CN1486184A - 抑制β-淀粉状蛋白肽释放或合成的内酰胺化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供化合物(N)－((S)－2－羟基－3－甲基－丁酰基)－1－(L－丙氨酰基)－(S)－1－氨基－3－甲基－4，5，6，7－四氢－2H－3－苯并氮杂－2－酮、其组合物和该化合物的使用方法。

Description

抑制β-淀粉状蛋白肽释放或合成的内酰胺化合物
                        发明领域
本发明涉及药物和有机化学领域并涉及抑制β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成的化合物。
                        发明背景
PCT申请PCT/US97/22986描述了某些内酰胺，它们抑制β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成，因此可用于治疗阿尔茨海默氏病。
本发明化合物(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基(alaninyl))-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮可用于抑制β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成，因此可用于治疗阿尔茨海默氏病并具有有益效果和安全性。
                        发明概述
本发明提供化合物(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。
在一个其方法方面，本发明涉及抑制β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成的方法，该方法包括给有此需求的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。在一个具体的方法的实施方案中，本发明提供治疗阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括有此需求的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。本发明还提供防止或抑制阿尔茨海默氏病发展的方法，该方法包括给有此需求的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。
在另一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，该组合物包含(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮和可药用稀释剂。这类组合物可用于抑制β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成，包括阿尔茨海墨氏病的治疗。
                        发明详述
本文中使用的术语具有下面所示含义：
术语“ee”或“对映体过量”是指当用式((E1-E2)+(E1+E2))×100％＝ee计算时，在两种对映体(E1+E2)的混合物中，对映体E1的百分数是过量的。本领域公知，对映体过量可通过化合物或其衍生物的毛细管电泳和手性HPLC测定。
本文中，有关相对于甘油醛的异构体的立体化学的(R)-和(S)-的Cahn-Prelog-Ingold命名以及L-和D-的命名用于指特定异构体。
本发明化合物可如下制备。除非另有说明，在下面的反应方案中，所有取代基的定义都如前述定义，所有试剂均是本领域熟知的或已知的。
                    反应方案1
在反应方案1的步骤1中，式(1)的N-甲基苯乙胺用适宜的二烷氧基羰基乙酸酯转移试剂酰化，得到式(2)化合物。N-甲基苯乙胺有市售，也很容易通过2-溴或2-氯乙基苯与甲胺在本领域熟知或已知条件下的反应来制备。适宜的二烷氧基羰基乙酸酯转移试剂是其中R4是C1-C4烷基的并且将二烷氧基羰基乙酰基转移到式(1)化合物上的那些，例如二烷氧基羰基乙酸和二烷氧基羰基乙酰氯(参见Ben-Ishai，Tetrahedron，43，439-450(1987))。
例如，将式(1)化合物与适宜的二烷氧基羰基乙酸接触，得到式(2)化合物。这类偶联反应是肽合成中常见的，因此可使用肽合成方法中使用的方法。例如，为有助于这种酰化，可使用公知的偶联试剂，如碳二亚胺，与此同时可使用或不使用公知的添加剂，如N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑等。这类偶联反应常使用适合的碱，以清除反应期间生成的酸。适宜的碱包括，例如三乙胺、N，N-二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉等。该反应一般在惰性的非质子极性稀释剂，如二甲基酰胺、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃等中进行。该反应典型地是在约0℃至约60℃的温度下进行约1至约24小时。反应完全后，通过常规方法回收式(2)产物，常规方法包括提取、沉淀、色谱、过滤、研制、结晶等。
或者，例如可将式(1)化合物与适宜的二烷氧基羰基乙酰氯接触，得到式(2)化合物。这类酰氯很容易如下制备：由相应的酸，通过本领域公知的方法，如在约0-80℃下，在惰性溶剂，如甲苯、二氯甲烷或氯仿中，通过三氯化磷、三氯氧化磷、五氯化磷、亚硫酰氯或草酰氯的作用，同时可使用或不使用少量二甲基甲酰胺。该反应典型地进行1-24小时。酰氯可被分离和纯化或者经常是直接使用，即，可进行或不进行分离和/或纯化。这类酰化反应一般使用适宜的碱，以清除反应期间形成的酸。适宜的碱包括，例如吡啶、三乙胺、N，N-二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉等。该反应通常在惰性非质子极性稀释剂，如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃等中进行。该反应通常在约-20℃至约80℃的温度下并通常进行约1至约24小时。反应完全后，式(2)产物可通过常规方法回收，常规方法包括提取、沉淀、色谱、过滤、研制、结晶等。
在反应方案1的步骤2中，环合式(2)化合物，得到式(3)化合物。
例如，将式(2)化合物与酸，例如甲磺酸或硫酸接触。该反应通常使用选择的酸作为溶剂进行。通常，开始时，在约-20℃至约0℃下混合反应物，然后使之温热到大约环境温度至约60℃的温度。该环合反应一般需要约12至约72小时。反应完全后，通过常规方法回收式(2)的产物，常规方法包括提取、沉淀、色谱、过滤、研制、结晶等。
在反应方案1的步骤3中，将式(3)化合物脱保护，得到式(4)化合物。
这类烷氧羰基胺保护基的除去是本领域公知的和清楚的。例如，参见Protecting Groups in Organic Synthesis，Theodora Greene(1st和2nd Editions，Wiley-Interscience)和Ben-Ishai，Tetrahedron，43，439-450(1987)。
                            反应方案2
Figure A0182210000061
在反应方案2的步骤1中，将适宜的式(5)的苯乙酸与适宜的式(6)的乙缩醛偶联，得到式(7)的化合物。适宜的式(5)的苯乙酸是其中A2是有活性的基团，例如-OH、-Cl或-Br的一类。适宜的式(6)的乙缩醛是其中R5是C1-C4烷基的一类。这类偶联反应是肽合成领域常见的，因此可以使用肽合成中使用的方法，如反应方案1的步骤1所示的方法。
另外，反应方案2步骤2中描述的偶联反应可使用式(5)化合物的酰卤和适宜的式(6)的乙缩醛，在Schotten-Baumann条件下，在混合溶剂，如甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氢呋喃、丙酮或乙醚和水中进行。这类反应使用适宜的碱进行，所述碱是例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾。该反应通常在搅拌或剧烈搅拌下进行并且在约-20℃至约80℃下进行通常是约1至约24小时。反应完全后，式(7)的产物通过常规方法回收，常规方法包括提取、沉淀、色谱、过滤、研制、结晶等。
在反应方案2的步骤2中，将式(7)化合物环合，得到式(8)化合物。这类环合反应在酸，如硫酸中进行。典型地是，使用酸作为溶剂。通常，该反应在约-20℃至约150℃下进行，通常需要进行约1至约24小时。反应完全后，式(8)产物通过常规方法回收，常规方法包括提取、沉淀、色谱、过滤、研制、结晶等。
在反应方案2的步骤3中，式(8)化合物进行胺转移反应，得到式(9)化合物。在反应方案2中，描述了肟化反应。这类肟化反应通过将式(8)的烯醇化物与肟转移试剂，如烷基亚硝酸酯接触来实现。式(8)的烯醇化物可如下制备：将式(8)化合物与适宜的碱，如叔丁醇钾、二异丙基氨基锂、hexamethylsilazide锂、hexamethylsilazide钠、hexamethylsilazide钾等反应。Wheeler等人在Organic Syntheses，Coll.Vol.VI，p.840中例举了该类肟化反应，其中描述了亚硝酸异戊酯与酮反应来制备所需的肟。该反应一般在溶剂，如四氢呋喃中进行。通常，该反应在约-20℃至约50℃下进行并且通常需要约1至约24小时。反应完全后，式(8)产物通过常规方法回收，常规方法包括提取、沉淀、色谱、过滤、研制、结晶等。
或者，这类胺转移反应可通过叠氮化物来完成。叠氮化物可通过式(8)的烯醇化物与叠氮化物转移试剂，如甲苯磺酰叠氮和三异丙基苯磺酰叠氮的反应形成。Evans等人在J.Am.Chem.Soc.，112：4011-4030(1990)41中例举了这类反应的实例。该反应通常是在溶剂，如四氢呋喃中进行。通常，该反应在约-20℃至约50℃下进行并且通常需要约1至约24小时。反应完全后，用叠氮化物代替了肟的式(8)产物通过常规方法回收，常规方法包括提取、沉淀、色谱、过滤、研制、结晶等。
如反应方案2的步骤4中所示，将肟还原为式(4)化合物。这类还原反应通过用氢和适宜的催化剂，如阮内镍或钯催化剂，如披钯碳处理来完成。该反应通常在溶剂，如四氢呋喃、乙酸乙酯或低级醇，如甲醇、乙醇和异丙醇中，在乙酸、水、氨水等以及它们的混合物中进行。该反应通常在大气压至约600psi(4137kPa)的氢气压下进行。通常，该反应在约20℃至约100℃下进行并且通常需要约1至约24小时。反应完全后，式(4)产物通过常规方法回收，常规方法包括提取、沉淀、色谱、过滤、研制、结晶等。
或者，其中胺通过叠氮化物转移，叠氮基被还原。这类还原反应通过上述氢化反应进行。
反应方案A中描述了制备(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的方法。
反应方案A
反应方案A的步骤1描绘了立体化学拆分式(4)的适宜的内酰胺，得到式(10)的内酰胺，即基本上纯的(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。本文中使用的术语“基本上纯的”是指对映体纯的(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。依据本发明，可制备基本上纯的(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮，其包含大于80％，优选大于90％，更优选大于95％，最优选大于97％的(S)对映体。
例如，通过二苯甲酰酒石酸盐、(R)-(-)-d-樟脑磺酸和(D)-(-)-扁桃酸盐的分级结晶可拆分式(4)化合物的(S)-异构体。预期各类二苯甲酰酒石酸(酯)盐都适用于此目的。尤其是优选对位具有选自氢、卤素、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基的取代基的二苯甲酰酯，二-对甲苯甲酰酒石酸(酯)盐是优选的。使用二-对甲苯甲酰-L-酒石酸盐获得(S)-异构体。
依据本发明，将式(4)化合物与所选择的酸接触。通常，可以使用约0.4摩尔当量至大大过量的选择的酸，优选约0.4-1.5摩尔当量，更优选约0.5-1.1摩尔当量。
该方法通常通过在溶液中使酸加成盐结晶进行。特别适合的溶剂是，例如低级醇，包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、异戊醇、叔戊醇、己醇、环戊醇和环己醇，甲醇、乙醇和异丙醇是优选的。使用抗溶剂可能是有益的。本文中使用的“抗溶剂”是指与溶剂相比，其中盐是明显不溶的溶剂。优选地，当使用抗溶剂时，它与所选择的溶剂混溶。适宜的抗溶剂包括醚类，如乙醚、甲基叔丁基醚等；和乙酸低级烷基酯，如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丙酯、乙酸异丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯等；和链烷烃，如戊烷、己烷、庚烷、环己烷等。当本发明方法通过结晶外消旋混合物的酸加成盐来进行时，必须小心地使用抗溶剂，以避免不需要的非对映体盐的盐的结晶。
通常，结晶在约40℃至所选择溶剂的回流温度的起始温度下和约0.05摩尔至约0.25摩尔的起始浓度下进行。然后使该混合物冷却，得到盐。加入晶种可能是有利的。将起始沉淀搅拌约4至约48小时可能是有利的。优选缓慢地冷却结晶溶液。最宜使结晶冷却到环境温度至约-20℃的温度。可使用本领域公知的技术收集盐，包括过滤、滗析、离心、蒸发、干燥等。式(10)化合物可以以所选择酸的酸加成盐形式直接使用。或者，如本领域公知的那样，使用前，可在酸交换后以另一种酸加成盐的形式分离式(10)化合物或者可在碱性条件下通过萃取以碱的形式分离式(10)化合物。
优选的方法得到基本上对映体纯的(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮，该方法包括在芳香醛的存在下，以动态方法结晶酸加成盐形式的1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮，所述酸加成盐的酸选自二-对甲苯甲酰-L-酒石酸、(R)-(-)-d-樟脑磺酸和(D)-(-)-扁桃酸。动态方法的优势在于在结晶期间，1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮转化为一种异构体，这样提高了产率并避免了包括不需要的异构体的废液。
预期各类芳香醛均适用于该动态方法，我们现已发现实际上有多种醛是特别适合的。特别地，我们发现水杨酸是优选的，因此在本发明的动态拆分方法中，水杨醛、5-硝基水杨醛和3，5-二氨水杨醛是更优选的。
因此，当本发明方法以动态拆分方式进行时，将1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮与所选择的酸在芳香醛的存在下进行接触。对于动态拆分，通常使用约0.9-1.2摩尔当量的酸，优选1摩尔当量。芳香醛常以催化量使用。通常，使用约0.5-0.001摩尔当量的芳香醛，约0.1至约0.01摩尔当量是优选的。
动态方法通常在不含如上所述的抗溶剂的溶剂中进行。将1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮、选择的酸和芳香醛的混合物搅拌，使其转化为所需异构体。该转化反应通常在环境温度至溶剂的回流温度下进行。转化反应通常需要6-48小时。
本领域专业技术人员清楚，当本发明方法以动态拆分方式进行时，分离产物中存在少量芳香醛使得(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的酸加成盐的使用复杂化。因此，动态拆分后，优选通过盐交换，优选以盐酸盐形式分离(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮，然后使用它或形成碱。
反应方案A的步骤2描绘了式PgNH-CHCH3-C(O)-A的适宜的氨基保护的丙氨酸与式(10)的适宜酰胺的偶联反应。适宜的氨基保护的丙氨酸是其中Pg是氨基保护基、是L-构型的并且A是活泼基团，如-OH或-C1的化合物，该化合物能与式(10)化合物的氨基偶联。本领域专业技术人员很容易获得这类氨基保护的丙氨酸。
反应方案A的步骤2中描绘的偶联反应包括肽合成中常进行的反应，因此可使用肽合成中使用的合成方法。这类方法详述于反应方案1的步骤1中。
反应方案A的步骤3描绘了式(11)化合物脱保护，得到式(12)化合物。这类氨基保护基的脱保护是本领域公知的。
反应方案A的步骤4描绘了式(13)的适宜化合物，(CH3)2CH-CHOH-C(O)A1和式(12)化合物的得到式I化合物的偶联反应。式(13)的S-异构体化合物有市售或者是本领域，包括1997年12月22日提交的PCT申请PCT/US 97/22986中公知的。步骤3中描绘的偶联反应使用式(13)的酸(其中A1是-OH的化合物)或由其得到的酰卤(其中A1是-C1或-Br的化合物)，以类似于反应方案1的步骤1中教导的方式进行。
制备式I化合物的另一种方法描绘于反应方案A的步骤5中，该步骤显示了式(10)的适宜的化合物与式(14)的适宜化合物，(CH3)2CH-CHOH-C(O)-NH-CHCH3-C(O)A2的直接得到式I化合物的偶联反应。式(10)的适宜化合物如步骤2中所描述。式(14)的适宜化合物是其中立体化学如式I终产物中所需的化合物。
如上所述，式(14)化合物很容易通过偶联羧基保护的氨基酸，H2N-CHCH3-C(O)OPg1与式(13)的化合物来制备。这类偶联反应也是本领域公知的，其获得产物在脱保护后，得到式(14)化合物。
式I化合物可通过多种技术，包括结晶进行分离和纯化。可使用溶液结晶和成浆技术。尤其是，本发明化合物可通过在各种无水和含水溶剂中结晶来制备。适宜的溶剂包括含水或不含水的丙酮、低级醇(如甲醇、乙醇和异丙醇)、乙酸和乙腈；以及乙酸乙酯，乙醚和甲基叔丁基醚。实践中，发现含水丙酮是优选的。对于给定的含水溶剂，使用的水量取决于(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮在溶剂中的相对溶解度(与水相比的)以及使用结晶或成浆技术。
结晶通常如下进行：将(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮溶于含水溶剂中，然后使该溶液冷却，其中可加入或不加入更多的水，得到固体。结晶通常在约40℃至所选择含水溶剂的回流温度的起始温度下进行。然后冷却该混合物，以得到结晶二水合物。接种晶种也是有利的。优选使结晶溶液缓慢地冷却。最适宜将结晶溶液冷却到室温至约-20℃。
通过下列实施例和制剂例进一步举例说明本发明。这些实施例和制剂例仅是说明性的，而不是用于以任何方式来限制本发明。
除非另有指明，实施例和制剂例中使用的术语具有它们常规含义。例如“℃”是指摄氏度；“mmol”指毫摩尔；“g”指克；“mL”指毫升；“盐水”是指饱和的氯化钠水溶液；“THF”是指四氢呋喃；“HPLC”是指高压液相色谱，等等。
                         实施例1
1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的合成
往氢化钠(1.1eq)在15mL无水DMF中的浆状物中加入4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(0.0042摩尔)的DMF(10mL)溶液。然后加入碘甲烷(约2eq.)。当经TLC检测反应完全时，将反应混合物倾入冰中，用乙酸乙酯萃取。有机层用水洗涤，然后用盐水洗涤。有机层然后用无水硫酸钠干燥、过滤并加压浓缩。残余物经HPLC(LC2000)，用乙酸乙酯/己烷系统洗脱，得到3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。
将3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(1eq.)溶于THF并加入异戊腈(1.2eq.)。将该混合物在冰浴中冷却到0℃。滴加NaHMDS(1.1eq.，1M THF液)。搅拌1小时或者直至反应完全后，浓缩该混合物，然后用1N盐酸溶液酸化并用乙酸乙酯萃取。将有机部分干燥并浓缩，得到粗产物，经硅胶色谱纯化后，得到1-羟基亚氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮：质谱(M+H)+，205.1。
将1-羟基亚氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮溶于EtOH/NH3(20∶1)并使用阮内镍和氢(500psi/3447kPa)在100℃氢化10小时。将所得混合物过滤并浓缩，得到油状物，该油状物经硅胶色谱纯化，得到标题化合物。
                         实施例2
1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的合成
在室温下，往20L Morton烧瓶中加入MTBE(5.52L，7体积)和(N-甲基氨基)-乙醛缩二甲醇(614g，5mol)，形成溶液。将碳酸氢钠(546g，6.5mol)和水(6.31 L，8体积)制得的溶液加到该Morton反应烧瓶中。使混合物冷却至低于10℃并用1小时的时间，将苯乙酰氯(789g，5mol)的MTBE(789mL)溶液滴加到该冷却至低于10℃的反应混合物中。添加完毕后，将反应混合物在室温搅拌1小时。在该步骤进行的HPLC分析显示反应完全。用MTBE(4体积)进行萃取处理，无水硫酸镁干燥后，在旋转蒸发仪上浓缩，得到1.187kg(98％)N-甲基-N-(2，2-二甲氧基乙基)苯乙酰胺液体，(M+H)+＝237.9。在浓厚的氮气氛下，往5L Morton烧瓶中加入H2SO4(1.42L)并将N-甲基-N-(2，2-二甲氧基乙基)苯乙酰胺(712g，3mol)滴加到该反应烧瓶中，该滴加产生放热(22至78℃)。所得反应物在110℃加热3小时后，冷却到室温并转移到20L Morton烧瓶中。在低于10℃下，用氢氧化钠水溶液(9.18L，5N)处理反应混合物。用乙酸乙酯萃取(2×2.85L)，用硫酸钠干燥后，浓缩，得到520g(73.5％)3-甲基-6，7-二氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的固体。为提高纯度，该产物可在MTBE中重结晶，得到固体，mp＝81-82℃；(M+H)+＝174.2。
将3-甲基-6，7-二氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(113.8g，0.657mol)的THF(0.5L)溶液冷却到0℃并滴加异戊腈(100.75g，0.86mol)。以使温度保持低于10℃的速率，往所得混合物中加入LiHMDS(1NTHF溶液，854mL，0.854mol)。添加完毕后，使反应在室温下搅拌2-3小时，同时通过HPLC检测反应进程。一旦反应完全，将混合物冷却到0℃，并用HCl水溶液(2N)将pH从12调至2-3。将所得沉淀搅拌12-16小时后，过滤分离并干燥，得到86.3g(64.9％)1-羟基亚氨基-3-甲基-6，7-二氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮；mp＝225-226℃；(M+H)+＝203.0。
将1-羟基亚氨基-3-甲基-6，7-二氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(35g，0.173mol)的乙醇(525mL)溶液与披钯碳(10％，3.5g)的稀盐酸(浓水溶液，17.5g在17mL水中)的浆状物一起加到高压釜中。将所得混合物在50℃和250psi(1723kPa)下氢化，直至反应完全。用乙醇作为溶剂，将反应混合物滤过硅藻土(Celite)滤垫，将滤液浓缩至90mL。将水(350mL)加到该浓缩物中，将所得溶液进一步浓缩至约200mL。将二氯甲烷(350mL)加到该水溶液中，然后用氢氧化钠水溶液(1N)将pH调至11-11.5。分离有机部分，含水部分用二氯甲烷(175mL)萃取。将合并的萃取液浓缩为残余物，该残余物经放置结晶，得到标题化合物：mp＝69-81℃；(M+H)+＝191.0。
                         实施例3
1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3苯并氮杂-2-酮的合成
往22L Morton烧瓶中加入二氯甲烷(4.73L，8体积)、N-甲基苯乙胺(591g，4.33mol)和碳酸氢钠水溶液(436.7g，5.2mol在4.73L水中的溶液)。将该混合物冷却到5℃以下并用70分钟时间往该冷却的反应混合物中滴加氯乙酰氯(513.7g，4.55mol)的二氯甲烷(887mL)溶液。添加完毕后，HPLC分析显示反应完全。分离两层，水层用二氯甲烷萃取。合并的有机层经无水硫酸镁干燥并在旋转蒸发仪上浓缩，得到915.7g(99.8％)N-甲基-N-(2-苯基乙基)-1-氯乙酰胺：(M+H)＝212.1。
在氮气氛下，往12L烧瓶中加入N-甲基-N-(2-苯乙基)-1-氯乙酰胺(883.3g，4.17mol)和邻二氯苯(6.18L)。加入氯化铝(1319g，10.13mol)，这引起放热(22至50℃)。然后将所得反应物加热至165℃2.5小时，然后经约14小时冷却到室温。将反应混合物冷却到约0℃，并且为保持放热至约40℃，将其分四次加到冷水(8.86L，约5℃)中。分离各层，水层用二氯甲烷(7.07L)萃取并分离各层。将有机层合并并用盐酸水溶液(8.83L，1N)萃取，然后用饱和碳酸氢钠水溶液(7.07L)萃取，经硫酸镁干燥，与硅胶(883g)合并并施于硅胶柱(3.53kg，以二氯甲烷中的浆状物填充到烧结的玻璃漏斗中)。该柱用二氯甲烷洗脱，直至收集到25L，然后用乙酸乙酯洗脱，得到产物。将含产物的流分蒸发，得到3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮，为棕褐色固体，608g(83％)。
在氮气氛下，在22L烧瓶中加入3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(606g，3.46mol)和异戊腈(543g，4.5mol)在THF(7.88L)中的混合物。该混合物冷却到约0℃后，以使温度保持低于7℃的速率加入LiHMDS(1N THF溶液，4.5L，04.5mol)。添加完毕后，使反应在室温搅拌约2小时，同时经HPLC检测反应进程。一旦反应完全，将混合物冷却到约0℃，并用HCl水溶液(2N)将pH从12调至约2-1。将所得沉淀搅拌约6小时后，过滤分离并干燥，得到1-羟基亚氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮，604.7g(85.6％)。
1-羟基亚氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(625g，3.06mol)和3A乙醇(15.6L)。在剧烈搅拌下，将所得混合物在50℃和250psi(1723kPa)下氢化直至反应完全(约4小时)。用乙醇作为溶剂，将反应混合物滤过硅藻土滤垫，浓缩滤液，得到固体。该固体用二氯甲烷(6L)处理，并加入1N氢氧化钠水溶液，直至水层的pH为11-11.5。搅拌混合物，分离各层，水层用二氯甲烷(2L)萃取。有机层经硫酸镁干燥，过滤并在旋转蒸发仪中蒸发，得到标题化合物477g(81.9％)。
                     实施例4
(s)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的合成
将1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(1.544g，8.12mmol)在15mL甲醇中微微加热，形成溶液。在另一个烧瓶中，将二-对-甲苯甲酰-L-酒石酸(3.12g，8.08mmol)溶于15mL甲醇并通过移液管加到温热的胺溶液中。加热该混合物，产生固体沉淀。加入另外30mL甲醇，得到溶液，将该溶液回流30-40分钟，然后缓慢地冷却到环境温度，得到固体。搅拌约18小时后，过滤收集固体并用少量冷甲醇冲洗，得到2.24g(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮二-对-甲苯甲酰-L-酒石酸盐(96％产率，94.7％ee)。
(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮二-对-甲苯甲酰-1-酒石酸盐(11.83g，20.5mmol)溶于45mL 1.0N氢氧化钠水溶液中并用二氯甲烷(3×25mL)萃取。合并的二氯甲烷层用35mL 1.0N氢氧化钠水溶液洗涤，然后用盐水溶液洗涤，并经无水硫酸镁干燥。真空除去溶剂，得到无色油状的标题化合物(3.38g)(87％产率，93.2％ee)。
                         实施例5
(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的合成
将1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(6.0g，31.5mmol)在75mL甲醇中微微加热，形成溶液，并与二-对-甲苯甲酰-1-酒石酸(12.2g，31.5mmol)在75mL温热甲醇中的溶液合并。对该溶液接种晶种，形成固体。加入另外100mL甲醇并搅拌该混合物。搅拌约18小时后，过滤收集固体并用少量冷甲醇冲洗，得到6.7g固体。将该固体与甲醇(200mL)合并并搅拌。18小时后，收集该固体，得到(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮二-对-甲苯甲酰-L-酒石酸盐(4.4g)。通过实施例4中所述方法分离碱，得到标题化合物(96％ee)。
                     实施例6
(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的合成
在22L容器中，在氮气氛下，加热1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(438g，2.3mol)(约40℃)，得到甲醇溶液(4.38mL)。在另一个烧瓶中，将二-对-甲苯甲酰-L-酒石酸(889.7g，2.3mol)溶于4.38L甲醇并加热至约40℃，然后加入1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的溶液。继续加热并加入另外6.13L甲醇，然后将该混合物回流约45分钟，然后使其缓慢冷却到环境温度，得到固体。搅拌约18小时后，过滤收集固体，并用少量母液冲洗，空气干燥后，用约2L乙酸乙酯，得到561.6g(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮二-对-甲苯甲酰-L-酒石酸盐。合并(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮二-对-甲苯甲酰-L-酒石酸盐、二氯甲烷(6.57L)和1N氢氧化钠水溶液(6.57L)并搅拌。分离各层，有机层用1N氢氧化钠水溶液萃取两次(3.28L)、盐水萃取一次(2.46L)，然后经硫酸镁干燥、过滤并在旋转蒸发仪上蒸发，得到标题化合物250g(57.4％，94.1％ee)。
                         实施例7
(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮
                       盐酸盐的合成
将1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(31.9g，168mmol)在约300mL乙酸异丙酯中制成浆状物并加热至45℃。在一个单独的烧瓶中，在约130mL异丙醇中加热(R)-(-)-D-扁桃酸(25.0g，164mmol)直至形成溶液，并将其加到上面得到的1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮/乙酸异丙酯浆状物中，得到溶液，该溶液中快速形成沉淀。将该混合物在45℃下加热约3小时。将5-硝基水杨酸(2-羟基-5-硝基苯甲醛)(1.40g，8.38mmol，5mol％)加到该温热溶液中并在45℃搅拌该混合物。约14小时后，使该浆状物冷却到环境温度并搅拌2小时，然后过滤收集固体并用70mL冷的乙酸异丙酯冲洗，在40℃真空烤箱中干燥，得到46.62g(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(R)-扁桃酸盐(82.9％产率，98.4％ee)。
在环境温度，将(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(R)-扁桃酸盐(2.42g，7.06mmol，98.4％ee)在25mL乙酸乙酯中制成浆状物。加入浓盐酸水溶液(1.1mL，约11.2mmol)并将该混合物加热到50℃并剧烈搅拌3.5小时。使该浆状物冷却到环境温度，过滤并用甲基叔丁基醚(约10mL)冲洗，得到1.48g标题化合物(92.5％产率，97.9％ee)。
                             实施例8
(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-氨基-3-甲 基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的合成
在氮气氛下，在园底烧瓶中装入N-t-Boc-L-丙氨酸(1.0eq.)、羟基苯并三唑水合物(约1.1eq.)和(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(1.0eq.)的THF溶液。将Hunig碱(N，N-二异丙基乙基胺，1.1eq.)加到充分搅拌的该混合物中，然后加入EDC(1.1eq.)。在环境温度搅拌4-17小时后，减压除去溶剂，将残余物加到乙酸乙酯和水中，用饱和碳酸氢钠水溶液、1N盐酸水溶液、盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压除去溶剂，得到1-(N-t-Boc-1-丙氨酰基)氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮：质谱(M+H)+，362.3。
往在NZ下、在冰浴中冷却到约10℃的搅拌下的1-(N-t-Boc-1-丙氨酰基)氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮在1，4-二噁烷(0.03-0.09M)中的溶液中通入无水氯化氢气10-15分钟。将该溶液加盖，移走冷却浴，使溶液温热到环境温度并搅拌2-8小时，经TLC检测原料的消耗(1.0)。浓缩溶液，得到1-(L-丙氨酰基)-(S)-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮，该产物无需进一步纯化，即可使用。
在氮气氛下，形成1-(L-丙氨酰基)-(S)-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-3-甲基-2H-3-苯并氮杂-2-酮(1.0eq.)、羟基苯并三唑水合物(1.1eq.)和(S)-2-羟基-3-甲基-丁酸(1.0eq.)在THF中的混合物。将Hunig碱(N，N-二异丙基乙基胺，1.1eq.)加到充分搅拌的该混合物中，然后加入EDC(1.1eq.)。在环境温度搅拌4-17小时后，减压除去溶剂，残余物加到乙酸乙酯(或类似溶剂)和水中，用饱和碳酸氢钠水溶液、1N HCl、盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压除去溶剂，得到标题化合物。
                         实施例9
(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-氨基-3-甲 基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的合成
在氮气氛下，在园底烧瓶中加入N-t-Boc-L-丙氨酸(249.5g，1.32mol)、羟基苯并三唑水合物(232.2g，1.52mol)和(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(250.8g，1.32mol)的THF(3.76L)液。将该混合物冷却到5℃以下，然后加入Hunig碱(N，N-二异丙基乙基胺，188.4g，1.45mol)，再加入EDC(283.7g，1.45mol)。搅拌6小时后，将该反应混合物温热到环境温度并搅拌约14小时。减压除去溶剂，残余物加到乙酸乙酯(3.76L)和水(1.76L)中，分离各层，有机层用水(1.76L)萃取，将水层合并并用乙酸乙酯(1.76L)萃取。合并有机层，用饱和碳酸氢钠水溶液萃取(1.76L)，经无水硫酸钠干燥、过滤并在旋转蒸发仪上蒸发，得到1-(N-t-Boc-L-丙氨酰基)氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮，463g(97.2％)。
使用表面下分散管，将无水HCl气体通入冷却到约0℃的乙酸乙酯(1.76L)中制备HCl的乙酸乙酯溶液。将上面制得的HCl的乙酸乙酯溶液加到剧烈搅拌的1-(N-t-Boc-L-丙氨酰基)氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮(462g，1.28mol)的乙酸乙酯(3.7L)中的浆状物中。加入另外的乙酸乙酯(1L)并使该反应混合物温热到室温并搅拌22小时。过滤反应混合物，得到固体。该固体用乙腈(5L)制成浆状物，加热至回流后，冷却到约60℃，然后过滤并干燥，得到1-(L-丙氨酰基)-(S)-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮，389.8g(94.7％)。
在氮气氛下，在THF(4.8L)中混合1-(L-丙氨酰基)-(S)-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-3-甲基-2H-3-苯并氮杂-2-酮(369.5g，1.18mol)、羟基苯并三唑水合物(207.6g，1.36mol)、Hunig碱(N，N-二异丙基乙基胺，352.2g，2.71mol)和(S)-2-羟基-3-甲基-丁酸(140.6g，1.18mol)并将其冷却到5℃以下。加入EDC(253.7g，1.3mol)，使该反应混合物温热到环境温度并搅拌。约25小时后，该反应混合物用二氯甲烷(5.54L)稀释并用水(2.22L)萃取。有机层用水(2.22L)萃取，水层合并并用二氯甲烷(5.54L)萃取。合并有机层，用水萃取两次(2.22L)，用饱和碳酸氢钠水溶液萃取(2.22L)，经无水硫酸钠干燥，过滤并在旋转蒸发仪上蒸发，得到428g固体(100％)。将该固体加到含丙酮(3.42L)和水(0.856L)的溶剂混合物中并微微温热(40℃)。将该溶液分为～2L的份，往每份中加入水(7.19L)，同时将该浑浊溶液温热至50℃。加完水后，使该浑浊溶液冷却到环境温度，得到固体，将其以浆状物形式在环境温度下搅拌约14小时，然后过滤并干燥，得到二水合物形式的标题化合物，310.6g(66.2％)。
当作为药物使用时，本发明化合物通常以药物组合物形式使用。因此，在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物，该组合物包含有效量的N-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮和可药用稀释剂。这类组合物用于抑制β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成，包括治疗阿尔茨海默氏病。因此，本发明包括N-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮用于制备抑制β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成，尤其包括治疗阿尔茨海默氏病的药物的用途。
(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮可以通过各种途径给药。本发明化合物可以以使所述化合物以有效量为生物利用的任何形式或模式给药，包括口服和非胃肠途径。例如，本发明化合物可以通过口服、吸入、皮下、肌内、静脉内、经皮、鼻内、直肠、眼、局部、舌下、颊等途径给药。
在制备本发明组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，通过用赋形剂稀释或包封在这类载体中，所述载体可以呈胶囊、扁囊、纸袋或其它容器形式。本发明化合物可以单独或者以药物组合物形式给药，所述药物组合物即是与可药用稀释剂，如载体或赋形剂混合的形式，它们的比例与性质由本发明化合物的溶解度和化学性质、选择的给药途径和标准的药学实践来决定。(Remington′s PharmaceuticalSciences，18th Edition，Mack Publishing Co.(1990))。
本发明药物组合物以药物领域公知的方式制备。载体或赋形剂可以是固体、半固体或液体物质，它们可以用作活性成分的载体或介质。适宜的载体或赋形剂是本领域公知的。药物组合物可适于口服、吸入、非胃肠或局部使用，并且可以以片剂、胶囊、气溶胶、吸入剂、栓剂、溶液、悬浮剂等形式对患者给药。
对于口服治疗给药目的，可以将化合物与赋形剂掺混并以片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂(wafers)、口嚼胶(chewing gums)等形式使用。这些制剂应包含至少4％的本发明化合物，但活性成分的量可以根据具体形式发生变化，其含量通常为单位制剂重量的2％至约90％。存在于组合物中的化合物的量是可获得适合剂量的量。本发明优选的组合物和制剂可由本领域技术人员确定。
片剂、丸剂、胶囊、锭剂等还可包含一种或多种下列辅料：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如藻酸、Primogel、玉米淀粉等；润滑剂，如硬脂酸镁、硅油或Sterotex；助流剂，如胶态二氧化硅；并可加入甜味剂，如蔗糖或糖精；或者矫味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙子香精。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的辅料外，它还可包含液体载体，如聚乙二醇或脂肪油。
其它剂量单位形式可包含调整剂量单位物理形式的其它各类材料，如包衣材料。因此，片剂或丸剂可用糖、虫胶或其它包衣剂包衣。除本发明化合物外，糖浆可包含作为甜味剂的蔗糖以及某些防腐剂、染料和着色剂和矫味剂。用于制备这些各类组合物的材料应是药学纯的并且在使用量下是无毒的。
对于非胃肠给药目的，可将本发明化合物掺入溶液或悬浮液中。这些制剂通常包含占其重量至少0.1％的本发明化合物，但该量也可在在0.1至约90％的范围内变化。存在于这类组合物中的本发明化合物的量应是可获得适宜剂量的量。溶液或悬浮液还可包含一种或多种下列辅料：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调整渗透压的物质，如氯化钠或葡萄糖。可将非胃肠制剂密封在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多次给药的小瓶中。优选的组合物和制剂可由本领域技术人员确定。
本发明化合物也可经局部给药，此时载体可适宜地包括溶液、软膏或凝胶基质。基质，例如可包含一种或多种下列物质：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂，如水和乙醇，以及乳化剂和稳定剂。局部用制剂可包含约0.1-10％w/v(每体积的重量)浓度的式I化合物或其可药用盐。
本发明的另一个优选的制剂使用透皮给药装置(“贴剂”)。这类透皮贴剂可用于连续或间断的输送受控量的本发明化合物。用于递送药物的透皮贴剂的结构和应用是本领域公知的。参见，例如1991年6月11日发布的美国专利5,023,252，在此通过引用并入该专利。可构建这类贴剂用于连续、脉动或根据需要释放药物。
为更全面地说明本发明的实施，下面描述代表性的药物组合物。下列实施例仅是说明性的，并非用于以任何方式限制本发明的范围。
                    制剂实施例1
制备包含下列成分的硬明胶胶囊：
成分                        量(mg/胶囊)
活性成分                     30.0
淀粉                         305.0
硬脂酸镁                     5.0
将上述成分混合并以340mg的量填充到硬明胶胶囊中。
                    制剂实施例2
使用下列组分制备片剂：
组分                        量(mg/片)
活性成分                     25.0
纤维素，微晶的               200.0
胶态二氧化硅                 10.0
硬脂酸                       5.0
将各组分混合并压缩成片，每片重240mg。
                        制剂实施例3
制备包含下列组分的干粉吸入剂：
成分                           重量％
活性成分                        5
乳糖                            95
将活性成分与乳糖混合并将该混合物加到干粉吸入装置中。
                        制剂实施例4
如下制备每片含30mg活性成分的片剂：
组分                           量(mg/片)
活性成分                        30.0mg
淀粉                            45.0mg
微晶纤维素                      35.0mg
聚乙烯吡咯烷酮
(10％无菌水溶液)                4.0mg
羧甲基淀粉钠                    4.5mg
硬脂酸镁                        0.5mg
滑石                            1.0mg
总计                            120mg
将活性成分、淀粉和纤维素通过20目美国筛并充分混合。将聚乙烯吡咯烷酮的溶液与所得粉末混合，然后使其通过16目美国筛。将如此制得的颗粒在50-60℃干燥并通过16目美国筛。然后往该颗粒中加入预先筛过30目美国筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石，混合之后在压片机上压片，得到每片重150mg的片剂。
                        制剂实施例5
如下制备每枚胶囊包含40mg药物的胶囊：
组分                            量(mg/胶囊)
活性成分                         40.0mg
淀粉                             109.0mg
硬脂酸镁                         1.0mg
总计                             150.0mg
将通过20目美国筛的活性成分、淀粉和硬脂酸镁混合并以150mg的量填充到硬明胶胶囊中。
                        制剂实施例6
如下制备每枚含25mg活性成分的栓剂：
成分                            量
活性成分                        25mg
饱和脂肪酸甘油酯  加至          2,000mg
将活性成分筛过60目美国筛并悬浮于使用需要的最低热量预先熔融的饱和脂肪酸甘油酯中。然后将该混合物倾入名义上2.0g容量的栓剂模具中并使其冷却。
                        制剂实施例7
如下制备每5ml剂量含50mg药物的悬浮剂：
成分                             量
活性成分                         50.0mg
黄原胶                           4.0mg
羧甲基纤维素钠(11％)
微晶纤维素(89％)                 50.0mg
蔗糖                             1.75g
苯甲酸钠                         10.0mg
矫味剂和色素                     适量
净化水            加至           5.0ml
混合活性成分、蔗糖和黄原胶，使其通过10目美国筛，然后与预先制备的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的水溶液混合。用适量水稀释苯甲酸钠、矫味剂和色素并在搅拌下加入。然后加入足量水以产生所需体积。
                        制剂实施例8
如下制备每枚包含15mg药物的胶囊：
组分                           量(mg/胶囊)
活性成分                       15.0mg
淀粉                            407.0mg
硬脂酸镁                        3.0mg
总计                            425.0mg
混合活性成分、淀粉和硬脂酸镁，使其通过20目美国筛，并以560mg的量填充到硬明胶胶囊中。
                        制剂实施例9
如下制备皮下给药制剂：
成分                            量
活性成分                        1.0mg
玉米油                          1ml
根据活性成分在玉米油中的溶解度，在该制剂中可使用多达约5.0mg或更多的活性成分(如果需要)。
                        制剂实施例10
如下制备局部用制剂：
成分                            量
活性成分                        1-10g
乳化蜡                          30g
液体石蜡                        20g
白软石蜡         加至           100g
将白软石蜡加热至熔化。掺入液体石蜡和乳化蜡并搅拌直至溶解。加入活性成分并继续搅拌，直至活性成分分散。然后使该混合物冷却至固化。
在其方法的一个方面，本发明涉及抑制β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成的方法，该方法包括给需此抑制的患者施用有效量的N-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。在一个特定方法的实施方案中，本发明提供治疗阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括给需此治疗的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。
还认识到，本领域专业技术人员通过治疗目前患阿尔茨海默氏病的患者或者预防性地治疗处在发展为该病的危险境地的患者可以影响阿尔茨海默氏病。因此术语“治疗”用于指其中可减缓、干预、抑制、控制或阻断阿尔茨海默氏病的进程的，而不必表示所有症状全部消除。如此，本发明方法包括预防处于发展为阿尔茨海默氏病的危险境地的患者的阿尔茨海默氏病的发作、抑制阿尔茨海默氏病的进程以及治疗晚期阿尔茨海默氏病。
本文中使用的术语“患者”是指患有与β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成增多有关的病症，包括阿尔茨海默氏病的温血动物，如哺乳动物。应该清楚，豚鼠、狗、猫、大鼠、小鼠、马、牛、羊和人均是该术语含义范围内的动物的实例。有此治疗需求的患者很容易被诊断。
本文使用的术语式I化合物的“有效量”是指抑制β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成，特别是治疗阿尔茨海默氏病有效的量。
有效量可容易地由作为本领域技术人员的主治诊断医生采用常规技术并观察在类似情况下获得的结果来确定。在N-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的有效量、剂量的确定中，主治诊断医生应考虑多种因素，包括、但不限于：N-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的效价和特性；患者的种类；其体形、年龄和一般健康状况；疾病涉及的程度和严重程度；个体患者的反应；给药方式；给药制剂的生物利用度特性；选择的剂量方案；其它伴随药物的使用；以及其它相关情况。
N-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的有效量预期为约0.1毫克/千克体重/天(mg/kg/天)至约100mg/kg/天。由本领域技术人员可确定优选的量。
N-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮无水物的量预期为约0.1毫克/千克体重/天(mg/kg/天)至约100mg/kg/天。由本领域技术人员可确定优选的量。
在包括下列的各种生物体系中试验本发明的N-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮的无水物。
                        实施例A
    检测β-淀粉状蛋白产生的抑制剂的细胞筛选
在具有Swedish突变的细胞系中测定上面多种式I化合物抑制β-淀粉状蛋白产生的能力。该筛选测定使用细胞(K293＝人肾细胞系)，该细胞是以国际专利申请94/105698和Citron等人12中描述的方式，用包含Lys651Met652突变为Ash651Leu652(APP751编号)的双重突变的淀粉状蛋白前体蛋白751(APP751)的基因稳定转染的。这种突变常被称为Swedish突变，将称为“293 751 SWE”的细胞在补加10％胎牛血清的Dulbecco最低基本培养基(Sigma，St.Louis，MO)中以2-4×104个细胞/孔的密度涂铺于Corning 96孔培养板上。为获得测定线性范围内的β-淀粉状蛋白的ELISA结果(-0.2-2.5ng/mL)，细胞数是重要的。
在37℃下，在用10％二氧化碳平衡的培养箱中培养过夜后，取出培养基，并且每孔用200μL含式I化合物(药物)的培养基置换进行2小时的预处理并如上培养细胞。用100％二甲基亚砜制备药物储备液，使得处理中使用的最终药物浓度，二甲基亚砜浓度不超过0.5％，而实际上，一般等于0.1％。
在预处理结束时，再次取出培养基，并用如上的新鲜的包含药物的培养基置换，并将细胞再培养2小时。处理后，将培养板在BeckmanGPR中以1200rpm转速在室温下离心5分钟，以沉淀条件培养基中的细胞碎片。如国际专利申请WO 94/105698中所述，将每孔中100μL的条件培养基或其适宜的稀释液转移到预先包被抗β-淀粉状蛋白肽的13-28氨基酸的抗体266[P.Seubert，Nature(1992)359：325-327]的ELISA培养板上并在4℃下贮藏过夜。第二天，使用标记的抗β-淀粉状蛋白肽的1-5氨基酸的抗体3D6[P.Seubert，Nature(1992)359：325-327]进行ELISA测定，以测定产生的β-淀粉状蛋白肽的量。
