α- APM-Herstellung zu geringeren Gesamtausbeuten. Zur Erhöhung der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens bestand daher ein erhöhter Bedarf an wirksamen Herstellungsverfahren.

Die Aufgabe wird nun durch die kennzeichnende Maßnahme des Verfahrens gemäß Hauptanspruch gelöst.

Die Erfindung schafft daher ein Verfahren zur Herstellung von α-L- Aspartyl-L-phenylalanin, das darin besteht, einen Alkylester des α-L-Aspartyl-L-phenylalanins mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe mit einer mindestens 1 Mol Bariumionen pro Mol Dipeptidester enthaltenden wäßrigen Lösung bei einem pH-Wert von mehr als 7 zu hydrolysieren.

Das α-L-Aspartyl-L-phenylalanin kann dann zur Herstellung von α-APM gemäß Reaktion 1 wiederverwendet werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Produkt in deutlich erhöhter Ausbeute und unter verminderter Bildung von Abfallprodukten hergestellt.

Weitere Gesichtspunkte und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung und den Ansprüchen.

Die Hydrolyse ist selektiv, d. h., die Alkylester des α-L-Aspartyl-L-phenylalanins werden mit hoher Ausbeute zu α-L-Aspartyl-L-phenylalanin umgewandelt, während die Bildung anderer Produkte, die man als Ergebnis der Hydrolyse erwarten könnte, unterdrückt wird. Werden Alkylester des α-L-Aspartyl-L-phenylalanins hydrolysiert, dann sind mehrere Ergebnisse möglich. So kann die Hydrolyse von α-APM eine oder mehrere der folgenden Reaktionen zur Folge haben:

Die Reaktion a) stellt die Bildung eines substituierten Diketopiperazin dar. In Reaktion b) wird die Dipeptidbindung des α-L-Aspartyl-L-phenylalaninesters gespalten, so daß sich L-Asparaginsäure und ein Alkylester des Phenylalanins bilden. Dieser in Reaktion b) gebildete Alkylester des Phenylalanins kann weiter zu L-Phenylalanin hydrolysiert werden. In Reaktion c) wird α-L-Aspartyl-L-phenylalanin gebildet.

Eine Hydrolyse des Diesters und des Aspartylesters kann, im allgemeinen entsprechend den obigen Reaktionen, ebenfalls zu verschiedenen Produkten führen. Bei der Hydrolyse des Diesters kann zusätzlich ein Monoester gebildet werden, wenn nur eine Estergruppe hydrolysiert wird.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird durch Hydrolyse von Alkylestern des α-L-Aspartyl-L-phenylalanins selektiv α-L-Aspartyl-L-phenylalanin hergestellt. Die Hydrolyse verläuft praktisch nach Reaktion c), wobei die Reaktionen a) und b) im wesentlichen unterdrückt werden. Diese Ergebnisse sind unerwartet und waren von den Fachleuten nicht vorauszusehen. Sie können ferner z. B. bei der Herstellung von α-APM gemäß US-PS 39 33 781 eingesetzt werden, da das α-L-Aspartyl- L-phenylalanin leicht wiederverwendet und erneut verestert werden kann, so daß auf wirtschaftliche Weise wertvolle Ausbeuteverbesserungen erzielt werden.

Bei der Hydrolyse von Alkylestern des α-L-Aspartyl-L-phenylalanins mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden größere Mengen α-L-Aspartyl-L-phenylalanin hergestellt. Mit der Hydrolyse nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden in dem Produkt nur kleinere Mengen eines substituierten Diketopiperazins festgestellt. Es gab ferner praktisch keine Anzeichen einer Spaltung der Dipeptidbindung. Da die Bildung unerwünschter Produkte unterdrückt wird, werden auch die schwierigen und kostspieligen Trennmaßnahmen reduziert, die notwendig wären, um z. B. α-L-Aspartyl-L-phenylalanin in einer für die Wiederverwendung in einem α-APM-Herstellungsverfahren geeigneten Form herzustellen.

Die Hydrolyse erweist sich als wirksam für alle Ester des α-L-Aspartyl-L-phenylalanins, d. h. die in Reaktion 1 dargestellten Ester, den Diester und den Aspartylester. Die Hydrolyse kann für einen Ester oder für ein Gemisch aus verschiedenen Estern durchgeführt werden. Die Alkylgruppe der Ester ist erfindungsgemäß eine Niedrigalkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, wobei der Methylester bevorzugt ist.

