DE2005658B2

DE2005658B2 - Verfahren zur herstellung von des-phenylalanin hoch b 1-insulin

Info

Publication number: DE2005658B2
Application number: DE19702005658
Authority: DE
Inventors: Rolf Dipl.-Chem.Dr. 6000 Frankfurt Geiger
Original assignee: Farbwerke Hoechst AG, vormals Meister Lucius & Brüning, 6000 Frankfurt
Priority date: 1970-02-07
Filing date: 1970-02-07
Publication date: 1973-01-11
Also published as: CH569700A5; DK139577B; GB1340924A; AT308293B; CS155966B2; FR2104735B1; NL7101360A; IE34934L; JPS5136276B1; SE370935B; CA945143A; YU25671A; SU385436A3; NL168502C; ZA71673B; IL36124A; RO58860A; NO133590B; FR2104735A1; PL81164B1

Description

Bei der Reaktion von tert. Butyloxycarbonyl-azid

mit Insulin entsteht überraschenderweise unter den ge- _G,_u. _{berechnet 7 ge}f_unden 7,00;

nannten Bedingungen des Verfahrens der Erfindung

ganz überwiegend das N*<ai>, N«<^B29>-Di-tert. Butyl- GIy: berechnet 4, gefunden 3,98;

oxycarbonyl-insulin, dessen noch freie Aminogruppe 60 p_ne: berechnet 2, gefunden 2,06;

am Phenylalanin³¹ nun selektiv mit einem Phenyliso-

thiocyanat umgesetzt wird. Bei der anschließenden ^Ly^{s: berechnet} L gefunden 1,01.

Behandlung des Reaktionsproduktes mit einer starken

Säure, bevorzugt Trifluoressigsäure, werden gleich- Das erfindungsgemäß hergestellte Des-Phenylala-

zeitig die beiden tert. Butyloxycarbonylgruppen und 65 nin^B1-insulin besitzt die bereits bekannten Eigendas Phenylalanin³¹ (als Thiazolinon) abgespalten. schäften der Verbindung. Seine vorteilhafte und

Als Ausgangsprodukt kommt Insulin verschiedener spezielle Verwendung als Arzneimittel (als Antidiabeti-Spezies in Frage, bevorzugt verwendet man Rinder- cum) beruht auf einigen gegenüber Insulin veränderten

physikalischen Eigenschaften, ζ. B. der veränderten kann auch 10 Minuten bei 50⁰C oder 5 Minuten

Löslichkeit der Verbindung. unter Rückfluß vorgenommen werden.

Beispiele Beispiel 2

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung S Man setzt 1 g Rindei-Insulin nach Beispiel 1 um und näher erläutern. Zur Charakterisierung der acylierten erhält 710 mg Des-PhenylaIanin^B1-insulin (Rind).
Insuline diente die Papierelektrophorese (6 Stunden . .

Volt: in Essigsäure/Ameisensäure pH 2: Anfärben B e ι s ρ ι e 1 3

mit Bromphenolblau); zur Kontrolle der Abspaltung Man setzt Ig Rinder-Insulin nach Beispiel 1 um,

von Phenylalanin dienten die Elektrophorese und die io führt jedoch die Reaktion b) während SO Stunden bei Aminosäure-Analyse. +5⁰C in 85prozentigem Pyridin durch.

Ausbeute: 695 mg Des - Phenylalanin⁰¹- insulin Beispiel 1 (Rind).

a) 1 g (0,167 mMol) Schweine-Insulin werden in 15

70 ecm 80prozentigem Dimethylacetamid aufge- Man setzt 1 g Schweine-Insulin räch Beispiel 1 um,

nom^en. Man gibt 1,45 g (10 mMol) tert. Butyl- führt jedoch die Reaktion b) während 1 Stunde bei

oxycarbonyl-azid und 3,3 ecm (3,3 mMol)l N Na- 40⁰C durch.

