DE2005658A1

DE2005658A1 - Verfahren zur Herstellung von Des Phenylalanin hoch Bl insulin

Info

Publication number: DE2005658A1
Application number: DE19702005658
Authority: DE
Inventors: Rolf Dipl Chem Dr 6000 Frankfurt P Geiger
Original assignee: Farbwerke Hoechst AG, vorm Meister Lucius & Bruning, 6000 Frankfurt
Priority date: 1970-02-07
Filing date: 1970-02-07
Publication date: 1971-09-02
Also published as: BE762575A; NO133590B; JPS5136276B1; IE34934L; ZA71673B; PL81164B1; DK139577B; GB1340924A; BG17979A3; CH569700A5; IL36124A0; NL168502C; FI53304C; AT308293B; CA945143A; CS155966B2; ES387934A1; IL36124A; SU385436A3; FI53304B

Description

FARBWERKE HOECHST AG., vormals Meister Lucius & Brüning Aktenzeichen: - HOE 70/P 01h Datum: 5. Febr. 1970 - Dr.Hg/kä

Bl Verfahren zur Herstellung von Des-Phenylalanin -insulin

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von

Bl
Des-Phenylalanin -insulin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Insulin in einer Mischung, die aus einem N.N'-Dialkylearbonsäureamid mit insgesamt 3 - 6 Kohlenstoffatomen und einer wässrigen Pufferlösung von einem pH-Wert von 8.0 - 9*0 besteht, mit einem Überschuß an tert. Butyloxycarbonyl-azid bei Raumtemperatur oder leicht erhöhten Temperaturen umsetzt, anschließend mit 2-4 Äquivalenten eines unsubstituierten oder mit einem negativen Substituenten versehenen Phenylisothiocyanats umsetzt und das Reaktionsprodukt mit einer starken Säure wie z.B. Trifluoressigsäure behandelt.

Bl
Des-Phenylalanin -insulin wurde bisher aus Fluorescein- oder

Bl
Phenyl-thiocarbamoyl -insulin durch Edman-Abbau erhalten. Beim Umsatz des Insulins mit den entsprechenden Isothiocyanaten zu den Thiocarbamoy!verbindungen entstehen aber stets Gemische, da drei vorhandene Aminogruppen in unterschiedlichem Maße reagieren können. Diese Gemische mußten bisher mühsam durch Säulenchromatographie in 8 M Harnstoff oder durch Gel-Elektrophorese getrennt werden, ehe man nach Edman-Abbau einheitliche Verbindungen erhielt. Solche Trennungen sind aber nur in kleinem Maßstab möglich und dienten bisher vor allem analytischen Zwecken.

Demgegenüber läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren mühelos in größeren Maßstab übertragen, was den besonderen Vorteil dieses Verfahrens ausmacht.

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- 2 - HOE 70/F O^h

Bei der Reaktion von tert. Butyloxycarbonyl-azid mit Insulin entsteht überraschenderweise unter den genannten Bedingungen des Verfahrens der Erfindung ganz überwiegend das N ' '* N * "'-Di-tert. Butyloxycarbonyl-insulin, dessen noch freie Aminogruppe am Phenylalanin nun selektiv mit einem Phenylisothiocyanat umgesetzt wird. Bei der anschließenden Behandlung des Reaktionsproduktes mit einer starken Säure, bevorzugt Trifluoressigsäure, werden gleichzeitig die beiden tert. Butyloxycarbonylgruppen und das Phenylalanin (als Thiazolinon) abgespalten.

^ Als Ausgangsprodukt kommt Insulin verschiedener Spezies in Frage, bevorzugt verwendet man Rinder- oder Schweineinsulin oder ein Gemisch dieser beiden Insuline in beliebigem Mischungsverhältnis.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird beispielsweise so durchgeführt, daß man 1 mMol Insulin in der 30 - 70-fachen Gewichtsmenge eines N.N¹-Dialkyl-carbonsäureamides , welches bis zu etwa 25 % Wasser enthalten kann, suspendiert bzw. löst. Als Dialkylcarbonsäureamid werden beispielsweise verwendet: Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Diäthylformamid oder M-Methylpyrrolidon. Anschließend werden 20 - 75 mMol tert. Butyloxycarbonyl-azid und eine Pufferlösung in 2,5 - 4-facher ψ Volumen-menge, bezogen auf das Gewicht des eingesetzten Insulins, zugegeben und anschließend 3-6 Stunden bei etwa 35 - ²K)⁰ C gerührt. Als Pufferlösung können zum Beispiel 1 NAlkalibicarbonat oder Alkaliphosphatpuffer von pH 8,0 - 9,0 verwendet werden. Die Reaktionstemperatur kann auch auf etwa 50° C gesteigert werden, bevorzugt sind jedoch etwa 35-^0 ^c Die Umsetzung läuft bereits bei Raumtemperatur ab, jedoch wird dann die 4 - 6-fache Zeit benötigt.

! Il 9 H j G / I b Ü y

- 3 - HOE 70/P OlU

Zur intermediären Isolierung des Di-tert. Butyloxycarbonylinsulins fällt man endweder direkt mit Äther aus oder bringt die Lösung zuerst bei höchstens 50 G Badtemperatur im Vakuum zur Trockne und verreibt dann mit Äther, Zur Entfernung der Puffersalze digeriert man mit der 5 " 10-fachen Gewichtsmenge 1 - 2-proz. Essigsäure und Wasser und trocknet im Vakuum über P₂ ⁰K*

Zur Herstellung der Phenylthioearbamoylverbindung löst man das Produkt vorteilhaft in der etwa 20 - 50-fachen Menge etwa 6o - 95~P^roz· wässrigen Pyridine - bevorzugt 80 - 95~P**oz. fügt 1»5 - k mMol eines Phenylsenföls zu, das gegebenenfalls substituiert sein kann. An Stelle des Pyridins kann auch Dimethylformamid als Lösungsmittel verwendet werden. Als Substituenten des Phenylsenföls kommen negative Substituenten wie z.B. Chlor, Nitro- oder Trifluormethyl in Präge. Man rührt 3-20 Stunden - vorzugsweise 3-6 Stunden - bei Raumtemperatur, wobei man zweckmäßig bei auftretender Trübung (Hinweis auf beginnende Denaturierung des Reaktionsproduktes) die Umsetzung beendet· Man kann auch unter entsprechender Verkürzung bzw. Verlängerung der Reaktionszeit bei etwa 40 C oder bei 0 - 10° C arbeiten.

Nach beendeter Reaktion wird das Reaktionsprodukt mit Äther ausgefällt, 1-2 Stunden in der etwa 10-fachen Gewichtsmenge Trifluoressigsäure aufbewahrt, wiederum mit Äther ausgefällt und in bekannter Weise bei einem pH-Wert von 5»0 - 5i5 kristallisiert.

Die Aminosäureanalyse der Verbindung zeigt die erwartete Zusammensetzung. Eine typische Analyse mit Glutaminsäure als Bezugssubstanz lautet z. B. für die interessierenden Aminosäuren:

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- 4 - HOE 70/F 01 ^

GIu Ber. 7 Gef. 7.OO

GIy Ber. 4 Gef. 3.98

Phe Ber. 2 Gef. 2.06

Lys Ber. 1 Gef. 1.01

Bl

Das erfindungsgemäß hergestellte Des-Phenylalanin -insulin besitzt die bereits bekannten Eigenschaften der Verbindung. Seine vorteilhafte und spezielle Verwendung als Arzneimittel (als Antidiabeticum) beruht auf einigen gegenüber Insulin veränderten physikalischen Eigenschaften, z.B. der veränderten Löslichkeit der Verbindung.

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- 5 - HOE 70/F 01*1

Beispiele

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Zur Charakterisierung der acylierten Insuline diente die Papierelektrophorese (6 Stunden 200 Volt: in Essigsäure/ Ameisensäure pH 2: Anfärben mit Bromphenolblau); zur Kontrolle der Abspaltung von Phenylalanin dienten die Elektrophorese und die Aminosäure-Analyse.

