DE19824983C2

DE19824983C2 - 2-(3-Aminopropylphosphorsäure)-L-ascorbat, Verfahren zu seiner Herstellung und dieses enthaltende kosmetische Zubereitung zur Aufhellung der Haut

Info

Publication number: DE19824983C2
Application number: DE19824983A
Authority: DE
Inventors: Jong Eon Hong; Ki Hwa Lee; Jun Chul Cho; Jang Sob Lee; Jung No Lee; Ji Min Chun; Dong Il Jang; Ok Sob Lee; Sang Rhin Lee
Original assignee: Pacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2001-06-28
Anticipated expiration: 2018-06-05
Also published as: US5916915A; CN1069904C; JP2926046B2; FR2764891A1; FR2764891B1; CN1201036A; DE19824983A1; JPH111486A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft 2-(3-Aminopropylphosphorsäure)-L-ascorbat mit verbes serter Wasserstabilität, ein Verfahren zu seiner Herstellung und eine kosmeti sche Zubereitung zur Aufhellung der Haut, die dieses als einen aktiven Bestandteil enthält.

L-Ascorbinsäure hat eine hohe Antioxidationsaktivität, die die Biosynthese von Collagen und die Proliferation von Fibroblasten fördert. Insbesondere ist es ein sehr wirksamer Inibitor der Melaninbildung und kann deshalb für örtliche An wendungen zur Verhinderung einer abnormalen Pigmentierung wie etwa Som mersprossen eingesetzt werden.

Ascorbinsäure wird jedoch in wäßrigem Medium leicht durch Oxidation zersetzt, was zu einer Verringerung der Aktivität während längerer Lagerung führt.

Unter diesen Umständen wurden die jüngsten Untersuchungen durchgeführt, um ein neues, in wäßrigem Medium stabiles Derivat zu erhalten. Die Vorge schlagenen Derivate liegen in Form der Ester vor, die durch Veresterung der Hydroxylgruppe in der 2-, 3-, 5- oder 6-Stellung der L-Ascorbinsäure mit einer Phosphat- oder Sulfatgruppe oder mit einer Fettsäure wie Stearinsäure oder Palmitinsäure erhalten werden. Die Esterbindung dieser Derivate kann durch ein hydrolytisches Enzym leicht gespalten werden, um L-Ascorbinsäure freizu setzen und damit für eine effektive physiologische Wirkung der L-Ascorbinsäure zu sorgen. Ein Beispiel ist Magnesium-2-phosphatoascorbat. Diese Verbindung kann durch die Einführung der Phosphatgruppe leicht perkutan resorbiert wer den und liefert der Lederhaut L-Ascorbinsäure, gleichzeitig ist sie selbst im wäßrigen Medium ohne jegliche oxidative Verfärbung sehr stabil. So wurde diese Verbindung als ein aktiver Bestandteil für kosmetische Zubereitungen zur Aufhellung der Haut vorgeschlagen (JP 1-283208 A, JP 3-227907 A).

Magnesium-2-phosphatoascorbat weist trotz der Verbesserung seiner Stabilität jedoch Nachteile auf, weil es im wäßrigen Medium selbst unlösliche Kristalle oder mit anderen Inhaltsstoffen wie anionischen Polymeren und oberflächenak tiven Stoffen Niederschläge bildet. Diese Niederschläge sind vermutlich auf eine geringe Löslichkeit in Wasser zurückzuführen.

Kürzlich ist Ascorbinsäure-2-O-α-glucosid als neues Material vorgeschlagen worden, das keines der obengenannten Probleme oder Nachteile hat. Dieses Derivat wird durch Fermentation hergestellt. Jedoch sind bis heute die perku tane Resorption oder eine Wirkung zur Inhibierung der Melaninbildung unge wiß. Zusätzlich ist es sehr teuer, da es durch Fermentation erzeugt wird.

Deshalb haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung umfangreiche Untersu chungen durchgeführt, um ein neues Derivat zur Verfügung zu stellen, das selbst sehr stabil ist und im wäßrigen Medium keine Niederschläge bildet. Sie haben Anstrengungen unternommen, um L-Ascorbinsäure mit einer Phosphat gruppe an der 2-Hydroxylgruppe zu finden. Als diese Phosphatgruppe zogen sie 3-Aminpropylphosphorsäure in Betracht, die in Wasser eine gute Löslichkeit aufweist, und in jeglicher Art von kosmetischen Zubereitung verwendet werden kann, sofern diese etwas Wasser enthält. Um es genau auszudrücken, führten sie 3-Aminpropylphosphorsäure an der 2-Hydroxylgruppe der L-Ascorbin säure über eine Phosphatesterbindung ein, um 2-(3-Aminpropylphosphor säure)-L-ascorbat herzustellen.

