DE2452285A1

DE2452285A1 - Verfahren zur herstellung von alphal-aspartyl-l-phenylalaninalkylestern

Info

Publication number: DE2452285A1
Application number: DE19742452285
Authority: DE
Inventors: Gerald Lee Bachman; Marvin Loren Oftedahl; Billy Dale Vineyard
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1973-11-05
Filing date: 1974-11-04
Publication date: 1975-05-07
Also published as: GB1464139A; DK573674A; BR7409198A; SE7710696L; IT1025399B; CA1020159A; ZA747077B; NO143940B; SU544367A3; NO803386L; GB1464140A; US3933781A; CH605678A5; HU170725B; NO145273C; NO143940C; NL7414280A; FR2249872A1; JPS5526133B2; FR2249872B1

Description

Priorität: 5. November 1973, Nr. 412 923, USA

Verfahren zur Herstellung von a-L-AsOartyla Hey Ie stern

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-allryIestern. α-L-Aspartyl-L-phenylalaninalkylestsr, speziell der Methylester, sind aufgrund ihrer Verwendbarkeit als SUSmittel gut bekannt.

Die a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-alltylester wurden bisher mit Hilfe eines chemischen Synthesev/ego hergestellt, bei den als Reaktantsn L-Phenylalanin-alkylester verwendet wurden. Es hat sich gezeigt, daß diese Verfahren zur Herstellung von a-L-Aspsrtyl-L-phenylsla-ήΐη-alkylestern außerordentlich ]coinpliziert und teuer sind, viodurch hohe Herstellungskosten verursacht v/erden.

Der Erfindung liegt -daher die Aufgabe zugrunde, ein neues Syntheseverfahren zur Herstellung von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-all-rylestern zur Verfügung zu stellen und neue Ausgongsverbindungen ?-ur Herstellung von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-alicylestern zugänglich zu iaachen.

"//eitere Gegenstände, Gesichtspunkte und Vorteile der Erfindung sind aus der nachstehenden Baychreibung ersichtlich.

509819/1 121

Gegenstand der Erfindung sind daher neue Verbindungen, nämlich H-geschützte α-L-Aspartyl-L-phenylalanine, die als Ausgangsverbindungen zur Herstellung von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-allcylestern geeignet sind.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung von α-1-Aspartyl-L-phenylalanin-alkylestern, das dadurch gekennzeichnet ist_s daß man IT-geschütztes L-Asparaginsäurean-hydrid mit L-Phenylalanin unter Bildung von IT-geschütztem a-L-Aspartyl-L-phenylalanin umsetzt, die Schutzgruppe von dem IT-geschützten a-L-Äspartyl-L—phenylalanin entfernt, das gebildete a-L-Aspartyl-L-phenylalanin mit einem Alkanol unter Bildung eines a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-allrylesters verestert, welcher dann gewonnen v.'ird.

Die erfindungsgemäße Synthese von a-L-Aspartyl-L-phenylalaninalkylestern lcann nach der folgenden allgemeinen Reaktionsfolge verlaufen;

5 0 9 819/11

LO	D	X-NH	CH	If
OO			J
CsI		CH	Η
CnI LO			Il 0

3)

.0 +

- CH - COOH

CH	IH	₂C00H	NH	- CH ■	- COOH	und
	0 Il		I CH'		/3-F or m
	Il -C-
CH
X-I

( α-Form)

CH₀COOH

^Δ ο

CH-C- NH

I X-NH

CH - COOH CH.

Entfernen der Schutzgruppe

CH₂COOH

CH-C I NH-

-NH-CH- COOH

CH.

CH₀COOH

*

H-C-NH NH..

CH - COOH

CH.

ROH

CH₂COOH

CH-C-NH

NH

In den vorstehenden Gleichungen bedeuten X eine Schutsgruppe für die Aminogruppe und R eine niedere Alky!gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen,

V/ie in Gleichung l) gezeigt ist, werde:: als Ausgangsreaktanteii ein N-geschütztes L-Asparaginsäureanhy:rid und L-Phenylalanin verwendet, die unter Bildung von IT-geschütztem a-L-Aspartyl-L-pheny!alanin umgesetzt werden. Die Schutzgruppe für die Aminogruppe kann irgendeine der auf di-sem Fachgebiet bekannten Gruppen sein, beispielsweise eine Formel-, Acetyl-, Bensoyl-, substituierte oder unsubstituierte Carbobenzo-xy-, t-3uto::ycarbony!gruppe oder ein Halogenwasserstoffsalz. Besonders bevorzugt v:ird ZT-Forr.yl-L-asparaginsfa^.reanhydrid, das beispielsweise nach dem in der FR-PS 2 0Λ0 473 beschriebenen Verfahren hergestellt v/erden kann, bei dem !T-For;.:yl-L-3sp3raginsäure bei 0 bis 60 C in einem organischen lösungsmittel mit Essigsäiireanhydrid behandelt wird.

