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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Stoffes,
der Schimmelpilzgärungen zur Herstellung von Säuren des Krebssehen Zyklus, insbesondere
von Zitronensäure, nach dem Oberflächenverfahren, stimuliert.
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Es ist bekannt, Säuren des Krebssehen Zyklus durch Fermentation von
Nährböden bzw. Nährlösungen mittels Schimmelpilzen herzustellen.
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Zum Beispiel ist es bekannt (deutsche Auslegeschrift 1086 653), Zitronensäure
durch submerse Züchtung von Penicilliumarten in zuckerhaltigen Nährsubstraten, etwa
Melasse, zu gewinnen.
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Weiterhin ist es bekannt (deutsche Auslegeschrift 1086 654), Itaconsäure
durch submerse Züchtung des Schimmelpilzes Aspergillus itaconicus in Melasse zu
gewinnen.
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Es ist auch bekannt (USA: Patentschriften 2 438136, 2 993 838), daß
die Auswahl des richtigen Stammes der verwendeten Mikroorganismen entscheidenden
Einfluß auf die Ausbeute an Zitronensäure hat.
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Schließlich ist es noch bekannt (französische Patentschrift 1256 566),
Äpfelsäure im Submersverfahren bei der Verwendung eines geeigneten Bodens zu gewinnen.
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Bei der industriellen fermentativen Herstellung von Zitronensäure
wird insbesondere Melasse als Kohlenhydratquelle verwendet (USA: Patentschrift 2
492 673). Bevorzugt wird dabei als produzierender Mikroorganismus der Schimmelpilz
Aspergillus niger verwendet. Bei dem bekannten Verfahren muß jedoch streng darauf
geachtet werden, daß die der Melasse zuzusetzenden Nährstoffe genau auf die Zusammensetzung
der Melasse abgestimmt werden. Durch Behandlung der Melasse mittels eines besonders
gesteuerten Ionenaustauschverfahrens gelingt es auch, die Melasse durch Zusatz von
standardisierten Nährstoffen in den Optimalzustand für eine nachfolgende Fermentation
zu bringen.
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Für die Produktion von Fumarsäure ist es bekannt (Underkofler und
Hickey, »Industrial Fermentationsu, Bd.1, 1954, S. 476 bis 480), den Schimmelpilz
Rhizopus nigricans zu verwenden. Allerdings kann bei Anwendung dieses Pilzes nicht
von Rohrzucker, also Melasse; ausgegangen werden, da dem genannten Pilz Invertase
fehlt. Die Melasse muß also vor Beginn der Fermentation entsprechend mit einer Mineralsäure
oder Invertase vorbehandelt werden.
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Endlich ist es bekannt, Itaconsäure im Oberflächen-oder Submersverfahren
durch Anwendung des Schimmelpilzes Aspergillus terreus herzustellen. Wenn auch dabei
das Submersverfahren einfacher zu handhaben ist, so ergibt das Oberflächenverfahren
bessere Ausbeuten.
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Obwohl, wie dargestellt, Verfahren zur Erzeugung von Säuren des Krebssehen
Zyklus also gut bekannt sind und auch vielfach, teilweise im großtechnischen Maßstab,
angewendet werden, sind noch heute die Faktoren unbekannt, mittels welcher man die
Bildung der Säuren direkt beeinflussen kann. Sei es im Sinne einer Steigerung, oder
sei es auch im Sinne einer Verminderung der Produktion. Es ist zwar z. B. bekannt,
daß bei einigen Stämmen des Schimmelpilzes Aspergillus niger die Bildung von Zitronensäure
stark herabgesetzt wird, falls Sulfonamide zugesetzt werden, jedoch kann diese Inhibition
weder durch Zusatz von p-Aminobenzoesäure noch durch andere bekannte Wachstumfaktoren
beseitigt werden; somit ist der Wirkungsmechanismus dieser Faktoren also noch immer
ungeklärt.
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Die Kenntnis von Faktoren, die die Bildung von Säuren des Krebssehen
Zyklus direkt beeinflussen, ist jedoch nicht nur für die Herstellung der Säuren
an sich von größtem Interesse, sondern auch deshalb, weil der Krebssche Zyklus der
grundlegende Stoffwechselprozeß bei der aeroben Umsetzung von aktivierter Essigsäure
und Brenztraubensäure, welche die Produkte des Zuckerabbaus sind, ist (vgl. A. K
1 e i nz e 11 e r, Cs. fysiologie, 1954, 11I, 3, S. 315 bis 332; H. A. K r e b s,
A. d. V., Enzymol, 1943, S.191). Durch den Krebssehen Zyklus werden die wesentlichen
Nährstoffe (Zucker, Fette, Lipoide und stickstoffhaltige Stoffe) verarbeitet. Gleichzeitig
ist der Krebssche Zyklus auch der Hauptmechanismus bei der Verwertung des Energiegehaltes
der Nährstoffe für die physiologische Tätigkeit.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist nun die Gewinnung eines Stoffes
der Schimmelpilzgärungen zur Herstellung von Säuren des Krebssehen Zyklus, insbesondere
Zitronensäure nach dem Oberflächenverfahren stimuliert. Dies wird dadurch erreicht,
daß man das Mycel von Säuren des Krebssehen Zyklus produzierenden Schimmelpilzen
mechanisch von Flüssigkeit befreit, mit Wasser wäscht, anschließend mit Wasser oder
Methanol extrahiert, aus dem Extrakt noch vorhandene Säuren des Krebssehen Zyklus
in Form eines kalkhaltigen Salzes ausfällt und abfiltriert, das Filtrat über einen
stark basischen Anionenaustauscher führt, den Austauscher mit Wasser wäscht und
schließlich den stimulierend wirkenden Stoff mit lmolarer Salzsäure vom Austauscher
eluiert und anschließend durch Vakuumverdampfung bei 50° C oder Lyophilisierung
trocknet.