Beispiel 1

a) 1 g (0,167 mMol) Schweine-Insulin werden in 7° ecm 80-proz. Dimethylacetamid aufgenommen. Man gibt 1,^5 g (1O mMol) tert.Butyloxycarbonyl-azid und 3»3 ecm (3i3 mMol) 1N Natriumbicarbonat zu und rührt 5 Stunden bei 35 C. Dann wird die Lösung im Vakuum bei höchstens 50 C Badtemperatur eingeengt« Den Rückstand verreibt man mit Äther und erhält 1.275 S salzhaltiges Produkt, das nach Digerieren mit 20 ecm 2-proz. Essigsäure 9²*5 mg Ν^α'^Α1'.Ν '^B29^-Di-tert.Butyloxycarbonylinsulin (Schwein)ergibt.

b) Diese Verbindung wird in k ecm 95-P^r°z. Pyridin gelöst. Man

gibt Ο.Ο365 ecm Phenylisothiocyanat zu und rührt h Stunden λ bei Raumtemperatur. Dann wird im Vakuum bei höchstens $0 C Badtemperatur auf ein kleines Volumen eingeengt und die Verbindung mit Äther ausgefällt.

Ausbeute: 820 mg N**^^A1'.N '^B29'-Di-tert.Butyloxycarbonyl-

^a(Bi) /

N ^v '-phenylthiocarbamoyl-insulin (Schwein).

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. 6 - ^H0E 70/F 01^

c) 820 mg der nach b) hergestellten Verbindung werden 1 Stunde in 8,5 ecm Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur aufbev/ahrt. Auf Zusatz von 100 ecm 'ither fallen 720 mg Des-Phenylalanin insulin (Schwein) aus, die in bekannter V/eise bei pH 5,0 bis 5,5 zur Kristallisation gebracht werden können. Die Behandlung mit Trifluoressigsäure kann auch 10 Minuten bei 50 C oder 5 Minuten unter Rückfluß vorgenommen werden.

Beispiel 2

Man setzt 1 g Rinder-Insulin nach Beispiel 1 um und erhält

Bl
710 mg Des-Phenylalanin -insulin (Rind).

Beispiel 3

Man setzt 1 g Rinder-Insulin nach Beispiel 1 um, führt jedoch die Reaktion b) während 50 Stunden bei +5 C in 85-proz. Pyridin durch.

Bl '

Ausbeute: 695 mg Des-Phenylalanin -insulin (Rind).

Beispiel

Man setzt 1 g Schweine-Insulin nach Beispiel 1 um, führt jedoch die Reaktion b) während 1 Stunde bei 40° C durch.

Bl
Ausbeute: 7²5 mg Des-Phenylalanin -insulin (Schwein).

Beispiel 5

Man setzt 1 g Misch-Insulin (Rind und Schwein) nach Beispiel 1 um, stellt jedoch in Reaktion b) mit 0,3 «Mol 4-Nitro-phenyl-

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isothiocyanat während 2 Stunden bei Raumtemperatur die entsprechende 4-Nitrophenylthiocarbamoyl-Verbindung her.

Beispiel 6

Man setzt 1 g Rinder-Insulin nach Beispiel 1 um, stellt jedoch in Reaktion b) mit 0,4 mMol 4-Chlorphenylisothiocyanat während 3> Stunden bei Raumtemperatur die entsprechende 4-Chlorphenylthiocarbamoyl-Verbindung her.

Beispiel 7

Man setzt 1 g Schweine-Insulin nach Beispiel 1 um, stellt jedoch in Reaktion b) mit 0,3 irMol 3-Trifluormethylphenylisothiocyanat während 2 Stunden bei Raumtemperatur die entsprechende 3-Trifluormethylthiocarbamoy!-Verbindung her.

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Claims

_ 8 - ^II0E 70/F 01 k

Patentanspruch

Rl Verfahren zur Herstellung von Des-Phenylalanin -insulin, dadurch gekennzeichnet, daß man Insulin in einer Mischung, die aus einem N.N¹-Dialkylcarbonsäureamid mit insgesamt 3-6 Kohlenstoffatomen und einer wässrigen Pufferlösung von einem pH-V/ert von 8.0 - 9·0 besteht, mit einem Überschuß an tert. Butyloxycarbonyl-azid bei Raumtemperatur oder leicht erhöhten Temperaturen umsetzt, anschließend mit 2-4 äquivalenten eines unsubstituierten oder mit einem negativen Substituenten versehenen Phenylisothiocyanats umsetzt und das Reaktionsprodukt mit einer starken Säure v;ie z.B. Trifluoressigsäure behandelt.

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