CN103728262B - 杀死金黄色葡萄球菌的组合物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种杀死金黄色葡萄球菌的方法，包括制备载体、药物调剂、制备孢子悬液、测定最低抑菌浓度MIC、制备金黄色葡萄球菌生物膜载体、药物对金黄色葡萄球菌生物膜作用和激光共聚焦显微镜观察，将亚抑菌浓度的黄芩苷破坏金黄色葡萄球菌生物膜后，结合最低杀菌浓度的万古霉素将金黄色葡萄球菌杀死。

Description

杀死金黄色葡萄球菌的组合物及方法

技术领域

本发明属于生物与医药技术领域，涉及金黄色葡萄球菌，具体涉及一种破坏金黄色葡萄球菌的组合物及方法。

背景技术

近年来，金黄色葡萄球菌（SAU）几乎对所有的抗生素都产生了耐药性，尤其是MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)菌株的传播和蔓延，已经成为人类健康的重要威胁，而其相关性感染导致的SAU生物膜形成使其对抗生素敏感性又大大降低，有效杀菌浓度甚至比浮游菌增大至10-1000倍，更加剧了治疗的难度。因此，临床上迫切需要开发新的可对抗SAU生物膜感染药物。

生物膜的发展和成熟主要受密度感应系统(quorum sensing system，QS)调控，尽管QS系统在生物膜形成、成熟以及消散各阶段的确切作用和由其导致的生物膜耐药性至今仍未完全清楚，但是QSI(QS inhibitors)的应用已被提议为抗生物膜的一项有效策略，Gilles等、Madanahally等、Cassandra L等发现黄芩水煎液、金缕梅单宁(Hamamelitannin)、鞣花酸(Ellagic Acid)活性成分可作为QSI对抗铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌BF，增强抗生素对BF内细菌的杀菌作用。如何解决金黄色葡萄球菌生物膜引起的耐药性问题，成为了金黄色葡萄球菌相关性感染成功治疗的一大难题。

发明内容

本发明的目的是破坏金黄色葡萄球菌生物膜后，将生物膜包裹的菌细胞杀死。实现本发明目的所使用的技术方案为：一种杀死金黄色葡萄球菌的方法，包括制备载体、药物调剂、制备孢子悬液、测定最低抑菌浓度MIC、制备金黄色葡萄球菌生物膜载体、药物对金黄色葡萄球菌生物膜作用和激光共聚焦显微镜观察，具体步骤如下，

（1）制备载体，用1×1cm²的聚氯乙烯薄片，用75%乙醇浸泡15~20min，作为载体；

（2）药物调剂，将黄芩苷用DMSO溶解成浓度为8mg/ml溶液并用氢氧化钠调节pH为7.2~7.4，用无菌ddH₂O将万古霉素溶解成浓度为1mg/ml溶液，用滤菌器过滤，分装于1.5ml灭菌离心管，-20~-25℃标记保存；

（3）制备孢子悬液，将金黄色葡萄球菌接种于TSA培养基中，35~37℃培养24h后，转接到另一TSA培养基中，35~37℃培养复壮24h，后挑选复壮后的菌株接种到20~25mlTSB-G培养基中培养，35~37℃，转速180rpm/min培养12~14h，后用TSB-G培养基稀释菌落至OD_600nm =0.1，备用；

（4）测定最低抑菌浓度MIC，在无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔加入步骤（3）孢子悬液，加入孢子悬液的量为100μl，再将步骤（2）制备的黄芩苷和万古霉素分别置于两个无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为50μl，第2~10孔依次倍比稀释至二倍终浓度，第11孔为步骤（3）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为TSB-G培养基，静置于35~37℃培养24h，获得黄芩苷和万古霉素最低抑菌浓度MIC；根据万古霉素的最低抑菌浓度MIC测定获得最低杀菌浓度MBC；最低抑菌浓度（MIC）的判定：96培养板各个孔充分混匀之后与生长对照孔比较，100%生长抑制所对应的最低药物浓度为此药物的MIC。

万古霉素的最低杀真菌浓度（MBC）的测定：将MIC以上各孔各吸取100μl的液体放到SDA平板上，用无菌接种棒均匀涂布到平板各处后静置于35~37℃的生化培养箱进行孵育，3天后数平板上的菌落，小于5个菌落的最低药物浓度即为最低杀真菌浓度，测定获得万古霉素的最低杀菌浓度MBC。

（5）制备金黄色葡萄球菌生物膜载体，将复壮后的金黄色葡萄球菌接种在20-30mlTSB-G培养基中，置于温度为35~37℃、转速为200~250rpm/min的恒温床培养18~20h，后用分光光度计测定金黄色葡萄球菌液在波长600nm处OD值，用TSB-G培养基将菌悬液稀释至OD600 =0. 1，后将2ml金黄色葡萄球菌放在步骤（1）制备的载体并置于24孔板底部中，35~37℃恒温培养72~144h，间隔24h用相同的TSB-G培养基换液，并用无菌生理盐水漂洗载体；

（6）药物对金黄色葡萄球菌生物膜作用，在不同时间段将步骤（5）制备的金黄色葡萄球菌生物膜载体置于24孔板各孔中，按步骤（4）获得黄芩苷的最低抑菌浓度MIC和万古霉素的最低杀菌浓度，加入亚抑菌浓度的黄芩苷，在各孔中分别加入黄芩苷和万古霉素，黄芩苷的浓度为128-512μg/ml，万古霉素为3-6μg/ml，剩余用TSB-G培养基补足至每孔为2ml，调好药物后，置于35~37℃培养12~14h，

（7）激光共聚焦显微镜观察，将步骤（6）的载体取出，用灭菌NS漂洗，去除游离菌，在载体上滴加50μl Molecular Probes溶液，后室温避光培养15~20min，再用灭菌NS漂洗荧光染液，置于激光共聚焦显微镜观察。

所述的步骤（7）Molecular Probes溶液是1:1000倍稀释液。

所述的TSB-G培养基添加5%葡萄糖。

一种杀死金黄色葡萄球菌的组合物，包括黄芩苷和万古霉素，所述的黄芩苷的浓度为128-512μg/ml，万古霉素为3-6μg/ml，以两种药物组合使用。

本发明突出的实质性进步和显著的特点为：使用本发明黄芩苷和万古霉素药物组合，结合本发明杀菌方法，应用本发明杀菌方法黄芩苷能够破坏金黄色葡萄球菌生物膜，消除金黄色葡萄球菌的耐药性，再结合万古霉素，达到杀死金黄色葡萄球菌的目的。

附图说明

图1是实施例2激光共聚焦显微镜观察建膜3d的生物膜；A为3d生物膜空白对照组（×400），B 为3d生物膜经VAN作用12h（×400），C为3d生物膜经256μg/ml BC作用12h（×400），D为3d BF经256μg/ml BC+ VAN作用12h（×400）。

具体实施方法

实施例1

1．制备载体，用1×1cm²的聚氯乙烯薄片（上海景年医疗器械有限公司），用75%乙醇浸泡15~20min，作为载体；

2．主要试剂及仪器，胰蛋白大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB，含0.5%葡萄糖）、MH肉汤（均为 SIGMAL TD），Molecular Probes’ LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits （Invitrogen）；黄芩苷（BC，陕西慈缘生物技术有限公司）万古霉素标准品（VAN，批号130360-200301 ）、克拉霉素标准品（CLR，批号130356-200403 ）由中国药品生物制品检定所提供；24孔、96孔细胞培养板（广州洁特生物公司，JET BIOFIL）、恒温摇晃培养箱（中国科学院武汉科学仪器厂）、紫外分光光度计（美国Bio-Rad SarmtSpec Plus）、超声波震荡器（B2500S-MTH，上海必能信超声有限公司）、迷你震荡仪（MSI，德国IKA）、激光共聚焦显微镜（日本Nikon A1）。

3．药物调剂，将黄芩苷用DMSO溶解成浓度为8mg/ml溶液并用氢氧化钠调节pH为7.2~7.4，用无菌ddH₂O将万古霉素溶解成浓度为1mg/ml溶液，用滤菌器过滤，分装于1.5ml灭菌离心管，-20~-25℃标记保存；

4．制备孢子悬液，将金黄色葡萄球菌接种于TSA培养基中，35~37℃培养24h后，转接到另一TSA培养基中，35~37℃培养复壮24h，后挑选复壮后的菌株接种到20~25mlTSB-G培养基中培养，35~37℃，转速180rpm/min培养12~14h，后用TSB-G培养基稀释菌落至OD_600nm =0.1，备用；

5．测定最低抑菌浓度MIC，在无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔加入步骤4孢子悬液，加入孢子悬液的量为100μl，再将步骤3制备的黄芩苷和万古霉素分别置于两个无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为50μl，第2~10孔依次倍比稀释至二倍终浓度，第11孔为步骤4制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为TSB-G培养基，静置于35~37℃培养24h，获得黄芩苷和万古霉素最低抑菌浓度MIC；最低抑菌浓度（MIC）的判定：96培养板各个孔充分混匀之后与生长对照孔比较，100%生长抑制所对应的最低药物浓度为此药物的MIC。万古霉素的最低杀真菌浓度（MBC）的测定：将MIC以上各孔各吸取100μl的液体放到SDA平板上，用无菌接种棒均匀涂布到平板各处后静置于35~37℃的生化培养箱进行孵育，3天后数平板上的菌落，小于5个菌落的最低药物。

6．制备金黄色葡萄球菌生物膜载体，将复壮后的金黄色葡萄球菌接种在20-30mlTSB-G培养基中，置于温度为35~37℃、转速为200~250rpm/min的恒温床培养18~20h，后用分光光度计测定金黄色葡萄球菌液在波长600nm处OD值，用TSB-G培养基将菌悬液稀释至OD600 =0. 1，后将2ml金黄色葡萄球菌放在步骤1制备的载体并置于24孔板底部中，35~37℃恒温培养72~144h，间隔24h用相同的TSB-G培养基换液，并用无菌生理盐水漂洗载体；

7．药物对金黄色葡萄球菌生物膜作用，在3d和7d将步骤5制备的金黄色葡萄球菌生物膜载体置于24孔板各孔中，分为空白对照组，阳性对照组：16μg/mlCLR组、4μg/mlVAN组、16μg/mlCLR+4μg/mlVAN组，实验组：512μg/ml、256μg/ml、128μg/ml BC组，512μg/ml、256μg/ml、128μg/ml BC +μg/ml VAN组，将3d或7dBF模型经无菌生理盐水漂洗后加入各组培养孔内，各孔含有各相应终浓度的药物及药物组合共2ml，37℃培养12h后连续稀释法进行活菌计数，各实验组计数4份标本，以上实验均独立重复三次。

8．激光共聚焦显微镜观察，将步骤6的载体取出，每组取出3个，用灭菌NS漂洗，去除游离菌，在每个载体上滴加50μl 1:1000稀释的Molecular Probes溶液，后室温避光培养15~20min，再用灭菌NS漂洗荧光染液，置于激光共聚焦显微镜观察。红色信号代表死菌被PI着色发出红色荧光, 绿色信号代表活菌被SYTO9着色发出绿色荧光，橙色或桔黄色部分一般认为是死菌和活菌重叠造成。每个标本取3个随机视野进行扫描。

实施例2

实施例1试验结果。

1．药物对S.a的MIC: BC、VAN及CRL分别对SAU实验菌株17546的MIC结果分别为2048 μg/ml、1 μg/ml、128 μg/ml及对质控菌株的MIC分别为2048 μg/ml、0.5μg/ml、2μg/ml。

2．建模3d 的BF经256μg/ml BC及16μg/mlCLR、4μg/mlVAN作用12h后，BF内活菌总数无明显变化，活菌数与空白对照组相比（P>0.05）；但VAN与256μg/ml BC及16μg/ml CLR联用后，BF内的活菌数明显比单用VAN少(P<0.05)，且VAN+ BC组活菌数比VAN+CLR组明显减少(P<0.05)，见表1。

表1 建模3d 的BF经不同药物及其组合作用12h后BF内活菌数变化（log10CFU/ml)

组别	3d
		空白对照组	7.98±0.25123
4μg/ml万古霉素组	7.95±0.19342 a
		16μg/ml克拉霉素组	8.03±0.25037 a
256μg/ml黄芩苷组	7.91±0.20776 a
		16μg/ml克拉霉素+4μg/ml万古霉素组	7.71±0.24806 b
256μg/ml黄芩苷+4μg/ml 万古霉素组	7.56±0.27514 b c

3．建模7d的 BF经不同浓度的BC及4μg/mlVAN作用12h后，BF内活菌数无明显改变，与空白对照组相比（P>0.05）；但VAN+512μg/mlBC、256μg/ml BC作用12h后，活菌数明显比空白对照组少(P<0.05)，而VAN+128 μg/ml BC组与空白对照组无明显差异（P>0.05），见表2。

表2 建模7d 的BF经不同药物及其组合作用12h后BF内活菌数变化（log10CFU/ml)

组别	7d
		空白对照组	8.24±0.19040
4μg/ml万古霉素组	8.12±0.18141 a
		512μg/ml黄芩苷组	8.12±0.10394 a
256μg/ml黄芩苷组	8.11±0.11550 a
		128μg/ml黄芩苷组	8.22±0.12440 a
512μg/ml黄芩苷+4μg/ml万古霉素组	7.47±0.16106 b
		256μg/ml黄芩苷+4μg/ml万古霉素组	7.52±0.16966 b
128μg/ml黄芩苷+4μg/ml万古霉素组	8.21±0.16591 a

4. 激光共聚焦显微镜观察，不管是建模3d或是7d 的BF，经单独应用VAN及BC作用BF12h后，活菌数未见明显减少，与空白对照组一样均以绿色的活菌为主，而BC联合VAN作用后，BF内活菌数明显减少，以红色的死菌为主，如图1。

Claims (3)

1.一种杀死金黄色葡萄球菌的方法，包括制备载体、药物调剂、制备孢子悬液、测定最低抑菌浓度MIC、制备金黄色葡萄球菌生物膜载体、药物对金黄色葡萄球菌生物膜作用和激光共聚焦显微镜观察，其特征在于，具体步骤如下，

（1）制备载体，用1×1cm²的聚氯乙烯薄片，用75%乙醇浸泡15~20min，作为载体；

（2）药物调剂，将黄芩苷用DMSO溶解成浓度为8mg/ml溶液并用氢氧化钠调节pH为7.2~7.4，用无菌ddH₂O将万古霉素溶解成浓度为1mg/ml溶液，用滤菌器过滤，分装于1.5ml灭菌离心管，-20~-25℃标记保存；

（3）制备孢子悬液，将金黄色葡萄球菌接种于TSA培养基中，35~37℃培养24h后，转接到另一TSA培养基中，35~37℃培养复壮24h后，挑选复壮后的菌株接种到20~25mlTSB-G培养基中培养，35~37℃，转速180rpm/min培养12~14h，后用TSB-G培养基稀释菌落至OD_600nm =0.1，备用； （4）测定最低抑菌浓度MIC，在无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔加入步骤（3）孢子悬液，加入孢子悬液的量为100μl，再将步骤（2）制备的黄芩苷和万古霉素分别置于两个无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为50μl，第2~10孔依次倍比稀释至二倍终浓度，第11孔为步骤（3）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为TSB-G培养基，静置于35~37℃培养24h，获得黄芩苷和万古霉素最低抑菌浓度MIC，根据万古霉素的最低抑菌浓度MIC测定获得最低杀菌浓度MBC；

（5）制备金黄色葡萄球菌生物膜载体，将复壮后的金黄色葡萄球菌接种在20-30mlTSB-G培养基中，置于温度为35~37℃、转速为200~250rpm/min的恒温床培养18~20h，后用分光光度计测定金黄色葡萄球菌液在波长600nm处OD值，用TSB-G培养基将菌悬液稀释至OD600 =0. 1，后将2ml金黄色葡萄球菌放在步骤（1）制备的载体并置于24孔板底部中，35~37℃恒温培养72~144h，间隔24h用相同的TSB-G培养基换液，并用无菌生理盐水漂洗载体；

（6）药物对金黄色葡萄球菌生物膜作用，在不同时间段将步骤（5）制备的金黄色葡萄球菌生物膜载体置于24孔板各孔中，按步骤（4）获得黄芩苷的最低抑菌浓度MIC和万古霉素的最低杀菌浓度，加入亚抑菌浓度的黄芩苷，在各孔中分别加入黄芩苷和万古霉素，黄芩苷的浓度为128-512μg/ml，万古霉素为3-6μg/ml，剩余用TSB-G培养基补足至每孔为2ml，调好药物后，置于35~37℃培养12~14h，

（7）激光共聚焦显微镜观察，将步骤（6）的载体取出，用灭菌NS漂洗，去除游离菌，在载体上滴加50μl Molecular Probes溶液，后室温避光培养15~20min，再用灭菌NS漂洗荧光染液，置于激光共聚焦显微镜观察。

2.根据权利要求1所述的杀死金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述的步骤（7）Molecular Probes溶液是1:1000倍稀释液。

3.根据权利要求1所述的杀死金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述的TSB-G培养基添加5%葡萄糖。