Es ist möglich, daß die Ester als Säuresalze vorliegen, z. B. bedingt durch das für die α-APM-Herstellung verwendete Verfahren. Die Esterhydrolyse kann jedoch trotzdem mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgen, wenn das Säuresalz vor oder während des Hydrolysevorgangs mit bekannten Mitteln neutralisiert wird.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Ester können in verschiedenen Nebenprodukten enthalten sein, die z. B. in den Reinigungs- und Trennstufen des Verfahrens der US-PS 39 33 781 zu finden sind. In diesen Produktströmen sind normalerweise verschiedene Ester des α-L-Aspartyl-L-phenylalanins vorhanden. Es wurde gefunden, daß das beschriebene Hydrolyseverfahren direkt auf diese Produktströme oder Kombinationen derselben angewandt werden kann, ohne daß die Ester daraus isoliert werden. Je nach den in der Reaktionsmasse vorhandenen Stoffen kann jedoch die Herstellung des α-L-Aspartyl-L-phenylalanins mit dem erfindungsgemäßen Hydrolyseverfahren durch Löslichkeit oder andere Ursachen beeinflußt werden.

Da es sich bei dem Verfahren um ein Hydrolyseverfahren handelt, ist es wesentlich, daß die Reaktion in wäßriger Lösung stattfindet. Die Menge des Wassers in der Lösung ist nicht kritisch, solange geeignete Anteile eingehalten werden.

Es wird ein Mol Wasser pro Mol zu hydrolysierendem Dipeptidmonoester benötigt. Bei einem Dipeptiddiester werden zwei Mol Wasser pro Mol Dipeptiddiester für eine vollständige Hydrolyse benötigt. Das Molverhältnis von Wasser zu Dipeptidester ist nur für die Bestimmung der zu hydrolysierenden Estermenge von Bedeutung. Ein Wasserüberschuß ist für die Reaktion nicht schädlich.

Als Lösungsmittel wird bei dieser Reaktion Wasser oder ein Gemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel verwendet, mit der Maßgabe, daß die Reaktionsteilnehmer in dem Gemisch löslich sind und das organische Lösungsmittel die gewünschte Reaktion nicht stört. Vorzugsweise wird als Lösungsmittel Wasser verwendet.

Überraschend wurde gefunden, daß die Gegenwart von Bariumionen in einer wäßrigen Lösung eine selektive Hydrolyse von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-alkylestern zu α-L-Aspartyl- L-phenylalanin verursacht, wenn die Lösung mit den Estern bei einem Reaktions-pH von mehr als 7 in Kontakt gebracht wird. Bei anderen Hydrolyseverfahren wurde die Bildung wesentlicher Mengen eines substituierten Diketopiperazin oder eine wesentliche Spaltung der Dipeptidbindung des α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-alkylesters beobachtet.

Es gibt verschiedene Verfahren zur Herstellung einer Bariumionen enthaltenden wäßrigen Lösung. Eine solche Lösung kann z. B. gebildet werden, indem man Barium, Bariumoxid oder Bariumhydroxid und Wasser zusammenbringt. Die Verwendung von Bariumoxid oder -hydroxid ist bevorzugt. Bariumhydroxid kann als Hydrat vorliegen. Andere Stoffe, die als Quelle für Bariumionen in Frage kommen, sind den Fachleuten bekannt.

Es wird erfindungsgemäß ein Mol Bariumionen pro zu hydrolysierendes Mol Dipeptidester eingesetzt. Die Anzahl der Estergruppen im Dipeptid beeinflußt die benötigte Molmenge Bariumionen nicht. Es wird also die gleiche Molmenge für den Monoester wie für den Diester des Dipeptids benötigt. Ist die Molmenge des Dipeptidesters größer als die der vorhandenen Bariumionen, dann findet nur eine partielle Hydrolyse statt. Es ist nicht bekannt, daß ein Bariumionenüberschuß für die Reaktion schädlich ist; große Überschüsse können jedoch unerwünschte Nebenreaktionen zur Folge haben.

Vorzugsweise wird die bariumhaltige Substanz zunächst in das Wasser gegeben und dann der Ester hinzugeführt, wobei es jedoch möglich ist, die Reihenfolge der Stoffzugabe zu ändern. So kann z. B. die Bariumquelle zu einem Gemisch aus Ester in Wasser gegeben werden. Weitere Variationsmöglichkeiten sind den Fachleuten bekannt. Die jeweilige Reihenfolge der Stoffzugabe ist nicht kritisch.

Die Reaktion wird erfindungsgemäß bei einem pH-Wert von mehr als 7 durchgeführt. Dieser, hier als "Reaktions-pH-Wert" bezeichnete Wert ist der pH-Wert des Reaktionsgemischs. Dieses besteht aus der die Bariumionen enthaltenden wäßrigen Lösung und den Estern, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren miteinander in Kontakt gebracht werden. Mit zunehmendem Reaktions- pH-Wert nimmt die Hydrolysegeschwindigkeit zu. Bevorzugt ist ein Reaktions-pH-Wert von mehr als etwa 10. Besonders bevorzugt ist ein Reaktions-pH-Wert von etwa 10,5 bis 13,5. Zur pH-Einstellung wird vorzugsweise Bariumoxid oder -hydroxid verwendet. Es können jedoch auch andere Basen, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, verwendet werden.

