实施本发明的最佳模式
在本发明的聚合物组合物和它的使用和制造方法被公开和描述之前,应该理解本发明不局限于具体的构型、工序和这里所公开的材料,因为这些构型、工序和材料多少发生改变。也应该理解的是,这里所使用的术语仅仅用于描述具体实施方案的目的而没有限制意义,因为本发明的范围仅仅受到所附权利要求和其等同物的限制。
必须指出,在本说明书和权利要求中所使用的单数形式也包括复数指示物,除非上下文另外清楚地规定。因此,例如,对于含有“端基”的聚合物的引用包括对于两个或更多此类基团的引用,和对于“疏水性药物”的引用包括两种或更多种此类药物的引用。
在描述和作为权利来要求本发明时,下列术语将根据下面所给出的定义来使用。
这里使用的术语“生物活性剂”或“药物”或任何其它类似术语是指适合由现有技术领域中先前已知的方法和/或由本发明中所教导的方法所施用并诱导所预期的生物或药理学效果的任何化学或生物材料或化合物。此类效果包括但不限于(1)对生物体有预防作用并防止所不希望有的生物效应如防止感染,(2)减轻由疾病所引起的症状,例如,减轻由疾病引起的疼痛或发炎,和/或(3)减轻,减少,或完全消除生物体的疾病。该效果可以是局部的,如保证局部麻醉效果,或是系统性的。
这里使用的术语“可生物降解的”或“生物降解”被定义为利用增溶化水解作用或利用生物学上形成的实体(它可以是酶或其它生物体产品)将材料转化成不太复杂的中间体或最终产物。
这里使用的术语“生物相容的”是指利用增溶化水解作用或利用生物学上形成的实体(它可以是酶或其它生物体产品和它对人体没有不利影响)所形成的材料或中间体或最终产物。
“聚(丙交酯)”或“PLA”是指从乳酸的缩合或通过丙交酯的开环聚合所衍生的聚合物。术语“丙交酯(lactide)”和“乳酸(内)酯(lactate)”可以互换使用。
这里使用的“有效量”指在合理的风险/效益比率下足以提供所预期的局部或系统效果和性能的生物活性剂的量,不管经历任何医学处理。
这里使用的“给药”和类似术语是指将组合物分配到所要治疗的个体中,使得组合物能够系统地循环。优选,本发明的组合物经由皮下,肌内,透皮,口服,透粘膜,静脉内或腹腔途径给药。可供使用的可注射剂能够以普通形式制备,作为液体溶液或悬浮液,或呈现固体形式,它适合在注射之前在液体中制备为溶液或悬浮液,或作为乳液。供施用的合适的赋形剂包括,例如,水,盐水,葡萄糖,甘油,乙醇等;和如果需要,少量的辅助物质如湿润或乳化剂,缓冲剂等。对于口服,它能够配制成各种形式,如溶液,片剂,胶囊剂等。
现在参考举例的实施方案,特定的语言在这里用于描述它。仍然应该理解,本发明的范围的限制不是有意的。这里所描述的本发明特征的改变和进一步改进,和这里所描述的本发明的原理的附加应用,这些是相关技术领域中的技术人员所能想到的并具有本公开物的所有权,将是考虑在本发明范围内。
本发明的一个方面是能够截留大量疏水性药物和在含水环境中形成稳定的聚合物胶束或纳米颗粒的聚合物组合物。具体地说,本发明提供聚合物组合物,它包括由亲水性嵌段和疏水性嵌段组成的两亲性嵌段共聚物,和具有羧端基的聚乳酸衍生物,其中该组合物在含水环境中形成稳定的聚合物胶束。
本发明的另一个方面提供聚合物组合物,它包括由亲水性嵌段和疏水性嵌段组成的两亲性嵌段共聚物,和结合了二-或三-价的金属离子的具有羧端基的聚乳酸衍生物。
本发明还提供药物组合物,它包括由以上聚合物组合物和截留在其中的疏水性药物所形成的聚合物胶束或纳米颗粒。本发明此外提供制备上述药物组合物的方法。
本发明的两亲性嵌段共聚物优选是包括亲水性A嵌段和疏水性B嵌段的A-B型二嵌段共聚物。两亲性嵌段共聚物,当放入水相中时,形成核壳型聚合物胶束,其中疏水性B嵌段形成了该核和亲水性A嵌段形成了该壳。优选,亲水性A嵌段是选自聚亚烷基二醇,聚乙烯醇,聚乙烯基吡咯烷酮,聚丙烯酰胺和它的衍生物中的成员。更优选,亲水性A嵌段是选自单甲氧基聚乙二醇,单乙酰氧基聚乙二醇,聚乙二醇,聚乙二醇共丙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮中的成员。优选,亲水性A嵌段具有500到50,000道尔顿的数均分子量。更优选,亲水性A嵌段具有1,000到20,000道尔顿的数均分子量。
本发明的两亲性嵌段共聚物的疏水性B嵌段是选自聚酯,聚酸酐,聚氨基酸,聚原酸酯和聚膦嗪中的高度生物相容的和可生物降解的聚合物。更优选,疏水性B嵌段是选自聚丙交酯,聚乙交酯,聚己酸内酯,聚二噁烷-2-酮,聚乳酸共乙交酯,聚乳酸共二噁烷-2-酮,聚乳酸共己内酯,和聚乙醇酸共己内酯中的一种。疏水性B嵌段的羧端基能够被脂肪酸如丁酸,丙酸,乙酸,硬脂酸和棕榈酸取代。优选,两亲性嵌段共聚物的疏水性B嵌段具有500到50,000道尔顿的数均分子量。更优选,两亲性嵌段共聚物的疏水性B嵌段具有1,000到20,000道尔顿的数均分子量。
本发明的两亲性嵌段共聚物的亲水性A嵌段与疏水性B嵌段的比率优选是在2∶8到8∶2范围内,和更优选在4∶6到7∶3范围内。如果亲水性A嵌段的含量太低,则聚合物不会在水溶液中形成聚合物胶束,而如果该含量太高,则所形成的聚合物胶束是不稳定的。
本发明的聚乳酸衍生物的一端以共价键方式键接于至少一种羧酸或羧酸盐上。本发明的聚乳酸衍生物的另一端能以共价键方式键接于选自羟基,乙酰氧基,苯甲酰氧基,癸酰氧基和棕榈酰氧基中的官能团上。该羧酸或羧酸盐在pH4或更高的水溶液中用作亲水性基团并使聚乳酸衍生物在其中形成聚合物胶束。当本发明的聚乳酸衍生物溶于水溶液中时,在聚乳酸衍生物中存在的亲水性和疏水性组分应该平衡,以形成聚合物胶束。因此,本发明的聚乳酸衍生物的数均分子量优选是在500到2,500道尔顿的范围内。聚乳酸衍生物的分子量能够在制备过程中通过控制反应温度、时间等来调节。
聚乳酸衍生物优选由下面通式表示:
RO-CHZ-[A]n-[B]m-COOM (I)
其中A是-COO-CHZ-;B是-COO-CHY-,-COO-CH2CH2CH2CH2CH2-或-COO-CH2CH2OCH2;R是氢原子,乙酰基,苯甲酰基,癸酰基,棕榈酰基,甲基或乙基;Z和Y各是氢原子,甲基,或苯基;M是H,Na,K,或Li;n是1到30的整数,和m是0到20的整数。
本发明的聚乳酸衍生物的一端以共价键方式键接于羧基或它的碱金属盐上,优选,它的碱金属盐上。在形成聚乳酸衍生物的碱金属盐中的金属离子是单价的,例如钠,钾或锂。金属离子盐形式的聚乳酸衍生物在室温下是固体,并且是非常稳定的,因为它的相对中性pH。
更优选地,聚乳酸衍生物是由下面通式表示:
RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY′]q-COO-CHZ-COOM (II)
其中X是甲基;Y’是氢原子或苯基;p是0到25的整数;q是0到25的整数,前提条件是,p+q是5到25的整数;R,Z和M与在通式(I)中定义相同。
另外,下列通式(III)和(IV)的聚乳酸衍生物也适合于本发明:
RO-PLA-COO-W-M′ (III)
该PLA是选自D,L-聚乳酸,D-聚乳酸,聚扁桃酸,D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物,D,L-乳酸和扁桃酸的共聚物,D,L-乳酸和己内酯的共聚物,以及D,L-乳酸和1,4-二噁烷-2-酮的共聚物中的一种;R和M与在通式(I)定义相同。
S-O-PLA-COO-Q (IV)
其中S是
L’是-NR
1-或-O-;R
1是氢原子或C
1-C
10烷基;Q是CH
3,CH
2CH
3,CH
2CH
2CH
3,CH
2CH
2CH
2CH
3或CH
2C
6H
5;a是0到4的整数;b是1到10的整数;R和M与通式(I)中定义相同;和PLA与通式(III)中定义相同。
本发明的聚合物组合物可以含有5-95wt%的两亲性嵌段共聚物和5-95wt%的聚乳酸衍生物,基于两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的总重量。优选,本发明的聚合物组合物含有20-80wt%的两亲性嵌段共聚物和20-80wt%的聚乳酸衍生物。更优选,本发明的聚合物组合物含有50-80wt%的两亲性嵌段共聚物和20-50wt%的聚乳酸衍生物。
本发明的聚乳酸衍生物单独能够在pH4或更高的水溶液中形成胶束,然而,聚合物组合物能够在水溶液中形成胶束,与溶液的pH无关。因为可生物降解的聚合物通常在10或更高的pH下水解,本发明的聚合物组合物可以在1到10范围内的pH,优选在4到8范围内的pH下使用。从本发明的聚合物组合物制备的胶束或纳米颗粒的粒度可以调节在1到400nm范围内,和优选在5到200nm范围内,这取决于聚合物的分子量以及聚乳酸衍生物与两亲性嵌段共聚物的比率。
如在图1到图3中所示,聚乳酸衍生物或两亲性嵌段共聚物单独以及它们的混合物可以在水溶液中形成胶束。1表示弱水溶性的药物;10表示单甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯(mPEG-PLA);11表示单甲氧基聚乙二醇(mPEG);12表示聚丙交酯(PLA);20表示D,L-聚(乳酸)的钠盐;21表示D,L-聚乳酸和22表示羧酸钠。然而,本发明的聚合物组合物显著地改进该药物负载效率和在水溶液中形成的胶束的稳定性,与从聚乳酸衍生物或两亲性嵌段共聚物单独形成的胶束相比。