Speziell 3-Aminopropylphosphorsäure ist selbst ein aktiver kosmetischer Stoff, der die Fähigkeit der Haut zur Retention von Feuchtigkeit und zur Erholung bei Narbenbildung sowie ihre Festigkeit erhöhen kann und daher die Hautalte rung wirksam verzögert. Zusätzlich verursacht es keine Hautreizung und ist stabil, so daß es einfach in die kosmetischen Produkte formuliert werden kann, weiterhin kann es das Zellwachstum und die Biosynthese des Hautkollagens fördern. Basierend auf diesen Effekten und Wirkungen wurden im US-Patent Nr. 5,723,645 kosmetische Zubereitungen vorgeschlagen, die 3-Aminopropyl phosphorsäure enthalten.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigten, daß 2-(3-Aminopropyl phosphorsäure)-L-ascorbat selbst sehr stabil ist, ohne jegliche Entfärbung und Verringerung der Aktivität durch Oxidation, und daß es keinerlei Niederschläge im wäßrigen Medium verursacht. Weil dieses Derivat durch die Phosphat gruppe leicht perkutan resorbiert und, sobald es aufgenommen ist, leicht durch ein hydrolytisches Enzym zersetzt werden kann und Ascorbinsäure und 3- Aminopropylphosphorsäure freisetzt, kann darüber hinaus erwartet werden, daß eine kosmetische Zubereitung, die dieses Derivat enthält, auf der Haut die effektiven physiologischen Wirkungen sowohl von Ascorbinsäure als auch von 3-Aminopropylphosphorsäure zeigen kann. Basierend auf dieser Annahme wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein neues, durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestelltes Derivat der L-Ascorbinsäure zur Verfügung zu stellen, das sehr stabil ist und im wäßrigen Medium keinerlei Niederschläge verursacht:

Darüber hinaus ist es eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung des besagten Derivats (I) der L-Ascorbinsäure und eine hautaufhellende kosmetische Zubereitung zur Verfügung zu stellen, die das besagte Derivat (I) der L-Ascorbinsäure als einen wirksamen Bestandteil enthält, und die die Melaninbildung inhibieren kann und damit einen hautauf hellenden Effekt hat, ebenso wie sie Faltenbildung der Haut verhindern kann und damit wirksam die Hautalterung verzögert.

Das durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellte Derivat der L- Ascorbinsäure ist das durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellte 2- (3-Aminopropylphosphorsäure)-L-ascorbat:

Das Derivat (I) der L-Ascorbinsäure (im folgenden wird diese Verbindung als "AsA-APPA" bezeichnet, was den abgekürzten englischsprachigen Namen für Ascorbinsäure-Aminopropylphosphorsäurediester bedeutet) ist eine Verbin dung, bei der 3-Aminopropylphosphorsäure mit der 2-Hydroxylgruppe der Ascorbinsäure durch eine Phosphorsäureesterbindung verknüpft ist. Diese Verbindung ist sehr stabil, ohne jegliche Entfärbung und Verringerung der Akti vität durch Oxidation im wäßrigen Medium, ist in Wasser gut löslich und verur sacht keinerlei Niederschläge. Darüber hinaus kann es durch die Phosphat gruppe leicht perkutan resorbiert werden und die einmal absorbierte Verbin dung kann leicht durch ein hydrolytisches Enzym zersetzt werden, um Ascor binsäure und 3-Aminopropylphosphorsäure freizusetzen. Als ein Ergebnis kann diese Verbindung durch die Ascorbinsäure eine Wirkung zur Inhibierung der Melaninbildung und durch 3-Aminopropylphosphorsäure eine Aktivität zur Ver zögerung der Hautalterung aufweisen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das Verfahren zur Herstellung des durch die Formel (I) dargestellten AsA-APPA ein Verfahren zur Herstellung von 3-Aminopropylphosphorsäure (3-APPA), das im US-Patent 5,723,645 offengelegt wurde. Das offengelegte Herstellungsverfahren von 3-APPA ist einfach und wirtschaftlich, weil es ein zweistufiges Verfahren ist, preiswertes Phosphor oxychlorid eingesetzt wird, und es damit vorteilhafterweise in industriellem Maßstab angewendet werden kann.

Im einzelnen ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Derivats (I) der L-Ascorbinsäure dadurch gekennzeichnet, daß man

1. 3-Amino-1-propanol mit Phosphoroxychlorid in einem äquivalenten Verhält nis von 1 : 1 bis 1 : 1.3 in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer organischen Base bei einer Temperatur von etwa 0 bis 5°C über 1 bis 2 Stun den zum 2-Chlortetrahydro-2H-1,3,2-oxazaphosphinin-P-oxid der Formel II umsetzt,
2. diese Verbindung II mit L-Ascorbinsäure mit geschützten 5,6-Hydroxylgrup pen in Gegenwart einer organischen Base in einem organischen Lösungsmittel zum L-Ascorbinsäure-Derivat der Formel III reagieren läßt,
3. dieses durch die Zugabe von destilliertem Wasser bei einer Temperatur von 5 bis 100°C über 3 Stunden zu 2-(3-Aminopropylphosphorsäure)-L-ascorbat hydrolysiert,
4. dieses Produkt aus einem polaren organischen Lösungsmittel kristallisiert und
5. wahlweise mit Alkali oder einer Base zum gewünschten Salz neutralisiert.

Das Verfahren kann durch das folgende Reaktionsschema dargestellt werden:

Reaktionsschema

In Stufe (1) ist es vorteilhaft, die Umsetzung von 3-Amino-1-propanol und Phosphoroxychlorid in einem äquivalenten Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 1.3 durchzuführen. Falls das Verhältnis kleiner als 1 : 1 ist, kann das gewünschte Produkt nicht erhalten werden, während in Fällen, in denen das Verhältnis grö ßer als 1 : 1.3 ist, neben dem gewünschten Produkt in hohem Maße Nebenpro dukte erhalten werden.

Bei dieser Stufe wird als Zwischenprodukt in einer Ausbeute von 95% oder mehr ein 1 : 1-Komplex von 3-Amino-1-propanol und Phosphoroxychlorid gebil det, und als ein Nebenprodukt wird in einer Ausbeute von 1 bis 2% oder dar unter ein 1 : 2-Komplex von 3-Amino-1-propanol und Phosphoroxychlorid gebil det. Das Nebenprodukt kann jedoch chromatographisch oder durch Kristallisa tion aus Toluol entfernt werden. Im speziellen werden zwei der Chloratome des Phosphoroxychlorids durch die funktionellen Hydroxyl- und Aminogruppen von 3-Amino-1-propanol ersetzt und es wird zu 2-Chlortetrahydro-2H-1,3,2- oxazaphosphinin-P-oxid cyclisiert. Das dritte Chloratom wird bei einer tiefen Temperatur von 5°C oder darunter inaktiviert und nicht ersetzt. Der Grund ist, daß das Chloratom von 2-Chlortetrahydro-2H-1,3,2-oxazaphosphorin-P-oxid in einem inerten nichtwäßrigen Lösungsmittel stabil ist und nicht leicht durch 3- Amino-1-propanol ersetzt werden kann. Deshalb ist es vorteilhaft, die Umset zung der Stufe (1) bei einer Temperatur von 5°C oder darunter durchzuführen, um die Bildung des 2 : 1-Nebenproduktes von 3-Amino-1-propanol und Phos phoroxychlorid zu verhindern. Das Verfahren kann in diesem Fall auf einem einfachen und leichten Weg durchgeführt werden, da es nicht nötig ist, das dritte Chloratom des Phosphoroxychlorids beispielsweise durch Ester- oder Amidgruppen zu schützen. Weil bei einer Temperatur unter 0°C die Löslichkeit der Reaktanten verringert sein kann und die Umsetzung langsam und mit Schwierigkeiten ablaufen kann, kann die Menge an nicht umgesetztem Material ansteigen, was zu einer verringerten Ausbeute führt. Deshalb ist es vorteilhaft, die Umsetzung von Stufe (1) bei einer Temperatur von 0 bis 5°C durchzufüh ren.

Die in dieser Stufe verwendete organische Base kann Pyridin und Triethylamin umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Unter diesen kann vorzugsweise Triethylamin verwendet werden.

Darüber hinaus kann man in dieser Stufe als organisches Lösungsmittel Dichlormethan, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, Acetonitril, Chloroform oder Ethylether einsetzen, ist aber nicht darauf beschränkt. Unter diesen kann vor zugsweise Dichlormethan eingesetzt werden.

In Stufe (2) können die 5,6-Hydroxylgruppen der L-Ascorbinsäure durch eine Schutzgruppe wie Benzyliden, Phenylethyliden und Isopropyliden maskiert werden. Unter ihnen kann Isopropyliden bevorzugt als Schutzgruppe verwendet werden.

Die in Stufe (2) verwendete organische Base kann Pyridin und Triethylamin umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Unter diesen kann Triethylamin be vorzugt eingesetzt werden.

Darüber hinaus kann man in Stufe (2) als organisches Lösungsmittel Dichlor methan, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, Acetonitril, Chloroform oder Ethylether einsetzen, ist aber nicht darauf beschränkt. Unter diesen kann vorzugsweise Chloroform eingesetzt werden.

Die in Stufe (2) hergestellte Verbindung (III) ist in wäßriger Lösung eine starke Säure (beispielsweise pH 2 in einprozentiger wäßriger Lösung.) Daher können die Schutzgruppen der 5,6-Hydroxylgruppen der Ascorbateinheit und die P-N- Bindung der cyclischen Oxaphosphorinineinheit ohne Zusatz von saurem Ka talysator leicht durch die Zugabe von destilliertem Wasser und anschließendes Rühren bei einer Temperatur von 5 bis 100°C, vorzugsweise von etwa 50°C, über etwa drei Stunden hydrolysiert werden.

Das Produkt kann durch Umkristallisieren in einem polaren organischen Lö sungsmittel gereinigt werden. Das polare Lösungsmittel kann Methanol, Etha nol, Isopropanol, Aceton, Tetrahydrofuran, Acetonitril oder Dioxan umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt.

Darüber hinaus kann das Produkt, AsA-APPA, vorzugsweise in Form seiner durch Neutralisation mit Alkali oder einer Base erhaltenen Salze eingesetzt werden, weil das Produkt selbst sauer ist. Ein in dieser Stufe (5) eingesetztes Neutralisierungsmittel kann Alkali oder Metalloxide wie Natriumcarbonat, Na triumhydroxid, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Magnesium hydroxid, Calciumoxid und Magnesiumoxid; basische Aminosäuren wie Lysin, Arginin und Histidin; Ammoniak oder Amine wie Triethanolamin; kationische Polymere wie Polyquarternium-4, -6, -7, -10, -11 und -16, und kationische ober flächenaktive Substanzen wie Lauryldimethylbenzylammoniumchlorid und Stearyldimethylbenzylammoniumchlorid umfassen, ist aber nicht darauf be schränkt.