通过改进的Hansen等人的方法测定化合物的细胞毒性作用。往组织培养板中残留的细胞中加入25μL 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)(Sigma，St.Louis，MO)储备溶液(5mg/mL)，至终浓度为1mg/mL。将细胞在37℃保温1小时，通过加入等体积的MTT溶解缓冲液(20％w/v十二烷基硫酸钠在50％二甲基甲酰胺中的溶液，pH 4.7)阻断细胞活性。在室温下振摇过夜进行完全萃取。在Molecular Device的UVmax微量培养板阅读器上测定作为细胞存活指示剂的OD562nm和OD650nm的差异。
将β-淀粉状蛋白肽ELISA的结果与标准曲线拟合并以ng/mL β-淀粉状蛋白肽表示。为规一化细胞毒性，将这些结果除以MTT结果并以相对于不含药物的对照的百分数表示。所有结果均是至少6次重复测定的平均值和标准偏差。
                            实施例B
            β-淀粉状蛋白的释放和/或合成的体内抑制
该实施例举例说明如何测试本发明化合物体内抑制β-淀粉状蛋白的释放和/或合成。对于这些实验，使用3-4月龄的PDAPP小鼠[Games等人，(1995)Nature 373：523-527]。根据测试的化合物，通常以1-10mg/mL的浓度配制化合物。由于化合物的低溶解性因素，它们可使用不同的载体进行配制，如使用玉米油(Safeway，South SanFrancisco，CA)；10％乙醇的玉米油溶液；2-羟基丙基-β-环糊精(Research Biochemicals International，Natick MA)和羧甲基纤维素(Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)。
用26号枕头对小鼠进行皮下给药，3小时后，通过CO2麻醉对动物施行安乐死，使用以0.5M EDTA(pH8.0)涂敷的1cc 25G5/8″结核菌素注射器/针头通过心脏穿刺取血。将血液放入包含EDTA的Becton Dickinson vacutainer管中并在5℃以1500xg离心15分钟。然后取出小鼠的大脑，切下皮层和海马并置于冰上。
1.脑组织测定
为制备用于酶联免疫吸附测定(ELISAs)的海马和皮层组织，使用Kontes电动乳钵(Fisher，Pittsburgh PA)将各大脑区域在10体积冰冷的胍缓冲液(5.0M胍-HCl，50mM Tris-HCl，pH8.0)中匀浆化。在室温下，使匀浆物轻轻在旋转平台上摇动3-4小时，然后贮藏在-20℃直至进行定量分析β-淀粉状蛋白。
大脑匀浆物用冰冷的酪蛋白缓冲液[0.25％酪蛋白，磷酸盐缓冲的盐水(PBS)，0.05％叠氮化钠，20μl/ml抑酶肽，5mM EDTA，pH8.0，10μg/ml亮肽素]进行1∶10稀释，有此使胍的最终浓度降至0.5M，然后在4℃下以16,000xg离心20分钟。为获得ELISA测定的最佳范围，如果需要，加入其中加有0.5M盐酸胍的酪蛋白缓冲液进一步稀释样品。制备β-淀粉状蛋白标准品(1-40或1-42氨基酸)，以使0.1％牛血清白蛋白(BSA)存在下的最终组成为0.5M胍。
测定β-淀粉状蛋白(aa1-40)和β-淀粉状蛋白(aa1-42)的整个β-淀粉状蛋白夹层ELISA由针对β-淀粉状蛋白的两种单克隆抗体(mAb)组成。捕获抗体266[P.Seubert，Nature(1992)359：325-327]对β-淀粉状蛋白的13-28氨基酸具有特异性。对β-淀粉状蛋白的1-5氨基酸具有特异性的抗体3D6[Johnson-Wood等人，PNAS USA(1997)94：1550-1555]被生物素化并且在该测定中被用作报道抗体。3D6生物素化方法使用制造商(Pierce，Rockford IL)的NHS-生物素标记免疫球蛋白的方法，不同的是使用100mM碳酸氢钠，pH8.5的缓冲液。3D6抗体不识别分泌的淀粉状蛋白前体蛋白(APP)或全长的APP，但仅检测具有氨基末端的天冬氨酸的β-淀粉状蛋白。该检测的敏感性低限为～50pg/ml(11pM)并且对浓度高达1ng/ml的内源性鼠β-淀粉状蛋白肽不表现出交叉反应性。
定量测定β-淀粉状蛋白(aa1-42)的夹层ELISA构造使用mAb21F12[Johnson-Wood等人，PNAS USA(1997)94：1550-1555](其识别β-淀粉状蛋白的33-42氨基酸)作为捕获抗体。在该测定中，生物素化的3D6也是报道抗体，其敏感性低限为～125pg/ml(28pM)。
在室温下，以10μg/ml用266和21F12捕获mAbs过夜包被96孔免疫测定培养板(Costar，Cambidge MA)。对该板吸气并在室温下用0.25％人血清白蛋白的PBS缓冲液阻断至少1小时，然后贮藏在4℃直至使用。使用前，该板用洗涤缓冲液(Tris-缓冲的盐水，0.05％Tween20)重新水合。将样品和标准品加到该培养板中并在4℃保温过夜。在测定的每一步骤之间，该板用洗涤缓冲液洗涤3次。将用酪蛋白培养缓冲液(0.25％酪蛋白，PBS，0.05％Tween 20，pH7.4)稀释到0.5μg/ml的生物素化的3D6加到孔中，在室温下保持1小时。将用酪蛋白培养缓冲液1∶4000稀释的Avidin-HRP(Vector，Burlingame CA)加到孔中，在室温保持1小时。加入呈色底物，Slow TMB-ELISA(Pierce，Cambridge MA)并使其反应15分钟，之后加入2N H2SO4阻止酶反应。使用Molecular Devices Vmax(Molecular Devices，MenloPark CA)测定在450nm和650nm处的吸收差异来定量反应产物。
2.血液测定
EDTA血浆用样品稀释液(0.2gm/l磷酸二氢钠·H2O，2.16gm/l磷酸氢二钠·7H2O，0.5gm/l硫柳汞，8.5gm/l氯化钠，0.5ml TritonX-405，6.0g/l不含球蛋白的牛血清白蛋白；和水)进行1∶1稀释。使用上述脑组织测定中β-淀粉状蛋白总量的测定方法(266捕获剂/3D6报道分子)测定样品稀释液中的样品和标准品，不同的是使用样品稀释液代替所述的酪蛋白稀释液。
由前面的描述，本领域技术人员可对组合物和方法进行各种修饰和改变。所有落入所附权利要求书范围内的这类修饰均应包括在本发明中。

Claims (13)

1.化合物(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。
2.一种药物组合物，它包含(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮和可药用稀释剂。
3.一种抑制β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成的方法，该方法包括给需此抑制的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。
4.一种治疗阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括给需此治疗的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。
5.一种预防阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括给有此需要的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。
6.一种抑制阿尔茨海默氏病发展的方法，该方法包括给有此需要的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮。
7.作为药用的权利要求1的化合物。
8.用于治疗阿尔茨海默氏病的权利要求1的化合物。
9.用于预防阿尔茨海默氏病的权利要求1的化合物。
10.用于抑制β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成的权利要求1的化合物。
11.用于抑制阿尔茨海默氏病发展的权利要求1的化合物。
12.权利要求1的化合物用于制备抑制β-淀粉状蛋白肽的释放和/或其合成，包括治疗阿尔茨海默氏病的药物的用途。
13.权利要求1的化合物用于制备预防阿尔茨海默氏病和/或抑制阿尔茨海默氏病的发展的药物的用途。
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