CZ154295A3 - Complex of human insulin analog and parenteral pharmaceutical composition containing thereof - Google Patents

Description

Komplex analogu lidského inzulínu a parenterální farmaceutický prostředek, který ho obsahuje.

Oblast techniky

Vynález se týká roonomerního analogu liského inzulínu. Především se- vynález týká hexamerního komplexu -obsahujícího inzulínový analog, -zinek a derivát fenolu a parenterá1ního farmaceutického prostředku, který tento.hexamerní komplex obsahuje.

Dosavadní stav techniky'

Od zavedení inzulínu v roce .1920 se dosahuje stálých velkých pokroků ve zlepšení ošetřování diabetes mellitus, Hlavního pokroku se dosáhlo v -čistotě a v' dostupnosti ínzilínu.· Byly rovněž -vyvinuty různé farmaceutické prostředky s různou časovou aktivací. Nehledě na tato zlepšení, terapie subku.tanní ho vstřikování je stále neuspokojivá pro jedince potřebujícího regulaci a normali.zaci glycemické kontroly. U jedinců dochází opakovaně k hyperglycemia nebo k hypoglycemia a k dlouhodobým' komplikacím včetně retinopathy, neuropathy, nefropathy, mikroangiopathy a makroangiopathy.

Aby se předešlo extremním gí ycemickýnk hladinám, diabetici často praktikují terapií opakovaného vstřikování, přičemž se inzulín podává při každém jídle.

dostupný inzulín vykazuje vrchol -vá. příliš dlouho, něž se dosáhne kosy. Nejnověji se -věnuje . ' ve.lké ředků a inzulínových analogových kině ti ku procesu su-bkutanní abso Jelikož -všechny obchodní obsahují inzulín ve spontánně asociovaném stavu a převážně v zinkové hexamer n.í ' f ormě , je domněka, že stupněm limitujícím rychlost absorpce inzulínu z místa .subkutanního vstřiku do krevního oběhu je disociace spontánně agregovaného inzulínového hexameru (Bránge

Nejrychleji působící, obchodně pří liš pozdě po v.střiknutí a troptimálního seřízení hladin gluúsilí vývoji inzulínových prost prostředků,-které' by měly jinou r p c e .

, * . · , · farmaceutické přostř-edk.y .inzulínu '

- *> · a ko 1. , Diabetes' Care 13, s tr. 923 až 95'4, 1990). K urychlení procesu absorpce se vyvinuly monoměrní inzulínové-analogy. Tyto monomemí inzulínové analogy vykazují srovnatelně rychlejší nastartování aktivity než inzulín‘za současného.. zachován í biologieké účinnosti nativního 1idského inzulinu. 'Vykazují/rychlejší -absorpci na místě vstřiku a -píkové působení inzulínu těsně $ poobědovou glukosou jakožto odezvou·, na jídlo. *Způsob; .pří pravý různých monomer.ních analogů popsal Cháne? a kol. (zveřejněná . evropská přihláška vynálezu číslo EPO 383472) a Brange a kol·’. .( zveřejněná vropská přihláška vynálezu číslo EPO 214 826 )..

Modifikace inzulínu, vedoucí, k raónomerním analogům inzulínu, vedou však také ,k'.vysoké rychlosti vytváření (polymeru v parenterálních farmaceutických prostředekh . '/Jcl ikož^k' expiraci inzulino . .· .. ' .. ' vých 'farmaceutických .prostredk'ů.,-_<když-'.,se ., 0'b's.ah'lpolymeru stoupne na 1 X (U.S. .P.ha'rmacopoeia', 1990)., je mininiá.Ihzáce ~ tohoto typu znehodnocení ších účinků.

a ' vy tváření h e Dále^še ukázalo, že feéxtrémně významná pro ,snižóvání.nežádoucích vedlejJe proto žádoucí formulovat monoměrní analogy tak, aby docházelo k samovolné asociaci .‘aňalogujk: vy tvářen í stabilního uspořádání a při tom se ještě zachovala''jeho rychlá absorpce.

Pří sada' některých kovových .iontů, především zinku ,· zl epšu je chemickou stálost tím, že nutí inzulín k asociaci xamerů, specificky uspořádání 1n(I I)-T&;

noly specificky vážou-inzulínový.hekámer.fa zavádějí-allosterickou změnu uspořádání, přičemž osm N-termináíních aminokyselin B-rese převádí z- rozvinutého uspořádání ,na\ α-šroúbovici (Derea ko.l., Nátuře 338 ,.str.. 594 až' 596-,.^1.989.} Tento stav' uspořádání s fenol ickou .vazbou je' znám pod''/o značením -.stav 'Zn (11)-R .

V silném . kontrastu k těmto uznávaným'/--poznatkům, že inzulín ochotně agreguje v ‘ př í tomnosti. zinku za . vzniku-dobře definované * A* . *' ^{k 1 1} » · · stabilní struktury hexameru. ' zinku',-’, ukázaly! ne jnově js.í studie s monomerními -inzulinovýni- -«.analogy, ··' že'-,, jakákoli ·' agregace mezi; zinkem a inzulínovým analogem še od li suje ?od .agregace pozorované u inzulínu (B.H. 'Franktext(a d iapoz i ti vy' přednášky.' na ' konf eren-y ci o inzulinu Self-Association and Conformational Studies in Humen Proinsulin and Insul in .Analogs,. University'of Yorkj 29,srpna

- .3 ně Brems a objevil , •až 1. září. 1989). Dále vysoce; stabilní Zn-hexamerový komplex/ pozorovaný u inzulínu, není pozorován u monomerních analogů, Podobkol. ( P rote i n En.g i n e e r i ng . 5 : 6 str. 527 až 5 33, 199 2} že monomerní Ly s ^{B 2 3} Pr o^{9 2 8} j- j_{e m}éně náchylný k dimerizaci, a samočinné asociaci'na .'tvary s vyšší molekulovou hmotností než inzulín '. Brems- akol. ' dále dokládá, že Asp^92SPro^32<,-h.l·, Λla⁰²⁸Pro^B29-hl a Lys^B28Pro^B2.7-hT .výkazují malou' vůbec žádnou zinkem vyvolanou asociaci, a· že nebe nevykazují p _r o b 2 9 inzulín,

Lys^{B 28} inzu 1 i.n , Asp^{B 2 8} ' i nzul i'n . a Ala⁰²⁸ inzulín wkazují zinkem vyvolanou asociaci, ale méně než. Zn-iňzulin.'' Následně naznačují nepublikované' .experimentální práce .autora' tohoto vynálezu, že asociace se zinkem je pozorována;, avšak -taková asociace mezi analogem a zinkem se liší od inzulínu. .AsOciac-.e, kterou lz.e pozorovat v případě těchto analogů, má formy-s mnohonásobně vyšší molekulovou hmotností a lišící se od-převláda jících: dobře'ďefinova- ných Z-n-inzulinových -hexamer-ů.' '

Proto je .zřejmé, že monomerní, inžul in.ové .analogy nevytvářejí uspořádání Zn(II)-T& způsobem, analogickým k'inzulínu.

Vzhledem ke známému · stavu techniky; je překvapující, že.t.ento vynález poskytuje monomerní -analogy' inzulínu v dobře definovanémstabilním zinek-fenol hexamerovém· komplexu. Tento hexamerový komplex se jedinečně .odlišuje od komplexů’ pozorovaných s inzulínem za identických podmínek.·. Inzulínové komplexy še' zinkem a fenolem jsou v uspořádání ,Zn(Il)-R6. Hexamer.ový komplex podle, tohoto vynálezu není s .tímto uspořádáním identický. .Také dost i. pozoruhodně má analogový hexamerový ..komplex inzulínu.·-.'značně větší·'. náchylnost . k disociaci než inzulín.' Tato 'náchylnost -k ;·· di sočiači vede. k- žádoučí vlastnosti rychlého..·’působení · - ··'/ , . . .Brange a kol. (knihař Current Opinionin Střuétuřal.' Biology

l.str. 934 až 940, 1991)' , popisuje pyůzňé rychle.'působící inzulinové monomery ·· -a konstatu je.i/žeý zře j mource stou ..k' < vytvořen í. rych l'e' . působícího inzulínu·' j e ..zabrán i t vyt váren í. dimeru nebo hexameru. Podobně Brange a kol. .(Diabetes--Care'>13 ,\s'tr. 923 až '954, 1990 uvádějí, že podává-li se^inzuliň v podobě’ hexameru,¹ :musí být hexamer ještě k .jeho pomalejší uvolňovací difusi stericky více brzděn než monomer v průběhu djfusního transportu v subcutis a/nebo během jeho průchodu kapilární membránou. Dále, je-li injek.továno subkuténně uspořádání Zn(II)-Ré, ned i. soc-iu je přímo, ale musí se transf ormovat, ..na uspořádání Zn (TI )-Tt... Ty to-.

z toho plynoucí disociace; oddalují '-nástup v současné · době pracovníci v oboru domnívají,, že úsilí.k chemické stabilizaci monomerního insulinového analogu zinkem za. vytvoření dobře definovaného hexamerního komplexu bude neúspěšné nebo pokud by byle úspěšné, bude to na úkor rychlému nástupu žádané účinnosti .

konformační změny a aktivity. Proto se.

Podstatu vynálezu

-,P 4’

Komplex analogu lidského¹, inzulínu 'spočívá'· podle 'vynálezu v tom, že šest molekul anologú ..lidského inzulínu,, dva · z i nečnaté ionty a · alespoň tř i ' .molekuly ''.fenolové .'sloučeniny · ze souboru je zinkem a f-eriokterý se rych1e zahrnujícího m-kresol, fenol .a’směsi. 'm^kresólu-fenolu tvoří hexamerní komplex analogu.· i '\:/ ¹ ; Farmaceutickým prostředkem podle vynálezu lickou sloučeninou navozený . h examer ní --komplex , absorbuje. Rychlost absorpce hexamerního . komplexu., je- alespoň „dva krát větší než jaká je pozorovaná .v případě i n zulí.nu .-'Takový; hexamerní komplex,po zpracování na, farmaceutický prostředek/· je stejně stálý· jako inzulín proti chemickému odbourání ..· .Proto je překvapivé,, že nalog na dobře s fenolem. Při /· ·ύ'_; ? /.' -'ý / · »·· í.e/ * íW x, Λ ť*

4-7 '••/A’· ··

4'

-Λί*:' ^q·* .

..Λ’ , v V./.

Λ· - v. * í, .

se. podle vynálezu př eyád í jmen o měrní;. i n zul i nový a definovaný /.stálý..' hexamerní^'komplex ’ se/.zinkem a zpracování si tento hexamerní komplex/ponechává zvláště charakteristiky rychlého působení -·, které' aa- monomemP inzulínový. analog . Podle vynálezu, se tedy získají par enter áln í^:.' f armaceut ické .prostředky hexanem ího... · .komplexu i ηζυ 1 i nového'· 'analogu , / , '' ///-/ /77,'./·'//..,//. 7/^? 7,- 'Af' .

který je stálý a rychle působí c í _v7 á //-7-/. ,:7/7///// ₄ /'

Předmětem vynálezu je jak hexamerní ,kómpl.ex aňal'ogu - lid ského. inzulínu' tak parenterální f armaceut ický/'' -prostředekkterý. her'ob,sáhuje. ' , '' / />'-^:/ . * , ^:7ζ/'. ' -7/./7 ' /7 ' .. .,- ,

Vynález bií že objasňuje následující podrobný''popis a také připojené obrázky:

Na obr. 1 je graf působení bvs^B28Pro^B29-hi a lidského inzulínu. Na grafy je střední .glukosová infuzní ' .odezva. Graf dokládá předno-sti vynálezu, Na o*e x.je, doba v minutách, na.

ose y hodnoty a m o 1. / m i η . K ř i v a n o 18 e r . 10 J , S C , s plným černým kos oč tvorečkem je pro LysPro-mok r i v k a s prázdným kosočtverečkem je pro LysPro-. hexa.mer, . 10 J, SC, křivka s plným černým čtverečkem. je pro regulérní .lidský inzulín (hexamer) 10 J, SC

Na obr'. 2.je graf stability I,ys^{B 28}Pro^{s 2 9} .lidského inzulínu. Na grafu je stabilita vyjádřená měření.® tvoření polymeru inzulínového analogu v hexamerovérn seskupení ve srovnání nonosernía Lys^{8 28}Pro^{8 2 9} -1 i dskýin inzulínem a inzulinem.·Graf dokládá přednosti vynálezu.. Na ose x je doba ve 'dnech při teplotě 30 ’C, na· ose y vytváření dimeru v procentech, Křivka .s· plným černým kosoČtve rečkem je pro 'LysPro-monomer, křivka, s 'prázdným kosočtverečkem je pro LysPro-hexámer, křivka s ..plným’ černým čtverečkem je pro hi neforraulovaný, křivka s prázdným čtverečkem je pro hi formulovaný Na obr.. 3 je graf ddsociace bys^B28Pro®²⁹ lidského inzulínu ve formě h e x a m e r η í h o 'komplexu. .Na grafu j e i n v i t r o · d i s o c i a c e pro formulovaný inzulín ( prá zdrié kol ečko) , pro Lys^{B 28}Pro^{s 2 9}-h.i formulovaný jako hexamerní komplex (prázdný'trojúhelník),· pro neformu-. lovaný inzulín (prázdný čtvereček) a pro monomemí Lys^B28Pro^{8 2 9} -; hi' (hvězdička) monitorovaná· stat.ičkýrorozptyle.m světla při 488 nm: pod úhlem 90 Formulovaný vzorek obsahuje 0,5 mol zinku na mol proteinu, 1,2 5 mg/ml m-kresol.u a. 1,.09 -mg/ml fenolu, 7 mM fosforečnanu sodného a 16 mg/ml glycerolu. Naformulované a jionomerití’

...vzorky neobsahují žádné přídavné-,éxc.ipienty. Obr. dokládá', před-: nosti vynálezu. Na. ose x je koncentrace proteinu v mg/ml, na ose y střední molekulová hmotnost (g/mol). ,·

Jak shora :uv'edeno, týká se vynález moncaerního lidského inr ' zu 1 i.nového-' analogu komplexovaného. ve' formě hexameru. Výrazy moriomernx inzulínový analog'.' nebo lidský inzulínový analog se ty-, kají lidského íriznlinu, 'přičemž: . ’'./·.

Pro v poloze B28 je substituován· Asp, Lys·, -Láu,· Val ' nebo Ala; a Lys v .poloze B29 je lysin nebo .je ' substituován proliném·;

·4\ -ϊ·' ·

Office. Obzvláště výhodným L_V?;B28p_ro d e s (B 2 8 - 8 3 O) ; n e b o des(T327 ).

Monomerní inzulínové analogy popsal Chance a kol, (evropská, zveřejněná přihláška vynálezu Číslo EPO ,383472.) á Br.ange a .kol. .(evropská zveřejněná'přihláška vynálezu 'číslo ΣΡ.0 214826);'. ..Monomerní'· inzulínové analogy jsou méně náchylné.-k dimerizaci nebo ke.„spon¹ . · · ‘ < i: ,· y. ''' ' .

tánní asociaci než inzulín.· . ''·.....* .·' ,· (.„.'$···' ·' • . .... ',· í ¹ *' '* > . - v

Pracovníkům v oberu je 'jasné,' že . jsou .možné,-další •.modifikace. Tyto modifikace jsou v oboru ve velké, míře přijímány a-.zahrnují náhradu histidinového zbytku v poloze BIO kyselinou asparagovou; náhradu fenylalani nového zbytku v poloze B1 kyselinou asparsgovon.; náhradu threoninového zbytku y _p poloze B30 alaniném; náhradu .-serinovéhc zbytku'v poloze.,B9 asparagovou kyselinou; vypuštění aminokyselin v .po] oz e’ B1 .'sb.m'o,tných . .nebol v kombinac i .-s je-, jich vypuštěním v poloze B2; vypuštění .threon, inu- v. poloze. B30,-..'·'

Všechny zkratky, pou ží váné--pró ' a ni-i noky sěli-ny jsou v souladu s 37 C , F , R , § 1 .822{b){2) úřadu United. States Patěnť .&·'Trademark.

· . *' ’ ·’ I ^: ·' ^v,' ’ '· ’ , '.,*í ř·.. * '· · «η. · - * ·· ¹ monOmernlm .inzulínovým;.' analogem -je

B 2⁹ -1. i d sk ý inzulín (B28 je bys, B29je Pro) ·.·.Výrazem ošetřování“ se zde- vždy míní''.zacházení s'nemocným a péče o nemocné za účelem boje proti- neomoci.,••'••sta,vu.nebo · poruše· a zahrnuje podáván í. s 1 čučen i ny λ pod lě'· vynálezu k přede házen í · nástupu symptomů nebo korapl i kac í/, (sni žovánr symptomů nebo komplikací nebo eliminaci i nemocnění chorobných .stavů nebo vpoYuch. -Výrazem isotonické činidlo, se-zde ·..-vždy. míní činidlo. ^!',.-fysiologicky.

. ' , v. i, . 5'\' '! . . ‘1Λ . ·'. .- 1 ., ' snášené a zahrnuje vhodnou ton i citu. k' vytváření nebo kýprevenci toku ' vody přes buněčnou membránu'.' ‘ Pro-tyto účely «se.''používají v koncentracích o sobě známých sloučeniny- jako- glycerin,'· .Výrazem fenolická sloučenina nebo f en.o’l i cký . der i vá t '-.se zde -.vždy míní m-kresol, fenol, nebo je jich směsi Výr a z/''f ysioí og i;c.'ky,>,v hodný ;

pufr je pracovníkům v oboru žna^i?-Jakožto :.f ý;sio,logi-ícký;(.;vhódný / '·., /'' ' ·( . - ·;·'· . g -.-.5- */ - .. . '.· pufr 'přichází -v úvahu· především .fosfátový pufr; jako' Fosfát sodný.

Jakožto další fysiologicky..· vhodné, pufry.·; se l·,. uvádě jí (TŘIŠ·, ácetát;

.·.<· ·. ''.ti 'čý 3>.·' ( vl' ’ i j f .«-.v nebo 'citrát, sodný. ,'Volba,, a koncentrace; pufruvjé.. v. oboru 'známa

Inzulínové analogy podle vynálezu .vytvářejí komplex se ,ziI nečnatými' jonty a s fenolov-ou sloučeninou za vzniku stabilní hexamerní. -konformace. ZineSnaté ionty a .fenolová sloučenina mají rozhodující význam pro vytváření komplexu.,· který je' stálý a .rychle dissocinje pro započetí -působení. Hexaměrový komplex sestává ze dvou . zinečnatých .iontů, na hexamer analogu lidského 'inzulínu a z alespoň tří molekul fenolové sloučeniny, volené ze souboru zahrnujícího m-kresol, fenol a směs m-kresolu a fenolu.

Rozpustný monomerní analog se převádí. na hexamerní komplex rozpuštěním monomerního analogu-v. ředidle obsahujícím/fenolovou sloučeninu při hodnotě'pH pr ib1.’j žně·,7‘‘, 5·· - a- přidáním.' zinku. Zinek se v r výhodou přidává ve formě solil Jakožto representativní soli zinku se uvádějí, acetát, bromid., chlorid., . fluor id , j.odid’a síran zinečnatý. Pracovníkům v oboru· je.jasné,, že je 'možné podle vynálezu použít · i jiných z inečnatýcb 'solí. ; .8 výhodou se používá, octanu nebo chloridu zinečnatého, jelikož se v takovém/.••případě;

nezavádějí další chemické ionty .do průmyslově vhodného procesu.' . . ·.·<’

RczpuStění analogu se může napomáhat způsobem,.běžně známým jako kyselé rozpouštění, to znamená, ' že se hodnota pH snižuje na přibližně 3,0 až 3,5 použitím fysiologicky vhodné kyseliny, s výhodou kysel iny-chlorovodíkové, k napomáhání' rozpouštění monomerního analogu. Jakožto jiné fysiologicky vhodné kyseliny se uvádějí kyselina octová, citrónová a fosforečná. Hodnota. pH'se pak upraví fysiologicky vhodnou zásadou, ..s ,’výhodou hydroxidem sodným,, na přibližně 7,4 až 7,5. Jakožto . jiná fysiologicky vhodná' zásada’ se uvádějí hydroxid draselný, a hydroxid·'amonný 1 ,. y

H.examerní komplex se.může formulovat’ ría stálý, rychl e ’ působicí párentcrální farmaceutický, prostředek. Koncentrace'inzullnového analogu ve farmaceutickém prostředku je přibližně ·· 0,5. až přibližně 20-mg/ml, s výhodou přihli žně 1,2-až přibližně 17,5 mg/ ml a především přibližně 3,5 mg/ml.·' Obecně ..je. koncentrace, zinku·

Ϊ» *

* '·* \ ' <’,· přibližně 10 až, přibližně 50 pg/ml a zinku v prostředku 14 až přibližně.' 35 .opti málně / je·.koncentrace pg/ml, př ičemž jsoii dvaionty·zinku vázány na každý .hexamer. Při formulování váže hexaroeř až sedm-molekul fenolové sloučeniny. Obecně-se při formulaci váže ha, hexamer .šest molekul fenolové sloučeniny. Do prostředku se proto přidává s výhodou nadbytek fenolové sloučeniny. Fenolová prostředek. Výhodnou nej výhodněji 2 3 Ό.

Do prostředku se glycerin. Koncentrace slon cenit! a působí také jako k on ser v a ční koncentrací je'proto přibližně 23 až 35 oiM ,

Fenolovou sloučeninou je s výhodou m-kresol. , - , .

může přidávat.,, isotonické činidlo.,· .s výhodou jsotonického činidla je . o · sobě známá ^pro inzulínové prostředky, s výhodou, je přibližně 16 mg/ml. ·. Hodnota pH farmaceutického prostředku se může pufrovat, fvsiologicky vhodným pufrem., s výhodou ' fosfátovým pufrem, například fosforečnanem sodným. ' . ^Λ . ·

Podle známého, stavu techniky potřeboval pracovník v oboru eliminovat agregaci, aby dosahoval rychlé·absorpce. Proto je'velmi překvapivé, že formulovaný hexamer analogu · přináší .. .rychlý ...začátek působení. Na rozdíl od inzulinu.vytváření běxameru komplexu inzulínového analogu. n'e'má--nepríznívé působení na dobu potřebnou k dosažení píku koncentrace inzulínového analogu v seru. Obr'. 1 dokládá v případě lidí střední glukosovou infuzní odezvu'na prostředek obsahující monomerní Lys^B2BPro ^B29-h.i' _{formulovaný bez zinku); na .formulovaný' I.ys^B28Pro ^B'²⁹-bi' hexamer; a na lidský in'zelin. Formulovaný hexamerní komplex si ponechává rychlé působení monomerního Lys^B2BPro. ^B29-'hi. Absorpce je značně rychlejší, než: regulérního lidského insulinu. Výsledky podle obr.l tedy .dokládá-, jí, že především mají · hexamer L.ys^B2BPro ^S29-hi a monomerní Lys^B28Pro ^B29-hi podobnou rychlost absorpce a dále,' že jak hexamerní tak monomerní Lys^B28Pro. ^B29,-hi. vykazují...rychlejší absorpci než inzulin.

!. i. ' Á

Farmaceutický prostředek·, obsahůjící inzulínóvý·analogový - ' . : . . - j :·' · ' ' komplex ve formě hexámeru, je stálý. Porovnávací studie monomer-' s'^:H ního kys^S28Pro. ^B29-hi' vykázala rychlejší, odbourání s 1,63% týden- íj 'ním vzrůstem se zřetelem na' vytváření, polymeru v- průběhu . šes-titý-./.··'^// denn í stud i e . Ne formulovaný’, . 1 idský,. i nzul in pod 1 éhá - pomal é jšímú^h; j/v •Vvytváření polymeru, 0,61.·'% za týden . · Avšak po formu láci 'se- ryčh-T¹ • ' \ ···’·.· . f . ' .*' ··. j·· '·’ lost vytváření polymeru s vyšší molekulovou hmotností, ^snižujejna A

0,095 % za týden pro; inzulín. Formulovaný Lys^B28Pro ^{B 28}-h formě hexamerního komplexu vykazuje sníženou rychlost vytvářena

,3 polymeru s větší molekulovou hmotností 0,11 % za týden,' což je porovnatelné s rychlostí v případě formulovaného inzulínu. Tyto studie jsou objasněny v příkladu 1. a na^-obr. 2.

Inzulínový analog podle vynálezu se může připravovat jakýmkoliv o sobě známým .'způsobem· peptidové syntézy včetně klasic(r o z tok o v éh o ) způsobu, způsobů v' pevné fázi., polosyntetického kých způsobů a nejnověji rekombi nantnimi způsoby DNA. Způsoby přípravy různých monomerních analogů popsali například Chánes a kol.,(evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EPO 383472) 'B.range a kol. (evropská zveřejněná přihláška' vynálezu číslo EPO 214826) .

Následující příklady praktického provedení způsob přípravy' 'inzulínových analogů podle vynálezu, toliko objasňují, přičemž není je.jleh záměrem- nějak vynález omezovat. _? · . '

Příklady provedení, vynálezu V · ' .Příprava 1 ·. . . .

Příprava proteinového zásobního roztoku

Neformu 1 ováné vzorky .inzulínu a Lys^B28Pro ^B28-hi se připraví v koncentraci 3,5 mg/ml-y 7 m.M fosforečnanu •sodném a s 1,25 mg/.ml • · r A m-'kresolu nebo bez m-kresolu, s 1,09 ,rag/ml fenolu

Cl a· se .6 mg/ml

1·^ , Λ >. / τι t -4 ·;

.-· V.

·· ;* : i··

V ?

J^v ‘/ΪΊ •U; ·^Λ glycerolu v závislosti na prováděném pokusu. Připraví se vzorky bys^B29Pro ^B29-hi ve formě hexa'merníbc\ komplexu naprosto'stejně, jedině-se přidá 19,7 gg/ml z.inku. Všechny _; vzorky se' udržují na·, hodnotě pH 3,0, přičemž se přidá zinek.· Hodnota· pH sc pak nastaví 1 na 7,4. Proteinová, koncentrace se stanovuje před přidáním fenolové' sloučeni ny; UV absorpční spektroskopií za· použití spektrofoto-.' metru model AVIV 14 DS. Proteinová koncentrace sevypočte- způsobem, který popsal Frank . R.H., Pekar '' A.'.H .. .a . Veros. A . J.. (.Diabetes

21.'. (Supp I.. 2 } ' štr . '4 86 ' a ž 491, ' 197'2 ) . < .'··' ' ' ' ' ' '.-·'··· ' ' ' > ' .... ..'·'·> '

Příklad 1 . ? ;‘ j

Chemická stálost . ·. ' ' .•••u,

-ΊΟ . ' ·ν ' \

Odbourání se iniciuje inkubaci formulovaných a n-eformu 1 ováných prostředků inzulínu a monomerního a hexanemího tys⁰²⁸?ro při teplotě 30 ’C. Formulovaný inzulín a he?;amerní 'Lys⁰²⁸Pro· ^θ2<5hi vždy obsahuje·: 3,5 mg/ml proteinu,' .16 'mg/ml ' glycerp'lu_ia?'7’ nrM heptahydrátu dibazického' fosforeč-naňu..sodného i 1 ,2 5’/mg/.ml. mykřesolu, 3,09 mg/ml fenolu a 0,024 5 . mg/ml·. oxidu· z .i nečriatéhp ípřl'- bod-¹ i?, '< j $*' notě pH 7,3 až 7,4. Ne f o r mu 1 ováný : inzulín,, ετ monom ér ní tys⁰².⁸;/ ' ’ · ' ; > . ·ϊΧ/ '

Pro B 2 9-h i vždy obsahuje: 3,5 mg/ml·proteinu, 16 mg/ml glycérolu, mM heptahydrátu dibazi ckého .fosforečnanu sodného, 1,25 mg/ml, jji-kresolu, 1,09 mg/ml fenolu při 'hodnotě' pH 7,3.až 7,4. V s.edmidenních intervalech se odebírají' vzorky . z inkubace . při. 30 '*C· a;

zkouší ss na vytvoření výšemolekulár. nich.'látek z.a použití - chromá~;

_f ' ' ' ⁷ ' ' ' ' ‘ * ’Χ-' / ' r·'·!',· , ΐ·:.ϊ •tografie prováděné vst ř ikován i ni .20-,μΐ.. ‘.-.vzorků'na'.' -sloupec;. Pupont

Zorbax GF-250 Speciál- {9,...4 x. 250,.-mra·) /a/ za-použití jako. ělnčníh-o — . -'. .-i V / »·><. /ý ΛΧλ/·/'. ’ činidla směsi 0,4 M hydrogenuhliči tanu sodného a -·'. ac.eto-nitTi.lu :

/průtoková rychlost 0,5 'ml/mi'n při teplotě okolí. a . za détekc.e^pr-í ·.

214' nm}, -Procentové vytváření polymeru': „/sě stanovyjeJz poměru tv.y- - , - / . /'^: vy.< - _:. u.y sokomolekuVárního píku k celkové.· ploše- monomerniho .á vysokomole-·· kulárního píku i. Výsledky objasňuje-obr^-. 2.- -', . /

Příklad 2

S t a t i c k ý r c z p t y I s v ě 11 a.

' Charak te.r i st iký disociace/in’' vítr o/monom erního

Lys^B28Pro ^B28-hi, .Lys^B28Pro- ^B29-hi/ .ve forně-héxam.erníbd.'komplexu-b . ^: y,·' ; '·. ' ? > : ‘ 'X ''í$^;< ' 1--. ¹ ·.''· a inzulínu se zkoušejí za použití/statického/rozptylu syě-tlalfSlS / . ' ' · ' .-i /.· ‘Ύί i' ' ' I -'V⁷/ y///' static light scatter ing'”.) . Připraví i/sev-tři⁷-.form.iílóva.hě Ia’néf.or:y; .-I-t ^; ·> I. jry; · y_; ./I/.·-,/ nulované proteinové zásobní roztoky'.shora- popsaným způsobém^pri-/ř-·'/ čemž však n e f o r mu J. o váný-.protě i ho vý zásobní roztok' neobsahuje izl·.-nek, glycerol nebo konser va ční; př í sadu Za* poďž i t í. ,.-t ěchtip :3-,5 mg/ml- zásobní cb roztoků se -'připraví řada '.zředěni·,pro/-jak. in^.u,I in- tb/ ·: , .. z ,·. -. V--',- .ν,.ί· yícytYvψ-ν'tak pro Lys⁸ 28pjo ' B 2 9-hÍ''- za* koncentrace- proteinu.-/3^, 5 *áž -;0,2

Všechna zředění- ' se ..upraví -na konecný//· ob jem IO’ m.Í použ.I tímf osforečnanu 's-odného jakožto 'pufru ,za( bodnotyjipH.Ík, 4/ k iriapó&pbenl/í , ,-'· . ' ' - f A-. v ^ř /1//1 subkutan-ní ho mí š-tá . po^; ' vstriknutl ť/.'Všechny /'/rbtť.oky. ,še’ /f ilit-rn jíl^; · .·' filtry Gelman, s ní zkou'.schopností, vázat-protein . před prováděním •Ϊ;. '

a

SLS měření- Koncentrace proteinu v těchto vzorcích se stanovuje reversní fázovou chromatográfií HPLC.

Pro analýzu formulovaných vzorků se připraví proteinu prosté slepé rozonštědln pro každou řadu proteinových vzorků.; Tyto slepé'vzorky obsahují excip.ien.ty v téže koncentraci· jako odpovíΆ>vzorky. Pro .analýzu· neformuleváných vzorků se mM fosforečnanu sodného . Použ it.í těchto odpadající proteinové použui je slepého ·' vídajících slepých rozpouštědel· zajišťuje, že hodnoty reflektují pouze rozptyly rozpouštědla a nikoliv příspěvek .změn.rozpouštědla. ·’ ' . '·. ··. ' . · · ··..

Statické pokusy rozptylu světla SLS se provádějí za použití, zařízení Brookhaven Instruments 2O3OAT autokor c, lá tor a za použití at

K·¹.· ψ;

f ί* /·

ν..

ftí

4’ ír

-Í.I..

tí·!

LÍ

s.l as otvorem za úhlu Model '3500 arogenového gonioroetru. Všechna měření se provádějí .

rozptylu 90 ’za pou ž i t í . zař í z en í·. Lexelův iontového laseru při. 488,-nm. Teplota se. udržuje· na . 25 ’C, lázní •Neslab .RTE-110. Signál· fotonásobící trubice' je kalibrován za' .použití 0-, 1 um f i .1 tro váného' toluenů ..

Hmotnostní střední molekulová hmotnost se vypočte za použití rovnice, kterou popsal Cantor C.R. a Schimmel P.R. { Biochemical

Oheraistry W.H.Freeman .and Company, New. Yo.rk, str. · 838 až 843, . >

1982 ). Výsledky této-studie jsou na obr. 3. Dis.ociaČní profil in vitro Lys ^{8 2 8}Pro ^B29-hi ve formě hexamerního - komplexu' a .inzulínu je značně rozdílný. Inzn1inový,analog vykazuje rychlou disociaci,' která umožňuje rychlejší absorpci než lidský -inzulín. Jakkoliv oba prostředky obsahují hexamerní .asociační- formy a prostředky jsou stejně stálé proti ''chemickému. ·. odbourání , má · hexamer ní '·· Lys^B28Pro ³²⁹-hí větší sklon· k di soci ac i ;ne ž- inzu 1 i n . .. - '.· • . · ' , . I t * .

Průmyslová -využitelnost

Hexamerní komplex analogu.lidského inzulínu·, vhodnýpro parenterální .farmaceutické prostředky obsahu je lidské,' inzulínové - analogy v hexamerní konf i guracizinečnaté ionty' a,'alespoň tři molekuly fenolové sloučeniny ze souboru m.-kresol, fenol a- jejich směsi. Takové · kcmpl exy‘ a . farmaceutické. prostředky,· které je' obsahují, jsou stálé proti chemickému odbourání a. začíjhají .rychle působit.

Claims (7)

1. -Komplex analogu lidského -inzulínu obsahující šest molekmí anologu lidského inzulínu, dva zínečnaté ionty a alespoň tri molekuly fenolové sloučeniny ze, souboru' zahrnu jícího, mkresol, .fenol a siněsii m-kresolu fenol ve formě hexameřu'.: ' '

2. Parenterální farmaceutický prostředekv y z n a č u j 3 c í. .se t í m , že obsahuje jako účinnou látku komplex analogu lidského inzulínu podle nároku 1

11. í ', '·, *·

3. Parenterální farmaceutický prostředek-podle nároku 2, vy. -s .: · z, n a č u j í c í se tím , že dále · obsahu je.'ísolonické či.nidlo a fysi ologi cky · vhodný-puf r '/.', .’%···.⁷ . i.ť . - '· · ' ... v

4. Parenterální farmaceutický prostředek.' podle nároku 3, v y- z n a č u j í c -í se’· t í. ra , že obsahuje .'jako. analog lidské_?;B28p_ro B2 9_lidský i.nzu 1 i-ná ho inzulínu Ly

5, Parenterální farmaceutický prostředek' podle nároku 4,' v y-..

značující se t í m ., že obsahuje přibližně 3,5. .mg/tnl LysBSSpro ^b29 lidského inzulínu, přibližně' 19,7 gg/ml .zinku, ^přibližně 7 mM fosforečnanu 'sodného, přibližně'16 rag/ml' glycerinu a;/ přibližně 29 mM ir.-kresolú. - ' '/

6. ' ' Komplex analogu 1 idského' in'zu'lin.u-.'.pódl,e nároku .1 , kterým-// je LysB28pro' ⁸²⁹ lidský inzulín. ‘- > ---/:/. ··.·.·'· ' · t/l;//-¾ ·/

- ’ ‘ '' ' ⁴ /Ϊ ‘ ipy ., , ' - . - ^j _z . 7í f

7. Komplex analogu- lidského .inzulínu podle nároku; 1-, kterými..v.}/ je Asp^B2S lidský inzulín. ' -