triumbicarbonat zu und rührt 5 Stunden bei 35° C. Ausbeute: 725 mg Des-Phenylalanin⁸¹-insulin Dann wird die Lösung im Vakuum bei höchstens 20 (Schwein).
50° C Badtemperatur eingeengt. Den Rückstand Beispiel 5
verreibt man mit Äther und erhält 1,275 g salzhaltiges Produkt, das nach Digerieren mit 20 ecm Man setzt 1 g Misch-Insulin (Rind und Schwein) 2prozentige Essigsäure 945 mg N<*<^Al> · N«^(B28)- nach Beispiel 1 um, stellt jedoch in Reaktion b) mit Di-tert. Butyloxycarbonylinsulin (Schwein) ergibt. 25 0,3 mMol 4-Nitro-phenylisothiocyanat während 2 Stun-

b) Diese Verbindung wird in 4 ecm 95prozentigem den bei Raumtemperatur die entsprechende 4-Nitro-Pyridin gelöst. Man gibt 0,0365 ecm Phenyliso- phenylthiocarbamoyl-Verbindung her.

thioc^anat zu und rührt 4 Stunden bei Raum- _R . . . ,

temperatur. Dann wi-d im Vakuum bei höchstens Beispiel

5O⁰C Badtempc-atur auf ein kleines Volumen ein- 30 Man setzt Ig Rinder-Insulin nach Beispiel 1 um,

geengt und die Verbindung mit Äther ausgefällt. stellt jedoch in Reaktion b) mit 0,4 mMol 4-Chlor-

Ausbeute: 820 mg N*<^Al> · N"<^B28>-Di-tert. Butyl- phenylisothiocyanat während 3 Stunden bei Raum-

oxycarbonyl - N"<^B1> - phenylthiocarbamoyl - in- temperatur die entsprechende 4-Chlorphenylthiocarb-

sulin (Schwein). amoyl-Verbindung her.

c) 820 mg der nach b) hergestellten Verbindung 35 . . . _
werden 1 Stunde in 8,5 ecm Trifluoressigsäure bei B e > s ρ 1 e 1 /
Raumtemperatur aufbewahrt. Auf Zusatz von Man setzt 1 g Schweine-Insulin nach Beispiel 1 um, 100 ecm Äther fallen 720 mg Des-Phenylalanin^Bl- stellt jedoch in Reaktion b) mit 0,3 mMol 3-Trifluorinsulin (Schwein) aus, die in bekannter Weise bei methylphenylisothiocyanat während 2 Stunden bei pH 5,0 bis 5.5 zur Kristallisation gebracht werden 40 Raumtemperatur die entsprechende 3-Trifluormethylkönnen. Die Behandlung mit Trifluoressigsäure thiocarbamoyl-Verbindung her.

Claims

oder Schweineinsulin oder ein Gemisch dieser beiden Patentansprüche: Insuline in beliebigem Mischungsverhältnis. Das erfindungsgemäße Verfahren wird beispiels-

1. Verfahren zur Herstellung von Des-Phenyl- weise so durchgeführt, daß man 1 mMol Insulin in der alanin^B1-insulin, dadurch gekennzeich- 5 30-bis 70fachen Gewichtsmenge eines N.N'-Dialkyln e t, daß man Insulin in einer Mischung, die aus carbonsäureamides, welches bis zu etwa 25°/o Wasser einem N.N'-Dialkylcarbonsäureamid mit insge- enthalten kann, suspendiert bzw. löst. Als Dialkylsamt 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und einer wäßrigen carbonsäureamid werden beispielsweise verwendet: Pufferlösung von einem pH-Wert von 8,0 bis 9,0 Dimethylformamid, DimeÜrylacetamid, Diäthylformbesteht, mit einem Überschuß an tert. Butyloxy- io amid oder N-Methylpyrrolidon. Anschließend werden carbonyl-azid bei Raumtemperatur oder leicht er- 20 bis 75 mMol tert. Butyloxycarbonyl-azid und eine höhten Temperaturen umsetzt, anschließend mit Pufferlösung in 2,5- bis 4facher Volumenmenge, be-2 bis 4 Äquivalenten eines unsubstituierten oder zogen auf das Gewicht des eingesetzten Insulins, zumit einem negativen Substituenten versehenen gegeben und anschließend 3 bis 6 Stunden bei etwa Phenylisothiocyanats umsetzt und das Reaktions- 15 35 bis 40⁰C gerührt. Als Pufferlösung können z. B. produkt mit einer starken Säure behandelt. 1 N-A:kalibicarbonat oder Alkaliphosphatpuffer von