Weiterhin kann die Erfindung eine kosmetische Zubereitung zur Aufhellung der Haut zur Verfügung stellen, die durch das oben beschriebene Verfahren herge stelltes 2-(3-Aminopropylphosphorsäure)-L-ascorbat oder dessen Salz als ei nen aktiven Bestandteil enthält, der die Melaninbildung inhibieren kann und damit einen hautaufhellenden Effekt hat, ebenso wie er die Proliferation von Fibroblasten fördert und damit die Hautalterung wirksam verzögert. Die Zube reitung kann 2-(3-Aminopropylphosphorsäure)-L-ascorbat oder dessen Salz in einer Menge von 0.005 bis 10 Gew.-% enthalten, vorzugsweise 0.01 bis 3 Gew.-%, was abhängig von den Formulierungen oder dem Zweck der Zuberei tung gewählt werden kann. Weiterhin kann die Zubereitung in Hautweichma chern, Adstringenzien, nährenden Toilettenwässern, Nährcremes, Massage cremes, Essenzen, Augencremes, Augenessenzen, Reinigungscremes, Reini gungsschäumen, Reinigungswässern, Packungen, Pudern, Körperlotionen, Körpercremes, Körperölen oder Körperessenzen formuliert werden, ist aber nicht darauf beschränkt.

Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird in näheren Einzelheiten durch die folgenden Beispiele beschrieben. Dennoch werden diese Beispiele nur zum Zwecke der Verdeutlichung widergegeben und sind nicht als den Rahmen der Erfindung beschränkend auszulegen, der in den anhängenden Ansprüchen genau be schrieben ist.

Herstellungsbeispiel 1 Herstellung von 2-Chlorotetrahydro-2H-1,3,2-oxazaphosphinin-P-oxid

34 ml (0.36 mol) Phosphoroxychlorid wurden in 400 ml Dichlormethan gelöst. Die resultierende Lösung wurde anschließend in einem Eisbad auf 0 bis 5°C abgekühlt.

In einem anderen Reaktor wurden 28 ml (0.36 mol) 3-Amino-1-propanol und 102 ml (0.73 mol) Triethylamin mit 200 ml Dichlormethan verdünnt und allmäh lich über 2 Stunden zu der obenbeschriebenen Lösung gegeben. Nach der Zugabe wurde das entstandene Gemisch filtriert, um Triethylammoniumchlorid zu entfernen. Das Filtrat wurde mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter verringer tem Druck aufkonzentriert. Dazu wurde Toluol gegeben, damit Kristalle ent standen. Dann wurde das Produkt unter verringertem Druck getrocknet, um 53 g der Titelverbindung als weißes Pulver zu erhalten, das mittels IR und NMR identifiziert wurde.
Schmelzpunkt: 79-82°C
IR (CHCl₃, cm^-1): 3254, 1477, 1274, 1092, 1036, 996
¹H-NMR (CDCl₃): δ(ppm) = 1.7 (m, 1H), 1,1 (m, 1H), 3.3 (m, 2H), 4.4 (m, 2H), 4.9 (br, 1H)
¹³C-NMR(CDCl₃): δ(ppm) = 25.78, 25.85, 42.05, 42.11, 71.69, 71.81

Herstellungsbeispiel 2 Herstellung von 2-(3-Aminopropylphosphorsäure)-L-ascorbat

10 g (0.04 mol) L-Ascorbinsäure, deren 5,6-Hydroxylgruppen isopropyliden maskiert waren, wurden in 100 Chloroform gelöst, dann wurden dazu bei 5°C in einem Eisbad 12.9 ml (0.093 mol) Triethylamin zugegeben. Bei derselben Temperatur wurden 8.6 g (0.055 mol) im Herstellungsbeispiel 1 hergestelltes 2- Chlorotetrahydro-2H-1,3,2-oxazaphosphinin-P-oxid in 20 ml Chloroform gelöst und allmählich zu der oben beschriebenen Lösung gegeben. Nach der Zugabe wurde das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.

Die organische Schicht wurde mit einer wäßrigen Phosphorsäurelösung gewa schen, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und mit Aktivkohle entfärbt. Die Lösung wurde filtriert und unter verringertem Druck aufkonzen triert. 30 ml destilliertes Wasser wurden zugegeben und 3 Stunden fang wurde in einem Thermostaten bei 50°C gerührt. Dann wurden 150 ml Isopropanol zugegeben, um Kristalle zu erhalten. Anschließend wurde das Produkt unter verringertem Druck getrocknet, um 6 g der Titelverbindung als weißes Pulver zu ergeben, das mittels IR und NMR identifiziert wurde.
Schmelzpunkt: 176-180°C
IR (KBr, cm^-1): 3407, 3322, 3101, 2914, 1747, 1673, 1664, 1533, 1364, 1218, 1072
¹H-NMR (D₂O): δ(ppm) = 1.9 (m, 2H), 3.05 (t, 2H), 3.62 (m, 2H), 3.98 (m, 3H), 4.90 (s, 1H)
¹³C-NMR (D₂O): δ(ppm) = 26.76, 22.86, 32.35, 57.30, 59.77, 59.84, 64.15, 71.55, 71.72, 109.79, 156.58, 156.63, 167.32, 167.38

Herstellungsbeispiele 3 bis 7 Herstellung von Salzen von 2-(3-Aminopropylphosphorsäure)-L-ascorbat

In jedem Beispiel wurde 1 g des in Herstellungsbeispiel 2 hergestellten AsA- APPA in 30 ml destilliertem Wasser gelöst und dann wurde in Herstellungsbei spiel 3 5%-ige wäßrige Natriumcarbonatlösung, in Herstellungsbeispiel 4 5%- ige wäßrige Kaliumcarbonatlösung, in Herstellungsbeispiel 5 5%-ige wäßrige Calciumhydroxidlösung, in Herstellungsbeispiel 6 Magnesiumoxid, und in Her stellungsbeispiel 7 5%-ige wäßrige Triethanolaminlösung zugegeben, um einen pH-Wert von 7 einzustellen. Die resultierenden Lösungen wurden gefrier getrocknet, um die jeweiligen Salze als weiße Feststoffe zu ergeben.

Versuchsbeispiel 1, Stabilität von AsA-APPA

L-Ascorbinsäure und in Herstellungsbeispiel 2 hergestelltes AsA-APPA wurden in Pufferlösungen bei pH 7 in Konzentrationen von jeweils 50 µM gelöst und dann in einem Thermostaten auf 50°C gehalten. In konstanten Intervallen wur den UV-Absorptionen von AsA-APPA bei 259 nm und von L-Ascorbinsäure bei 266 nm gemessen, um die Stabilitäten der Testproben als Restverhältnis in % zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Wie in der obigen Tabelle 1 dargestellt, wurde die L-Ascorbinsäure innerhalb einer Stunde zersetzt, während erfindungsgemäßes AsA-APPA in der neutralen wäßrigen Lösung sehr stabil war.

Versuchsbeispiel 2, Stabilität von AsA-APPA im wäßrigen Medium

Jeweils 3 g der Verbindungen aus den Herstellungsbeispielen 3 und 6 sowie Magnesium-2-phosphato-L-ascorbat wurden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und dann in einem Thermostat 30 min lang auf 50°C gehalten. Nieder schlag und Entfärbung wurden im Lauf der Zeit beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2

Wie in der obigen Tabelle 2 dargestellt ist, verursachten die Komponenten der vorliegenden Erfindung keinen Niederschlag im wäßrigen Medium und keine Verfärbung mit der Zeit.

Versuchsbeispiel 3, Fibroblastenproliferation

Die aus neuem epidermischem Gewebe erhaltene Haut wurde mit Collagenase vom Typ 1 behandelt, um Epidermis zu entfernen. Die erhaltenen Fibroblasten wurden in nach Dubelcco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) kultiviert.

Die Menge an Fibroblasten wurde nach der MTT-Methode gemessen. Das Er gebnis zeigte, daß die Verbindung aus Herstellungsbeispiel 2 in einer Konzen tration von lediglich 10 mM eine wirksame Fibroblastenproliferation zeigt.

Versuchsbeispiel 4, Unschädlichkeit von AsA-APPA für den lebenden Körper

Weil kosmetische Materialien auf die Haut aufgetragen werden, ist ihre Un schädlichkeit für den lebenden Körper sehr wichtig. In der vorliegenden Erfin dung wurden die Toxizität und die Reizwirkung von AsA-APPA auf den Körper durch die folgenden Versuche untersucht. Die Ergebnisse bewiesen, daß AsA- APPA für den lebenden Körper unschädlich war.

(4-1) Akuter oraler Toxizitätstest

10 ml/kg AsA-APPA aus Herstellungsbeispiel 2 wurden mit physiologischer Salzlösung zu einer 50%-igen Testprobe verdünnt. Diese Testprobe wurde zehn (10) ICR-Mäusen (fünf männlichen und fünf weiblichen) mit einem Ge wicht von 20 bis 33 g oral verabreicht (verabreichte Menge von AsA-APPA: 5 g/kg Gewicht). Als Kontrollgrupe wurde zehn (10) ICR-Mäusen (fünf männli chen und fünf weiblichen) mit einem Gewicht von 20 bis 33 g 10 ml/kg physio logische Kochsalzlösung oral verabreicht (verabreichte Menge von AsA-APPA: 0 g/kg Gewicht).

An diesem Tag wurde sechs Stunden lang stündlich das allgemeine Aussehen beobachtet und vom nächsten bis zum 14. Tag wurden jeden Tag das allge meine Aussehen (klinische Symptome), toxische Symptome, Tod und ähnliches beobachtet. Darüber hinaus wurden Gewichtsänderungen am 1., 3., 7. und 14. Tag gemessen.

Jede während der Beobachtungszeit gestorbene Maus wurde sofort einer Autopsie unterzogen, und überlebende Mäuse wurden nach der Beobach tungsperiode einer Autopsie unterzogen. Innere Organe wurden mit bloßem Auge untersucht und in Fällen anormaler Symptome pathologischen Gewebe tests unterzogen.