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Es wurde festgestellt, daß bei der Verwendung eines nach der Erfindung
aus dem produktiven Mycel des Schimmelpilzes Aspergillus niger gewonnenen stimulierenden
Stoffes unter anderem die Bildung von Zitronensäure bei Schimmelpilzgärungen zu
der Herstellung von Zitronensäure nach dem Oberflächenverfahren ganz erheblich stimuliert
wird. Auch der negative Einfluß von Sulfonamiden wird geändert. In ähnlicher Weise
wirkt der Extrakt auf die Produktion der übrigen Säuren des Krebssehen Zyklus, wie
z. B. der Fumar- oder Itäconsäure. Statt des Schimmelpilzmycels der Gattung Aspergillus
können auch die Mycelien von anderen, Säuren des Krebssehen Zyklus produzierenden
Schimmelpilzen für die Gewinnung des stimulierend wirkenden Stoffes eingesetzt werden.
Daraus ist zu folgern, daß der erfindungsgemäß gewonnene Stoff stimulierend in Richtung
einer Synthese von Säuren des Krebssehen Zyklus bei Schimmelpilzgärungen zur Herstellung
dieser Säuren nach dem Oberflächenverfahren wirkt.
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Durch Anwendung des erfindungsgemäß gewonnenen stimulierenden Stoffes
wird nicht nur die Ausbeute bei den bekannten Oberflächengärungen zur Produktion
von Säuren des Krebssehen Zyklus verbessert, sondern es ist auch die Produktion
solcher Säuren mittels Oberflächengärungen dann möglich, wenn ein nur sehr wenig
produzierender Schimmelpilz benutzt wird. Es werden dabei Ausbeuten erzielt, die
das Niveau der Produktion mit guten Schimmelpilzen erreichen.
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Da der erfindungsgemäß gewonnene Stoff nicht nur im nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren gewonnenen Extrakt des Aspergillus niger vorhanden
ist,
sondern auch z. B. beim Aspergillus terreus, kann angenommen werden, daß der erfindungsgemäß
gewonnene Stoff zur Gruppe der Aufbaufaktoren (Vitamine) gehört, die am Aufbau und
Metabolismus lebender Organismen Anteil nehmen.
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Der erfindungsgemäße Stoff ist dialysierbar, besitzt einen sauren
Charakter (Rr = 0,25), ist in alkalischem Medium unbeständig und thermostabil.
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Eine zweckmäßige Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht
darin, daß man das Schimmelpilzmycel zunächst einer Extraktion mit einer wäßrigen
Athanollösung (Konzentration 1:1) unterwirft, den Extrakt bei 50° C eindampft und
erst diesen so gewonnenen Rückstand mit Methanol extrahiert.
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Eine besonders große Menge des stimulierenden Stoffes wird dann gewonnen,
wenn man ein Schimmelpilzmycel verwendet, das mindestens während eines Teils seiner
Züchtung der Einwirkung von Streptomycin oder Sulfonamiden ausgesetzt wurde.
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Nachfolgend wird die Erfindung an Hand mehrerer Beispiele näher erläutert.
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Beispiel 1 Isolierung des erfindungsgemäßen Stimulans aus dem Mycel
des Pilzes Aspergillus niger 10 kg eines 3 bis 5 Tage alten Mycels des Pilzes Aspergillus
niger, gezüchtet auf einem Nährmedium, das für die Biosynthese der Zitronensäure
geeignet ist, werden durch Auspressen von Flüssigkeit befreit; das Mycel wird dann
gründlich in Wasser gewaschen und dann in einem rostfreien Extraktor in ungefähr
501 Wasser extrahiert. Die Extraktion dauert etwa 24 Stunden. Das Mycel wird dann
abgetrennt und ausgepreßt und das ausgepreßte Extrakt der Flüssigkeit beigefügt.