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- pH 8,0 bis 9,0 verwendet werden. Die Reaktionszeichnet, daß als starke Säure Trifluoressigsäure temperatur kann auch auf etwa 50⁰C gesteigert werverwendet wird. den, bevorzugt sind jedoch etwa 35 bis 40 C. Die Um-

20 setzung läuft bereits bei Raumtemperatur ab, jedoch wird dann die 4- bis 6fache Zeit benötigt.
Zur intermediären Isolierung des Di-tert. Butyjoxy-

carbonylinsulins fällt man entweder direkt mit Äther

aus oder bringt die Lösung zuerst bei höchstens 50^C

25 Badtemperatur im Vakuum zur Trockne und verreibt

dann mit Äther. Zur Entfernung der Puii>.rsalze dige-

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur riert man mit der 5-bis 1Ofachen Gewichtsmenge 1-bis Herstellung von Des-Phenylalanin^B1-insulin, das da- 2prozentiger Essigsäure und Wasser und trocknet im durch gekennzeichnet ist, daß man Insulin in einer Vakuum über P₂O₅.

Mischung, die aus einem Ν,Ν'-Dialkylcarbonsäure- 30 Zur Herstellung der Phenylthiocarbamoylverbinamid mit insgesamt 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und dung löst man das Produkt vorteilhaft in der etwa 20-einer wäßrigen Pufferlösung von einem ρ H-Wert von bis 50fachen Menge etwa 60- bis 95prozentigen wäß-8,0 bis 9,0 besteht, mit einem Überschuß an tert. Butyl- rigen Pyridins — bevorzugt 80- bis 95prozentig — fügt oxycarbonyl-azid bei Raumtemperatur oder leicht er- 1,5 bis 4 mMol eines Phenylsenföls zu, das gegebenenhöhten Temperaturen umsetzt, anschließend mit 2 bis 35 falls substituiert sein kann. An Stelle des Pyridins kann 4 Äquivalenten eines unsubstituierten oder mit nega- auch Dimethylformamid als Lösungsmittel verwendet tiven Substituenten versehenen Pbenylisothiocyanats werden. Als Substituenten des Phenylsenföls kommen umsetzt und das Reaktionsprodukt mit einer starken negative Substituenten wie z. B. Chlor, Nitro- oder Säure wie z. B. Trifluoressigsäure behandelt. Trifluormethyl in Frage. Man rührt 3 bis 20 Stunden

Des-Phenylalanin^Bl-insuIin wurde bisher aus Fluo- 40 — vorzugsweise 3 bis 6 Stunden — bei Raumtemperescein- oder Phenyl-thiocarbamoyl^B1-insulin durch ratur. wobei man zweckmäßig bei auftretender Trü-Edman-Abbau erhalten. Beim Umsatz des Insulins mit bung (Hinweis auf beginnende Denaturierung des den entsprechenden Isothiocyanaten zu den Thio- Reaktionsproduktes) die Umsetzung beendet. Man carbamoylverbindungen entstehen aber stets Ge- kann auch unter entsprechende- Verkürzung bzw. mische, da drei vorhandene Aminogruppen in unter- 45 Verlängerung der Reaktionszeit bei etwa 40 oder bei schiedlichem Maße reagieren können. Diese Gemische 0 His 10⁰C arbeiten.

mußten bisher mühsam durch Säulenchiomatographie Nach beendeter Reaktion vvird das Reaktionspro-

in 8 M-Harnstoff oder durch Gel-Elektrophorese ge- dukt mit Äther ausgefällt, 1 bis 2 Stunden in der etwa trennt werden, ehe man nach Edman-Abbau einheit- lOfachen Gewichtsmenge Trifluoressigsäure aufbeliche Verbindungen erhielt. Solche Trennungen sind 50 wahrt, wiederum mit Äther ausgefällt und in bekannter aber nur in kleinem Maßstab möglich und dienten bis- Weise bei einem pH-Wert von 5,0 bis 5,5 kristallisiert, her vor allem analytischen Zwecken. Die Aminosäureanalyse der Verbindung zeigt die er-

Demgegenüber läßt sich das erfindungsgemäße Ver- wartete Zusammensetzung. Eine typische Analyse mit fahren mühelos in größeren Maßstab übertragen, was Glutaminsäure als Bezugssubstanz lautet z. B. für die den besonderen Vorteil dieses Verfahrens ausmacht. 55 interessierenden Aminosäuren: