CZ302632B6

CZ302632B6 - Zpusob prípravy dihydroxyesteru a tento dihydroxyester

Info

Publication number: CZ302632B6
Application number: CZ20023675A
Authority: CZ
Inventors: Antony Holt@Robert; John Blacker@Andrew; David Reeve@Christopher
Original assignee: Astrazeneca Uk Limited
Priority date: 2000-05-09
Filing date: 2001-05-01
Publication date: 2011-08-10
Also published as: CY1109991T1; EE200200628A; UA73774C2; IS6609A; WO2001085975A1; HK1051708A1; US7157255B2; US7416865B2; EE05062B1; SK15892002A3; JP2003532427A; CZ302675B6; MY127751A; EP1657310B1; IL193404A0; ES2289722T3; IL193405A0; CN1196793C; PT1726658E; PL208377B1

Abstract

Rešení se týká zpusobu prípravy dihydroxyesteru obecného vzorce 1, který zahrnuje bud stereoselektivní redukci slouceniny obecného vzorce 2 za vzniku slouceniny obecného vzorce 3 a esterifikaci slouceniny obecného vzorce 3 za vzniku slouceniny obecného vzorce 1, nebo esterifikaci slouceniny obecného vzorce 2 za vzniku slouceniny obecného vzorce 4 a stereoselektivní redukci slouceniny obecného vzorce 4 za vzniku slouceniny obecného vzorce 1, pricemž X znamená poprípade substituovanou uhlovodíkovou spojovací skupinu, R a R'' každý nezávisle predstavuje poprípade substituovanou uhlovodíkovou skupinu a R' predstavuje poprípade substituovanou uhlovodíkovou skupinu, jakož i uvedeného dihydroxyesteru.

Description

Způsob přípravy d i hydroxy esteru a tento dihydroxyester

Oblast techniky

Vynález se týká stearoeselektivního způsobu přípravy d i hydroxy esteru a tohoto dihydroxyesteru.

Dosavadní stav techniky

Mikrobiální redukce ethylesteru kyseliny 3,5-dioxo-6—(benzyioxy)hexanové k získání kyseliny 3,5-dihydroxy-6-(benzyloxy)hexanové je popsán v patentovém dokumentu EP 0 569 998 a v Enzymu and Microbial Technology, 1993, sv. 15, 1014 až 1021 (Patel a j.). Mikrobiální redukce 6-kyano-5-hydroxy-3-onhexanoátů k získání odpovídajících alkyl-6-kyano-3,5-dihydroxyhexanoátů je popsána v mezinárodní přihlášce WO 97/00968.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob přípravy dihydroxyesteru obecného vzorce 1 jehož podstata spočívá v tom, že se buď sloučenina obecného vzorce 2

OH O ^HOx^X^^₍X)__CO₂R (2) podrobí stereoselektivní redukci za vzniku sloučeniny obecného vzorce 3

I

_{(3) a} sloučenina obecného vzorce 3 se esterifikuje v přítomnosti sloučeniny obecného vzorce

R-0-COR’ a enzymu lipázy či hydrolázy za vzniku sloučeniny obecného vzorce 1, nebo

c) se esterifikuje sloučenina obecného vzorce 2 v přítomnosti sloučeniny obecného vzorce R-COR' a enzymy lipázy či hydrolázy za vzniku sloučeniny obecného vzorce 4

R'

II ^u (4) a

d) sloučenina obecného vzorce 4 se podrobí stereoselektivní redukci za vzniku sloučeniny obecného vzorce 1, přičemž

X znamená popřípadě substituovanou uhlovodíkovou spojovací skupinu,

R a R každý nezávisle představuje popřípadě substituovanou uhlovodíkovou skupinu a ? R' představuje popřípadě substituovanou uhlovodíkovou skupinu, výhodně popřípadě substituovanou alkylovou skupinu.

Výhodné X znamená skupinu vzorce -CH?-. Výhodně R znamená vinylovou skupinu nebo isopropenylovou skupinu. Výhodně R' znamená substituovanou nebo nesubstituovanou alkyloio vou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů. Výhodněji R' znamená methylovou skupinu.

Výhodně sc sloučeniny obecných vzorců 2 nebo 4 redukují kontaktem s organismem vykazujícím vlastnosti mikroorganismu zvoleného ze skupiny zahrnující organismy rodu Beauveria, Pichia, Candida, Kluyveromyces nebo Turolaspora nebo enzymem extrahovaným z těchto organismů. Výhodně se sloučeniny obecných vzorců 2 nebo 4 redukují kontaktem s organismem zvoleným is ze skupiny zahrnující Pichia angusta, Pachía pastoris, Candída quillermondii, Saccharomyces carisbergensis, Pichia trehalophila, Kluyveromyces drosophilarum a Torulospora hansenii, nebo enzymem extrahovaným z těchto organismů. Výhodně se použijí celé buňky. Výhodně se sloučeniny obecných vzorců 2 nebo 4 redukují při pH od 4 do 5. Výhodně se sloučeniny obecných vzorců 2 nebo 3 esterifikují v přítomnosti enzymu zvoleného ze skupiny zahrnující prasečí pankreatickou lipázu, lipázu z Candida cylindracea, lipázu z Pseudomonas flhuorescens, frakci B zCandica antarctica a lipázu z Humicola lanuginosa. Výhodně je sloučeninou obecného vzorce R- OCOR’ vinylacetát.

Předmětem vynálezu je rovněž dihydroxyester obecného vzorce 1:

OH OH

R._(j-^ONÁA_W_CO₂R ° (1) , ve kterém

R' znamená skupinu CH₃, so R představuje popřípadě substituovanou uhlovodíkovou skupinu,

X znamená skupinu -(CH?),- a n nabývá hodnot od 1 do 4.

Výhodně R znamená terc-butylovou skupinu a X znamená skupinu -CH?Předmetem vynálezu je rovněž způsob přípravy dihydroxyesteru obecného vzorce 1

OH OH _(X)__CO R jehož podstata spočívá v tom, že se esterífikuje sloučenina obecného vzorce 3

OH OH

CO₂R (3) v přítomnosti sloučeniny obecného vzorce R-O—COR' a enzymu lipázy či hydrolázy za vzniku sloučeniny obecného vzorce 1;

přičemž

X znamená popřípadě substituovanou uhlovodíkovou spojovací skupinu

R a R každý nezávisle představuje popřípadě substituovanou uhlovodíkovou skupinu a

R’ představuje popřípadě substituovanou uhlovodíkovou skupinu, výhodně popřípadě substituovanou alkylovou skupinu.

Výhodně R’ znamená skupinu CH₃, R znamená terč. butylovou skupinu a X znamená skupinu -OF-. Výhodně R znamená vinylovou skupinu nebo isopropenylovou skupinu. Výhodně se enzym zvolí ze skupiny zahrnující prasecí pankreatickou lipázu, lipázu z Candica cylindracea, lipázu z Pseudomonas fluorescens, frakci B z Candida antarctica a lipázu z Humicola lanuginosa.

Uhlovodíkové skupiny ve významu symbolů X, R, R' nebo R mohou být substituovány jedním či více substituenty a mohou být per-substituovány, například perhalogenovány. Mezi příklady substituentů patří atomy halogenů, zejména atomy fluoru, chloru, alkoxyskupiny, jako jsou alkoxyskupiny obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, a oxoskupina.

Výhodně znamená symbol X skupinu obecného vzorce -(CH₂)_n- kde n nabývá hodnot od 1 do 4, a nejvýhodněji znamená symbol X skupinu vzorce -GH₂-.

Symbol R může znamenat alkylovou skupinu, jako jsou alkylové skupiny obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, nebo alkyl karbony lovou skupinu, jako jsou alkylkarbonylové skupiny obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů v alkylové části, například skupinu CH₂(C-O)- nebo CF₃(C=O>-. Nejvýhodněji symbol R znamená vinylovou skupinu nebo isopropenylovou skupinu.

Symbol R výhodně představuje alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, která může být lineární či rozvětvená a může být substituována jedním či více substituenty. Nej výhodněji znamená symbol R terč.butylovou skupinu.

Symbol R* může znamenat substituovanou alkylovou skupinu, často alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, jako jsou skupiny CF₃- nebo CF3CH2-, avšak výhodně představuje nesubstituovanou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů a nejvýhodněji methylovou skupinu.

Při stereoselektivní redukci sloučenin obecných vzorců 2 nebo 4 se výhodně používají chemické nebo mikrobiální redukční metody, jako jsou hydrogenace, transferová hydrogenace, redukce pomocí hydridů kovů nebo dehydrogenáz. Mezi příklady vhodných hydrogenačních způsobů, které jsou např. popsány v Helv. Chim. Acta 69, 803, 1986 (zde zahrnuto zmínkou) patří použití 0,01 až 10 % (hmotn./hmotn.) katalyzátoru, jako jsou platina, palladium nebo rhodium, na heterogenních nosičích, jako jsou uhlí, hliník, silika, s použitím molekulárního vodíku při tlaku mezi 100 a 1000 kPa, v rozpouštědle, jako jsou methanol, ethanol, terc.butanol, dumethylformamid, terc.butylmethylether, toluen nebo hexan. Alternativně lze použít homogenní hydrogenační katalyzátory, jako jsou katalyzátory popsané v EP 0 583 171 (zahrnutém zde zmínkou).

Mezi příklady vhodných chemických transferových hydrogenačních způsobů patří způsoby popsané v Zassinovich, mestroni a Gladiali, Chem. Rev. 1992, 92, 1051 (zde zahrnuto zmínkou) nebo v Fuji a kol., J. Am. Chem. Soc. 118, 2521, 1996 (zde zahrnuto zmínkou). Při výhodných chemických transferových hydrogenačních způsobech se používají chirálně vázané komplexy přechodných kovů, jako jsou ruthenium nebo rhodium, zejména chirální diaminem vázané

-3 CZ 302632 B6 neutrální aromatické komplexy ruthena. Výhodně se při takovém chemickém přenosu jako zdroj vodíku používá kyselina, zejména sůl kyseliny mravenčí, jako je triethylammonium-formiát.

Lze použít také činidla obsahující hydridy kovů. jako jsou činidla popsaná v Tet. 1993, 1997,

Tet. Asymm. 1990, 1, 307, (zde zahrnuto zmínkou), nebo v J. Am. Chem. Soc. 1998, 110, 3560 (zde zahrnuto zmínkou).

Mezi příklady vhodných způsobů mikrobiální redukce patří podrobení sloučeniny obecného vzorce 2 nebo 4 působení organismu vykazujícího vlastnosti mikroorganismu zvoleného ze skupiny ío zahrnující organismy rodu Beauveria, výhodně druhu Beauveria bassiana, rodu Pichia, výhodně druhů Pichia angusta nebo Pichia pastoris, treholophila, haplophíla nebo membranefaciens, rodu

Candida, výhodně druhů Candida humicola, solani, guillermondii, diddenssiae nebo friedrichii, rodu Kluyveromyces, výhodně druhu Kluyveromyces drosophilarum, nebo rodu Torufaspora, výhodně druhu Torulaspora hansenii. Redukce lze dosáhnout podrobením sloučeniny obecných vzorců 2 nebo 4 působení enzymů extrahovaných z výše uvedených mikroorganismů. Nejvýhodněji se sloučeniny obecných vzorců 2 nebo 4 podrobují působení mikroorganismu zvoleného ze skupiny zahrnující mikroorganismy druhů Pichia angusta, Pichia pastoris, Candida guillermondii, Saccarornyces carlsbergensis, Pichia trehalophila, Kluyveromyces drosophilarum a Torulospora hansenii, nebo extraktu z výše uvedených organismů.

Předkládaný vynález se výhodně týká přípravy sloučeniny obecného vzorce 3 selektivní redukcí sloučeniny obecného vzorce 2 pomocí celých buněk či extraktů výše uvedených mikroorganismů, výhodně ze skupiny zahrnující Pichia angusta, Pichia pastoris, Candida guillermondii, Saccharomyces carlsbergensis, Pichia trehalophila, Kluyveromyces drosophilarum a Torulospora hansenii.

Způsob podle předkládaného vynálezu se nej výhodněji provádí pomocí celých buněk organismů, protože se tak lze vyhnout nutnosti separovat požadovaný enzym a poskytnout se kofaktory pro reakci.

jo Lze použít libovolného z výše uvedených druhů, avšak při mnoha provedeních se ukázalo, že použitím enzymu nebo celých buněk mikroorganismu druhu Pichia angusta lze dosáhnout vysoké konverze a vysoké selektivity.

K řízení reakce se s enzymy obecně používá kofaktor, obvykle NAD(P)H (nikotinamid-adenin35 dinukleotid či nikotinamid- adenin-dinukleotid -fosfát), a systém pro regeneraci tohoto kofaktoru, například glukóza a glukózdehydrogenáza. Protože jsou v celých buňkách přítomny vhodné kofaktory a redukční mechanismy, je výhodné použití celých buněk v živném prostředí, které výhodně obsahuje vhodný zdroj uhlíku, což může zahrnovat jeden či více z následujících zdrojů: cukr, např. maltózu, sacharózu nebo výhodně glukózu, polyol, např. glycerol nebo sorbitol, kyselo linu citrónovou nebo nižší alkohol, například methanol nebo ethanol.

Pokud mají buňky během reakce růst, měly by být v živném prostředí obsaženy zdroje dusíku a fosfátu a stopových prvků. Těmito zdroji mohou být zdroje běžně používané při kultivaci organismů.

Způsob lze provádět přidáním sloučeniny obecného vzorce 2 nebo 4 ke kultuře rostoucích organismů v prostředí, jež je schopné podporovat růst, nebo k suspenzi živých buněk v prostředí, které výhodně obsahuje zdroj uhlíku, které však postrádá jednu či více živin nutných pro růst. Lze také použít mrtvé buňky, a to za předpokladu, že jsou přítomné potřebné enzymy a kofak50 tory; pokud je to žádoucí, lze je k mrtvým buňkám přidat.

Pokud je to žádoucí, lze buňky imobilizovat na nosiči, který je v kontaktu se sloučeninou obecného vzorce 2 nebo 4, výhodně v přítomnosti vhodného zdroje uhlíku, jak je popsáno výše.

-4 CZ 302632 B6

Hodnota pH se vhodně pohybuje mezi 3,5 až 9, například 4 až 9, výhodně činí nejvýše 6,5 a nejvýhodněji nejvýše 5.5. Velmi vhodně se použije pH v rozmezí 4 až 5. Způsob lze vhodně provádět při teplotě pohybující se mezi 10 až 50 °C, výhodně 20 až 40 °C a výhodněji 25 až 35 °C. Pokud se použije živé celé buňky výše uvedených organismů, je výhodné pracovat za aerobních podmínek. Při výše uvedených hodnotách pH a teploty se vhodně použije intenzita provzdušnění ekvivalentní k 0,01 až 1,0 objemových jednotkách vzduchu, měřeno pri standardní teplotě a tlaku, na objemovou jednotku prostředí za minutu, avšak bude ceněno, že jsou možné značné změny. Pokud růst organismů probíhá odděleně od způsobu, lze během něho použít podobné hodnoty pH, teploty a provzdušnění.

Purifikované enzymy lze izolovat známými způsoby, vhodně odstřeďováním suspenze rozpadlých buněk a separací čirého roztoku od buněčných zbytků, separací požadovaného enzymu z tohoto roztoku, například pomocí chromatografie s iontoměniči, vhodně pomocí eluce ze sloupce použitím kapaliny s rostoucí iontovou silou, nebo/a pomocí selektivní precipitace přidáním materiálu iontové povahy, například síranu amonného. Pokud je žádoucí vyšší čistota, lze tyto procedury opakovat.

Mikrobiální redukce sloučenin obecného vzorce 2 nebo 4 je obzvláště výhodná, a proto tento způsob představy druhé provedení předkládaného vynálezu.

Při esterifikací sloučenin obecného vzorce 2 nebo 3 je výhodné je transesterifikovat pomocí jiného esteru, kterýje přítomný alespoň v molámí ekvivalenci, vzhledem k alkoholu, a je jím vhodně vinylester (jako vedlejší produkt se acetaldehyd nezúčastňuje zpětné reakce.) Alternativně lze použít anhydrid, jako je acetanhydrid nebo anhydrid kyseliny trifluoroetové, nebo ester, jako je ethylacetát, nebo fluorovaný ester, jako je trifluorethylacetát. S výhodou se místně specifická esterifikační reakce provádí v organickém rozpouštědle obsahujícím méně než I % (hmotn./hmotn.) vody, jak jsou acetonitril, ethylacetát, tetrahydrofuran, terc.butylmethylether. toluen, butanon, pentanon či hexanon, pri teplotě činící výhodně 20 až 75 °C, výhodněji 25 až 50 °C. Estery jsou výhodně estery nižších alkanových kyselin obsahujících 2 až 8 uhlíkových atomů nebo jejich substituované deriváty. Popřípadě lze použít inertní atmosféru, například lze roztokem probublávat proud dusíku.

Enzymy lze poskytovat jako takové nebo v podobě buněk je obsahujících. Je výhodné je imobilizovat, a tak usnadnit jejich separaci od proudu a, pokud je to žádoucích, jejich opětovné použití.

Mezi výhodné enzymy patří lípázy, jako jsou prasečí pankreatická lipáza, lipáza zCandida cylindracea, lipáza z Pseudomonas fluorescens, frakce B z Candida antarctica, dostupná např. pod ochrannou známkou Cihrazyme L2, lipáza z Humicola lanuginosa, prodávaná popřípadě pod ochrannou známkou Lípo lase, nebo z Pseudomonas, prodávané například pod ochrannou známkou SAM II, a výhodněji zCandida antarctica, dostupná např. pod ochrannou známkou Chirazyme.

Sloučeniny obecného vzorce 1, ve kterém znamená symbol R' skupinu CH₃, symbol R představuje popřípadě substituovanou uhlovodíkovou skupinu, X znamená skupinu -(CH₂)_n-a n nabývá hodnot od 1 do 4, představuje třetí provedení předkládaného vynálezu. Výhodně představuje symbol R terč. buty lovou skupinu a nej výhodněji znamená symbol X skupinu -CH₂Sloučeniny obecného vzorce 1 jsou použitelné jako meziprodukty pro přípravu farmaceutických sloučenin. Obvykle se ponechají reagovat s chránící skupinou pro 1,3-dihydroxy skupiny, jako je 2,2-d i methoxy propan, za vzniku acetonidu, jak je popsáno v Synthesis 1998, 1713. Skupinu R'-(C=O)- lze poté selektivně odstranit působením slabě bazického alkoholového roztoku, např. roztoku K₂CO₃, jak je popsáno v US 5 278 313, nebo lipázy, buď ve vodném roztoku, nebo v organickém roztoku obsahujícím dostatečně vody pro podporu hydrolýzy, za vzniku sloučeniny obecného vzorce 5:

- 5 CZ 302632 B6

O V

HO (χ)— (X)—C0₂R

Tento způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce 5 představuje Čtvrté provedení předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Příprava (3R,5S) terc.butyl-3,5,6-lrihydroxyhexanoátu

Za míchání byla baňka s kulatým dnem o objemu 250 ml naplněna 20 ml acetonitrilu, 0,405 g (0,662 mmol) di-mu-chlorbis[(p~cymene)chlorruthenia (ll)] a 0,492 g (1,34 mmol) (lS,2S)-(+)~· N-(4-toluensulťonyl)-l,2-difenylethylendiaminu. Roztok byl deoxygenován pomocí dusíku a následně udržováním jeho proudu. Deoxygenovaný roztok 26 g (0,119 mol) opticky čistého (5S) terč.but\T-3 -keto—5,6—dihydroxyhexanoátu v 15 ml acetonitrilu byl vložen do reakční nádoby a roztok byl míchán při pokojové teplotě po dobu 20 minut. Poté bylo po dobu 10 minut přidáváno 65 ml 5:2 (mol/mol) směsi destilované kyseliny mravenčí a triethylaminu a reakční směs byla míchána při pokojové teplotě po dobu 48 hodin, K tomuto roztoku bylo pomalu přidáno 80 ml dichlomethanu a 120 ml nasyceného hydrogenuhličitanu sodného. K vodné vrstvě bylo přidáno 70 g chloridu amonného a organická vrstva byla oddělena. Vodná vrstva byla třikrát promyta 90 ml ethylacetátu, organické frakce byly smíchány, sušeny pomocí síranu sodného a bylo odstraněno rozpouštědlo za vzniku 21,1 g surového oleje obsahujícího převážně (3R,5S)-terc.butyl-3,5,6-trÍhydroxyhexanoátu. Poměr diastereomerů byl stanoven pomocí ^k'C-NMR a činil 5,2 : 1 (3R:5S) : (3S:5S). V další reakci byl materiál použit surový, avšak bylo možno ho purifikovat pomocí sloupcové chromatografie.

Příprava (3R,5S)-terc.butyl-6-acetoxy-3,5-dihydroxyhexanoátu

Do baňky s kulatým dnem o objemu 1 1 bylo za míchání vloženo 700 ml tetrahydrofuranu a 70,7 g (0,32 mol) (3R,5S)-terc.butyl-3,5,6-trihydroxyhexanoátu, 41 ml (0,46 mol) vinylacetátu a 6,3 g lipázy Chirazyme L2^1M. Po 3 hodinách míchání při pokojové teplotě byla lipáza odstraněna prosetím a těkavé látky byly odstraněny destilací za vakua. Množství surového oleje činilo 78,7 g a bylo stanoveno, že hlavní složkou byl (3R,5Sý-terc.butyl-6-acetoxy-3,5-dihydroxyhexanoátu. Tento materiál byl přímo použit v dalším stupni.

Příprava 1,1-dimethylesteru kyseliny (4R,6S)-6-[(acetyloxy)methyl]-2,2-dimethyl-l,3-dioxan4-oxtové

Do baňky s kulatým dnem o objemu 1 1 bylo za míchání vloženo 78,7 g (3R,5S) terc.butyl-6acetoxy-3,5-dihydroxyhexanoátu, 800 ml 2,2-d imethoxy propanu a 5,7 g kyseliny p-toluensulfonové. Po 35 hodinách byla reakční směs koncentrována na polovinu jejího objemu a bylo přidáno 300 ml dichlormeethanu a 300 ml 1M hydrogenuhličitanu sodného. Organická vrstva byla oddělena a vodná vrstva byla třikrát promyta 150 ml ethylacetátu. Organické frakce byly smíchány, sušeny pomocí síranu sodného a těkavé látky byly odstraněny destilací za vakua. Bylo získáno 92 g surového oleje. Tento byl nejprve purifikován průchodem krátkým sloupcem bleskové siliky a eluován hexanem a poté směsí hexan: ethyl acetát 85:15 (obj./obj.), a poté třikrát krystalizaci materiálu z hexanu za vzniku 22,17 g 1,1 -d i methy lesteru kyseliny (4R,6S)-6-6CZ 302632 B6 [(acetyIoxy)methyl]-2,2-dimethyl-l,3-dioxan-4-octové, který byl stanoven chirální GC ve výší 99,9 %.

Příprava 1,1-dimethy lethylesteru kyseliny (4R,6S)-6-(hydroxymethyl)-2,2-dimethyl-l,3-di5 oxan—4—octové

Do banky s kulatým dnem o objemu 500 ml bylo za míchání vloženo 22,17 g 1,1-dimethylethylesteru kyseliny (4R,6S)-6-[(acetyloxy)methyl]-2,2-dÍmethyl— 1,3-dioxan—4-octové, 250 ml methanolu a 5,05 g drceného uhličitanu draselného. Reakční směs byla míchána po dobu io 35 minut až do dokončení hydrolýzy, poté byl přesetím odstraněn uhličitan draselný, reakční hmota byla koncentrována a bylo přidáno 150 ml 5% (hmotn./hmotn.) solanky a 150 ml toluenu.

Organická vrstva byla oddělena a vodná vrstva byla promyta dvakrát 250 ml toluenu. Organické vrstvy byly smíchány, třikrát promyty 15% (hmotn./hmotn.) solankou a rozpouštědlo bylo odstraněno pomocí vakuové destilace za vzniku 17,78 g čirého oleje, o němž bylo stanoveno, že jím je z >99%, 1,1-dimethylethylesteru kyselin (4R,6S)-6-(hydroxymethyl)-2,2-dimethyl-l ,3dioxan^-octové.

Příklad 2

Příprava (5S) terc.butyl-6-acetoxy-5-hydroxy-3-ketohexanoátu

Za míchání byla baňka s kulatým dnem o objemu 250 ml naplněna 2,32 g (0,0106 mol) (5S)-terc.butyl-5,6-dihydroxy-3-ketohexanoátu, 40 ml tetrahydrofuranu, a 0,98 ml (0,0106 mol) vinylacetátu a 0,22 g lipázy Chirazyme L2™. Po 20 minutách byla odstraněna lipáza přesetím a těkavé látky byly odstraněny destilací za vakua za vzniku 2,96 g surového oleje, který byl pomocí NMR charakterizován jako (5S)-terc.butyl-6-acetoxy-5-hydroxy-3-ketohexanoát.

Příklad 3

Příprava (3R,5S) terc.butyl-3,5,6-trihydroxyhexanoátu

Pichia angusta NCYC R230 (uložená dle ustanovení Budapešťské dohody 18. května 1995) byla kultivována v multifermentačním systému Braun Biostat Q v následujícím prostředí (na litr): glukóza, 40 g; MgSO₄, 1,2 g; K₂SO₄, 0,21 g; KH₂PO₄, 0,69 g; H,PO₄ (koncentrovaná), 1 ml; kvasinkový extrakt (Oxid), 2 g; FeSO₄.7H₂O, 0,05 g; odpěňovadlo (EEA 142 Foammaster), roztok stopových prvků, 1 ml (tento roztok obsahoval na litr: CuSO₄.5H₂O, 0,02; MnSO₄.4H₂O,

0,1 g; ZnSO₄.7H₂O, 0,1 g; CaCO₃, 1,8 g.

Každý ze Čtyř fermentoru byl naplněn 250 ml média a byl sterilizován pomocí autoklávováním. Hodnota pH byla upravena na 4,5 pomocí 7M roztoku hydroxidu amonného, teplota byla nastavena na 28 °C, tok vzduchu byl nastaven na 300 ml/minuta a rychlost míchání na

1200 otáček za minutu. Fermentery byly naočkovány buňkami z agarových desek (2% agar) obsahujících stejné médium, jako je médium popsané výše, kromě toho, že koncentrace glukózy činila 20 g/l itr. Po 22 hodinách růstu ve fermenterech byla nastartována bioredukční reakce přidáním (5S)-terc.butyl-3-keto-5,6-dihydroxyhexanoátu; dva z fermenterů byly naplněny každý 3,75 ml a zbývající dva byly naplněny každý 5 ml.

V reakcí bylo pokračováno po dalších 78 hodin až do 100% konverze substrátu. Během tohoto období byla kultivace zásobena 50% roztokem glukózy při rychlosti 1 až 3 gramy glukózy/litr kultury/hodina pro zachování životaschopnosti buněk a pro poskytnutí zdroje redukční síly. Reakce byly ukončeny odstraněním buněk odstřeďováním. K získanému supernatantu prostému buněk byl přidán chlorid sodný ke konečné koncentraci ve výši 20% hmotn./obj. a směs byla

-7CZ 302632 B6 extrahována třikrát úměrným objemem acetonitrilu. Smíchané acetonitrilové extrakty byly sušeny pomocí bezvodého síranu sodného a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku na rotační odpařovačce (teplota vodní lázně 45 °C) za zisku viskózního bledě žlutého oleje. Identita produktu z každé reakce byla potvrzena, jednalo se o (3R,5S)-terc.butyl-3,5,6-trihydroxyhexanoát a nadbytek diastereomerů u každého ze vzorků ukazuje tabulka uvedená níže.