L-Phenylalanin ist mit Hilfe bekannter Synthese- und/oder Fermentation sverfahren leicht zugänglich ^nd wird gewöhnlich in einer Ilengs von 2_s0 bis 0,5 Hol pro Mol des IT-geschützten L-AsparaginsäureanhydridSj, vorzugsweise in einer 1-Ienge von etwa 1,0 Mol L-Phenylalanin pro Mol des IT-geschützten L-Asparaginsäureanhydrids, eingesetzt. Ss kann jedes beliebige Lösungs-^· mittel verwendet v/erden, vorausgesetzt, daß die Reaktanten darin löslich sind und nicht ungebührlich mit dem Lösungsmittel reagieren. Zu Beispielen für geeignete Lösungsmittel gehören Äthylacetat, Methylpropionat, Tetrahydrofuran, Dioxan, A'ther, Chloroform, Toluol und Essigsäure. Eisessig wird besonders bevorzugt.

Wenn auch die Reaktion bei Raumtemperatur glatt verläuft, kann die Reaktionsgeschwindigkeit durch Erhitzen des Reaktionsgemisches erhöht werden. Wenn jedoch die R-eaktionstemperatur zu hoch ist, besteht die ITeigung zum Auftreten von ITebenreaktionen, wie einer Racemisierung. Aus diesem Grund wird die Reaktion

509819/1121

BAD OftfeiiMAL

vorzugsweise bei einer Temperatur von weniger als etwa 30° C, vorzugsweise bei einer Temperatur von weniger als etwa 60° C,

durchgeführt.

Die Reaktionsraasse, die aus der in Gleichung 1) dargestellten

Reaktion erhalten wird, enthält das gewünschte Produkt der Fo: mel

CH COOII X - NH - CH - C - NH - CH - COOH

η t

O CH-

(das nachstehend als "α-Fora" bezeichnet wird) und ein unerwünschtes Nebenprodukt der Formel

X - NH - CH - COOH

CH. - C - NH - CH - COOH

2 η ι

O CH.

(das nachstehend als "3-?orn" bezeichnet wird).

Überraschenderweise v/erden die als Reaktionsprodukte erhaltene a-Forn und 3-Fora in einen Verhältnis entsprechend etwa 4 Teilen der a-Forn zu etwa 1 Teil der 3-Form gebildet, wenn die Reaktion in Eisessig bei einer Reaktionstemperatur von etwa 20" C bis etwa 60 C durchgeführt wird. 3s wurde gefunden, da.2 relativ reine a-Forn dann durch Kristallisation aus der Reaktionsinasse gewonnen, werden kann. Diese Tatsache ist ein besonders vorteilhaftes Merkmal des erfindungsgeniä.3en Verfahrens. Die so gewonnene α-Form kann dann weiter in die zweite Stufe des erfindungsgecä.ren Verfahrens eingesetzt v/erden. Die 3-Form, lie in der resultierenden Mutterlauge verbleibt, kann einer weiteren Aufarbeitung, wie der

509819/1121

BAD

Hydrolyse, unterworfen werden, uia L-Asparaginsäure und L-Phenylalanin zu gewinnen, die dann in vorhergehende Stufen zurückgeführt werden können.

Gemäß einer anderen Ausführungsfora kann auch die Reaktionsmasse, die beide Reaktionsprodukte enthält, der nächsten Reaktionsfolge unterworfen werden.

Das erhaltene IT-geschützte a-L-Aspartyl-L-phenylalanin v/ird dann zum Entfernen der Schutzgruppe behandelt (Gleichung 2), wobei a-L-Aspartyl-L-phenylalanin erhalten wird. Zu diesem Zv;eck ist jede Methode anwendbar, die sich zur Entfernung von Sehutzgruppen von Aninen eignet. Zu Beispielen für diese Methoden gehören die katalytische Hydrierung und die Behandlung mit Mineralsäuren oder Basen. Es v/ird bevorzugt, die Schutzgruppe, insbesondere die Pormylgruppe, durch Säurehydrolyse au entfernen« Diese Hydrolyse kann beispielsweise in einer verdünnten wässriger* Chlorwasserstoffsäurelösung durchgeführt werden. Die Grav-andlin^ in cc-L-Aspartyl~L-phenylalanin ist überraschenderweise sehr hoch.5 d."h. sie liegt in der Größenordnung Ύοη 95% oder darüber, bezogen auf das so behandelte IT-geschützte a-L-Aspartyl-L-phenylalanin. Ein anderes geeignetes Kediua für eine derartige Behandlung ist eine wässrige Essigsäure-Chlorwasserstoff Säure-Lösung«

Das a-L-Aspartyl-L-phenylalanin kann dann durch Ausfällung und J'lüssig/?est~Phasentrennung gewonnen werden. Diese Ausfällung kann beispielsweise durch Einstellen des pH-Vierts verursacht werden, wenn die Schutsgruppe in einer sauren Lösung entfernt wurde. Das vorherrschende unerwünschte Nebenprodukt, das in der Mutterlauge verbleibt, ist 3-L-Aspartyl-L-phenylalanin, wenn sein Vorläufer in der oben angegebenen ',leise in diese Reaktionsstufe übernommen wurde«, Diese Verbindung kann dann aufgearbeitet werden, wie durch !Hydrolyse, ua L-Asparaginsäure und L-Phenylalanin zur Zurückführung in vorhergehende Stufen zu gewinnen»

112 1

Wie in Gleichung 3) verdeutlicht wird, wird dsnn a-L-Aspartyl-L-phenylalanin der Veresterung mit einen Alkanol unterworfen, wobei ein α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-alkylester gebildet wird.

Das für diese Reaktion verwendete Lösungsmittel kann irgendein geeignetes organisches Lösungsmittel sein, vorausgesetzt, da3 die Reaktanten in diesem Lösungsmittel löslich sind und daß es die gewünschte Reaktion nicht stört. Zu Beispielen für geeignete Lösungsmittel gehören Alkenole, Tetrahydrofuran , Methylenchlorid, Chloroform und Benzol. Alkenole werden besonders bevorzugt. Ss wird bevorzugt, die Reaktion in Anwesenheit von möglichst wenig Wasser durchzuführen.

Vorzugsweise wird diese Veresterungsreaktion in einem sauren Medium durchgeführt. So kann die Reaktion beispielsweise in einem Alkanol, das etwa 1 bis etwa 10 Hol Chlorwasserstoff pro Mol a-L-Aspartyl-L-phenylalanin, vorzugsweise etwa 1,05 bis etwa 2,0 Mol Chlorwasserstoff pro Mol a-L-Aspartyl-L-pheny!alanin enthält, durchgeführt werden.

Für den Fachmann ist leicht ersichtlich, daß die Veresterungsreaktion praktisch durch Umsetzung eines Säuresalzet= von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin und dem Alkanol vorgenommen werden kann; aus Gründen der Bequemlichkeit wird jedoch hier nur von einer Reaktion zwischen a-L-Aspartyl-L-phenylalanin und dem Alkanol gesprochen.

Die angewendeten Temperaturen sollten etwa -20° C bis zu dem Siedepunkt des Reaktionsmediums betragen, wobei eine Temperatur von etwa 20° C b
wendet wird.

etwa 20° C bis 40° C besonders bevorzugt wird, wenn Methanol ver-

Im allgemeinen sollte das angewendete Molverhältnis von Alkanol zu a-L-Aspartyl-L-phenylalanin etwa 0,5 bis etwa 50, vorzugsweise etwa 0,1 bis 10, betragen.

509819/1121

Bei dieser Veresterungsreaktion tritt notwendigerweise die Bildung der nachstehenden unerwünschten ITebenprodukte ein:

C-O- Alkyl O ₀ -CH-C-NH-CH-C-O- Alkyl

& η ι

O CH₂

(nachstehend als "Diester" bezeichnet) und ©

C-O- Alkyl O

^ -CH -C- NH -CH-C- OH

2 «ι ι

(nachstellend als "Aspartylester" bezeichnet)

Außer diesen beiden unerwünschten Nebenprodukten enthält die Reaktionsmasse außerdem unumgesetztes a-L-Aspartyl-L-phenylalanin. Die Reaktionen₉ die zu dem gewünschten Produkt und den !Tebenprodukten führen₉ sind sämtlich Gleichgewichtsreaktionen β Es wurde gefunden«, daß die Reaktionen zur Bildung von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-alkylester in hohem Maß führen, wenn die Veresterung, urn sie zu veranschauliche^ in Methanol in Gegenwart eines Überschusses von einem Mol Chlorwasserstoff pro Mol α-L-Aspartyl-L-phenylalanin, gewöhnlich etwa I₉I Mol Chlorwasserstoff pro Mol a-L-Aspartyl-L-phenylalanin, vorgenommen wird. Bei etwa Raumtemperatur wird ein so hoher Anteil wie etwa 40 bis 45 'p des a-L-Aspartyl-L-phenylalanins in rx-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester übergeführt.

Der a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-alkylester kann dann ge*.;onnon werden. Dies erfolgt beispielsweise durch partielle neutralisation der resultierenden Reaktionsmasse, wobei nicht umgesetztes

50931 9/1121

α-L-Aspartyl-L-phenylalanin ausgefällt wird, welches dann durch Verfahren der Fest st off-Flüssigkeits-Trennung gewonnen werden lcann. Die verbleibende Lösung kann dann zum Entfernen von unumgesetztem Alkanol aufgearbeitet werden, beispielsweise durch Destillation. Die verbleibende Reaktionsnasse l:ann dann behandelt werden, um das gewünschte Produkt zu gewinnen. Dies erfolgt beispielsweise durch Behandlung mit einer Chlorwasserstoffsäurelösung, wodurch die Ausfällung des Hydrochloridsalrres des a-L-Aspartyl-L-phenylalsnin-alkylesters verursacht wird. Das Chlorwasserstoffsäuresalz kann dann gewonnen und in das gewünschte Produkt umgewandelt werden.

^lJo ^v

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß das Kydrochlorid von a-L-Aspartyl-L-Phenylalanin-alkyle^ter bedeutend weniger löslich ist als die anderen vorstehend angegebenen Verbindungen, und daß daher diese Verbindung in einfacher Vfeise in dieser Form durch Feststoff/Flüssigkeitstrennung abgetrennt werden kann. Im wesentlichen verbleiben alle anderen Vorbindungen in der Mutterlauge und können zu a-I-Aspartyl-L-phe::ylalsnin hydrolysiert werden, welches dann gewonnen und/oder in die Veresterungsreaktion zurückgeführt werden kann.

Die nachstehenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung ausführlich zu erläutern. Es ist ersichtlich, da:3 die Erfindung nicht auf die speziellen Einzelheiten der Beispiele beschränkt sein soll.

Für die in den Beispielen angewendeten Analysen durch Lünnschic:i^H chronatographie v.-urden folgende Materialien und Verfahren benutzt:

Silicagel F auf Glasplatten der Brinknsn Instrument Inc., v'estbury, Ii. Y. 11 590.

B. Lösung-"nittelr;;,'ster,e:

509819/1121

1. Chloroform 64
Methanol 30 V0I.-5S Essigsäure 2 Vol.-^ destilliertes Wasser 4 Vol.-^

2. π-Propanol 70 Vol.~£ destilliertes Wasser 10 Vol.-5^ Methanol 10 # Ameisensäure 10 f

G* Spruhlösungen gun nachweis :

1. 0,3 g llinhydrin, gelöst in einem Geaisch aus 100 nl n-Butanol und 3 ml Eisessig

2. 1 g KaliuTnjodid tmd 1 g "lösliche Stärke, gelöst in 100 ral destilliertem Wasser

I». Yerf

!lach dem Auftragen der Flecken und der Entwicklung in einem geeigneten Lösungsmittelsystem wurde die Platte 50 Minuten an der Luft getrocknet.

Ki^iydringrprgT; Die Platte wurde besprüht und 15 Hinuten bei 100 G in Trockenschrank gehalten.

Stärke iodid-Spray: Die Platte wurde 15 Minuten in eine mit t-Butyl-hypochlorit-JDairpf gesättigte Kammer gelegt, 30 Minuten sn der Luft getrocknet und danach mit frisch zubereiteter Stärkejodidlösung besprüht.

Beispiel 1

II-Foririyl—-~x-L~a sparty 1-Ii-phen.yla lanin

In einen geeigneten Reaktionsgefä.3 v/erden bei einer Temperatur

5 0 9 819/1121

- ii -

von 45 bis 50° O 34,6 g (0,21 Mol) L-Phenylalanin innerhalb etwa 45 Minuten zu einem Gemisch aus 30 g (0,21 Mol) IT-P or myl -L- a spa raginsäureanhydrid und 300 g Eisessig gegeben. Das erhaltene Gemisch wird weitere 30 Minuten bei dieser Temperatur gehalten und.danach auf 25° C gekühlt. Das entstandene kristalline Produkt v/ird durch Filtration gewonnen und mit 50 g Eisessig gewaschen. Die Ausbeute an N-Forrayl-a-L-aspartyl-L-phenylalanin beträgt 40,5 g; F. 180 bis 1S2 ° C. Die Analyse dieses Produkts durch DünnschichtChromatographie zeigt keine feststellbare Verunreinigung durch die 3-Form an.

