CN102220234A - 万古霉素耐药金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属医学检验技术领域，具体涉及一种万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(VRSA)快速检测试剂盒及其制备方法。本发明的目的是，提供一种快速检测VRSA的试剂盒。其特征在于：万古霉素培养基集成于特制容器，能够简便快速地一次性检出异质性耐药、中介、低水平耐药及高水平耐药葡萄球菌，并能够准确预测细菌MIC和定量检测耐药克隆的突变率，获得单个菌落用于进一步研究；观察实验结果无需打开培养基，有效避免微生物气溶胶等生物危害，安全、环保；同时能够解决储存过程中易污染，水分易丢失，抗生素浓度不稳定，保存期短等问题；成本低，可以自动化生产。

Description

万古霉素耐药金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属医学检验技术领域，具体涉及一种万古霉素耐药金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

根据细菌对万古霉素敏感性的不同，金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药水平分为异质性耐药、中介和耐药。目前，临床检测万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(VRSA)的方法主要有微量肉汤稀释法，自动化仪器检测法以及含6μg/ml万古霉素-脑心浸液琼脂平板筛选法，K-B法不能检出VRSA，已经淘汰。微量肉汤稀释法能够准确检出VRSA，但无法检出异质性万古霉素耐药金黄色葡萄球菌，而且由于操作太繁琐，不利于在临床常规应用，仅用来检测最低抑菌浓度(MIC)；自动化仪器法能够检出VRSA，而难以检出对万古霉素异质性耐药或中介株，甚至部分VRSA也能漏检，而且自动化仪器目前价格昂贵，无法在基层普及。

6μg/ml万古霉素-脑心浸液琼脂平板筛选法操作简便，不依赖于仪器，结果易于观察，目前在临床，尤其在科研中应用较多。但这种方法同时也存在一些缺点。例如，该方法采用单一浓度，部分异质性耐药菌会漏检，而且MIC为4μg/ml的敏感性减低株也会漏检。动物实验和临床实践表明，敏感性减低株、甚至异质性耐药菌的存在可直接导致临床抗感染治疗失败；其次，琼脂平板筛选法采用单一浓度万古霉素无法预测细菌MIC，因为所有MIC高于6μg/ml的菌株均能生长，而低于6μg/ml的菌株均不能生长。

目前，市场上已经有商品化的6μg/ml万古霉素-脑心浸液琼脂平板出售，采用一次性塑料平皿制备。这种平板采用真空包装，一旦打开外包装，必须一次用完，否则易被革兰阴性菌或霉菌等杂菌污染；而且，由于平皿开口大，即使放置2-8℃冰箱储存，在长时间存放过程中，琼脂中水分易丢失，也会导致平板中抗生素浓度改变，致使其保存期短，甚至要求需要时临时配制，在很大程度上限制了这种平板的商品化大批量生产。

这种一次性平板还有一个比较明显的缺陷一直难以解决。接种细菌后的平板，需要在温箱中孵育18-24h，细菌容易在平皿内形成气溶胶，由于平皿开口大，打开孵育箱门后，会造成实验室内空气污染，而且金黄色葡萄球菌对外界的抵抗力较强，治病性也很强。由于对包括万古霉素在内的几乎所有抗生素耐药(已经检出对利奈唑胺耐药的VRSA)，VRSA感染几乎无药可医，VRSA感染或传播将带来灾难性后果。同样，其他能引起烈性传染病的细菌在常规细菌培养过程中也会遇到同样的难题，一直无法解决。

本发明的目的是，提供一种快速检测万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(VRSA)的试剂盒。含有不同浓度万古霉素的培养基集成于特制容器制备成选择性培养基，能够简便快速地一次性检出对异质性耐药、中介、低水平耐药及高水平耐药的葡萄球菌，并能够准确预测细菌MIC和定量检测耐药克隆的突变率，同时能够获得单个菌落，用于进一步细菌学研究；本发明设计出特制培养皿，解决常规培养基储存过程中易污染，琼脂水分易丢失，导致选择性培养基中抗生素浓度改变，保存期短等问题；同时，本发明设计的试剂盒中，培养基为一密封系统，在观察实验结果时也无需打开培养基，有效避免微生物气溶胶等生物危害，安全、环保。

发明内容

本发明包括两个部分。

第一部分，特制培养皿设计。本发明试剂盒包括一个四面体、具螺旋开口的培养皿(图1，图2)和一个有内螺旋平皿盖(图3)两部分组成。

培养皿主体部分为四面体，四面体最佳的长、宽、高分别为长8cm、宽8cm，高12cm；四个对称平面(长12mm，宽8mm)上均设计一个向平皿外部凸出的长方体，长8cm，宽6cm，厚4mm(如图2)；在四个对称面分别用不同颜色做点状标记或文字标记以示区分；四面体培养皿上平面向上隆起，设一个向上凸出的圆形开口，外直径5cm，高2.5cm，凸出的圆形开口部分的外侧有螺旋，可以与平皿盖内侧螺旋匹配并旋紧；平皿盖为圆形，内直径5cm，内高2.0cm(图3)与四面体培养皿向上凸出的圆形开口相当，内侧有螺旋与培养皿的圆形开口处匹配，可以旋紧不漏气。

四面体培养皿部分由无色透明聚丙乙烯制成，平皿盖部分由无毒塑料制 备，经环氧乙烷消毒备用。

附图说明

附图给出本发明的万古霉素耐药金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒的结构示意图

图1本发明的万古霉素耐药金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒的的正视平面结构示意图

图2本发明的特制四面体培养皿主体部分横切面结构示意图

图3本发明的特制四面体培养皿盖子结构示意图

第二部分，试剂盒的制备方法。

药物浓度选择。常规方法制备4份脑心浸液琼脂，消毒后冷却至55℃，向4份琼脂中分别准确加入不等量的万古霉素储备液并混匀，制备成含万古霉素浓度分别为4μg/ml，6μg/ml、8μg/ml、16μg/ml脑心浸液琼脂，保温备用。

培养基浇注。超净操作台内打开已消毒培养皿并使其平卧，此时培养皿的某一颜色或文字标记面(如红色或4μg/ml)平贴台面，该面向外凸出的部分成为一个凹槽，以消毒移液管向其中准确15ml含万古霉素浓度为4μg/ml脑心浸液琼脂(勿使琼脂溢出凹槽)。待琼脂凝固后，将瓶子翻转一面，使另一面平贴桌面，同法加入相应浓度含药琼脂。四种浓度琼脂都浇注并凝固后，盖上平皿盖并旋紧，置2-8℃冰箱保存。

接种方法。常规方法制备0.5麦氏单位菌液，将培养瓶平卧，使含万古霉素浓度为4μg/ml脑心浸液琼脂面向下，用移液器取10μl菌液置于该琼脂表面，以接种环涂布，或以无菌生理盐水浸透无菌棉签后，挤出多余水分后涂布，使菌液均匀分布于整个琼脂面；将容器翻转一面，重复上述操作，至4个平面的琼脂全部接种完毕后，旋紧平皿盖，将培养皿直立，温箱孵育。18-24h后，直接观察结果，无需打开平皿盖。

本发明的优点。同常规培养皿比较，本发明设计出的复合培养皿，成功解决了培养基储存过程中易污染，琼脂水分易丢失，导致选择性培养基中万古霉素浓度改变，保存期短等问题；尤其是，本试剂盒为一密封系统，避免了在运输过程中因外层真空包装破裂引起的污染以及培养过程中培养基水分丢失等问题；本培养皿为四面立体密封系统，可以方便地通过不含琼脂的培养皿部分，从侧面完整观察各个侧面上细菌的生长情况，因此，在观察实验结果时也无需打开培养 基，避免微生物气溶胶等生物危害，实现安全、环保，该培养皿制备的培养基也可以推荐作为培养烈性传染病细菌专用培养基；培养皿上四个侧面向外凸出形成的凹槽，成功实现了在一个培养基上携带不同浓度抗生素而相互间没有干扰；而从较低浓度开始，一系列不同浓度万古霉素的运用，能够有效地选择出异质性、中介、低水平及高水平耐药菌株；能够获得单个菌落，有利于对细菌进行进一步研究；同时，本试剂盒可以定量接种，能够实现对耐药克隆的突变率定量分析；由于部分采用了琼脂稀释法的原理，可以准确预测细菌MIC；另外，本发明研制的培养皿和试剂盒特别适合自动化生产线批量生产，而且可以大大延长了使用有效期。

Claims (3)

1.一种培养皿，一个四面体培养皿内可同时浇注含有相同或不同组成成分的琼脂制备成复合式固体培养基：

——其特征在于，它的组成结构包括一个向上开口的四面体培养皿和一个平皿盖两部分组成；

——其特征在于，四面体培养皿除其底平面和上平面外，其余四个平面上均设计一个向培养皿外部凸出的长方体，用于浇注琼脂；

——其特征在于，四个突出的长方体分别用不同颜色或文字做标记区分；

——其特征在于，四面体培养皿的上平面向上隆起，有一个向上凸出的圆形开口，凸出的圆形开口部分的外侧有螺旋，可以与平皿盖内侧螺旋匹配并旋紧；

——其特征在于，平皿盖部分为圆形，内直径与四面体培养皿向上凸出的圆形开口外直径相当, 内侧有螺旋与培养皿的圆形开口处匹配，可以旋紧不漏气；

——其特征在于，制备培养基时，培养皿平卧，先浇注琼脂于平贴台面的一个平面的凹槽内，待琼脂凝固后，翻转一面，继续浇注琼脂于其他平面内的凹槽。

2.根据权利要求1，一种四面体或多面体培养皿，至少有2个平面浇注成分相同或不同的固体培养基；

——根据权利要求1，一种四面体或多面体培养皿，至少一个平面向培养皿外凸出，形成凹槽，以使不同平面上浇注的固体培养基部分互相间不接触；

——根据权利要求1，一种用于浇注平板的四面体或多面体培养皿，培养皿部分和培养皿盖之间通过螺旋密封。

3.一种检测万古霉素耐药金黄色葡萄球菌的试剂盒，由一系列含有不同浓度万古霉素的培养基浇注四面体培养皿制备而成、对不同耐药水平的细菌具有选择性的培养基：

——其特征在于，试剂盒中四面体培养皿与圆形培养皿盖之间由螺旋旋紧，为一密封系统；

——其特征在于，试剂盒中的培养皿为四面立体，培养皿每个面均留有不浇注琼脂的部分；

——其特征在于，培养皿上四个侧面向培养皿外部凸出形成凹槽，只在凹槽内浇注琼脂；

——其特征在于，试剂盒中一个培养皿同时携带含万古霉素浓度为4μg/ml，6μg/ml、8μg/ml、16μg/ml脑心浸液琼脂组成选择性培养基；

4. 根据权利要求3，改变四面体或多面体培养皿内浇注琼脂的营养成分，添加不同抗生素，制备成其他细菌选择性培养基；

——根据权利要求3，改变四面体或多面体培养皿内浇注琼脂的营养成分，不添加抗生素，

制备成普通细菌或特定细菌培养基；

——根据权利要求3，适合于自动化生产线批量生产的四面体或多面体培养皿以及检测万古霉素耐药金黄色葡萄球菌的试剂盒。

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