DE2005658C - Verfahren zur Herstellung von Des-Phenylalanin hoch B 1-Insulin - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur riert man mit der 5-bis lOfachen Gewi;htsmenge 1-bis

Herstellung von Des-PhenyIalanin^Bl-insulin, das da- 2prozentiger Essigsäure und Wasser und trocknet im

durch gekennzeichnet ist, daß man Insulin in einer Vakuum über P₂O₅.

Mischung, die aus einem Ν,Ν'-Dialkylcarbonsäure- 30 Zur Herstellung der Phenylthiocarbamoylverbin-

amid mit insgesamt 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und dung löst man das Produkt vorteilhaft in der etwa 20-

einer wäßrigen Pufferlösung von einem pH-Wert von bis SOfachen Menge etwa 60- bis 95prozentigen wäß-

8,0 bis 0,0 besteht, mit einem Überschuß an tert. Butyl- rigen Pyridins — bevorzugt 80- bis 95prozentig — fügt

oxycarbonyl-azid bei Raumtemperatur oder leicht er- 1,5 bis 4 mMol eines Phenylsenföls zu, das gegebenen-

höhten Temperaturen umsetzt, anschließend mit 2 bis 35 falls substituiert sein kann. An Stelle des Pyridins kann

4 Äquivalenten eines unsubstituierten oder mit nega- auch Dimethylformamid als Lösungsmittel verwendet

tiven Substituenten versehenen Phenylisothiocyanats werden. Als Substituenten des Phenylsenföls kommen

umsetzt und das Reäktionsprodukt mit einer starken negative Substituenten wie z. B. Chlor, Nitro- oder

Säure wie z. B. Trifluoressigsäure behandelt. Trifluormethyl in Frage. Man rührt 3 bis 20 Stunden

Des-PhenyIalanin^BI-insulin wurde bisher aus Fluo- 40 — vorzugsweise 3 bis 6 Stunden -— bei Raumtempe-

rescein- oder Phenyl-thiocarbamoyl^BI-insulin durch ratur, wobei man zweckmäßig bei auftretender Trü-

Edman-Abbau erhalten. Beim Umsatz des Insulins mit bung (Hinweis auf beginnende Denaturierung des

den entsprechenden Isothiocyanaten zu den Thio- Reaktionsproduktes) die Umsetzung beendet. Man

carbamoylverbindungen entstehen aber stets Ge- kann auch unter entsprechender Verkürzung bzw.

mische, da drei vorhandene Aminogruppen in unter- 45 Verlängerung der Reaktionszeit bei etwa 40 oder bei

schiedlichem Maße reagieren können. Diese Gemische 0 bis 10°C arbeiten.

mußten bisher mühsam durch Säuienchromatographie Nach beendeter Reaktion wijd das Reaktionspro-

in 8 M-Harnstoff oder durch Gel-Elektrophorese ge- dukt mit Äther ausgefällt, Γ bis 2 Stunden in der etwa

trennt werden, ehe man nach Edman-Abbau einheit- lOfachen Gewichtsmenge Trifluoressigsäure aufbe-

liche Verbindungen erhielt. Solche Trennungen sind 50 wahrt, wieuerum mit Äther ausgefällt und in bekannter

aber nur in kleinem Maßstab möglich und dienten bis- Weise bei einem pH-Wert von 5,0 bis 5,5 kristallisiert,

her vor allem analytischen Zwecken. Die Aminosäureanalyse der Verbindung zeigt die er-

Demgegenüber läßt sich das erfindungsgemäße Ver- wartete Zusammensetzung. Eine typische Analyse mit

fahren mühelos in größeren Maßstab übertragen, was Glutaminsäure als Bezugssubstanz lautet z. B. für Jie

den besonderen Vorteil dieses Verfahrens ausmacht. 55 interessierenden Aminosäuren:

Bei der Reaktion von tert. Butyloxycarbonyl-azid

mit Insulin entsteht überraschenderweise unter den ge- _G]u. _{berechnet 7} gefunden 7,00;
nannten Bedingungen des Verfahrens der Erfindung

ganz überwiegend das N«<^A1>, N'<^B">-Di-tert. Butyl- GIy: berechnet 4, gefunden 3,98;

oxycarbonyl-insulin, dessen noch freie Aminogruppe 60 p_ne: berechnet 2, gefunden 2,06;

am Phenylalanin¹⁵¹ nun selektiv mit einem Phenyliso- , _f . _{Λ ni}

thiocyanat umgesetzt wird. Bei der anschließenden ^Ly^s: berechnet 1, gefunden 1,01.
Behandlung des Reaktionsproduktes mit einer starken

Säure, bevorzugt Trifluoressigsäure, werden gleich- Das erfindungsgemäß hergestellte Des-Phenylala-

zeitig die beiden tert. Butyloxycarbonylgruppen und 65 nin^B1-insulin besitzt die bereits bekannten Eigen-

das Phenylalanin⁰¹ (als Thiazolinon) abgespalten. schäften der Verbindung. Seine vorteilhafte und

Als Ausgangsprodukt kommt Insulin verschiedener spezielle Verwendung als Arzneimittel (als Antidiabeti-

Spezies in Frage, bevorzugt verwendet man Rinder- cum) beruht auf einigen gegenüber Insulin veränderten

3 4

physikalischen Eigenschaften, z.B. der veränderten kann auch 10 Minuten bei 50³C oder 5 Minuten

Löslichkeit der Verbindung. unter Rückfluß vorgenommen werden.

Beispiele Beispiel2

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung 5 Man setzt 1 g Rindei-Insulin nach Beispiel 1 um und

näher erläutern. Zur Charakterisierung der acylierten erhält 710 mg Des-PhenyIaIanin^B1-insuIin (Rind).

Insuline diente die Papierelektrophorese (6 Stunden . . . ,

Volt: in Essigsäure/Ameisensäure pH 2: Anfärben H ei spiel J

mit Bromphenolblau); zur Kontrolle der Abspaltung Man setzt 1 g Rinder-Insulin nach Beispiel 1 um,

von Phenylalanin dienten die Elektrophorese und die io führt jedoch die Reaktion b) während 50 Stunden bei

Aminosäure-Analyse. +5⁰C in 85prozentigem Pyridin durch.

Ausbeute: 695 mg Des-Phenylalanin¹³¹-insulin

Beispiel 1 (Rind).

Beispiel 4

a) 1 g (0.167 mMol) Schweine-Insulin werden in 15

70 ecm 80prozentigem Dimethylacetamid aufge- Man setzt 1 g Schweine-Insulin nach Beispiel 1 um,

nommen. Niin gibt 1,45 g (10 mMol) tert. Butyl- führt jedoch die Reaktion b) während 1 Stunde bei

oxycarbonyl-azid und 3,3 ecm (3,3 mMol)l N Na- 40⁰C durch.

triumbi'.arbonat zu und rührt 5 Stunden bei 35°C. Ausbeute: 725 mg Des-Phenylalanin¹³¹-insulin

Dann wird die Lösung im Vakuum bei höchstens 20 (Schwein).

50° C Badtemperatur eingeengt. Den Rückstand Beispiel 5 verreibt man mit Äther und erhält 1,275 g salzhaltiges Produkt, das nach Digerieren mit 20 ecm Man setzt 1 g Misch-Insulin (Rind und Schwein) 2prozentige Essigsäure- 945 mg hH^A1> · N'<^B29)- nach Beispiel 1 um, stellt jedoch in Reaktion b) mit •Di-tert. Butyloxycarbonyiinsulin (Schwein) ergibt, as 0,3 mMol 4-Nitro-phenylisothiocyanat während 2 Stun-

b) Diese Verbindung wird in 4 ecm 95prozentigem den bei Raumtemperatur die entsprechende 4-Nitro-Pyridin gelöst. Man gibt 0,0365 ecm Phenyliso- phenylthiocarbamoyl-Verbindung her.

thiocyanat zu und rührt 4 Stunden bei Raum- _R . . ,,

tempera:>jr. Dann wird im Vakuum bei höchstens ^p

50⁰C Badtemperatur auf ein kleines Volumen ein- 30 Man setzt Ig Rinder-Insulin nach Beispiel 1 um,

geengt und die Verbindung mit Äther ausgefällt. stellt jedoch in Reaktion b) mit 0,4 mMol 4-Chlor-