根据下列实施例,由聚乳酸衍生物单独组成的聚合物胶束可以含有至多25wt%的紫杉酚,但是紫杉酚是在37℃下1小时内释放在水溶液中。另外,由两亲性嵌段共聚物单独组成的聚合物胶束可以含有5wt%或5wt%以下的紫杉酚,而且紫杉酚是在37℃下6小时内释放在水溶液中。相反,由包括两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的本发明的组合物组成的聚合物胶束可能含有至多25wt%的紫杉酚,但是紫杉酚在37℃下24小时内没有释放在水溶液中。
药物在聚合物胶束中的负载效率与构成在水溶液中所形成的胶束的疏水性芯的疏水性嵌段的份额成比例。聚合物胶束在水溶液中的稳定性取决于它们在水溶液中的动态平衡,即在聚合物胶束的状态和溶于水中的单种聚合物之间的平衡常数。聚乳酸衍生物是非常疏水性的,因为亲水性组分,即羧酸端基,占聚合物的10%或10%以下。因此,由聚乳酸衍生物单独形成的聚合物胶束可以含有大量的疏水性药物,但是所形成的胶束是非常不稳定的,归因于在聚合物胶束的末端存在的羧基阴离子基团之间的静电斥力。另一方面,从单甲氧基聚乙二醇(Mn:5,000道尔顿)和聚丙交酯(Mn:4,000道尔顿)的两亲性嵌段共聚物形成的胶束难以含有大量的疏水性药物,因为疏水性嵌段仅仅占聚合物的大约40%。然而,该胶束是非常稳定的,因为两亲性嵌段共聚物的亲水端基是非离子的聚乙二醇,它没有显示静电斥力,与聚乳酸衍生物相反。因此,通过将两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物相结合,本发明提供了聚合物胶束组合物,后者使大量的弱水溶性的药物增溶化并保持稳定性24小时或更多。
在本发明的一个实施方案中,聚乳酸衍生物的羧端基被二-或三-价的金属离子结合或束缚。金属离子束缚的聚合物组合物能够通过向两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物组合物中添加二-或三-价的金属离子来制备。通过改变为了结合或束缚聚乳酸衍生物的羧端基所添加的二-或三-价的金属离子的量可以形成聚合物胶束或纳米颗粒。
该二-或三-价的金属离子优选是选自Ca2+,Mg2+,Ba2+,Cr3+,Fe3+,Mn2+,Ni2+,Cu2+,Zn2+,和Al3+。该二-或三-价的金属离子能够以硫酸盐,氯化物,碳酸盐,磷酸盐或羟基化物的形式,和优选以CaCl2,MgCl2,ZnCl2,AlCl3,FeCl3,CaCO3,MgCO3,Ca3(PO4)2,Mg3(PO4)2,AlPO4,MgSO4,Ca(OH)2,Mg(OH)2,Al(OH)3,或Zn(OH)2的形式被添加到两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物组合物中。
如在图4和5中所示,当在聚乳酸衍生物的羧端基上的单价金属离子被二-或三-价的金属离子取代而形成金属离子键时,所形成的胶束或纳米颗粒具有改进的稳定性。
聚合物胶束或纳米颗粒能够通过改变所添加的金属离子的当量来制备。具体地说,如果二价金属离子以相对于羧端基的0.5当量或更低当量添加,则与聚乳酸衍生物的羧端基形成键的金属离子是不够的的,和因此,形成了聚合物胶束。如果二价金属离子以0.5当量或更高添加,则与聚乳酸衍生物的羧端基形成键的金属离子足以牢固地束缚该胶束,因此形成了纳米颗粒。
另外,药物从聚合物胶束或纳米颗粒中的释放速度可通过改变所添加的金属离子的当量值来调节。如果该金属离子是以相对于聚乳酸衍生物的羧基而言的1当量或1当量以下存在,则供结合于聚乳酸衍生物的羧端基上的数量会减少,因此,该药物释放速度会提高。如果该金属离子是1当量或1当量以上存在,则供结合于聚乳酸衍生物的羧端基上的数量会增加,因此,该药物释放速度会下降。因此,为了提高在血液中的药物释放速度,该金属离子以较小的当量数使用,而为了降低药物释放速度,该金属离子以较大的当量数使用。
本发明的金属离子束缚的聚合物组合物可以含有5-95wt%的两亲性嵌段共聚物,5-95wt%的聚乳酸衍生物和0.01-10当量的二-或三-价的金属离子,相对于聚乳酸衍生物的羧端基的当量。优选地,它们含有20-80wt%的两亲性嵌段共聚物,20-80wt%的聚乳酸衍生物和0.1-5当量的该二-或三-价的金属离子,和优选地,20-60wt%的两亲性嵌段共聚物,40-80wt%的聚乳酸衍生物和0.2-2当量的该二-或三-价的金属离子。
本发明还涉及药物组合物,它含有从本发明的聚合物组合物形成的聚合物胶束或纳米颗粒和截留在其中的弱水溶性的药物。本发明的药物组合物保证疏水性药物的提高的血浆浓度并能够用于各种药物配制料中。
如图3到5中所示,弱水溶性的药物与两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物组合物混合而形成在其中含有药物的聚合物胶束。为了改进它的稳定性,二-或三-价的金属离子可以与聚乳酸衍生物的羧端基形成金属离子键,因此形成含有药物的聚合物胶束和纳米颗粒。
该术语“弱水溶性的药物”或“疏水性药物”,是指具有50mg/ml或更低的水溶性的任何药物或生物活性剂。这些包括抗癌剂,抗生素,消炎药,麻醉药,激素,抗高血压药,治疗糖尿病的试剂,抗高血脂剂,抗病毒药,治疗帕金森氏病的试剂,抗痴呆剂,止吐药,免疫抑制剂,抗溃疡剂,通便剂,和抗疟剂。疏水性药物的例子包括抗癌剂如紫杉酚,喜树碱,鬼臼亚乙苷,亚德利亚霉素,dausorubicin,idarubicin,胞嘧啶阿拉伯糖苷等;免疫抑制剂如环孢菌素A(cyclosporine A)等。甾族激素如睾丸激素,雌二醇,雌激素,黄体酮,triameinolon乙酸盐,地塞米松等和消炎药如tenoxicam,pyroxicam,抗炎吲哚酸,COX-II抑制剂等,它们具有非常快的从血液中的排泄速率,也是可用于本发明中的合适的疏水性药物的例子。
弱水溶性的药物的含量优选是在0.1-30wt%范围内,基于包括两亲性嵌段共聚物,聚乳酸衍生物,和疏水性药物的药物组合物的总重量。含有药物的聚合物胶束或纳米颗粒的尺寸可以调节在5到400nm范围内,和优选在10到200nm范围内,这取决于聚合物的分子量以及两亲性嵌段共聚物与聚乳酸衍生物的比率。
对于弱水溶性的药物的口服或肠胃外给药,该药物截留在聚合物胶束或纳米颗粒中,因此增溶化。特别地,该金属离子-束缚聚合物胶束或纳米颗粒长时间保留在血流中并在靶疾患处积累。该药物从胶束的疏水性芯中释放出来而显示药理学的效果,同时该胶束发生降解。
对于胃肠外给药,该药物可以经由静脉内,肌内注射,腹膜内,透鼻,直肠内,眼内,或肺内来给药。对于口服给药,药物与本发明的聚合物胶束混合,然后以片,胶囊,或水溶液的形式给药。
根据本发明的金属离子束缚的聚合物胶束或纳米颗粒具有优良的稳定性,因此,能够提高药物的血浆浓度。如在下面实验和图6中所示,其中紫杉酚截留在金属离子束缚的聚合物胶束内的组合物1在血流中具有更长的药物停留时间,因此更长时间维持有效血浆药物浓度,与其中紫杉酚截留在由仅仅嵌段共聚物组成的聚合物组合物中的组合物3,和其中紫杉酚截留在嵌段共聚物和聚乳酸的混合聚合物胶束中的组合物2相比而言。
如在下列实验和图7和8中所示,组合物4,其中紫杉酚截留在金属离子束缚的聚合物组合物中,具有在血流中的更长时间的药物停留时间,因此更长时间维持有效血浆药物浓度,与市售的紫杉酚配制料,Taxol(组合物5)相比而言,并且对于癌症生长具有高抑制率,因此显示出高抗癌活性。
此外,本发明包括制备上述药物组合物的方法。具体地说,如图3和5中所示,两亲性嵌段共聚物,聚乳酸衍生物,和弱水溶性的药物溶于有机溶剂中,然后,有机溶剂从中蒸发。其后,所获得的混合物被添加到水溶液,以制备含有弱水溶性的药物的混合聚合物胶束。金属离子束缚的聚合物胶束或纳米颗粒可通过向混合聚合物胶束中添加二-或三-价的金属离子,因此束缚聚乳酸衍生物的羧端基来制备。
聚乳酸衍生物,两亲性嵌段共聚物,和弱水溶性的药物按照某种比率能够溶于选自丙酮,乙醇,甲醇,乙酸乙酯,乙腈,二氯甲烷,氯仿,乙酸和二噁烷中的一种溶剂或多种混合溶剂中。有机溶剂能够从中除去而制备弱水溶性的药物和聚合物的均匀混合物。弱水溶性的药物和本发明的聚合物组合物的均匀混合物能够在0-80℃下添加到pH4-8的水溶液中,获得含有弱水溶性的药物的混合聚合物胶束水溶液。上述含有药物的聚合物胶束水溶液然后被冻干以制备固体形式的聚合物胶束组合物。
含有0.001-2M的二-或三-价金属离子的水溶液被添加到含有弱水溶性的药物的混合聚合物胶束水溶液中。混合物在室温下缓慢地搅拌0.1-1小时,然后冻干以制备固体形式的金属离子束缚的聚合物胶束或纳米颗粒组合物。
下列实施例将使本领域中的那些技术人员更清楚地理解如何实施本发明。需要理解的是,尽管本发明已经结合后面跟着的本发明的优选的特定实施方案进行了描述,但本意是说明本发明而不是限制本发明的范围。本发明的其它方面对于本发明所属技术领域中的那些技术人员是显而易见的。