Pokus	Nadbytek diastereomerů (%)
1	99, 6
2	99, 6
3	99,4
4	99, 6

Příklad 4

P ří prav a (3 R, 5 S )-terc. buty 1-3,5,6-t r i h y droxy hexanoátu

Pichia anguste NCYC R320 (uložená dle ustanovení Budapešťské dohody 18. května 1995) byla kultivována v multifermentačním systému Braun Bíostat Q v následujícím prostředí (na litr): glukóza, 20 g; síran amonný, 10 g; kvasinkový extrakt (Oxoid), 2 g; MgSO₄. MgSO₄.7H₂0, 1,2 g; KH?PO₄, 0,69 g; K?SO₄, 0,21 g; FeSO₄. 7H₂O, 0,05 g; H₃PO₄ (koncentrovaná), 1 ml; odpěňovadlo (EEA 142 Foammaster), 0,5 ml; roztok stopových prvků, 1 ml (tento roztok obsahoval na litr: Ca (CH₃CO₂)₂ 2,85 g; ZnSO₄.7H₂0, 0,1 g; MnSo₄.H₂O, 0,075 g; CuSO₄.5H₂0, 0,02 g; kyselina sírová (koncentrovaná), I ml).

Jeden fermenter byl naplněn 250 ml média a byl sterilizován pomocí autoklávování. Hodnota pH byla upravena na 5,0 pomocí 2M roztoku hydroxidu sodného. Teplota byla nastavena na 28 °C, tok vzduchu byl nastaven na 250 ml/minuta a rychlost míchání na 1200 otáček za minutu. Fermenter byl naočkován 2,5 ml suspenze buněk ve sterilní deionizované vodě připravené buňkami zagarové desky s Pichia angusta NCYC R320. Po 17 hodinách růstu byla nastartována bioredukce přidáním 6,36 g (5S)-terc.butyl-3-keto-5,6-dihydroxyhexanoátu v podobě vodného roztoku. Ve stejném čase bylo započato s dodáváním glukózy do fermenteru při rychlosti 2g glukózy na litr za hodinu.

V reakci bylo pokračováno po dalších 78 hodin, kdy bylo dosaženo 96% konverze substrátu. Výchozí materiál a produkt byl stanovován pomocí HPLC (sloupec Hichrom S55 CN-250A, teplota 35 °C, mobilní fáze: vodný roztok kyselin trifluoroctové (TFA) (0,1%); acetonitril 95:5, rychlost toku 1 ml.min'¹, injekční objem 5 ml, detektor indexu lomu).

Reakce byla ukončena odstraněním buněk odstřeďo váním při 4000 x g po 20 minut. Hodnota pH získaného supernatantu. prostého buněk byla upravena na 7,5 pomoct 2m NaOH. V supernatantu prostém buněk byl rozpuštěn MgSO₄.l,6 H₂O (15% hmotn./obj. na základě bezvodého) a výsledný roztok byl dvakrát extrahován úměrným objeme 2-pentanonu. Fáze rozpouštědla byla shromážděna a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku na rotační odpařovačce při 45 °C za výtěžku oranžového viskózního oleje. Tento byl opětovné rozpuštěn v 50 ml suchého, destilovaného 2-pentanonu a rozpouštědlo bylo opět odstraněno na rotační odpařovačce za zisku terc.butyl-3,5,6-trihydroxyhexanoátu (5,08 g, 80% izolovaný výtěžek). Byl stanoven nadbytek diastereomerů, a to následovně; vzorek terč. butyl-3,5,6-trihydroxyhexanoátu (30 mg) byl derivatizován alespoň 10 minut při pokojové teplotě reakcí v nadbytku anhydridu kyseliny trifluoroctové, nadbytek anhydridu byl odstraněn za proudu suchého dusíku a zbylý olej byl zředěn dichlormethanem (1 ml). Vzorek byl analyzován pomocí sloupce Chiralcel Dex CB (25 metrů)

-8CZ 302632 B6 při teplotě 140 °C (isotermická). Diastereomery byly eluovány za 14,4 minut (3R,5S-diastereomer) a 15,7 minut (3S,5S-diastereomer). Tímto způsobem byl zjištěn nadbytek diastereomerů ve vzorku, který činil 99,7 %.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY io

l. Způsob přípravy dihydroxyesteru obecného vzorce l

OH OH

O vyznačující se tím, že se buď

a) sloučenina obecného vzorce 2

OH O '(X)—co₂r podrobí stereoselektivní redukci za vzniku sloučeniny obecného vzorce 3

OH OH (2)