Ausbeute: 820 mg N'<^A1> · N'<^B"'-Di-tert. Butyl- phenylisothiocyanat während 3 Stunden bei Raum-

oxycarbonyl - N^a<^B1> - phenylthiocarbamoyl - in- temperatur die entsprechende 4-Chlorphenylthiocarb-

sulin (Schwein). amoyl-Verbindung her.

c) 820 mg der nach b) hergestellten Verbindung 35 R ' ' 1 7 werden 1 Stunde in 8,5 ecm Trifluoressigsäure bei ^p

Raumtemperatur aufbewahrt. Auf Zusatz von Man setzt 1 g Schweine-h.s-ilin nach Beispiel 1 um,

100 ecm Äther fallen 720 mg Des-Phenylalanin^B1- stellt jedoch in Reaktion b) mit 0,3 mMol 3-Trinuor-

insulin (Schwein) aus, die in bekannter Weise bei methylphenylisothiocyanat während 2 Stunden bei

pH 5,0 bis 5,5 zur Kristallisation gebracht ν erden 40 Raumtemperatur die entsprechende 3-Trifluormethyl-

können. Die Behandlung mit Trifluoressigsäure thiocarbamoyl-Verbindung her.

Claims (1)

1. ι 2

   oder Schweineinsulin oder ein Gemisch dieser beiden

   Patentansprüche: Insuline in beliebigem Mischungsverhältnis.

   Das erfindungsgemäße Verfahren wird beispiels-

   1. Verfahren zur Herstellung von Des-Phenyl- weise so durchgeführt, daß man 1 mMol Insulin in der alanin^BMnsulin, dadurch gekennzeich- 5 30-bis 70fachen Gewichtsmenge eines N₁N -Dialkyin e t, daß man Insulin in einer Mischung, die aus carbonsäureamides, welches bis zu etwa -5 /„Wasser einem N.N'-Dial.kylcarbonsäureamid mit insge- enthalten kann, suspendiert bzw. löst. Als Dialkylsamt 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und einer wäßrieen carbonsäureamid werden beispielsweise verwendet: Pufferlösung von einem pH-Wert v_Cn 8,0 bis 9,0 Dimethylformamid, Dimethyiacetamid, Diatnyliormbesteht, mit einem Überschuß an tert. Butyloxy- io amid oder N-Methylpyrrolidon. Anschließend werden carbonyl-azid bei Raumtemperatur oder leicht er- 20 bis 75 mMol tert. Butyloxycarbonyl-azid und eine höhten Temperaturen umsetzt, anschließend mit Pufferlösung in 2,5- bis 4facher Volumenmenge, oe-2 bis 4 Äquivalenten eines unsubstituierten oder zogen auf das Gewicht des eingesetzten Insulins, zumit einem negativen Substituenten versehenen gegeben und anschließend 3 bis 6 Stunden bei etwa Phenylisothiocyanats umsetzt und das Reaktions- 15 35 bis 40⁰C gerührt. Als Pufferlösung können z. B. produkt mit einer starken Säure behandelt. 1 N-Alkalibicarbonat oder Alkaliphosohatpuffer von

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- pH 8,0 bis 9,0 verwendet werden. Die Reaktionszeichnet, daß als starke Säure Trifluoressigsäure temperatur kann auch auf etwa 50⁰C gesteigert werverwendet wird. den, bevorzugt sind jedoch etwa 35 bis 40 C. Die Um-

   ao setzung läuft bereits bei Raumtemperatur ab, jedoch wird dann die 4- bis 6fache Zeit benötigt.
   Zur intermediären Isolierung des Di-tert. Butyjoxy-

   carbonylinsulins fällt man entweder direkt mit Äther

   aus oder bringt die Lösung zuerst bei höchstens 50⁰C

   35. Badtemperatur irr. Vakuum zur Trockne und verreibt

   dann mit Äther. Zur Entfernung der Puffersalze dige-