CN85106361A - 培养细菌的培替氏培养皿和检查药敏性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是关于培养细菌的培替氏培养皿和用这种培替氏培养皿检查从临床样品等分离出的或分离后纯培养出的细菌的药敏性的方法。

至少用一个片将培替氏培养皿本体的上端面盖住，在该培替氏培养皿的底部至少开一个小孔。如果需要，可以安装几个隔板。

使用渗透片作培养表面的、被分隔成几部分的培替氏培养皿，本发明的方法把在每一部分中接种了细菌的种类彼此不同的培养基，含不同种类的药物的培养基或含有同一种药物但浓度不同的培养基进行拼配。

Description

本发明是关于用来分离细菌、增菌法培养、药敏性试验等的培养细菌的培替氏培养皿，和用这种培替氏培养皿检查从临床样品等等分离出的或分离后的纯培养的细菌的药敏性的方法。

在医院里做细菌检查时，为了确定引起传染疾病的病原体，必须完成诸如从被检物得来的细菌的分离培养和增菌法培养等。特别是，由于传染病的药物学特征的并发症，从临床诊断推断致病的细菌更为困难的当今趋势的时刻，由检查细菌的方法得到的结果变得重要起来。

因为根据细菌种类的不同，适于细菌生长的培养基是多种多样的。然而，鉴别致病细菌的时候，需要制备一种这样的培养基，它对可能被确定为使被检物致病的全部细菌都是合适的。在血液样品中可能发现的细菌被载明的有：葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌属、肠球菌、嗜血杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、厌氧菌、compylobacter、布鲁氏菌属等等。为了分离这些细菌的任一种，通常对每一样品需要制备全部血液琼脂培养基、巧克力琼脂培养基、厌氧菌分离培养基、增菌法培养的培养基等等。此外，可以从排泄物中鉴定沙门氏菌属、痢疾杆菌、大肠杆菌、yersinia、小肠结肠菌、克雷白克氏杆菌属exytoca、弧菌属、葡萄球菌、蜡状的芽胞杆菌属等等。需要制备全部BTB乳糖琼脂培养基、DHL琼脂培养基、SS琼脂培养基、厌氧菌分离培养基、增菌法培养培养基等，作为任一种这些细菌的培养基。

然而，用一般的培养细菌的培替氏培养皿的方法制备这些培养基时，这样的一种制备方法需要将溶液进行长时间的加热，因为培养基中含有琼脂，还有在静止方法中还应将培替氏培养皿水平放置到琼脂培养基凝固为止，因此需要进行一种复杂的操作。此外，几乎所有的培养细菌的一般培替养氏培养皿都有其制备成系列的一种培养基，因此增加了一个样品所需要的培养皿的数目，完成一个接一个的培养皿的接种操作，以致不可避免使有关的操作复杂化。在这一点上，虽然可以设想一种方法，在这一方法中可以将几种培养基分别注入用隔板隔成几部分的培替氏培养皿中，从它的需要的观点出发，接种操作必需是一个部分接一个部分进行，因为各种培养基的制备使得增加了培养基之间的培替氏培养皿隔板之间的水平的差别。在这种方法和上述的一种培养基一个培替氏培养皿制备的情况之间没有改良性的变化。

此外，为了用培养细菌的这种一般培替氏培养皿的方法制备多种类型的平皿培养基，除此之外还需要复杂的操作，例如溶解、消毒、分别地灌注、培养基组分的凝固等，各个操作不得不尽可能地在无菌条件下进行。通常，一种培养基分别注入一个培替氏培养皿增加了每一样品所需的培替氏培养皿数，以致在医院的试验室中基本不能充分地准备所需量的培养基，因为在医院中样品量和需处理的细菌的种类不是一定的。因此之故，许多门诊部制作或购买预定期间内同时所需的预定量的培养基，并且不可避免地采用逐步消耗这些培养基的方法。在冰箱中贮存培养基时，在这种情况下贮存和购买只能在培养基容器的周围盖一个盖子的状态下进行，因为存在湿度和各种细菌污染培养基的问题。

在使用一般的培养基之前，对它们进行干燥的操作是必不可少的，但在贮存期间或在购买时处在排气状态的培养基在干燥操作中导致溶解空气中的氧。因此，如果处理厌氧菌，在干燥过程之后需要将它单独移到一个无氧的容器中。

然后，在对细菌传染病使用化学疗法的情况下，选择和使用最有效的药物去治疗引起这种病的细菌的方法是值得推荐的。尽管如此，对这些细菌有效的药物的种类和浓度需以细菌的种类而定，而化学疗法的现代普及引起产生抗药菌株（抗药性细菌）出现。这种抗药菌株表现出对通常的有效的药物有一种耐药量，因此，如果鉴定出任一引起传染病的细菌，采用一种有效的药基本上是不可能的。为此之故，为把临床适当的、合理的疗法投入实践的目的，不应忘记在被检查的细菌的项目中药敏性检查是一个重要的项目。

稀释法、扩散法和浊度测定法都可以用作检查细菌药敏性的方法;使用琼脂培养基的琼脂平皿稀释法和肉汤稀释法属于上述稀释法，并且把敏感片法、敏感圆片法、斜面平皿法和垂直扩散法用作扩散法。然而，根据细菌实际的长势，定向操作角主要有使用的琼脂平皿稀释法和敏感圆片法。

敏感圆片法是在被试细菌生物抑制圈或抑制带基础上判断结果，培养基不含药物时在预定的时间期间在此培养基上随后放入一浸渍了药物的圆纸片，在提前接种了被试细菌的培养基中完成细菌培养之后随着药物的扩散而出现抑制带或抑制圈。虽然这是一种广泛使用的方法，它容易操作且可对多数药物进行试验和用一个培替氏培养皿来进行一个浓度的试验。使用这种方法时，放了圆纸片在上面的培养基的厚度、倾角和性质很容易引起抑制圈大的波动，因此这种方法通常重复性不好。另一方面，虽然有时使用了一浓度圆片法（不在抑制圈大小的基础上判断效果，仅在它的存在上进行判断）但由于药物浓度的调整阔度很大，这种方法不适于测定被试细菌的最小抑制浓度（MIC）。

使用事先在其中含有预定浓度药物的培养基的琼脂平皿稀释法在重复性方面较好，并能自由地安排药物的浓度。由于这种方法需要每种药物一种培养基或浓度配置，不得不完成每一种培养基的接种操作，因此这一方法也是很复杂的。

一般的药敏性检查（其目的是取得治疗法则）把抑制全部细菌生长的药物浓度看得很重要，但并不注意对应于每一药物浓度的被试菌株的药敏度。然而，为了得到更适当的关于正在复杂化的传染病的治疗法则，需要进一步掌握引起这种疾病的细菌的详细情报。

本发明的目的是解决上述的培养细菌的一般培替氏培养皿的问题，即为了准备培养基不仅强制需要完成复杂的操作，而且一个操作仅可以接种细菌到一种培养基中的接种操作效率十分低。

通过本发明要达到的进一步的目的是解决培养基干燥的问题或是在储存和运输中被湿气和各种细菌的污染问题。

本发明的更进一步的目的是解决这样的问题，例如由于培养基的准备和上述一般检查方法的接种和敏感圆片法的低重复性所需的复杂操作。

为上述目的，本发明至少用一个片覆盖培替氏培养皿的上端面，在培替氏培养皿的底部至少开一个小孔，并且，如果需要的话，装几个其高度为培替氏培养皿底部和上述片之间的距离的隔板，在上述小孔上装密封盖。

上述的片可以是一种对充满培替氏培养皿的培养基组分可渗透的片（下文中称为渗透片），并可以适于附着细菌。配上这样一个培养基组分不能渗透的片（下文中称为非渗透片）也是可能的，在这种情况下，这种非渗透片需要可拆卸地覆盖着培替氏培养皿本体。可以配上对水和氧也不能透过的非渗透片。进一步容许用非渗透片可拆卸地覆盖在渗透片的外面。

使用渗透面作培养表面的、被分隔成几部分的培替氏培养皿，本发明的方法把在每一部分中接种了细菌的种类彼此不同的培养基，含不同种类的药物的培养基或含同种药物但浓度不同的培养基进行拼配，从而解释了上述的一般方法存在的问题。

由于使用上述方法的结果，制备培养基可以很容易，并且从开在培替氏培养皿底部的小孔分别地注入培养基填充物可以无菌地进行，当进行接种操作时，由于片的作用培养表面的高度是一致的，这使得用一次操作在被分隔成几部分的培养基的全区域接种细菌成为可能。

在使用非渗透片的情况下，培养基不会变得干燥或者在贮存和运输中不会受到湿气和各种细菌的污染。由于培养基是被封闭的，不会直接与空气接触，防止了培养基由于氧化而变质。在接种操作的时候，即使培养基是被分隔开了，揭开非渗透片也使得它获得一样平的培养基表面，从而一次操作就接种细菌到这样的被分隔开了的培养基的全部范围。

（实施例）

本发明的实施例的描述是和附图的描述一起进行的。

图1到图6说明用渗透性片的实施例。

（1）是Petri培养皿本体（1），Petri培养皿本体（1）是用塑料或玻璃之类材料制造的，并且最好是透明的。Petri培养皿本体（1）的上端面用渗透性片（2）覆盖，底（3）设置小孔（4）。上述的渗透性片（2）必须带一些细孔或间隙，间隙之外，在Petri培养皿本体（1）和渗透性片（2）之间被充满了的培养基沥滤到渗透性片（2）的表面。作为渗透性片的材料，多孔膜或多孔橡皮膜或包括醋酸乙酯类、聚丙烯类、聚碳酯类、聚偏二氟乙烯、涂于芳烃类的聚合物等的合成树脂之类的材料是更可取的材料。在Petri培养皿被含琼脂之类的固化剂充满的情况下，可以用织物和纸（它们的间隙比较大）作为渗透性材料。当然，在那种情况下，如果所使用的树脂膜是疏水性的，那么，事先要进行疏水性处理。就渗透性片（2）的强度而论。全部要求在于可以获得保持培养基平面的程度，当Petri培养皿以此被充满的时候，如果材料需要某些增强的话，合成纤维等可起这类作用，或在固体培养基的情况下，把平的增强的膜插入渗透性片（2）和Petri培养皿盖（5）之间的间隙（这将在下面提及）直到培养基被固化将起增强的作用为止。此外，在Petri培养皿底（3）上的小孔（4）最好设置有可卸的密封盖（6），在Petri培养皿中，被含琼脂之类的固化剂充满的情况下，这种需要有时差不多减少到零。以便在里面已被消毒的Petri培养皿（1）中，可以保持无菌状态。

（5）是Petri培养皿盖，用塑料或玻璃制造，且最好是透明的。Petri培养皿盖的内部周边设置环形突出物（7）。这个突出物（7）提供形成渗透性片（2）与Petri培养皿盖（5）之间的间隙，当Petri培养皿盖（5）与Petri培养皿本体（1）配合的时候，在渗透性片（2）上生长的细菌菌落靠它阻止附着到Petri培养皿盖（5）的内表面上，对培养皿盖（5）的外表面来说，并保持足够的不透气性。在那种情况下，当上述突出物（7）提供的地方没有必要限制于Petri培养皿盖（5）的内部周边的时候，将它设置在渗透性片（2）的周边上或设置在Petri培养皿本体（1）的上端面的周边上是可行的。

上述的Petri培养皿本体（1）可以设置几块隔板（8），隔板（8）的高度为Petri培养皿底（3）与渗透性片（2）之间的距离。在那种情况下，被隔板（8）分隔成的各个部分（9）要求分别设置小孔（4）。如同图4到图6所示的那样。例如，分隔成四个部分的情况，可以在Petri培养皿底（3）的中心设置小孔（4），其中隔板（8）交叉使小孔（4）和培养皿的每个部分（9）相通。此外，密封盖（6）可以采用具有十字形开口的堵头（10），如同所示的那样。

然后参考图7到图11，说明用非渗透性片的实施例。在Petri培养皿本体（1）的上端面用可卸的非渗透性片（11）覆盖。非渗透性片（11）在它的厚度方面没有任何限制，而要求它对水和氧是非渗透性的。作为非渗透材料，有对氧具有较高的屏障性能的合成树脂膜，例如聚丙烯腈尼龙、聚甲基丙烯腈、乙烯乙烯基醇聚合物，聚偏二氯乙烯、聚乙烯对苯二甲酸酯、聚氯乙烯等是更可取的材料。在其上覆盖对氧具有较高屏障性能的上述的树脂膜或金属箔如铝箔等的其它材料，只有当它们去履行有关的目的时，才满足需要。当Petri培养皿充满培养基的时候，非渗透性片（11）的厚度是根它的材料，只有当它的强度达到使培养基保持平面的程度才满足要求。在固体培养基情况下，把平的增强膜插入非渗透性片（11）和Petri培养皿盖（5）之间的间隙，直至到培养基被固化并由此起增强的作用。而且，如果在Petri培养皿底（3）上的小孔（4）设置可卸的密封盖（6）的时候，最好的情况是在Petri培养皿本体（1）的里面已经被消毒，实现了无菌状态。如果是这样的话，把培养基分别注入这个Petri培养皿的时候，当然与一般的Petri培养皿相似，这个Petri培养皿的内部也保持无菌状态。

图9和图10示出了一个相似的实施例。Petri培养皿的底（3）可以这样设置，以便从Petri培养皿本体（1）的周边到小孔（4）具有一个倾斜度。在这种情况下，当把培养基分别注入这个Petri培养皿的时候，如果不产生泡沫，就可能用培养基充满这个Petri培养皿。图11说明用几块隔板（8）把Petri培养皿本体（1）分隔成4份的情况，在那个实施例中，被分隔成的4份中的每一个部分（9）都设置小孔（4），通过小孔（4）把培养基分别注入每个部分（9）。小孔（4）可用密封盖（6）分别密封，因此，被细菌污染的危险性最小。

图12到图15说明用前述的渗透性片（2）和非渗透性片（11）二者的实施例。在Petri培养皿本体（1）的上端面用渗透性片（2）覆盖，又用可卸的非渗透性片（11）覆盖。

根据本发明用于培养细菌的Petri培养皿，除了液体或半液体的培养基之外，还可用各种琼脂培养基。

其次，根据本发明描述的实施例，检验细菌对药物灵敏的方法如下：

在这个实施例中，这样的Petri培养皿如同图4到图6所示的那样，即分隔成了4份的Petri培养皿本体（1）的上端面上用渗透性片（2）覆盖，Petri培养皿本体设置隔板（8），它的高度为Petri培养皿的底（3）和渗透性片（2）之间的距离，这个培养皿的底（3）设置小孔（4），而小孔（4）和被隔板（8）分隔成的Petri培养皿的每个部分相通，并且小孔（4）设置密封盖（6）。

如用作上述的渗透性片（2），使用多孔的聚偏二氟乙烯膜（孔径：0.45μ，μ＝微米）。用Müller-Hinton琼脂培养基作为培养基，每批药物稀释液以固定量加入培养基，以便得到如同表1中所示的药物浓度。一份Petri培养皿保留用于检验，根据药物的浓度，培养基通过3步分别注入Petri培养皿的其余三部分（9），并在那里固化（因此，在一份培养皿中操作达3次，四份培养皿需要操作12次。），如同检验培养基那样，Müller-Hinton培养基也是分别注入的。