HO, '(X)—CO₂R (3) a

b) sloučenina obecného vzorce 3 se esterifikuje v přítomnosti sloučeniny obecného vzorce R-O—COR' a enzymu lipázy či hydrolázy za vzniku sloučeniny obecného vzorce 1, nebo

c) se esterifikuje sloučenina obecného vzorce 2 v přítomnosti sloučeniny obecného vzorce R”-COR' a enzymu lipázy či hydrolázy za vzniku sloučeniny obecného vzorce 4

OH O

R'—C II O (X)—CO,R

4) a

d) sloučenina obecného vzorce 4 se podrobí stereoselektivní redukci za vzniku sloučeniny obecného vzorce 1, přičemž

30 X znamená popřípadě substituovanou uhlovodíkovou spojovací skupinu,

R a R každý nezávisle představuje popřípadě substituovanou uhlovodíkovou skupinu a

R' představuje popřípadě substituovanou uhlovodíkovou skupinu, výhodně popřípadě substi35 tuovanou alkylovou skupinu.
2. Způsob podle nároku I, vyznačující se tím, že X znamená skupinu vzorce -CH₂-.

-9CZ 302632 Β6
3. Způsob podle libovolného z nároků 1 a 2, vyznačující se t í ni, že R znamená vinylovou skupinu nebo isopropenylovou skupinu.
4. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že R' znamená substituovanou nebo nesubstituovanou alkylovou skupinu obsahující 1 a 6 uhlíkových atomů.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, žeR' znamená methylovou skupinu.
6. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 5, v y z n a č u j í c í se t í m , že se sloučeniny obecných vzorců 2 nebo 4 redukují kontaktem s organismem vykazujícím vlastnosti mikroorganismu zvoleného ze skupiny zahrnující organismy rodu Beauveria, Pichia, Candida, Kluyveromyces nebo Turolaspora nebo enzymem extrahovaným z těchto organismů.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím. že se sloučeniny obecných vzorců 2 nebo 4 redukují kontaktem s organismem zvoleným ze skupiny zahrnující Pichia angusta, Pichia pastoris, Candida guillermondii, Saccharomyces carlsbergensis, Pichia trehalophila, Kluyveromyces drosophilarum a Torulospora hansenii, nebo enzymem extrahovaným z těchto organismů.
8. Způsob podle libovolného z nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že se použijí celé buňky.
9. Způsob podle libovolného z nároků 6, 7 nebo 8, vyznačující se tím. že se sloučeniny obecných vzorců 2 nebo 4 redukují při pH od 4 do 5.
10. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se sloučeniny obecných vzorců 2 nebo 3 esterifikují v přítomnosti enzymu zvoleného ze skupiny zahrnující prasečí pankreatickou lipázu, lipázu z Candida cylindracea, lipázu z Pseudomonas ťluorescens, trakci B z Candida antarctica a lipázu z Humicola lanuginosa.
11. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že sloučeninou obecného vzorce R-O-COR' je vinylacetát.
12. Dihydroxyester obecného vzorce 1:

OH OH

R' ve kterém

R’ znamená skupinu CH₃,

R představuje popřípadě substituovanou uhlovodíkovou skupinu,

X znamená skupinu -(CH₂)_n- a n nabývá hodnot od 1 do 4.
13. Sloučenina podle nároku 12, kde R znamená terc.butylovou skupinu a Y znamená skupinu

-CH₂-.

- 10CZ 302632 B6 (1),
14. Způsob přípravy dihydroxyesteru obecného vzorce 1

OH OH vyznačující se tím, že se esterifikuje sloučenina obecného vzorce 3

OH OH (X)-CO₂R ₍₃₎ s v přítomnosti sloučeniny obecného vzorce RO-COR' a enzymu lipázy či hydrolázy za vzniku sloučeniny obecného vzorce 1;

přičemž io X znamená popřípadě substituovanou uhlovodíkovou spojovací skupinu,

R a R každý nezávisle představuje popřípadě substituovanou uhlovodíkovou skupinu a

R' představuje popřípadě substituovanou uhlovodíkovou skupinu, výhodně popřípadě substi15 tuovanou alkylovou skupinu.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že R' znamená skupinu CH₃, R znamená terc.butylovou skupinu a X znamená skupinu -CH₂20
16. Způsob podle nároku 14 nebo 15, vy zn a č η j íc í se tím, že R znamená vinylovou skupinu nebo isopropenylovou skupinu.
17. Způsob podle libovolného z nároků Maž 16, vyznačující se tím, že se enzym zvolí ze skupiny zahrnující prasečí pankreatickou lipázu, lipázu zCandida cylindracea, lipázu

25 z Pseudomonas fluorescens, frakci B z Candida antarctica a lipázu z Humicola Lanuginosa.