Ein Ergebnis ist, daß es keine toten Mäuse gab und kein bemerkenswerter Unterschied der Gewichtsveränderung im Vergleich mit der Kontrollgruppe beobachtet wurde. Das Autopsieprotokoll besagt weiterhin, daß keine anormalen Symptome beobachtet wurden.

Gemäß der Lichfield-Wilcoxon-Methode beträgt die LD₅₀ (Dosis letalis) von AsA-APPA bei der akuten oralen Einnahme 5 g/kg.

(4-2) Akuter dermatologischer Toxititätstest

4 ml/kg AsA-APPA aus Herstellungsbeispiel 2 wurden mit physiologischer Kochsalzlösung zu einer 50%-igen Testprobe verdünnt. Diese Testprobe wurde zehn (10) ICR-Mäusen (fünf männlichen und fünf weiblichen) mit einem Gewicht von 20 bis 33 g perkutan verabreicht (verabreichte Menge von AsA- APPA: 2 g/kg Gewicht). Als Kontrollgrupe wurde zehn (10) ICR-Mäusen (fünf männlichen und fünf weiblichen) mit einem Gewicht von 20 bis 33 g 10 ml/kg physiologische Kochsalzlösung perkutan verabreicht (verabreichte Menge von AsA-APPA: 0 g/kg Gewicht).

Etwa 24 Stunden zuvor war der Rücken jeder Maus in einem Bereich von 1.5 × 1.5 cm² enthaart worden. Dann wurde jeder enthaarte Bereich mit einem Stück Mull von 1 × 1 cm² Größe bedeckt, das mit einer der Test- und Kontrollproben versehen war und mit einem nichtreizenden Klebeband 24 Stunden lang fixiert wurde.

An diesem Tag wurde sechs Stunden lang stündlich das allgemeine Aussehen beobachtet, und vom nächsten bis zum 14. Tag wurden jeden Tag das allge meine Aussehen (klinische Symptome), toxische Symptome, Tod und ähnliches beobachtet. Darüber hinaus wurden Gewichtsänderungen am 1., 3., 7. und 14. Tag gemessen.

Ein Ergebnis ist, daß es keine toten Mäuse gab und kein bemerkenswerter Unterschied der Gewichtsveränderung im Vergleich mit der Kontrollgruppe be obachtet wurde. Das Autopsieprotokoll besagt weiterhin, daß keine anormalen Symptome beobachtet wurden.

Weiterhin beträgt gemäß der der Lichfield-Wilcoxon-Methode die LD₅₀ (Dosis letalis) von AsA-APPA beim akuten dermalen Kontakt 2 g/kg.

(4-3) Primärer Hautreizungstest

Der Test wurde an zwölf (12) männlichen Kaninchen der Rasse "New Zealand White" durchgeführt, deren Rücken 24 Stunden zuvor enthaart worden waren. 0.1 ml AsA-APPA aus Herstellungsbeispiel 2 wurde mit physiologischer Koch salzlösung zu einer 50%igen Testprobe verdünnt.

Die Testprobe wurde auf zwei Stellen (2.5 cm × 2.5 cm) der rechten Seite des Rückens aufgetragen (Menge an AsA-APPA pro Stelle: 0.5 ml). Zur Kontrolle wurden zwei Stellen (2.5 cm × 2.5 cm) der linken Seite des Rückens mit phy siologischer Kochsalzlösung behandelt. Jede getestete Stelle wurde mit Mull abgedeckt, das unter Verwendung eines nicht reizenden Klebebandes befestigt wurde. 24 Stunden später wurden die getesteten Stellen mit physiologischer Kochsalzlösung abgewaschen.

Das Ergebnis war, daß 24 oder 72 Stunden nach dem Entfernen der Mullflec ken keine Hautabnormalitäten wie Erytheme oder ein Ödeme beobachtet wur den. Der von Erythemen verursachte PII (Primärer Rötungsindex) nach Draize beträgt 0.13, was zeigt, daß AsA-APPA nicht reizend oder höchstens schwach reizend ist.

(4-4) Augenreizungstest

Der Test wurde an neun (9) Kaninchen der Rasse "New Zealand White" durch geführt.

0.1 ml AsA-APPA aus Herstellungsbeispiel 2 wurden mit physiologischer Koch salzlösung zu einer 10%-igen Testprobe verdünnt. Diese Testprobe wurde auf das rechte Auge jedes Kaninchens getropft, während das linke zur Kontrolle verwendet wurde. Nach 20 bis 30 Sekunden wurde nur bei drei (3) dieser Ka ninchen ausreichend mit sterilisierter Kochsalzlösung gewaschen.

Nach 24 Stunden oder 48 Stunden wurde keine Augenreizung an Hornhaut, Iris und Bindehaut beobachtet. Die Reizrate der Augenschleimhaut (M. O. I.) betrug 0.0 sowohl in den Fällen, in denen gewaschen wurde, als auch in den Fällen, in denen nicht gewaschen wurde.

(4-5) Hautsensibilisierungstest

Der Test wurde an sechs (6) (drei männlichen und drei weiblichen) Meer schweinchen (Hartley-Albino-Meerschweinchen) mit einem Gewicht von 300 bis 360 g nach dem Verfahren nach Maggnusson und Kligman (Meerschweinchen- Maximierungstest) durchgeführt.