Reaktionstemperatur und -druck sind nicht kritisch. Die Reaktion läuft bei Raumtemperatur und normalem Druck rasch ab. Es können Temperaturen von 0°C bis 100°C verwendet werden. Bei höheren Temperaturen können jedoch Sekundärreaktionen, wie Racemisierung, eintreten. Die Reaktion wird deshalb vorzugsweise bei einer Temperatur von unterhalb etwa 50°C, insbesondere bei einer Temperatur von etwa 20°C bis 40°C durchgeführt.

Die Reaktionszeit ist nicht kritisch. Bei einem Reaktions- pH-Wert von mehr als etwa 10 erfolgt die Reaktion bei Normalbedingungen praktisch augenblicklich. Wenn ein besserer Kontakt zwischen den Reaktionsteilnehmern erzielt werden soll, kann die Lösung beispielsweise etwa 15 min bis zu 1 Stunde unter fortgesetztem Rühren unter Reaktionsbedingungen gehalten werden.

Das gebildete α-L-Aspartyl-L-phenylalanin wird aus dem Reaktionsgemisch durch Ausfällen und Flüssig/Fest-Trennung erhalten. Eine solche Ausfällung kann z. B. durch Verschieben des pH-Wertes des Gemisches in den sauren Bereich und Abkühlen des Gemisches auf unter etwa 10°C erreicht werden.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Für die Dünnschichtchromatographie (TLC) der Beispiele wurden die folgenden Stoffe und Verfahren verwendet:

A. Platte
Silicagel F auf Glasplatte von Brinkmann Instrument
Inc., Westbury, N. Y. 11590.

B. Lösungssysteme
1. Chloroform64 Vol.-% Methanol30 Vol.-% Essigsäure 2 Vol.-% Destilliertes Wasser 4Vol.-% 2. n-Propanol70Vol.-% Destilliertes Wasser10 Vol.-% Methanol10 Vol.-% Ameisensäure10Vol.-%

C. Anfärbungs-Spraylösungen
1. 0,3 g Ninhydrin, gelöst in einem Gemisch aus 100 ml n-Butanol und 3 ml Eisessig.
2. 1 g Kaliumjodid und 1 g lösliche Stärke, gelöst in 100 ml destilliertem Wasser.

D. Verfahren
Nach Auftragen und Entwickeln im geeigneten Lösungssystem wurde die Platte 30 min getrocknet.
Ninhydrin-Spray: Die Platte wurde besprüht und 15 min bei 100°C in einem Ofen belassen.
Stärke-Jod-Spray: Die Platte wurde 15 min in eine mit tert.-Butylhypochloriddampf gesättigte Kammer gestellt, 30 min an der Luft getrocknet, dann mit frisch zubereiteter Stärke-Jodlösung besprüht.

Die folgenden Beispiele wurden bei normalem Druck durchgeführt. Sofern nichts anderes angegeben, sind alle Prozentangaben auf das Gewicht bezogen.

Beispiel 1

Während eines Zeitraums von 20 min wurden zu einer Lösung von 287,6 g (1,875 Mol) BaO in 2000 ml Wasser (40°C) 500 g (1,7 Mol) α-APM gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und zur Klärung gefiltert. Der Filterkuchen wurde mit 230 ml Wasser (25°C) ausgewaschen. Das mit der Waschlauge vereinigte Filtrat wurde auf 0°C abgekühlt (pH=13,3) und innerhalb von 4¹/₃ Stunden wurden unter externer Kühlung 1170 g Essigsäure zugegeben. Nach 0,5 Stunden Rühren (Temperatur = -3°C, pH=3,7) wurde der pH-Wert mit 203,2 g 37%iger HCl auf 3,0 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 0,5 Stunden gerührt und der Niederschlag mit einem Saugfilter entfernt. Der Filterkuchen wurde mit zweimal mit 500 ml Wasser (5°C) gewaschen und in einem Vakuumofen bei 55°C bis 60°C getrocknet. Die α-L-Aspartyl- L-phenylalanin-Ausbeute betrug 397 g (84,3% des theoretischen Wertes). Die TLC-Analyse ergab 97,5% α-L-Aspartyl- L-phenylalanin, 1,45% NaCl, weniger als 1% substituiertes Diketopiperazin und keine Spuren von α-APM, L-Asparaginsäure oder L-Phenylalanin.