实施例
制备例1-11:聚乳酸衍生物的合成
由2-羟基羧酸衍生物在催化剂不存在下,在升高的温度下(100-200℃)和在减压下(100到0.1mmHg)达6到24小时的聚合反应来制备聚合物,随后提纯。
制备例1:D,L-聚乳酸(PLA-COOH)的合成1
将一百克的D,L-乳酸引入到250ml三颈圆底烧瓶中。该烧瓶装有搅拌器,然后在80℃的油浴中加热。该反应利用由真空吸气器降至25mmHg的压力进行1小时,以除去多余水分。该反应然后在150℃的温度下在25mmHg的减压下进行6小时。所获得的产物被添加到1升的蒸馏水中以沉淀该聚合物。沉淀的聚合物然后添加到蒸馏水中以除去可溶于pH4或pH4以下的水溶液中的低分子量聚合物。沉淀的聚合物然后被添加到1升的蒸馏水中,水溶液的pH通过向其中滴加碳酸氢钠被调节至6到8,以溶解聚合物。水不溶性的聚合物被分离和通过离心作用或过滤除去。将1N盐酸溶液滴加到其中,聚合物在水溶液中沉淀。沉淀的聚合物用蒸馏水洗涤两次,分离和减压干燥,获得高度粘性的液体(78g的D,L-聚乳酸,产率:78%)。聚合物的数均分子量是540道尔顿,由1H-NMR谱测定。
制备例2-4:D,L-聚乳酸(PLA-COOH)的合成2
根据与制备例1中相同的程序获得D,L-聚乳酸,只是反应温度、压力和时间的控制如在表1中所列。从以上制备例1-4合成的D,L-聚乳酸的数均分子量和产率示于下表1中。
表
制备例 |
温度(℃) |
时间(小时) |
压力(mmHg) |
Mn |
产率(%) |
1 |
150 |
6 |
25 |
540 |
78 |
2 |
160 |
12 |
10 |
1140 |
83 |
3 |
160 |
24 |
10 |
1550 |
84 |
4 |
160 |
24 |
5 |
2100 |
87 |
*产率=(所获得的聚合物/所使用的单体)×100
制备例5:D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物的合成1(PLGA-COOH)
将五十五克的D,L-乳酸(0.6mol)和45克乙醇酸(0.6mol)一起引入到250ml三颈圆底烧瓶中。进行与制备例1中同样的程序,只是在150℃的温度下和在10mmHg的减压下进行反应12小时。
制备例6:D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物的合成2(PLGA-COOH)
将七十三克的D,L-乳酸(0.8mol)和27克乙醇酸(0.35mol)一起引入到250ml三颈圆底烧瓶中。进行与制备例1中同样的程序,只是在160℃的温度下和在10mmHg的减压下进行反应12小时。
制备例7:D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物的合成3(PLGA-COOH)
将九十一克的D,L-乳酸(1.0mol)和9克乙醇酸(0.12mol)一起引入到250ml三颈圆底烧瓶中。进行与制备例1中同样的程序,只是在160℃的温度下和在10mmHg的减压下进行反应12小时。
制备例8:D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物的合成4(PLGA-COOH)
将七十三克的D,L-乳酸(0.8mol)和27克乙醇酸(0.35mol)引入到250ml三颈圆底烧瓶中。进行与制备例1中同样的程序,只是在180℃的温度下和在5mmHg的减压下进行反应24小时。
在上述制备例5到8中合成的共聚物示于表2中。
表2
制备例 |
乳酸和乙醇酸的摩尔比率 |
反应温度(℃) |
反应时间(小时) |
压力(mmHg) |
Mn(道尔顿) |
产率(%) |
反应物 |
产物 |
5 |
50/50 |
52/48 |
150 |
12 |
10 |
920 |
63 |
6 |
70/30 |
67/33 |
160 |
12 |
10 |
1040 |
65 |
7 |
90/10 |
91/9 |
160 |
12 |
10 |
1180 |
68 |
8 |
70/30 |
71/29 |
180 |
24 |
5 |
1650 |
73 |
制备例9:D,L-乳酸和扁桃酸的共聚物的合成(PLMA-COOH)
将七十五克的D,L-乳酸(0.83mol)和25克D,L-扁桃酸(0.16mol)一起引入到250ml三颈圆底烧瓶中。进行与制备例1中同样的程序,只是在180℃的温度下和在10-20mmHg的减压下进行反应5小时。获得54g(产率:54%)的D,L-乳酸和扁桃酸的共聚物。D,L-乳酸与扁桃酸的摩尔比率是85/15。聚合物的数均分子量是1,096道尔顿,由1H-NMR谱测定。
制备例10:乙酰氧基D,L-聚乳酸衍生物(AcO-PLA-COOH)的合成
50g的从制备例2制得的D,L-聚乳酸(Mn:1,140道尔顿),和20ml的氯乙酸一起被引入到250ml圆底烧瓶中。该烧瓶配备冰箱,反应混合物在氮气流下回流4小时。过多的氯乙酸通过蒸馏被除去,然后,反应产物被添加到冰和水的混合物中。全部混合物慢慢搅拌以沉淀聚合物。沉淀的聚合物被分离,用蒸馏水洗涤两次,然后,溶于无水丙酮中。在其中添加无水硫酸镁以除去多余水分。所获得的产物经过滤被除去硫酸镁。丙酮通过使用真空蒸发器被除去,据此获得液体乙酰氧基D,L-聚乳酸(46g,产率:92%)。利用1H-NMR,该乙酰氧基团被鉴别为在2.02ppm处的单个峰。
制备例11:棕榈酰氧基D,L-聚乳酸衍生物(PalmO-PLA-COOH)的合成
将二十克的从制备例2制得的D,L-聚乳酸(Mn:1,140道尔顿)引入到250ml圆底烧瓶中。反应物在真空下在120℃的油浴中完全脱水。该油浴被冷却到50℃和向其中添加50ml丙酮,以完全溶解聚合物。添加5ml的氯棕榈酸,和该反应在50℃的温度下在氮气氛围中进行10小时。该反应产物用过量的己烷洗涤以除去任何残留的反应物。该产品然后溶于丙酮中和溶液被添加到冰和水的混合物中。全部混合物慢慢搅拌,导致低聚物的沉淀。低聚物被分离,用蒸馏水洗涤两次,然后,溶于无水丙酮中。将无水硫酸镁加入到溶液中以除去多余水分。所获得的产物经过滤被除去硫酸镁。丙酮用真空蒸发器除去,据此获得棕榈酰氧基D,L-聚乳酸衍生物(19.1g,产率:96%)。利用1H-NMR,该棕榈酰基团被鉴别为在0.88,1.3和2.38ppm处的峰。
制备例12到22:聚乳酸衍生物的羧酸盐的合成
从制备例1到11合成的聚乳酸衍生物与碳酸氢钠,碳酸钠,碳酸氢钾,或碳酸钾在丙酮溶剂中的碱性水溶液反应,制备它们的羧酸盐。
制备例12:聚乳酸的钠盐(PLA-COONa)的合成1
将从制备例1制得的D,L-聚乳酸(Mn:540道尔顿)溶于丙酮中。溶液被引入圆底烧瓶中和该烧瓶装有搅拌器。溶液在室温下慢慢地搅拌,缓慢地在其中添加碳酸氢钠溶液(1N),直到达到7的pH为止。在其中添加无水硫酸镁以从中除去多余水分。所获得的混合物被过滤和该丙酮用溶剂蒸发器来蒸发掉。获得白色固体。将固体溶于无水丙酮中和溶液经过过滤以除去不溶性的部分。丙酮被蒸发,留下白色固体形式的D,L-聚乳酸的钠盐(产率:96%)。如图2中所示,由1H-NMR在4.88ppm处观察到与羧酸基团靠近的氢峰,该聚合物在溶于水中时具有6.5到7.5的pH。
制备例13:聚乳酸的钠盐(PLA-COONa)的合成2
根据与以上制备例12同样的程序合成聚乳酸(产率:95%)的钠盐,只是使用从制备例2合成的D,L-聚乳酸(Mn:1,140道尔顿)和碳酸钠的水溶液。
制备例14:乙酰氧基-D,L-聚乳酸(AcO-PLA-COONa)的钠盐的合成
根据与制备例12同样的程序合成乙酰氧基-D,L-聚乳酸(产率:95%)的钠盐,只是使用从制备例10合成的乙酰氧基-D,L-聚乳酸(Mn:1,140道尔顿)和碳酸钠的水溶液。
制备例15:棕榈酰氧基D,L-聚乳酸(PalmO-PLA-COONa)的钠盐的合成1
将从制备例11合成的棕榈酰氧基D,L-聚乳酸(Mn:1,140道尔顿)完全溶于丙酮的水溶液(28.6v/v%)中。溶液被引入圆底烧瓶中和该烧瓶装有搅拌器。溶液在室温下慢慢地搅拌,然后,向其中添加碳酸氢钠的水溶液(1N)以进行中和。溶液在室温下慢慢地搅拌,缓慢地在其中添加碳酸氢钠溶液(1N),直到达到7的pH为止。在其中添加无水硫酸镁以除去多余水分。所获得的溶液被过滤和该丙酮溶液用溶剂蒸发器来蒸发掉。获得白色固体。将固体溶于丙酮中和溶液经过过滤以除去在丙酮中的不溶性物。丙酮被蒸发,获得白色固体形式的棕榈酰氧基D,L-聚乳酸的钠盐(产率:96%)。
制备例16:聚乳酸的钾盐(PLA-COOK)的合成2
根据与制备例12中同样的程序合成聚乳酸的钾盐(产率:98%),只是使用从在制备例3合成的D,L-乳酸(Mn:1,550道尔顿)和碳酸氢钾的水溶液。
制备例17:聚乳酸的钠盐(PLA-COONa)的合成3
根据与制备例12中同样的程序合成聚乳酸的钠盐(产率:95%),只是使用从在制备例4合成的D,L-乳酸(Mn:2,100道尔顿)。
制备例18:D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物的钠盐(PLGA-COONa)的合成1
根据与制备例12同样的程序合成D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物的钠盐(产率:98%),只是使用从制备例5合成的D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物(Mn:920道尔顿)和碳酸钠的水溶液。
制备例19:D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物的钠盐(PLGA-COONa)的合成2
根据与制备例12同样的程序合成D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物的钠盐(产率:93%),只是使用从制备例6合成的D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物(Mn:1,040道尔顿)。
制备例20:D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物的钾盐(PLGA-COOK)的合成
根据与制备例12同样的程序合成D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物的钾盐(产率:92%),只是使用从制备例7合成的D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物(Mn:1,180道尔顿)和碳酸钾的水溶液。
制备例21:D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物的钠盐(PLGA-COONa)的合成3
根据与制备例12同样的程序合成D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物的钠盐(产率:98%),只是使用从制备例8合成的D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物(Mn:1,650道尔顿)。
制备例22:D,L-乳酸和扁桃酸的共聚物的钠盐(PLMA-COONa)的合成
根据与制备例12同样的程序合成白色固体形式的D,L-乳酸和扁桃酸的共聚物的钠盐(产率:96%),只是使用从制备例9合成的D,L-乳酸和扁桃酸的共聚物(Mn:1,096道尔顿)。
从以上制备例12到22合成的聚乳酸衍生物的羧酸盐示于表3中。
表3
制备例 |
反应物(MN) |
碱 |
产物 |
Mn(道尔顿) |
产率(%) |
12 |
PLA-COOH(540) |
NaHCO3 |
PLA-COONa |
540 |
96 |
13 |
PLA-COOH(1,140) |
Na2CO3 |
PLA-COONa |
1,140 |
95 |
14 |
AcO-PLA-COOH(1,140) |
Na2CO3 |
AcO-PLA-COONa |
1,140 |
95 |
15 |
PalmitoyPLA-COOH(1,140) |
NaHCO3 |
PalmitoylO-PLA-COONa |
1,140 |
96 |
16 |
PLA-COOH(1,550) |
KHCO3 |
PLA-COOK |
1,550 |
98 |
17 |
PLA-COOH(2,100) |
NaHCO3 |
PLA-COONa |
2,100 |
95 |
18 |
PLGA-COOH(920) |
Na2CO3 |
PLGA-COONa |
920 |
98 |
19 |
PLGA-COOH(1,040) |
NaHCO3 |
PLGA-COONa |
1,040 |
93 |
20 |
PLGA-COOH(1,180) |
K2CO3 |
PLGA-COOK |
1,180 |
92 |
21 |
PLGA-COOH(1,650) |
NaHCO3 |
PLGA-COONa |
1,650 |
98 |
22 |
PLMA-COOH(1,096) |
NaHCO3 |
PLMA-COONa |
1,096 |
96 |
制备例23到29:由亲水性A嵌段和疏水性B嵌段组成的AB型嵌段共聚物的合成
制备例23:单甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯(mPEG-PLA)嵌段共聚物(AB型)的聚合
将五克的单甲氧基聚乙二醇(Mn:2,000道尔顿)引入到100ml两颈圆底烧瓶中,在减压(1mmHg)下加热至130℃来脱水3到4小时。该反应烧瓶用干燥氮气填充,然后使用注射器将反应催化剂,辛酸亚锡(Sn(Oct)2),与0.1wt%(10.13mg,25mmol)的D,L-丙交酯一起注入。反应混合物搅拌30分钟,该压力在130℃下降至1mmHg保持1小时以除去溶解该催化剂的溶剂(甲苯)。将提纯的丙交酯(10.13g)加入其中,和混合物加热至130℃保持18小时。将所形成的聚合物溶于二氯甲烷中,和向其中添加二乙醚以沉淀聚合物。所获得的聚合物在真空箱中干燥48小时。所获得的mPEG-PLA具有2,000-1,765道尔顿的数均分子量,并且由1H-NMR证实是AB型。
制备例24:单甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯(mPEG-PLA)嵌段共聚物(AB型)的聚合
将五克的单甲氧基聚乙二醇(Mn:2,000道尔顿)引入到100ml两颈圆底烧瓶中,在减压(1mmHg)下加热至130℃来脱水3到4小时。该反应烧瓶用干燥氮气填充,然后使用注射器将反应催化剂,辛酸亚锡(Sn(Oct)2),与0.1wt%(13.75mg,34mmol)的D,L-丙交酯一起注入。反应混合物搅拌30分钟,该压力在130℃下降至1mmHg保持1小时以除去溶解该催化剂的溶剂(甲苯)。将提纯的丙交酯(13.75g)加入其中,和混合物加热至130℃保持18小时。将所形成的聚合物溶于二氯甲烷中,和向其中添加二乙醚以沉淀聚合物。所获得的聚合物在真空箱中干燥48小时。所获得的mPEG-PLA具有2,000-5,000道尔顿的数均分子量,并且由1H-NMR证实是AB型。
制备例25:单甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯(mPEG-PLA)嵌段共聚物(AB型)的聚合
将五克的单甲氧基聚乙二醇(Mn:2,000道尔顿)引入到100ml两颈圆底烧瓶中,在减压(1mmHg)下加热至130℃来脱水3到4小时。该反应烧瓶用干燥氮气填充,然后使用注射器将反应催化剂,辛酸亚锡(Sn(Oct)2),与0.1wt%(22.0mg,55mmol)的D,L-丙交酯一起注入。反应混合物搅拌30分钟,该压力在130℃下降至1mmHg保持1小时以除去溶解该催化剂的溶剂(甲苯)。将提纯的丙交酯(22g)加入其中,和混合物加热至130℃保持18小时。将所形成的聚合物溶于二氯甲烷中,和向其中添加二乙醚以沉淀聚合物。所获得的聚合物在真空箱中干燥48小时。所获得的mPEG-PLA具有2,000-8,000道尔顿的数均分子量,并且由1H-NMR证实是AB型。
制备例26:单甲氧基聚乙二醇-聚(乳酸共乙交酯)(mPEG-PLGA)嵌段共聚物(AB型)的聚合
为了合成mPEG-PLGA嵌段共聚物,根据与制备例23相同的程序,让单甲氧基聚乙二醇(Mn:5,000道尔顿)与丙交酯和乙交酯在催化剂辛酸亚锡存在下在120℃下反应12小时。所获得的mPEG-PLGA具有5,000-4,000道尔顿的数均分子量,并且由1H-NMR证实是AB型。
制备例27:单甲氧基聚乙二醇-聚(乳酸共对-二噁烷-2-酮)(mPEG-PLDO)嵌段共聚物(AB型)的聚合
为了合成mPEG-PLDO嵌段共聚物,根据与制备例23相同的程序,让单甲氧基聚乙二醇(Mn:12,000道尔顿)与丙交酯和对-二噁烷-2-酮在催化剂辛酸亚锡存在下在110℃下反应12小时。所获得的mPEG-PLDO具有12,000-10,000道尔顿的数均分子量,并且由1H-NMR证实是AB型。
制备例28:单甲氧基聚乙二醇-聚己酸内酯(mPEG-PCL)嵌段共聚物(AB型)的聚合
为了合成mPEG-PCL段共聚物,根据与制备例23相同的程序,让单甲氧基聚乙二醇(Mn:12,000道尔顿)与己内酯在催化剂辛酸亚锡存在下在130℃下反应12小时。所获得的mPEG-PCL具有12,000-5,000道尔顿的数均分子量,并且由1H-NMR证实是AB型。
制备例29:单甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯-棕榈酸酯(mPEG-PLA-棕榈酸酯)嵌段共聚物(AB型)的聚合
所合成的单甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯(mPEG-PLA)(Mn:2,000-1,750,20g)被引入到烧瓶中并在120℃的油浴中在真空下完全地脱水。反应物被冷却到50℃和向其中添加50ml丙酮,以完全溶解聚合物。将2ml的棕榈酰氯加入其中(摩尔比率:棕榈酰氯/mPEG-PLA=1.2/1),和该反应于50℃在氮气流下进行10小时。反应混合物用过量的己烷洗涤,以除去残留反应物。所获得的聚合物溶于二氯甲烷中,用二乙醚沉淀,然后过滤。所获得的聚合物在真空箱中干燥48小时。所获得的mPEG-PLA-棕榈酸酯具有2,000-1,800道尔顿的Mn。另外,由1H-NMR证实,棕榈酰基键接于mPEG-PLA的-OH端基上。
从以上制备例23到29合成的嵌段共聚物示于下表4中。
表4
制备例 |
两亲性嵌段共聚物 |
Mn(道尔顿) |
产率(%) |
23 |
mPEG-PLA |
2,000-1,765 |
86 |
24 |
mPEG-PLA |
2,000-5,000 |
87 |
25 |
mPEG-PLA |
2,000-8,000 |
85 |
26 |
mPEG-PLGA |
5,000-4,000 |
90 |
27 |
mPEG-PLDO |
12,000-10,000 |
78 |
28 |
mPEG-PCL |
12,000-5,000 |
93 |
29 |
mPFG-PLA-棕榈酸酯 |
2,000-1,800 |
90 |
实施例1到7:含有弱水溶性的药物的混合聚合物胶束的制备
实施例1:D,L-PLA-COONa和mPEG-PLGA嵌段共聚物的含有紫杉酚的混合聚合物胶束组合物的制备
将从以上制备例合成的D,L-PLA-COONa(Mn:1,140道尔顿)(130mg),两亲性嵌段共聚物mPEG-PLGA(Mn:5,000-4,000道尔顿)(100mg),和40mg紫杉酚溶于1ml的丙酮中以制备透明溶液。丙酮从中除去以制备含有紫杉酚的混合聚合物组合物。将蒸馏水(2ml)加入到含有紫杉酚的聚合物组合物中,和混合物在40℃下搅拌20分钟以制备含有紫杉酚的混合聚合物胶束水溶液。溶液穿过具有200nm的孔隙大小的过滤器以除去不溶解的紫杉酚。紫杉酚的含量和溶解度是由HPLC测定和粒度是由Dynamic Light Scattering(DLS)方法测量。
D,L-PLA-COONa/mPEG-PLGA=56/44
紫杉酚的含量:14.8wt%
在水溶液中紫杉酚的溶解度:40mg/ml
粒度:24nm
实施例2:D,L-PLA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的含有紫杉酚的混合聚合物胶束组合物的制备
将从以上制备例合成的D,L-PLA-COONa(Mn:1,140道尔顿)(180mg),100mg的两亲性嵌段共聚物mPEG-PLA(Mn:2,000-1,765道尔顿),和20mg紫杉酚溶于1ml的丙酮中以制备透明溶液。丙酮从中除去以制备含有紫杉酚的混合聚合物组合物。将蒸馏水(2ml)加入到含有紫杉酚的聚合物组合物中,和混合物在40℃下搅拌30分钟以制备含有紫杉酚的混合聚合物胶束水溶液。溶液穿过具有200nm的孔隙大小的过滤器以除去不溶解的紫杉酚。
D,L-PLA-COONa/mPEG-PLA=64/36
紫杉酚的含量:6.7wt%
在水溶液中紫杉酚的溶解度:10mg/ml
粒度:16nm
实施例3:D,L-PLGA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的含有环孢菌素A的混合聚合物胶束组合物的制备
根据与实施例2中同样的程序制备含有环孢菌素A的混合聚合物胶束水溶液,只是使用从以上制备例合成的150mg的D,L-PLGA-COONa(Mn:1,650道尔顿),50mg的两亲性嵌段共聚物mPEG-PLA(Mn:2,000-1,765道尔顿),和20mg的环孢菌素A,并通过具有具有200nm的孔隙大小的过滤器以除去不溶解的环孢菌素A。
D,L-PLGA-COONa/mPEG-PLA=75/25
环孢菌素A的含量:9.1wt%
粒度:20nm
实施例4:D,L-PLA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的含有环孢菌素A的混合聚合物胶束组合物的制备
根据与实施例2中同样的程序制备含有环孢菌素A的混合聚合物胶束水溶液,只是使用从以上制备例合成的100mg的D,L-PLA-COONa(Mn:540道尔顿),100mg的两亲性嵌段共聚物mPEG-PLA(Mn:2,000-1,765道尔顿),和25mg的环孢菌素A。
D,L-PLA-COONa/mPEG-PLA=50/50
环孢菌素A的含量:11.1wt%
粒度:22nm
实施例5:D,L-PLGA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的含有环孢菌素A的混合聚合物胶束组合物的制备
根据与实施例2中同样的程序制备含有环孢菌素A的混合聚合物胶束水溶液,只是使用从以上制备例合成的100mg的D,L-PLGA-COONa(Mn:1,040道尔顿),100mg的两亲性嵌段共聚物mPEG-PLA(Mn:2,000-1,765道尔顿),和25mg的环孢菌素A。
D,L-PLGA-COONa/mPEG-PLA=50/50
环孢菌素A的含量:11.1wt%
粒度:24nm
实施例6:D,L-PLA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的含有紫杉酚的混合聚合物胶束组合物的制备
根据与实施例2中同样的程序制备含有紫杉酚的混合聚合物胶束水溶液,只是使用从以上制备例合成的D,L-PLA-COONa(Mn:1,140道尔顿)(100mg),90mg的两亲性嵌段共聚物mPEG-PLA(Mn:2,000-5,000道尔顿),和10mg的紫杉酚。
D,L-PLA-COONa/mPEG-PLA-54/46
紫杉酚的含量:5.0wt%
在水溶液中紫杉酚的溶解度:10mg/ml
粒度:56nm
实施例7:D,L-PLA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的含有紫杉酚的混合聚合物胶束组合物的制备
根据与实施例2中同样的程序制备含有紫杉酚的混合聚合物胶束水溶液,只是使用从以上制备例合成的D,L-PLA-COONa(Mn:1,140道尔顿)(150mg),90mg的两亲性嵌段共聚物mPEG-PLA(Mn:2,000-8,000道尔顿),和10mg的紫杉酚。
D,L-PLA-COONa/mPEG-PLA=63/37
紫杉酚的含量:4.0wt%
在水溶液中紫杉酚的溶解度:10mg/ml
粒度:56nm
对比实施例1:D,L-PLA-COONa的含有紫杉酚的聚合物胶束的制备
将从以上制备例合成的D,L-PLA-COONa(Mn:1,140道尔顿)(80mg)和20mg的紫杉酚溶于1ml的丙酮中。该丙酮通过使用真空蒸发器被除去,在其中添加蒸馏水以制备含有紫杉酚的D,L-PLA-COONa聚合物胶束。所获得的混合物通过具有200nm的孔隙大小的过滤器以除去不溶解的紫杉酚。紫杉酚的含量和溶解度,以及粒度是如下:
紫杉酚的含量:20wt%
在水溶液中紫杉酚的溶解度:20mg/ml
粒度:18nm
对比实施例2:含有紫杉酚的mPEG-PLGA聚合物胶束的制备
将从以上制备例合成的mPEG-PLGA(Mn:5,000-4,000道尔顿)(80mg)和20mg的紫杉酚溶于1ml的丙酮中。该丙酮通过使用真空蒸发器被除去,在其中添加蒸馏水以制备含有紫杉酚的mPEG-PLGA聚合物胶束。
紫杉酚的含量:5wt%
在水溶液中紫杉酚的溶解度:5mg/ml
粒度:28nm
实验实施例1:稳定性试验
从实施例1获得的含有紫杉酚的混合聚合物胶束组合物的水溶液的药物负载效率和在37℃的稳定性与从对比实施例1获得的D,L-PLA-COONa聚合物胶束组合物和从对比实施例2获得的mPEG-PLGA聚合物胶束组合物的此类性质进行对比。通过制备含有过量药物的聚合物胶束,让它们穿过具有200nm的孔隙大小的过滤器,由HPLC测量在滤液中的药物浓度,和将测量的浓度换算成以聚合物胶束组合物的总重量为基础计的药物的重量%,来计算聚合物胶束的药物负载效率。结果示于表5中。
表5
|
实施例1 |
对比实施例1 |
对比实施例2 |
负载效率(%) |
14.8 |
20 |
5 |
图1到3是上述实施例1和对比实施例1和2的聚合物胶束的示意图。
如表5中所示,紫杉酚的负载效率是在混合聚合物胶束中的14.8wt%和在D,L-PLA-COONa聚合物胶束中的20wt%,而它在mPEG-PLGA聚合物胶束中仅仅是5wt%。因此,已经证实,该mPEG-PLA聚合物胶束具有相当于其它聚合物胶束的负载效率的仅仅大约1/3的负载效率,而本发明的混合聚合物胶束具有与D,L-PLA-COONa类似的负载效率。
该聚合物胶束被稀释在具有pH7的磷酸盐缓冲盐水溶液中以调节紫杉酚的浓度到1mg/ml。然后,在37℃下保持的同时以一定时间间隔测量紫杉酚的浓度。结果示于表6中。
表6:混合和单种聚合物胶束在37℃下的稳定性
小时 |
紫杉酚的浓度(mg/ml) |
实施例1 |
对比实施例1 |
对比实施例2 |
0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1 |
1.0 |
0.6 |
1.0 |
6 |
1.0 |
0.4 |
0.9 |
12 |
1.0 |
0.3 |
0.5 |
24 |
1.0 |
0.3 |
0.4 |
如表6中所示,紫杉酚在24小时内没有从实施例1的混合聚合物胶束组合物中释放。相反,紫杉酚在1小时之后从对比实施例1的D,L-PLA-COONa中和在6小时之后从对比实施例2的mPEG-PLGA聚合物胶束组合物中猛烈地释放。在24小时之后仅仅大约40%的药物保留在对比实施例2的mPEG-PLGA聚合物胶束组合物中。以上结果证明,本发明的混合聚合物胶束组合物具有与对比实施例2的mPEG-PLGA聚合物胶束组合物相当的稳定性。
实验实施例2:聚合物的组成比率对于含有弱水溶性的药物的混合聚合物胶束的稳定性的影响的评价
根据在实施例1中的程序制备含有9.1wt%的紫杉酚的组合物,以组合物的总重量为基础。D,L-PLA-COONa(Mn:1,140道尔顿)与mPEG-PLA(Mn:2,000-1,765道尔顿)的组成比率是如下变化:0/100,10/90,20/80,40/60,50/50,60/40,80/20,90/10,和100/0。组合物然后稀释在pH7的磷酸盐缓冲溶液中以调节紫杉酚的浓度到1mg/ml。在25℃下保持的同时以一定时间间隔测量紫杉酚的浓度,以对比胶束稳定性。结果示于表7中。
表7:取决于聚乳酸衍生物和两亲性嵌段共聚物的组成比例的、在25℃下的稳定性的对比
D,L-PLA-COONa(mg) |
mPEG-PLA(mg) |
紫杉酚(mg) |
初始浓度(mg/ml) |
在12小时之后的浓度(mg/ml) |
在24小时之后的浓度(mg/ml) |
- |
100 |
10 |
1.0 |
0.65 |
0.2 |
10 |
90 |
10 |
1.0 |
1.0 |
0.83 |
20 |
80 |
10 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
40 |
60 |
10 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
50 |
50 |
10 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
60 |
40 |
10 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
80 |
20 |
10 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
90 |
10 |
10 |
1.0 |
1.0 |
0.94 |
100 |
- |
10 |
1.0 |
0.37 |
0.32 |
如表7中所示,本发明的混合聚合物胶束具有恒定的紫杉酚浓度,甚至在24小时之后,而包括聚乳酸衍生物或两亲性嵌段共聚物的单种聚合物胶束在12小时之后具有降低的紫杉酚浓度。因此,已经证实,该混合聚合物胶束具有比单种聚合物胶束更好的稳定性。
实施例8到13:含有二-或三-价金属离子束缚的弱水溶性的药物的胶束或纳米颗粒的制备
实施例8:D,L-PLA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的Ca2+束缚的含有紫杉酚的胶束的制备
步骤1:D,L-PLA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的含有紫杉酚
的聚合物胶束的制备
将130mg(114mmol)的制备例13的D,L-PLA-COONa(Mn:1,140道尔顿),30mg的紫杉酚,和100mg的制备例23的mPEG-PLA(Mn:2,000-1,765道尔顿)完全溶于2ml的丙酮中而获得透明溶液。丙酮从中除去以制备含有紫杉酚的聚合物组合物。将蒸馏水(2.5ml)加入其中,和混合物在40℃下搅拌30分钟以制备含有紫杉酚的聚合物胶束水溶液。
步骤2:用二价金属离子的束缚
将0.29ml(58mmol)的无水氯化钙的0.2M水溶液加入到在步骤1中制备的聚合物胶束水溶液中,混合物在室温下搅拌20分钟。混合物通过具有200nm的孔隙大小的过滤器,然后冷冻干燥。紫杉酚的含量和溶解度是由HPLC测定和粒度是根据Dynamic Light Scattering(DLS)方法测量。
D,L-PLA-COONa/mPEG-PLA(重量比):56.5/43.5
紫杉酚的含量:11.5wt%
在水溶液中紫杉酚的溶解度:10.7mg/ml
粒度:18nm
实施例9:D,L-PLA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的Mg2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束的制备
将0.29ml(58mmol)的无水氯化镁的0.2M水溶液加入到在以上实施例8的步骤1中制备的聚合物胶束水溶液中,混合物在室温下搅拌20分钟。混合物通过具有200nm的孔隙大小的过滤器,然后冷冻干燥。
D,L-PLA-COONa/mPEG-PLA(重量比):56.5/43.5
紫杉酚的含量:11.5wt%
在水溶液中紫杉酚的溶解度:10.7mg/ml
粒度:18nm
实施例10:D,L-PLA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的Zn2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束的制备
将0.29ml(58mmol)的无水氯化锌的0.2M水溶液加入到在以上实施例8的步骤1中制备的聚合物胶束水溶液中,混合物在室温下搅拌20分钟。混合物通过具有200nm的孔隙大小的过滤器,然后冷冻干燥。
D,L-PLA-COONa/mPEG-PLA(重量比):56.5/43.5
紫杉酚的含量:11.5wt%
在水溶液中紫杉酚的溶解度:10.7mg/ml
粒度:18nm
实施例11:D,L-PLMA-COONa和mPEG-PLA-棕榈酸酯嵌段共聚物的Ca2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束的制备
根据与实施例8相同的程序制备Ca2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束组合物,只是使用130mg(119mmol)的制备例22的D,L-PLMA-COONa(Mn:1,096),30mg的紫杉酚,100mg的制备例29的mPEG-PLA-棕榈酸酯(Mn:2,000-1,800道尔顿),和乙醇代替丙酮。
D,L-PLMA-COONa/mPEG-PLA-棕榈酸酯(重量比):56.5/43.5
紫杉酚的含量:11.5wt%
在水溶液中紫杉酚的溶解度:10.7mg/ml
粒度:18nm
实施例12:D,L-PLA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的Ca2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束的制备
根据与实施例8相同的程序制备Ca2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束组合物,只是使用100mg(88mmol)的制备例13的D,L-PLA-COONa(Mn:1,140),10mg的紫杉酚,90mg的制备例24的mPEG-PLA(Mn:2,000-5,000道尔顿),和乙醇代替丙酮。
D,L-PLA-COONa/mPEG-PLA(重量比):54/46
紫杉酚的含量:5.0wt%
在水溶液中紫杉酚的溶解度:10.0mg/ml
粒度:58nm
实施例13:D,L-PLA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的Ca2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束的制备
根据与实施例8相同的程序制备Ca2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束组合物,只是使用150mg(132mmol)的制备例13的D,L-PLA-COONa(Mn:1,140),10mg的紫杉酚,90mg的制备例25的mPEG-PLA(Mn:2,000-8,000道尔顿),和乙醇代替丙酮。
D,L-PLA-COONa/mPEG-PLA(重量比):63/37
紫杉酚的含量:4.0wt%
在水溶液中紫杉酚的溶解度:10.0mg/ml
粒度:50nm
实验实施例3:与所使用的金属离子的当量相关的聚合物胶束或纳米颗粒组合物的稳定性的评价
为了评价与所使用的金属离子的当量相关的聚合物胶束或纳米颗粒组合物的稳定性,如下制备聚合物胶束组合物。
步骤1:D,L-PLA-COONa和mPEG-PLA嵌段共聚物的含有紫杉酚的混合聚合物胶束的制备
将170mg(149mmol)的D,L-PLA-COONa(Mn:1,140),30mg的紫杉酚和50mg的两亲性嵌段共聚物mPEG-PLA(Mn:2,000-1,765道尔顿)溶于2ml的丙酮中而获得透明溶液。丙酮从中除去以制备含有紫杉酚的聚合物胶束组合物。将蒸馏水(3ml)加入到聚合物胶束组合物中,和混合物在40℃下搅拌30分钟以制备含有紫杉酚的聚合物胶束水溶液。
步骤2:用二价金属离子的束缚
将在步骤1中制备的含有紫杉酚的聚合物胶束水溶液分成3份,每份1ml。向每份中添加0.0625,0.125,和0.25ml(12.5,25,和50mmol)的0.2M无水氯化钙水溶液。混合物在室温下搅拌20分钟。混合物通过具有200nm的孔隙大小的过滤器。然后,将pH7.4的PBS(对苯甲酰硫酸盐)缓冲液添加进去,以调节紫杉酚的浓度到1mg/ml。在37℃下保持的同时由HPLC测量紫杉酚的浓度。结果示于表8中。
表8
|
mPEG-PLA/D,L-PLA-COONa(重量比) |
CaCl2/D,L-PLA-COONa(eq.) |
药物浓度 |
0hr |
6hrs |
12hrs |
24hrs |
0.25eq. |
50/170 |
0.25/1.00 |
1.0 |
1.0 |
0.9 |
0.7 |
0.5eq. |
50/170 |
0.50/1.00 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0eq. |
50/170 |
1.00/1.00 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
0eq. |
50/170 |
0.00/1.00 |
1.0 |
0.4 |
0.2 |
0.2 |
(eq.:当量)
如表8中所示,该药物浓度与初始浓度相比减少了80%,并且当没有添加Ca2+时在24小时之后药物浓度是0.2mg/ml。该药物浓度与初始浓度相比减少了大约30%,并且当添加0.25当量的Ca2+时在24小时之后药物浓度是0.7mg/ml,它高于当不添加Ca2+时的浓度。此外,当添加0.5当量或更高的Ca2+时,药物浓度在24小时之后没有变化。如上所述,该Ca2+-处理的组合物比未处理的组合物更稳定,并且当添加0.5当量或更高的Ca2+时,稳定性显著地提高。
实验实施例4:与所使用的D,L-聚乳酸钠盐(D,L-PLA-COONa)的M.W.有关的聚合物胶束的稳定性试验。
为了试验与所使用的D,L-聚乳酸钠盐(D,L-PLA-COONa)的M.W.有关的纳米颗粒组合物的稳定性,如下制备聚合物胶束组合物。
紫杉酚,mPEG-PLA(Mn:2,000-1,776),和D,L-PLA-COONa(Mn:646,1,145,1,500或2,300)是以1∶3∶3的当量比掺混,然后将混合物溶于5ml的无水乙醇中以制备透明溶液。使用真空蒸发器从中除去乙醇而制备含有紫杉酚的聚合物组合物。将蒸馏水(12ml)加入其中,和混合物在60℃下搅拌10分钟以制备含有紫杉酚的聚合物胶束水溶液。向以上聚合物胶束溶液中添加与D,L-PLA-COONa同样当量的CaCl2水溶液(浓度:100mg/ml),和混合物在室温下搅拌20分钟。混合物穿过具有200nm的孔隙大小的过滤器,然后向其中添加pH7.4的PBS缓冲液,将混合物稀释到具有1mg/ml的紫杉酚。让混合物在37℃下静置,由HPLC测量:随着时间的推移,紫杉酚的浓度。结果示于表9中。
表9
D,L-PLA-COONa的M.W. |
药物浓度(mg/ml) |
0d |
1d |
2d |
3d |
5d |
7d |
10d |
12d |
14d |
646 |
1.00 |
0.39 |
0.23 |
0.20 |
0.17 |
0.17 |
0.16 |
0.16 |
0.15 |
1,145 |
1.00 |
0.74 |
0.58 |
0.47 |
0.33 |
0.32 |
0.28 |
0.25 |
0.23 |
1,500 |
1.00 |
0.98 |
0.91 |
0.80 |
0.54 |
0.51 |
0.46 |
0.36 |
0.36 |
2,300 |
1.00 |
1.00 |
0.99 |
0.98 |
0.80 |
0.75 |
0.68 |
0.64 |
0.62 |
如表9中所示,随着D,L-PLA-COONa的M.W.提高到646,1,145,1,500,和2,300,在14天之后药物浓度分别增加到0.15,0.23,0.36和0.62mg/ml。随着D,L-PLA-COONa的M.W.的提高,药物沉淀减少,这说明聚合物胶束组合物是相对更稳定的。
实验实施例5:与所使用的D,L-聚乳酸钠盐(D,L-PLA-COONa)的当量有关的聚合物胶束的稳定性试验。
为了试验与所使用的D,L-聚乳酸钠盐(D,L-PLA-COONa)的当量有关的纳米颗粒组合物的稳定性,如下制备聚合物胶束组合物。
紫杉酚,mPEG-PLA(Mn:2,000-1,776),和D,L-PLA-COONa(Mn:646,1,145)是以1∶2∶x的当量比掺混,其中x是2,4,6,8,10或12,然后将混合物溶于5ml的无水乙醇中以制备透明溶液。使用真空蒸发器从中除去乙醇而制备含有紫杉酚的聚合物组合物。将蒸馏水(12ml)加入其中,和混合物在60℃下搅拌10分钟以制备含有紫杉酚的聚合物胶束水溶液。向以上聚合物胶束溶液中添加与D,L-PLA-COONa同样当量的CaCl2水溶液(浓度:100mg/ml),和混合物在室温下搅拌20分钟。混合物穿过具有200nm的孔隙大小的过滤器,然后向其中添加pH7.4的PBS缓冲液,将混合物稀释到具有1mg/ml的紫杉酚。让混合物在37℃下静置,由HPLC测量在不同的时间间隔中紫杉酚的浓度。结果示于表10中。
表10
D,L-PLA-COONa/mPEG-PLA(当量比:x/2) |
药物浓度(mg/ml) |
0d |
1d |
2d |
3d |
5d |
7d |
10d |
12d |
14d |
2/2 |
1.00 |
0.25 |
0.20 |
0.14 |
0.12 |
0.10 |
0.08 |
0.08 |
0.07 |
4/2 |
1.00 |
0.41 |
0.27 |
0.22 |
0.17 |
0.14 |
0.12 |
0.11 |
0.08 |
6/2 |
1.00 |
1.00 |
0.96 |
0.90 |
0.78 |
0.71 |
0.64 |
0.64 |
0.59 |
8/2 |
1.00 |
1.00 |
1.00 |
1.00 |
0.98 |
0.95 |
0.90 |
0.85 |
0.80 |
10/2 |
1.00 |
1.00 |
1.00 |
0.97 |
0.95 |
0.93 |
0.87 |
0.78 |
0.67 |
12/2 |
1.00 |
0.98 |
0.96 |
0.95 |
0.95 |
0.91 |
0.89 |
0.78 |
0.61 |
如表10中所示,随着D,L-PLA-COONa的当量的提高,聚合物胶束的稳定性会提高,并且在6/2或更高的当量比下显著地提高。特别地,在8/2的当量比下,在14天之后药物浓度是0.80mg/ml的最高值。
实验实施例6:Ca2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束的血液保留试验
为了试验Ca2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束的血流停留时间,如下制备聚合物胶束组合物。
步骤1:混合聚合物胶束的制备
含有紫杉酚,嵌段共聚物,聚乳酸,和金属离子的聚合物胶束(组合物1)。
紫杉酚,mPEG-PLA(Mn:2,000-1,776),和D,L-PLA-COONa(Mn:1,145)是以1∶5∶20的当量比掺混,然后将混合物溶于5ml的无水乙醇中以制备透明溶液。使用真空蒸发器从中除去乙醇而制备含有紫杉酚的聚合物组合物。将蒸馏水(4ml)加入其中,和混合物在60℃下搅拌10分钟以制备含有紫杉酚的聚合物胶束水溶液。向以上聚合物胶束溶液中添加与D,L-PLA-COONa同样当量的CaCl2水溶液(浓度:100mg/ml),和混合物在室温下搅拌20分钟。混合物通过具有200nm的孔隙大小的过滤器。
含有紫杉酚,嵌段共聚物,和聚乳酸的聚合物胶束(组合物2)。
紫杉酚,mPEG-PLA(Mn:2,000-1,776),和D,L-PLA-COONa(Mn:1,145)是以1∶5∶20的当量比掺混,然后将混合物溶于5ml的无水乙醇中以制备透明溶液。使用真空蒸发器从中除去乙醇而制备含有紫杉酚的聚合物组合物。将蒸馏水(4ml)加入其中,和混合物在60℃下搅拌10分钟以制备含有紫杉酚的聚合物胶束水溶液。混合物通过具有200nm的孔隙大小的过滤器。