Um die Konzentrationen der beim Induktionstest für leichte Reizung und dem Provokationstest ohne Reizung zu verwendenden Testproben zu bestimmen, wurden bei drei (3) der Meerschweinchen für jeden Test Primärreizungen mit 6.25%-, 12.5%- und 25%-igen Testproben durchgeführt. Bei jedem Tier wurde jede Stelle (2.5 cm × 2.5 cm) auf der rechten und linken Seite des Rüc kens mit drei Konzentrationen der Testproben mit einer Menge von 0.5 ml AsA- APPA pro Stelle behandelt und dann 24 Stunden mit Mull abgedeckt, das unter Verwendung eines nicht reizenden Klebebandes befestigt wurde. Anschließend wurden zwei Schweinchen (einem männlichen und einem weiblichen) 0.1 ml 25%-iges AsA-APPA unter Verwendung einer 26-er Nadel von 1,27 cm (0,5 Inch) intradermal injiziert. 7 Tage später wurden dieselben Stellen mit 10%- igem SLS in Petroleum enthaart. Dann wurde jede getestete Stelle mit 0.5 ml AsA-APPA pro Stelle behandelt und dann 48 Stunden lang mit Mull abgedeckt, das unter Verwendung eines nicht reizenden Klebebandes befestigt wurde. Zwei Wochen später wurde die linke Seite jedes enthaarten Schweinchens mit der Testprobe behandelt und die rechte Seite wurde mit physiologischer Koch salzlösung behandelt. 24 Stunden später wurden die behandelten Stellen mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.

Zur Kontrolle wurde der Test mit physiologischer Kochsalzlösung statt der Testprobe im selben Verfahren durchgeführt.

Das Ergebnis war, daß 24, 48 und 72 Stunden nach dem Entfernen der Mull flecken keine Hautanormalitäten wie Erytheme oder Ödeme beobachtet wur den, und gemäß dem Kligman-Kriterium wurde AsA-APPA in Klasse 1 einge ordnet, was besagt, daß AsA-APPA für die Haut sehr sicher ist.

(4-6) Tupfertest am Menschen

Der Test wurde mit dreißig (30) gesunden weiblichen Personen im Alter zwi schen 20 und 30 Jahren entsprechend des CTFA-Leitfadens (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington D. C. 20023, 1991) durchgeführt.

Der Rücken der Beobachtungspersonen wurde mit 70%-igem Ethanol gewa schen und getrocknet und dann wurde mit einer Rippenkammer, die 20 µl des 10% AsA-APPA aus Herstellungsbeispiel 2 enthaltenden Tupfermediums ent hielt, die Probe aufgetragen. Die Rippenkammer wurde mit einem feinporigen Klebeband auf der zu testenden Stelle befestigt. 24 Stunden später wurden das Klebeband und die Kammer entfernt und die getestete Stelle mit einem Mar kierstift markiert. Nach 24 oder 48 Stunden wurden Hautreaktionen oder gete steten Stelle beobachtet und Hautreizungen entsprechend dem ICDRG-Krite rium (International Contact Dermatitis Research Group) ausgewertet.

Das Ergebnis war, daß kaum primäre Hautreizungsreaktionen, mit der Aus nahme von einem Prozent Erytheme, beobachtet wurden, aber nach 48 Stun den waren alle Hautreizungen abgeklungen. Die durchschnittliche Reaktion betrug 0.42.

Tabelle 3

(4-7) Wiederholter Provokations-Tupfertest am Menschen

Der Test wurde mit zwanzig (20) gesunden weiblichen Personen im Alter zwi schen 20 und 30 Jahren entsprechend des CTFA-Leitfadens (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington D. C. 20023, 1991) durchgeführt.

Der Rücken der Beobachtungspersonen wurde mit 70%igem Propanol gewa schen und getrocknet und dann wurde mit einer Rippenkammer, die 20 µl des 10% AsA-APPA aus Herstellungsbeispiel 2 enthaltenden Tupfermediums ent hielt, die Probe aufgetragen. Das Auftragen wurde drei Wochen lang (Induk tionszeitraum) alle 24 Stunden wiederholt. Nach etwa zwei Wochen wurde der Provokationstupfentest durchgeführt. In dieser Stufe wurden während des In duktionszeitraums getestete und neue Stellen 24 Stunden lang mit Tupfern versehen. Später wurden die Tupfer entfernt und die Hautreaktionen der gete steten Stellen 24, 48 und 72 Stunden danach beobachtet und die Hautreizung wurde entsprechend dem ICDRG-Kriterium (International Contact Dermatitis Research Group) ausgewertet.

Das Ergebnis war, daß keine Reizung durch Wiederholung oder Reizung durch Sensibilisierung beobachtet wurde. Die durchschnittliche Reaktion lag bei 0.14 oder 0 während des Induktions- oder Provokationszeitraums.

Tabelle 4

Die Ergebnisse der Tests (4-1) bis (4-7) sind in Tabelle 5 zusammengefaßt

Tabelle 5

Durch die oben aufgeführten Tests wurde bewiesen, daß AsA-APPA ein siche res Material zur örtlichen Verwendung auf der Haut ist.