Beispiel 2

α-APM wurde im wesentlichen gemäß US-PS 39 33 781 hergestellt. Die aus den verschiedenen Trenn- und Reinigungsstufen erhaltenen Flüssigkeiten und Waschlaugen wurden vereinigt. Das kombinierte Reaktionsgemisch wog 1238 g und enthielt α-L-Aspartyl- L-phenylalanin, α-APM, Aspartylester und Diester (insgesamt 0,3 Mol α-L-Aspartyl-L-phenylalanin als Äquivalent für alle diese Esterformen). Das Gemisch wurde durch Abdestillieren von Wasser (45-50°C und 5320-6650 N/m² (40-50 mm Hg)) auf 817 g konzentriert. Mit 40 g 50%iger NaOH wurde der pH-Wert des Konzentrats (30°C) auf 3,0 eingestellt. Dann wurde der pH-Wert mit 89 g (0,58 Mol) BaO auf 11,7 (40°C) eingestellt. Das Gemisch wurde 0,5 Stunden bei 40°C gerührt, dann auf 5°C abgekühlt. Während die Temperaturen bei 5 bis 10°C gehalten wurde, wurde der pH-Wert mit 107 g 37%iger HCl auf 2,85 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 0°C bis 5°C gerührt. Der feste Niederschlag wurde abzentrifugiert und mit 330 ml kaltem Wasser ausgewaschen. Der Filterkuchen wurde bei 60°C und 19 950 N/m² (150 mm Hg) getrocknet. Die Ausbeute ergab 43,5 g (51,7% des theoretischen Wertes) α-L-Aspartyl-L-phenylalanin; TLC ergab 97%ige Reinheit.

Beispiel 3

Zu einer gerührten Aufschlämmung (30°C) von 5 g (etwa 0,017 Mol) rohem α-APM (90-95% α-APM, 5-10% α-L-Aspartyl- L-phenylalanin, 0,5 bis 1,5% substituiertes Diketopiperazin) in 34 ml destilliertem Wasser, wurden innerhalb von 5 Minuten portionsweise 2,6 g (0,017 Mol) BaO gegeben. Das erhaltene Reaktionsgemisch, das einen alkalischen pH-Wert hatte, wurde 2 Stunden bei 30°C gerührt. Die Lösung wurde mittels TLC analysiert, restliches a-APM wurde nicht gefunden. Die TLC-Analyse zeigte nur α-L-Aspartyl-L-phenylalanin (97,5 bis 98,5%) und substituiertes Diketopiperazin (1,5 bis 2,5%).

Die Beispiele 1 bis 3 zeigen die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie die dabei erhaltenen angestrebten Ergebnisse. Zum Vergleich wird in den Kontrollbeispielen 1 und 2 die Hydrolyse mit Magnesiumoxid und Kupfer-II-oxid dargestellt, die zu unerwünschten Ergebnissen führen.

Kontrollbeispiel 1 Hydrolyse mit Magnesiumoxid

Zu einer gerührten Aufschlämmung (30°C) von 5 g (etwa 0,017 Mol) rohem α-APM (90 bis 95% α-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, 5 bis 10% α-L-Aspartyl-L-phenylalanin, 0,5 bis 1,5% substituiertes Diketopiperazin) in 94 ml destilliertem Wasser wurden innerhalb von 5 Minuten portionsweise 0,7 g (0,017 Mol) MgO gegeben. Das erhaltene Gemisch, das einen alkalischen pH-Wert hatte, wurde 3 Stunden bei 30°C gerührt und abfiltriert. Die TLC-Analyse des Filterkuchens (2 g) ergab nur substituiertes Diketopiperazin, was eine wesentliche Umwandlung in dieses unerwünschte Produkt anzeigte. Die TLC-Analyse der Mutterlauge ergab α-L-Aspartyl- L-phenylalanin, substituiertes Diketopiperazin und kein α-APM.

Kontrollbeispiel 2 Hydrolyse mit Kupfer-II-oxid

Zu einer gerührten Lösung (30°C) von 5 g (etwa 0,017 Mol) rohem α-APM (90 bis 95% α-APM, 5 bis 10% α-L-Aspartyl-L- phenylalanin, 0,5 bis 1,5% substituiertes Diketopiperazin) in 34 ml Wasser wurde innerhalb von 5 Minuten portionsweise 1,4 g (0,017 Mol) CuO gegeben. Das Gemisch, das einen alkalischen pH-Wert hatte, wurde 3 Stunden bei 30°C gerührt. Die TLC-Analyse des Gemisches ergab im wesentlichen keine Umwandlung von α-APM zu α-L-Aspartyl-L-phenylalanin (α-APM noch vorhanden).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Alkylester des α-L-Aspartyl-L-phenylalanins mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe mit einer mindestens 1 Mol Bariumionen pro Mol Dipeptidester enthaltenden wäßrigen Lösung bei einem pH-Wert von mehr als 7 hydrolysiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert von mehr als 10 hydrolysiert.