含有紫杉酚和嵌段共聚物的聚合物胶束(组合物3)。
紫杉酚和mPEG-PLA(Mn:2,000-1,776)是以1∶5的当量比掺混,然后将混合物溶于5ml的无水乙醇中以制备透明溶液。使用真空蒸发器从中除去乙醇而制备含有紫杉酚的聚合物组合物。将蒸馏水(5ml)加入其中,和混合物在60℃下搅拌10分钟以制备含有紫杉酚的聚合物胶束水溶液。混合物通过具有200nm的孔隙大小的过滤器。
表11
| mPEG-PLA(mg) | D,L-PLA-COONa(mg) |
紫杉酚(mg) |
CaCl2(mg) |
紫杉酚的含量(mg/ml) |
Com.1 |
436.9 |
536.4 |
20.0 |
52.0 |
3.5 |
Com.2 |
436.9 |
536.4 |
20.0 |
- |
3.6 |
Com.3 |
436.9 |
- |
20.0 |
- |
3.7 |
为了进行动物试验,230-250g的雄性Sprague-Dawley鼠是股静脉和股动脉中插入导管。组合物1,2和3经过15秒以10mg/kg的剂量注入股静脉中。在注入之后,0.3ml的全部血液在1,15,30,45分钟,和1,1.5,2,3,4,5,6,8小时之后从股动脉中抽出,然后离心处理以获得清澈的上层血浆。
此外,为了分析药物的血浆浓度,将0.1ml的血浆注入到覆盖的玻璃管中和将0.1ml的含有内标准物质的乙腈溶液添加在其中。将10ml的乙酸乙酯添加到以上溶液中,混合物剧烈地搅拌30秒,然后,在2,500rpm下离心处理10分钟。全部的乙酸乙酯层被取出和转移到试管中,然后,有机溶剂于40℃在氮气流下完全地被蒸发掉。在其中添加的是0.1ml的40%(v/v)乙腈溶液,和混合物剧烈地搅拌30秒,然后,进行HPLC。HPLC的条件是如下这些:
注入体积:0.075ml
流速:1.0ml/分钟
波长:227nm
移动相:在5分钟中24%乙腈水溶液,在16分钟中已提高到58%,在2分钟中提高到70%,在4分钟中下降到34%,和维持5分钟
柱:4.6×50nm(C18,Vydac,USA)。
药物的血浆浓度的分析结果示于下表12和图6中。
表12
|
紫杉酚的血浆浓度(μg/ml) |
1m |
15m |
30m |
45m |
1h |
1.5h |
2h |
3h |
4h |
5h |
6h |
8h |
Com.1 |
82.6 |
17.8 |
10.1 |
6.5 |
5.4 |
2.8 |
2.1 |
1.2 |
0.70 |
0.46 |
0.32 |
0.18 |
Com.2 |
31.8 |
4.1 |
3.0 |
2.2 |
1.7 |
12 |
0.71 |
0.33 |
0.23 |
0.13 |
0.08 |
0.04 |
Com.3 |
30.4 |
2.4 |
1.6 |
1.1 |
0.90 |
0.66 |
0.39 |
0.17 |
0.09 |
0.07 |
0.03 |
0.02 |
如表12和图6中所示,含有D,L-PLA-COONa的组合物2,具有比仅仅含有mPEG-PLA嵌段共聚物的组合物3更长的血流停留时间,和含有Ca2+的组合物1具有比组合物2更长的停留时间。因此,以上结果说明,根据本发明的含有药物的聚合物胶束具有较长的药物的血流停留时间,和特别地,金属离子束缚的聚合物胶束具有更长的药物的血流停留时间。
实验实施例7:Ca2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束的血流停留时间
为了将Ca2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束的血流停留时间与含有其它载体的配制料的停留时间进行对比,如下制备组合物。
含有紫杉酚,嵌段共聚物,聚乳酸,和金属离子的聚合物胶束(组合物4)。
紫杉酚,mPEG-PLA(Mn:2,000-1,776)和D,L-PLMA-COONa(Mn:1,198)是以49.5∶49.5∶1的重量比掺混,然后将混合物溶于5ml的无水乙醇中以制备透明溶液。使用真空蒸发器从中除去乙醇而制备含有紫杉酚的聚合物组合物。将蒸馏水(4ml)加入其中,和混合物在60℃下搅拌10分钟以制备含有紫杉酚的聚合物胶束水溶液。向以上聚合物胶束溶液中添加与D,L-PLMA-COONa同样当量的CaCl2水溶液(浓度:100mg/ml),和混合物在室温下搅拌20分钟。混合物通过具有200nm的孔隙大小的过滤器。
含有紫杉酚,Cremophor EL,和无水乙醇的组合物(组合物5)。
将紫杉酚(30mg)溶于5ml的由Cremophor EL和无水乙醇组成的混合溶液(50∶50v/v)中而获得透明溶液。溶液通过具有200nm的孔隙大小的过滤器。
含有紫杉酚,polysorbate 80(Tween 80),和无水乙醇的组合物(组合物6)。
将紫杉酚(30mg)溶于5ml的由polysorbate 80和无水乙醇组成的混合溶液(50∶50v/v)中而获得透明溶液。溶液通过具有200nm的孔隙大小的过滤器。
以上组合物和药物含量概括在表13中。
表13
Com.4 |
mPEG-PLA(mg) |
D,L-PLMA-COONa(mg) |
紫杉酚(mg) |
CaCl2(mg) |
紫杉酚的含量(mg/ml) |
990 |
990 |
20.0 |
100.6 |
1.6 |
Com.5 |
Cremophor EL(ml) |
无水乙醇(ml) |
紫杉酚(mg) |
- |
紫杉酚的含量(mg/ml) |
2.5 |
2.5 |
30.0 |
- |
1.5 |
Com.6 |
Tween 80(ml) |
无水乙醇(ml) |
紫杉酚(mg) |
- |
紫杉酚的含量(mg/ml) |
2.5 |
2.5 |
30.0 |
- |
1.5 |
为了进行动物试验,230-250g重量的雄性Sprague-Dawley鼠是在股静脉和股动脉中插入导管。组合物4,5和6经过15秒以5mg/kg的剂量注入股静脉中。在注入之后,0.3ml的全部血液在1,15,30分钟,和1,1.5,2,3,4,6小时之后从股动脉中抽出,然后离心处理以获得清澈的上层血浆。
此外,该血浆药物浓度根据与实验实施例6中同样的方法来分析,血浆药物浓度的结果示于表14和图7中。
表14
|
紫杉酚的血浆浓度(μg/ml) |
1m |
15m |
30m |
1h |
1.5h |
2h |
3h |
4h |
6h |
Com.4 |
86.5 |
9.68 |
4.71 |
1.97 |
1.10 |
0.78 |
0.35 |
0.26 |
0.14 |
Com.5 |
45.7 |
6.60 |
3.20 |
1.40 |
0.75 |
0.46 |
0.25 |
0.16 |
0.09 |
Com.6 |
13.9 |
0.64 |
0.26 |
0.10 |
0.07 |
0.04 |
- |
- |
- |
如表14和图7中所示,Ca2+束缚的聚合物胶束(组合物4)具有比含有其它表面活性剂的注射剂(组合物5和6)更长的血流停留时间。因为本发明的Ca2+束缚的聚合物胶束(组合物4)具有比市售的配制料Taxol(组合物5)更长的血流停留时间,本发明通过使用可生物降解的和生物相容的聚合物而能够增加在血流中的药物停留时间,与Taxol相比而言。
实验实施例8:Ca2+束缚的含有紫杉酚的聚合物胶束的抗癌活性
将0.1ml的含有7×106人癌细胞(PPC1,HT29)的细胞悬浮液经皮下注入到健康的雌性裸(nu/nu)无胸腺(athymic)小鼠(20g,8周龄期,n=6)的侧边。在肿瘤达到一定尺寸之后,它们被异种移植三次而形成3-4mm的异种移植段。利用12规格套管针将异种移植片经皮下注入到健康的雌性裸(nu/nu)无胸腺(athymic)小鼠(20g,8周龄期,n=5)的侧边。当肿瘤的体积达到100-300mm3时,该药物被施用,和这一时间点被记录为0天。在0天,将小鼠布置成5只的各组,并且在0,1和2天,金属离子束缚的聚合物胶束(组合物4)和该Cremophor EL配制料(组合物5)是以20mg/kg的紫杉酚的剂量经由尾静脉注入,和肿瘤的体积是在不同的时间间隔测量。肿瘤的体积通过公式(W2×L)/2来计算,其中W是短轴,和L是长轴。
如图8a和8b中所示,与对照组相比,金属离子束缚的聚合物胶束处理过的组和Cremophor EL配制料处理过的组都显示了对肿瘤生长的相当大的抑制作用,和特别地,该金属离子束缚的聚合物胶束处理过的组显示出比Cremophor EL配制料处理过的组更高的抑制比率。
可以理解,以上描述的实施方案仅仅是本发明的原理的应用的举例说明。在不脱离本发明的精神和范围的前提下许多的改进和供选择的实施方案能够派生出来,并且所附权利要求希望覆盖此类改进和排列。因此,尽管本发明已经在附图中显示并且在以上关于目前视为本发明的最实际和优选的实施方案的那些内容进行了具体和详细的充分描述,对于本领域中的技术人员而言明显的是,在不脱离在权利要求中给出的本发明的原理和概念的情况下能够作很多改进。