Beispiel 2

In einem geeigneten Reaktionsgefäß v/erden 238 g (2,32 Mol) Essigsäureanhydrid zu 428 g 97 ^iger Ameisensäure während einer Dauer von etwa 45 Minuten bei 25° C gegeben und das Geraisch wird dort weitere 45 Minuten gehalten. Dann wird das Reaktionsgefäii mit 147 g (1,1 Mol) L-Asparaginsäure beschickt. Die erzielte Lösung wird etwa 3,5 Stunden bei 25° C gerührt. Überschüssige Ameisensäure v/ird durch fraktionierte Destillation entfernt. Dann v/ird eine ausreichende Menge Eisessig zugesetzt, so daß insgesamt 972 g Essigsäure vorliegen. Bei 50° C werden 174 g (1,05 Mol) L-Phenylalanin mit Hilfe einer Sehneckenfordervorrichtung innerhalb 45 Minuten zugesetzt. Die gebildete Masse wird 30 Hinuten bei 50 C gehalten und danach auf 25° C abkühlen gelassen. Das kristalline IT-Formyl-a-L-aspartyl-L-phenylalanin wird mit Hilfe einer Zentrifuge gewonnen und mit 200 ml Eisessig gewaschen. Das endgültig erhaltene Trockengewicht des Produkts beträgt 173 g, F. 182 bis 184 ° 0. Die Dünnschichtchromatographie zeigte praktisch reines IT-Formyl-^x-L-aspartyl-L-phenylalanin an, in welchem keine erkennbare Menge der 3-Form vorlag.

Beispiel 3 jx-L-Aspartyl-L-Ohenylalanin

509819/1 121

Ein Gemisch aus 100 g (0,322 Mol) H-Fornyl-a-L-aspartyl-L-phenylalaxiin und 59,7 g 57 ^iger HCl (0,607 Hol) in 392 ml Wasser wird 4 "bis 5 Stunden auf 60° C erhitzt. Die erhaltene Lösung. wird mit 32,6 g (o,41 Hol) 50 f'iger ITaOH partiell neutralisiert und danach auf 20 bis 25 C abgekühlt. Das gebildete Festprodukt wurde gewonnen und mit 50 ml !ca It em Wasser (5 0) gewaschen. Die Menge des gewonnenen ersten Anteils an rx-L-Aspartyl-L-phenylalanin "beträgt 32,7 g.

Die mit dem Waschwasser aus dein ersten Anteil kombinierte Mutterlauge wird weiter mit 17,6. g (0,22 Mol) 50 foiger HaOH bei 60° 0 neutralisiert. Durch Kühlen der Eeaktionsnasse auf 25° 0, Gewinnen des gebildeten Feststoffes und Waschen mit 50 oxP kaltem Wasser werden weitere 45 g cc-L-Aspartyl-!-phenylalanin gewonnen. Die Gesamtausbeute an α,-L-Aspartyl-L-phenylalanin beträgt 77,7 g, [cc] ^j + 30,2°, C=O,7, 75 i» wässrige Essigsäure.

Beispiel 4

ct-L-Aspartyl-L- phenylalanin

Zu 441 g 97 /oiger Ameisensäure in einem 2 Ltr,—Kolben, der mit Rührer versehen war, wurden tropfenweise während 95 Minuten 236g (2,8 Mol) Essigsäureanhydrid zugegeben. liach vollständiger Zugabe wurde die Lösung bei Raumtemperatur 45 Hinuten gerührt. Zu dieser Lösung wurden 147 g (1,1 Mol) L-Asparaginsäure in einem Anteil zugesetzt und das Rühren wurde bei Raumtemperatur 5>5 Stunden fortgesetzt. Überschüssige Ameisensäure wurde durch fraktionierte Destillation in einem Vakuum von 30 bis 60 mm entfernt. Dem ICoI-benrückstand wurden 244 g Essigsäure zugesetzt, so daß eine Gesamtmenge von 379 g Essigsäure vorlag.

Zu dieser Lösung von IT-Formyl-L-asparaginsäureanhydrid, von 50° C, wurden anteilweise während 1 Stunde 174 g (1,05 Mol) L-Phenyl- alanin z"
gerührt.

alanin zugesetzt. Die Reaktionsmasse wurde 1,5 Stunden bei 50° C

509819/1121

Die erhaltene Reaktionsmasse, die sowohl die α-Form als auch die 3-Forra enthielt, wurde nit 375 ml 'Wasser und 195 S 37 ^iger Chlorwasserstoffsäure behandelt und 4 Stunden auf 60° C erhitzt. Das Produkt v/urde aus dieser Hydrolyselösung durch Zugabe von 235>6 g 50 folgen rTatriumhydroxidlösung ausgefällt. Die Peststoffe wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 150 ml Wasser gewaschen. Der erhaltene Kuchen wurde getrocknet, wobei 146,4 g eines Produkts erhalten wurden, das sich durch Dünnschichtchromatographie als a-L-Aspartyl-L-phenylalanin mit einer

Heinheit von mehr als 95 fi erwies. [a]|j + 27,7, C=O,9, 75

wässrige Essigsäure. Beispiel 5 q-L-Aspartyl-L-phenylalanin

Zu einer Aufschlämmung von 6,0 g (0,042 Hol) IT-Formyl-L-asporaginsäureanhydrid in 15,1 g Essigsäure von 50 C wurden anteilweise während 45 Minuten 6,92 g (0,042 Hol) L-Phenyclanin gegeben. Nach beendigter Zugabe wurde das Geraisch 30 Hinuten gerührt,

Diese Reaktionsmasse, die sowohl die '-.- als auch die 3-Form enthielt, wurde mit 35 ml Wasser und 7,?g.~7 ^iger Chlorwasserstoffsäure behandelt und 4 Stunden bei 60 G gerührt. Das Produkt wurde aus der Hydrolyselösung durch Zugabe von 3,1 g 50 $iger ITatriumhydro::idlösung ausgefällt. Die Feststoffe wurden durch Filtration abgetrennt und mit 5 ml V/asser gewaschen. Der Kuchen wurde getrocknet, wobei 7,1 g des Produkts erhalten wurden, das sich durch Dünnschichtchromatographie als a-L-Aspartyl-L-phenylalanin erwies; C^J^ +29,5, 0=0,3, 75 ^cp wässrige Essigsäure.

Beispiel 6

0,825 g (5mliol) L-Phenylalanin wurie in 20 ml Wasser gelöst, die 0,5 ■% (5 m'I'Iol) Triethylamin enthielten, und die erhaltene Lösung wurde in einem Eisba-1 gekühlt. Dann wurde v/ährend einer

509819/1121

Dauer von 5 Minuten 0,33 g( 5»5 λ Mol) L-Asparaginsäureanhydril, hydroChlorid zu der gefühlten, unter Rühren gehaltenen Losung zugesetzt. Das Anhydrid löste sich augenblicklich auf. Die Lösung wurde 2 Stunden bei 5 C gerührt
auf Raumtemperatur erwarnen gelassen.

sung wurde 2 Stunden bei 5 C gerührt und danach unter Rühren

Die Analyse des Realctionsgemisch.es durch Dünnschicht Chromatographie zeigte an, daß das Gemisch etwa 20 % a-L-Aspartyl-L-pheny !alanin, enthielt.

BeisOiel 7

Eine Lösung von 46 mg (0,16 mMol) a-L-Aspartyl-L-phenylalanin, 35 rag (0,1GmKoI) p-Toluolsulfonsäure-aonohydrat und 0,5 ml wasserfreiem Methanol wurde 1,5 Stunden bei der Rückf3.u3temperatur (64,7 C) gehalten. Dabei wurden die nachstehenden, durch Dünnechichtchroaatographie bestimmten Ausbeuten, bezogen auf das ursprünglich eingesetzte a-L-Aspartyl-L-phenylalanin, erhalten:

Produkt Ausbeute, jo

α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-

methylester 35 - 40

a-L-Aspartyl-L-phenylalanin

(unungesetzt) 15 - 20

Aspartylester 15 - 20

Diester IO - 15

Beispiel 3

Bine Lösung aus 46 mg (O,16mi<Iol) cc-L-Aspartyl-L-phenylalanin, 1,1 ml 0,37 η H₉SO_-1-OH^OH-Losung (mit einem Gehalt an 0,2 mHol HpSO.,) und L ml wasserfreiem He than öl wurde 1,5 Stunden am "lüc: flu3 gehalten (64,7° C). Die 'lurch Lünnschichtchronatographie bestimmten, erhaltenen Ausbeuten haben folgende ^T.ferte, bezogen

509819/1121

auf die Anfangsbesehickung an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin:

Produkt	Ausbeute, yo
a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-
metbylester	15 - 20
α-L-Aspartyl-L-plienylalanin
(unumgesetzt)	35
Aspartylester	10
Diester	Spuren
Beispiel 9

Eine Lösung aus 46 mg (0,16 mliol) a-L-Aspartyl-L-phenylalanin, 0,43 mMol Pyropliosphorsäure und 5 ml wasserfreiem Methanol wurde 3 Stunden am Rückfluß (64,7° C) gehalten. Dabei wurden folgende Ausbeuten, bezogen auf die Anfangsbeschickung an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin, erhalten (bestiinint durch Dünnschi cht Chromatographie) :

Produkt	Ausbeute, fi	ster	- 25	*
a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-
methylester	20	35
a-L-Aspartyl-L-phenylalanin		- 25
(unumgesetzt)		- 10
Aspartylester	20
Diester	5
Beispiel 10
a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methyle

Eine Lösung aus 1,36 g -x-L-Aspartyl-L-phenylalanin, 2,9 ml 2,6 η Chlorwasserstoffsäure in Methanol und 7,2 ml Methanol wurde 2

509819/1121

Stunden "bei 30 C gerührt. Dabei v.'urcien die nachstellenden Ausbeuten, bezogen auf die Anfangsbeschickung an «x-L-Aspartyl-L-phenylalanin, bestimmt durch DSC, erhalten:

Produkt Ausbeute, fo

a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-

methylester 40 - 45

a-L-Aspartyl-L-phenylalanin

(unumgesetzt) 20 - 25

Aspartylester 15 - 20

Diester 15 - 20

BeisOiel 11

In ein geeignetes Reaktionsgefäi3, das mit Thermometer, Rührer und Rückflußkühler versehen ist, v/erden 111,5 g (0,4 Mol) α-L-Aspartyl-L-phenylalanin gegeben. Dann werden 500 ml Methanol und 132,5 al 3,42 η HCl in Methanol zugesetzt. Das Gemisch v/ird 2 Stunden gerührt und auf 30 C erwärmt. Dann wird auf 25° G abgekühlt und es werden während 15 Minuten 9,5 al (0,12 Hol) 50 foige ITaOH zugegeben. In einem Eisbad wird eine Stunde gerührt und nicht umgesetztes a-L— Aspartyl-L-phenylalanin abfiltriert. Der a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-Kuchen wird mit zwei 50 ml-Anbeilen eiskaltem Methanol gewäsehen. Der Kuchen wird in einem Vakuuntrockenschrank: getrocknet, wobei 25 g a-L-Aspartyl-L-pheny!alanin (etwa 90 io rein) gewonnen werden.

575 ml Methanol werden aus dem Piltrat durch Destillation entfernt. Dann werden 225 ml Wasser und 41,5 ml 37 £ige HGl (0,49 Mol) zugegeben, wonach 2 Stunden bei 0 bis 5 C gerührt wird. Das feste Chlorwasserstoffsäuresalz von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-inethylester wird filtriert und v;ieder in 610 nl V.^rasser-vcn50°C gelöst. Der pH-"..^rert der erhaltenen Lösung wird mit 17,-5 g (0,22 Mol) 50 piger ITaOH auf 4 bis /;,5 eingestellt und dann wird 2 Stunden bei 5° C gerührt. Der a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-

509819/1121

methylester wird filtriert und nit fünf 50 τηΙ-Αηΐ eilen Nasser τοπ O bis 5° C gewäsehen. Der erhaltene ."x-L-Aspartyl-L-phenylalanin-rnethyleeter wird im Yakuurrferockenschrank getrocknet. Die Ausbeute betragt 33 »65 S bei einer Reinheit von mehr als 98 fo (durch Dünnschichtchrornatographie).

Beispiel 12

:*-L-Ap^-Da rtyl-L-pheny In lanin-rie thy 1·? st er

Eine Lösung von 22,3 g ^-L-Aspartyl-L-pheny!alanin, 24,3 ml 3,76 ι Chlorwasserstoff sirure in Methanol und 25 r.l Methanol wurde 1,5 Stunden bei 30° G gerührt. ITa chel em die Veresterungsreaktion beendet v;ar, wurden 2,35 g 50 -'ige I7atriu:nhydro:-:i;Hösimg tropfenv;eise v/ährend einer Dauer von 12 Minuten zugegeben, um da ε υηιιηι-gesetate a-L-Aspartyl-L-phenylalanin auszufallen. Die Realrfcions-Eiasse v;ur;le 45 Hinuten bei Raumtenperatur gerührt. Das kristalline a-L-Aspartyl-L-phe:iylalanin v;urde durch Filtration entfernt. Der a-L-Aspartyl-L-phenyalanin-Kuchen wurde nit zwei 10 nl-Anteilen Methanol gewaschen und getrocknet, wobei 6,5 g "x-L-Aspartyl-Ii-phenylalanin erhalten v;urden(90 % rein, bestirint durch DSC).

Das Eiltrat und die Waschflüssiglceiten wurden in das Realctionsgefä.?· zurückgegeben und das !-!ethanol wurde durch Vakuumdestillation entfernt. Zu den Rückstand nach der Destillation wurden 45 ml Wasser und 3,3 ml 57 ^ige Chlorwasserstoffεε-ure gegeben. Die Reaktionsraasse wurde 1,5 Stunden bei 0 bis 5° C gerührt und das feste Hydrochlorid von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-nethylester wurde durch Filtration gewonnen.

Der erhaltene Kuchen wurde in 120 ml "asser von 50° C gelöst und der pH-^T.fert der resultierenien Lösung wurde durch Zugabe von 5,2 g 50 ^iger ITatriunhydroxidlösung auf 4,5 eingestellt. Die resultierende Masse wurde 1,5 Stunden bei 0 bis 5° C gerührt uni der ausgefüllte a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-riSthylester " urie durch Filtration gewonnen. Der erhaltene Kuchen wurde mit fünf

509819/1121 «, ₀WQ.nal

6 rnl-Anteilen Wasser von O "bis 5 O gewaschen und dann getrocknet«, v/obei 6,7g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-nethylester einer Reinheit von mehr als 93 % erhalten wurden (bestinat durch DZC),

09819/1 1 2

Claims

' 1. Verfahren zur Herstellung eines n-L-Aspartyl-L-phenylalaninalkylesters, dadurch gekennzeichnet , daß man IT-geschütztes L-Asparaginsäureanhydrid mit L-Phenylalanin unter Bildung von IT-geschütztem a-L-Aspartyl-L-phenylalanin umsetzt, die Schutzgruppe von dem H-geschützten a-L-Aspartyl-L-phenylalanin entfernt, das gebildete a-L-Aspartyl-L-phenylalanin mit einem Alkanol verestert und den erhaltenen cc-L-Aspartyl-L-phenylalaninalkylester gewinnt. *
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als N-geschütztes L-Asparaginsäureanhydrid N-3?ormyl-L-asparaginsäureanhydrid verwendet.
3« Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man das H-Formyl-L-asparaginsäurearihydrid in Gegenv;art von Eisessig mit L-Phenylalanin umsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch g e k e η η zeichnet, da ß nan die Pormylgruppe aus dem IT-P or my l-α -L-aspartyl-L-phenylalanin durch Hydrolyse entfernt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß man die Hydrolyse durch Behandlung des IT-IOrmyl-a-L-aspartyl-L-phenylalanins mit einer wässrigen Lösung von Chlor-

509819/1121

wasserstoffsäure vornimmt.
6. 'Verfahren nach einem .der Ansprüche 1 bie 5, dadurch gekennzeichnet,, daß man die Veresterung in Gegenwart ▼on Chlorwasserstoff durchführt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man den erhaltenen a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-^alkylester in Form eines Säuresalzes gewinnt.
8. Yerfaliren nach Anspruch 7# dadurch gekennzeichnet , daß man als Säuresalz ein Salz der Chlorwasserstoffaäurt verwendet»
9* . Yerfahren nach einen der Ansprüche 1 bis β «dadurch gekennzeichnet, da3 tuen als Alkenol Methanol verwendet.
10. Verfahren na oh Anspruch 1, dadaroh gekennzeichnet , daß man N-Pornyl-L-ae^arflginJäureönhydrid mit !-Phenylalanin in Eisessig unter Bildung von Ϊ-?ornyl-a-«spartyl-L-phenylalanin umsetzt, die foraylgvuppe duich Hydrolyse alt #±Ufc wÄIerigen Lösung von OhlorwaaaeratoffattDvf t«e des Ä*3Par«ja-a-L-aapartyl-L-phanjlalanin entfernt, das erhaltene a-L-AepartJrl-L-phenylalanin mit Methanol in Gegenvurt von Chlqrwaaeeratofi verestert und den erhaltenen «•^L'U.aiartyl^L-phenylalattin-^aettiyl eeter gewinnt.

5098 1 9/ Tt 21 copy_{gA0 üftiöWAL}
11. N-geschütztes π-L-Aspartyl-L-phenylalanin.
12. iT-Formyl-a-L-aspartyl-L-phenylalanin.

509819/1121

COPY