Vorteilhafter wird mit einem nicht zerdrückten Mycel gearbeitet, da das gewonnene
Extrakt verhältnismäßig rein ist. Die noch anwesende Zitronensäure wird dann unter
Sieden durch Schlämmkreide bei pH = 6 bis 6,5 aus dem wäßrigen Extrakt ausgefällt.
Das Fällprodukt wird dann gefiltert. Das reine Filtrat, welches nunmehr nur noch
Spuren von Zitronensäure enthält, wird auf die Kolonne eines stark basischen Anionenaustauschers
(z. B. »Zerolit-FF«) aufgegeben, an dem dann das Stimulans abgefangen wird. Nach
Durchwaschung des Anionenaustauschers mit Wasser wird das Stimulans mit lmolarer
Salzsäure eluiert und anschließend durch Vakuumverdampfung bei 50° C oder Lyophilisation
getrocknet.
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Beispiel 2 10 ml Lösung des erfindungsgemäß gewonnenen stimulierenden
Stoffes werden 101 eines Melassemediums zugesetzt, welches für die Synthese von
Zitronensäure mittels Aspergillus niger geeignet ist. Es zeigt sich, daß die Ausbeute
an Säure von 60% auf 75% gesteigert wird.
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Beispiel 3 Das Stimulans wird einem synthetischen Medium beigefügt,
in welchem der Schimmelpilz 40 bis 50% des anwesenden Zuckers in Zitronensäure synthetisieren
kann. Durch das Stimulans erhöht sich die Ausbeute an Zitronensäure von 60 auf 70%.
Beispiel 4 Zum Vergleich mit der in der USA.-Patentschrift 2492673 dargelegten
Arbeitsweise wurde Zitronensäure mit Aspergillus niger produziert auf einem synthetischen
Mineralnährmedium mit 15% Saccharose.
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Es wurden Versuche durchgeführt, ohne Stimulans sowie mit gemäß dem
erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Stimulans aus Aspergillus niger, Aspergillus
terreus und Rhizopus nigricans.
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Dabei ergaben sich folgende Ausbeuten an Zitronensäure (in Prozent
des ursprünglichen Zuckers):
| Stimulans Stimulans Stimulans |
| Ohne aus aus aus |
| Stimulans Aspergillus Aspergillus Rhizopus |
| niger terreus nigricans |
| 30,52 I 65,0 I 54,0 50,2 |
Beispiel 5 Zum Vergleich mit dem aus U n d e r k o f 1 e r und H i c k e y, Andustrial
Fermentations«, Bd. 1, 1954, S. 476 bis 480, bekannten Verfahren wurde Fumarsäure
mit Rhizopus nigricans produziert auf einem synthetischen Mineralnährmedium mit
15 %- Glukose.
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Als Ausbeute an Fumarsäure ergab sich (in Prozent des ursprünglichen
Zuckers):
| Stimulans Stimulans Stimulans |
| Ohne aus aus aus |
| Stimulans Aspergillus Aspergillus Rhizopus |
| niger terreus nigricans |
| 16,8 I 38,4 I 28,5 I 32,5 |
Beispiel 6 Zum Vergleich mit dem aus U n d e r k o f 1 e r und H i c k e y, »Industrial
Fermentations«, Bd. 1, 1954, S. 491, Absatz 2 und 3, bekannten Verfahren wurde Itaconsäure
mit Aspergillus terreus auf einem Nährmedium mit 15% Glukose produziert.
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Als Ausbeute ergab sich (in Prozent des ursprünglichen Zuckers):
| Stimulans Stimulans Stimulans |
| Ohne aus aus aus |
| Stimulans Aspergillus Aspergillus Rhizopus |
| niger terreus nigricans |
| 20,4 I 40,2 I 38,3 I 30,5 |
Die Zusammensetzung der in den Beispielen verwendeten Nährmedien war wie folgt:
Synthetisches Nährmedium für die Zitronensäure-Produktion gemäß Beispiel 4: Saccharose
...................... 150 g NH,,NOs . .. ................ 2,0 M9S04, kristallisiert
. . . .. . . . . . . . . . 1,0 KH2P04 ........................ 0,25 ZnS04 ..........................
0,025 FeS04 .......................... 0,005 H.,0 ........................ auf 11
pH 4,5
Synthetisches Nährmedium für die Fumarsäure-Produktion gemäß
Beispiel 5: Glukose
........ .......... 150,0 g NH4N03 . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 2,0 MgS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0
KH2P04 ........................ 0,25 ZnS04 ................. ........ 0,025 FeS04
......................... 0,005 H20 ........................ auf 11 Nährmedium für
die Itaconsäure-Produktion gemäß Beispiel 6: Glukose ........................ 150
g M9S04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 g NH4N03 . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . .
1,7 g
NaCI .. .. ................... 0,3 g
ZnS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . 0,005 HNO3 (spezifisches Gewicht 1,42)
. . 1,3 ml Maisquellwasser . . . . . . . . . . .
...... 3 ml