CN109097318A - 一种新型隐球菌体外培养荚膜的方法的制作工艺 - Google Patents

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李京培
李群
李恺悦
许方玮
牛瑞琪
桂思语
陈铭
陈一铭
尤宇星
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N3/00—Spore forming or isolating processes

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Abstract

本发明公开了一种新型隐球菌体外培养荚膜的方法的制作工艺，属于医学实验教学示教用品的制作工艺领域，利用体外培养结合促生长液的方式将新型隐球菌体外培养并形成厚壁荚膜，破了传统新型隐球菌要在小鼠或人体机体体内培养形成厚壁荚膜和不易保藏的特点。

Description

一种新型隐球菌体外培养荚膜的方法的制作工艺
技术领域
本发明属于医学实验教学示教用品的制作工艺领域，尤其指一种新型隐球菌体外培养荚膜的方法的制作工艺。
背景技术
荚膜是菌体外包绕的一层较厚的黏液性物质，具有抗吞噬和抗有害物质的损伤作用，对菌体具有保护作用。细菌荚膜和真菌荚膜在医学实验教学示教很常见，新型隐球菌在小鼠或人脑脊液生长的荚膜特征是鉴别隐球菌属具有致病性的重要手段之一。而在医学微生物学实验教学活动中，示教性展示该特征性新型隐球菌厚壁荚膜是非常重要的。近40年来，新型隐球菌厚壁荚膜教学活动都是把新型隐球菌菌液注射到小鼠腹腔内形成的厚壁荚膜，现做现用的状态。
目前，在国内还没有人用此方法作新型隐球菌厚壁荚膜教学活动，国外医学微生物学实验教学活动改为录像或用数码扫描新型隐球菌菌液注射到小鼠腹腔内形成的厚壁荚膜制片进行教学，本发明人根据多年研究新型隐球菌体外培养形成厚壁荚膜的方法的制片与保藏的方法，这为医学微生物学实验教学活动带来很大的便利性，也符合实验室生物安全要求。
发明内容
本发明旨在提供一种新型隐球菌体外培养荚膜的方法的制作工艺，突破了传统新型隐球菌体内培养形成厚壁荚膜和不易保藏的特点。
为了实现上述的目的，本发明提供以下技术方案：
一种新型隐球菌体外培养荚膜的方法的制作工艺，包括以下步骤：
（1）利用已知新型隐球菌在相对应的沙氏培养基平皿上接菌，四区分离划线，放置于37℃恒温培养箱中培养2天，形成单个菌落，再挑取大的单菌落接菌到血平皿上，放置于37℃恒温培养箱中培养2天，形成单个菌落；
（2）挑取一个菌落至1ml生理盐水里充分混匀，其菌悬液浓度相当于5×108CFU/ml；
（3）将步骤2所得菌液50μl加入到含有0.4ml促荚膜生长液的1.5mlEP管内，混匀，放入37℃恒温培养箱中培养5-7天，拿出EP管；
（4）在洁净的载玻片上用加样器取25μl步骤3所得培养液与25μl墨汁染色液混合，盖上盖玻片，得到培养形成的新型隐球菌厚壁荚膜，在400倍的生物显微镜下观察，可见到与传统的小鼠体内法产生的新型隐球菌培养的厚壁荚膜。
所述步骤3中促荚膜生长液为小牛血清和DMEM液等体积混合液。
所述新型隐球菌体外培养形成厚壁荚膜的保藏方法为，在培养形成的新型隐球菌厚壁荚膜，在其菌液里加入0.1-0.2ml无菌甘油，放于4℃冰箱内可保藏3年。
本发明的优点是：
本发明提供的新型隐球菌体外培养形成厚壁荚膜的方法与保藏的方法，突破了传统新型隐球菌要在小鼠或人体机体体内培养形成厚壁荚膜和不易保藏的特点。
附图说明
图1所示为体外培养形成的新型隐球菌荚膜墨汁负染镜下400倍图。
图2所示为体外培养形成的新型隐球菌荚膜墨汁负染镜下400倍图，这是新型隐球菌出芽状态。
图3所示为常规小鼠腹腔液现作现用的新型隐球菌荚膜墨汁负染镜下400倍图。
图4所示为体外沙氏液体培养基形成的新型隐球菌荚膜墨汁负染镜下400倍图。
具体实施方式
下面通过实施例详细说明本发明
一种新型隐球菌体外培养荚膜的方法的制作工艺，包括以下步骤：
（1）利用已知新型隐球菌在相对应的沙氏培养基平皿上接菌，四区分离划线，放置于37℃恒温培养箱中培养2天，形成单个菌落，再挑取大的单菌落接菌到血平皿上，放置于37℃恒温培养箱中培养2天，形成单个菌落；
（2）挑取一个菌落至1ml生理盐水里充分混匀，其菌悬液浓度相当于5×108CFU/ml；
（3）将步骤2所得菌液50μl加入到含有0.4ml促荚膜生长液的1.5mlEP管内，混匀，放入37℃恒温培养箱中培养6天，拿出EP管；
（4）在洁净的载玻片上用加样器取25μl步骤3所得培养液与25μl墨汁染色液混合，盖上盖玻片，得到培养形成的新型隐球菌厚壁荚膜，在400倍的生物显微镜下观察，可见到与传统的小鼠体内法产生的新型隐球菌培养的厚壁荚膜。
其中步骤3中促荚膜生长液为小牛血清和DMEM液等体积混合液。
新型隐球菌体外培养形成厚壁荚膜的保藏方法为，在培养形成的新型隐球菌厚壁荚膜，在其菌液里加入0.15ml无菌甘油，放于4℃冰箱内保藏。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作出任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何微细修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术方案的范围。

Claims (3)

1.一种新型隐球菌体外培养荚膜的方法的制作工艺，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用已知新型隐球菌在相对应的沙氏培养基平皿上接菌，四区分离划线，放置于37℃恒温培养箱中培养2天，形成单个菌落，再挑取大的单菌落接菌到血平皿上，放置于37℃恒温培养箱中培养2天，形成单个菌落；
（2）挑取一个菌落至1ml生理盐水里充分混匀，其菌悬液浓度相当于5×108CFU/ml；
（3）将步骤2所得菌液50μl加入到含有0.4ml促荚膜生长液的1.5mlEP管内，混匀，放入37℃恒温培养箱中培养5-7天，拿出EP管；
（4）在洁净的载玻片上用加样器取25μl步骤3所得培养液与25μl墨汁染色液混合，盖上盖玻片，得到培养形成的新型隐球菌厚壁荚膜。
2.根据权利要求1所述的新型隐球菌体外培养荚膜的方法的制作工艺，其特征在于，所述步骤3中促荚膜生长液为小牛血清和DMEM液等体积混合液。
3.根据权利要求1所述的新型隐球菌体外培养荚膜的方法的制作工艺，其特征在于，所述新型隐球菌体外培养形成厚壁荚膜的保藏方法为，在培养形成的新型隐球菌厚壁荚膜，在其菌液里加入0.1-0.2ml无菌甘油，放于4℃冰箱内可保藏3年。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180209974A1 (en) * 2016-02-29 2018-07-26 Dynamiker Biotechnology (Tianjin) Co.,Ltd Preparation method of crytococcus neoformans capsular polysaccharide gxm as well as gxm antigen immunoassay kit and application thereof

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王娅等: "新生隐球菌荚膜培养方法与保存", 《青岛医药卫生》 *
耿晓北等: "新型隐球菌荚膜体外保存法", 《浙江大学学报(医学版)》 *
钟有添等: "新生隐球菌荚膜形成条件的对比研究", 《赣南医学院学报》 *

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