首先，把病人的脓包作了试样，手工接种在上述被分隔成了四份的培养皿的渗透性片（2）上。

其次，用螺旋形片仪（spiral    plater）（由美国螺旋系统制造的）通过直接的方法从病人的脓包接种。这种螺旋形片仪是并入自动系统的接种装置，用来测量活的细菌的数目，它是美国食品药物管理局研究设计的。当被试材料根据从培养基中心的距离给出它的密度梯度的某一值的时候，接种过程是这样的进行，以便被试材料成螺旋形涂抹在培养基上。

为此，根据本发明的方法，如果被试材料为了以预定的密度梯度接种涂抹在渗透性片（2）上，那么，简单的进行每一个固定区域用的隔离的菌落数目的测量将使包含在单位被试材料中的活细菌的总数可以被计算出来。而且，当然，除了根据一般的药物灵敏度值外，对每种药物在各种浓度下，产生疾病的灵敏度将是容易而迅速得到的。

由于使用上述的螺旋形片仪，金黄色的葡萄球菌作为在这个试样中的病原菌是以2.8×10⁴CFU/ml的速度被分离的。

使用一般地以生长的实体为基础的鉴定标准，可以从表1作一鉴定。对上述分离出的细菌，ABPC的MIC值是1.56mg/ml，CTM的MIC值是0.78mg/ml，此外CZX、GM和NFLX的MIC值分别是6.25，50以上，3.13mg/ml。

注意，在各种药物的相应浓度中，分离了的菌落数目的变化，可以按照一般的标准提出，GM的MIC值超过50mg/ml，但实际上，浓度为6.25mg/ml，大约50%的被试细菌对药物显示出灵敏度。

ABPC：氨必西林    CTM：cefotiam

CZX：ceftizoxime    GM：艮他霉素    NFLX：norfloxacin

由于根据本发明用于培养细菌的Petri培养皿具有前述的结构，因此用培养基充满Petri培养皿本体（1）就不需要打开Petri培养皿盖（5），在那里培养基就可以分别注入。当Petri培养皿的盖（5）是合适的时候，可以做到。Petri培养皿可逆地转动，培养基分别从Petri培养皿的底（3）的小孔（4）注入。为此，因为Petri培养皿的盖（5）没有打开，当分别注入培养基的时候，培养基的分别注入和一般的方法相比，更大地减少了被各种细菌污染的危险。同样，在使用渗透性片（2）的情况下，培养基在作为底面工作的渗透性片（2）上固化，渗透性片（2）作为培养面，当培养基提供用来接种和培养细菌的时候，培养基的固化并不需要通常需要的在固化作用中的振动并不会引起在培养基的表面上产生扰动的一个平工作台。在使用非渗透性片（11）的情况下，如果非渗透性片（11）没有覆盖，当培养基用于接种和培养细菌的时候，同样也产生上述效果。

根据本发明，在使用分隔成几部分的Petri培养皿的情况下，因为被培养基充满了的每部分的培养面的高度由渗透性片（2）和非渗透性片（11）保持均匀，通过自动接种装置例如螺旋形片仪接种成为可能。在一般的被分隔了的用培养基充满的Petri培养皿中，由于隔板之间的各个培养基不在同一水平上，上述操作中就产生了问题，同样在手工接种的情况下，通过一次操作把细菌接种到培养基的大部分也成为可能。

另外，采用渗透性片（2）的Petri培养皿，因为充满了Petri培养皿本体（1）的培养基的形状通过Petri培养皿本体（1）和渗透性片（2）被固定，在Petri培养皿本体（1）中，借助于被密封了的有较高水吸收率的包含聚丙烯酸苏打、聚丙烯酸淀粉、PVA等的树脂，或包含来源于天然物质的藻酸和羧甲基纤维素的被密封在Petri培养皿本体（1）中固化剂，充满液体培养基也是可能的。因此，含药物培养基的制备需要的传统的复杂的操作将可能容易地进行。此外，如果Petri培养皿本体（1）的每一部分（9）用某些含不同浓度的药物的培养基充满的话，申请人认为：这些培养基用于药物灵敏度试验将是便利的培养基。

在使用非渗透性片（11）的Petri培养皿情况下，在用培养基充满了Petri培养皿之后，由于在贮存或在运输中，培养基在非渗透性片（11）和Petri培养皿本体（1）之间被密封，因此，培养基不能和空气接触，防止了培养基的干燥和由于氧化作用引起的变质，也防止了由于湿气使培养表面潮湿，还防止了在贮存中由各种细菌产生的污染。在与空气隔绝的情况下，培养基分别注入到培养皿里面贮存是可能的。当培养厌氧细菌的时候，如果培养基事先经过减压脱气、煮沸、超声波处理等，然后分别注入的话，就可以提供比一般的培养基有更少溶解氧的适当的培养基。

再者，根据本发明，用于培养细菌的Petri培养皿也可以通过在Petri培养皿的几部分调配足够的培养基的方法用几个培养皿来完成甄别病原菌。

根据本发明的方法，利用渗透性片（2）作为培养面就能够得到极平的培养面（尽管采用了被分隔的Petri培养皿），此外，进行手工细菌接种也比较容易。利用象螺旋形片仪的自动接种装置也成为可能。

图1是实施例1的局部剖视的透视图。根据本发明用于培养细菌的Petri培养皿是用的渗透性片;图2是实施例1的Petri培养皿盖的俯视图;图3是实施例1的Petri培养皿本体的俯视图;图4是实施例2的局部剖视的透视图;图5是实施例2的Petri培养皿盖的俯视图;图6是实施例2的Petri培养皿本体的俯视图;图7是用非渗透性片的实施例3的Petri培养皿的俯视图;图8是图7的在A-A线处的剖视图;图9是实施例4的Petri培养皿本体的俯视图;图10是图9在B-B线处的剖视图;图11是实施例5的局部剖视的透视图;图12是实施例6的用渗透性片和非渗透性片的二者的局部剖视的透视图;图13是实施例6的Petri培养皿本体的俯视图;图14是图13在C-C线处的剖视图;和图15是实施例7的局部剖视的透视图。

Claims (13)

1、一种培养细菌的培替氏培养皿，其特征在于至少用一个片覆盖所说的培替氏培养皿本体的上端面并在所说的培替氏培养皿的底部开一个小孔。

2、按照权利要求1的培替氏培养皿，其中所说的片对充满所说的培替氏培养皿本体内部的培养基的组分可以是能渗透的。

3、按照权利要求1的培替氏培养皿，其中所说的片对充满所说的培替氏培养皿本体内部的培养基的组分可以是非渗透的，所说的片可拆卸地盖在所说的培替氏培养皿上。

4、按照权利要求2的培替氏培养皿，其中所说的片用对充满所说的培替氏培养皿内部的培养基的组分是非渗透的另一个片可拆卸地盖住。

5、按照权利要求2或4的培替氏培养皿，其中所说的片能将细菌盛在它的表面上。

6、按照权利要求3的培替氏培养皿，其中所说的片对水和氧可以是非渗透的。

7、按照权利要求4的培替氏培养皿，其中所说的另一个片对水和氧可以是非渗透的。

8、按照权利要求1至7的任一培替氏培养皿，其中所说的培替氏培养皿本体被隔板分隔成几部分，隔板高为所说的培替氏培养皿底部和所说的片之间的距离。

9、按照权利要求1至8的任一培替氏培养皿，其中所说的小孔装有一可拆卸的密封盖。

10、检查细菌药敏性的方法，其特征在于把细菌接种在一个被分隔成几部分的培替氏培养皿中，该培养皿有一个培养基组分解渗透的作为培养表面的片。

11、按照权利要求10的检查方法，其中所含药物浓度彼此不同的培养基被拼配在所说的被分隔成几部分的培替氏培养皿中。

12、按照权利要求10的检查方法，其中所含药物种类彼此不同的培养基被拼配在所说的被分隔成几部分的培替氏培养皿中。

13、按照权利要求10的检查方法，其中所说的细菌接种是一种在完成接种时，同时配制一个密度梯度的螺旋形接种。

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