Beispiel 1 und Vergleichsbeispiele 1 bis 5; Cremes

Beispiel 2 und Vergleichsbeispiele 6 bis 10; Hautweichmacher

Versuchsbeispiel 5; Sicherheit für die Haut

Um die Sicherheit für die Haut von AsA-APPA enthaltenden aufhellenden kos metischen Zubereitungen auf der Haut beurteilen zu können, wurde der kon ventionelle Tupfertest für die Zubereitungen der Beispiele 1 bis 2 und der Ver gleichsbeispiele 1 bis 10 durchgeführt und das Maß der Hautreizung wurde entsprechend dem folgenden Wertungssystem eingestuft:

Wertungssystem

+++ Extrem starke Reizung, Einstufung: als kosmetisches Mittel ungeeignet
++ Starke Reizung, Einstufung: besser nicht als kosmetisches Mittel ver wenden
+ Leichte Reizung, Einstufung: mit Vorsicht als kosmetisches Mittel ver wenden
± Leichte Reizung
- Keine Reizung, Einstufung: geeignet für empfindliche Haut
= Keine Reizung bei wiederholter Anwendung

Tabelle 6

Wie in Tabelle 6 gezeigt wird, sind die AsA-APPA enthaltenden Zubereitungen nicht hautreizend.

Versuchsbeispiel 6; Aufhellungseffekt

Um den Aufhellungseffekt AsA-APPA enthaltender kosmetischer Zusammen setzungen für die Haut zu bewerten, wurde für die Zusammensetzungen der Beispiele 1 und 2 und der Vergleichsbeispiele 1 bis 10 das folgende Experi ment durchgeführt.

Auf die unteren Bereiche beider Arme von zehn (10) gesunden Freiwilligen wurde ein Tupfer mit vier (4) Löchern mit einem Durchmesser von 1.5 cm an gebracht und mit UV-Strahlung unter Verwendung einer TL20W/12UV-Lampe (Philips) und einer TL20W/09UV-Lampe (Philips) aus einem Abstand von 10 cm mit 1.5 MED zwei Tage lang einmal täglich bestrahlt. Dann wurden die Versuchspersonen in zwei Gruppen, A und B, aufgeteilt. Bei Gruppe A wurde jede der in Beispiel 1 und den Vergleichsbeispielen 1 bis 5 hergestellten Cremes, und bei Gruppe B wurde jeder der in Beispiel 2 und den Versuchsbeispielen 6 bis 10 hergestellten Hautweichmacher sechs Wochen lang zweimal täglich an gewendet. Die Hautaufhellungswirkung wurde mit bloßem Auge beobachet und als wirkungslos, wirksam oder sehr wirksam bewertet:. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.

Tabelle 7

Wie in Tabelle 7 gezeigt wird, ist der Aufhellungseffekt AsA-APPA enthaltender kosmetischer Zusammensetzungen (Beispiele 1 oder 2) ähnlich demjenigen von Magnesium-2-phosphato-L-ascorbat enthaltenden Zusammensetzungen (Vergleichsbeispiele 4 oder 9), während er wenig geringer ist als derjenige der AsA enthaltenden Zusammensetzung (Vergleichsbeispiele 2 oder 7)

Claims

1. 2-(3-Aminopropylphosphorsäure)-L-ascorbat der Formel I und seine Salze:

2. Verfahren zur Herstellung des 2-(3-Aminopropylphosphorsäure)-L-ascorbats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

1. 3-Amino-1-propanol mit Phosphoroxychlorid in einem äquivalenten Ver hältnis von 1 : 1 bis 1 : 1.3 in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer organischen Base bei einer Temperatur von 0 bis 5°C über 1 bis 2 Stun den zum 2-Chlortetrahydro-2H-1,3,2-oxazaphosphinin-P-oxid der Formel II umsetzt,
2. diese Verbindung II mit L-Ascorbinsäure mit geschützen 5,6-Hydroxylgrup pen in Gegenwart einer organischen Base in einem organischen Lösungsmit tel zum L-Ascorbinsäure-Derivat der Formel III reagieren läßt,
3. dieses durch die Zugabe von destilliertem Wasser bei einer Temperatur von 5 bis 100°C über 3 Stunden zu 2-(3-Aminopropylphosphorsäure)-L- ascorbat hydrolysiert,
4. dieses Produkt aus einem polaren organischen Lösungsmittel kristallisiert und
5. wahlweise mit Alkali oder einer Base zum gewünschten Salz neutralisiert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als organi sche Base in Stufe (1) Pyridin oder Triethylamin einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als organi sches Lösungsmittel in Stufe (1) und (2) Dichlormethan, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, Acetonitril, Chloroform oder Ethylether einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schutz gruppen zur Maskierung der 5,6-Hydroxylgruppen der L-Ascorbinsäure aus Benzyliden, Phenylethyliden und Isopropyliden bestehende Gruppen einsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als organi sche Base in Stufe (2) Pyridin oder Triethylamin einsetzt.

7. Hautaufhellende kosmetische Zubereitung, die 2-(3-Aminopropylphosphor säure)-L-ascorbat oder sein Salz nach Anspruch 1 enthält.