PL212199B1 - Związek N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on oraz kompozycja zawierająca ten związek - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest związek N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten związek.

Niektóre laktamy, które hamują uwalnianie i/lub syntezę peptydu β-amyloidu i zgodnie z tym, są przydatne do leczenia choroby Alzheimera, opisano w zgłoszeniu PCT nr PCT/US97/22986.

Związek według wynalazku umożliwia hamowanie uwalniania i/lub syntezy peptydu β-amyloidu i zgodnie z tym, jest przydatny w leczeniu choroby Alzheimera i wykazuje korzystną skuteczność i bezpieczeństwo.

Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze 1, N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on:

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca wymieniony powyżej związek oraz farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik.

Stosowane w niniejszym opisie terminy mają następujące znaczenia:

Termin „ee lub „nadmiar enancjomeryczny odnosi się do procentu, w którym jeden enancjomer występuje w nadmiarze w mieszaninie obu enancjomerów (E1 + E2), co obliczono według równania ((E1-E2) + (E1+E2)) x 100% = ee. Fachowcy w dziedzinie wiedzą, że nadmiar enancjomeryczny można określić metodą kapilarnej elektroforezy i chiralnej HPLC związków lub ich pochodnych.

W celu określenia specyficznych izomerów stosuje się oznaczenia (R)- i (S)- według Cahna-Preloga-Ingolda oraz oznaczenia L- i D- dla stereochemii w stosunku do izomerów aldehydu glicerynowego.

Związek według wynalazku można wytworzyć sposobem opisanym poniżej. Na poniższych schematach, wszystkie podstawniki, jeśli nie wskazano tego inaczej, określono uprzednio, a wszystkie reagenty są dobrze znane w dziedzinie.

Schemat 1

PL 212 199 B1

Na Schemacie 1, etap 1, N-metylofenetyloaminę o wzorze (1) acyluje się z zastosowaniem odpowiedniego reagenta przeniesienia bisalkoksykarbonylooctanu, z wytworzeniem związku o wzorze (2). N-metylofenetyloamina jest dostępna w handlu i można ją łatwo wytworzyć na drodze reakcji 2-bromo lub 2-chloroetylobenzenu, w warunkach dobrze znanych w dziedzinie, z zastosowaniem metyloaminy. Odpowiednim reagentem przeniesienia bisalkoksykarbonylooctanu jest związek, w którym R4 oznacza C1-C4 alkil, który przenosi grupę bisalkoksykarbonyloacetylową do związku o wzorze (1), taki jak kwasy bisalkoksykarbonylooctowe i chlorki bis-alkoksykarbonyloacetylowe. (Patrz Ben-Ishai, Tetrahedron, 43, 439-450 (1987)).

Na przykład związek o wzorze (1) kontaktuje się z odpowiednim kwasem bisalkoksykarbonylooctowym z wytworzeniem związku o wzorze (2). Takie reakcje sprzęgania są znane w syntezie peptydu oraz mogą być stosowane opisane tutaj metody syntetyczne. Na przykład można stosować dobrze znane reagenty sprzęgające takie jak karbodiimidy, w celu ułatwienia acylowania z wprowadzeniem lub bez dobrze znanych dodatków takich jak N-hydroksysukcynoimid, 1-hydroksybenzotriazol itp. W takich reakcjach sprzęgania często stosuje się odpowiednią zasadę w celu usunięcia kwasu wytwarzanego podczas reakcji. Odpowiednie zasady obejmują przykładowo trietyloaminę, N,N-diizopropyloetyloaminę, N-metylomorfolinę itp. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w obojętnym aprotonowym polarnym rozcieńczalniku takim jak dimetyloformamid, chlorek metylenu, chloroform, acetonitryl, tetrahydrofuran itp. Na ogół reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od około 0°C do około 60°C i zazwyczaj wymaga ona czasu od około 1 do około 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (2) odzyskuje się stosując typowe metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Alternatywnie, na przykład związek o wzorze (1) kontaktuje się z odpowiednim chlorkiem bisalkoksykarbonyloacetylu z wytworzeniem związku o wzorze (2). Takie chlorki kwasowe można łatwo wytworzyć stosując odpowiednie kwasy, metodami dobrze znanymi w dziedzinie, przykładowo działając związkami takimi jak trichlorek fosforu, tlenochlorek fosforu, pentachlorek fosforu, chlorek tionylu lub chlorek oksalilu, z dodatkiem lub bez małej ilości dimetyloformamidu, w obojętnym rozpuszczalniku takim jak toluen, chlorek metylenu lub chloroform; w zakresie temperatur od około 0-80°C. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w okresie czasu od 1 godziny do 24 godzin. Chlorek kwasowy można wydzielić i oczyścić lub często można go stosować bezpośrednio tj. z zastosowaniem lub bez oddzielania i/lub oczyszczania. W takich reakcjach acylowania zazwyczaj stosuje się odpowiednią zasadę w celu usunięcia kwasu wytwarzanego podczas reakcji. Odpowiednie zasady obejmują przykładowo związki takie jak pirydyna, trietyloamina, N,N-diizopropyloetyloamina, N-metylomorfolina itp. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w obojętnym aprotonowym polarnym rozcieńczalniku takim jak chlorek metylenu, chloroform, tetrahydrofuran itp. Na ogół reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od około -20°C do około 80°C i zazwyczaj wymaga ona od około 1 do około 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (2) odzyskuje się stosują c typowe metody takie jak ekstrakcja, wytrą canie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Według Schematu 1, etapu 2, związek o wzorze (2) cyklizuje się z wytworzeniem związku o wzorze (3).

Na przykład związek o wzorze (2) kontaktuje się z kwasem, takim jak kwas metanosulfonowy lub kwas siarkowy. Reakcję zazwyczaj prowadzi się stosując wybrany kwas, jako rozpuszczalnik. Na ogół reagenty początkowo miesza się w zakresie temperatur od około -20°C do około 0°C i następnie pozostawia do ogrzania do temperatury od zbliżonej do temperatury otoczenia aż do około 60°C. Reakcja cyklizacji zazwyczaj wymaga od około 12 do około 72 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (2) odzyskuje się stosując typowe metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Według Schematu 1, etapu 3, związek o wzorze (3) odbezpiecza się z wytworzeniem związku o wzorze (4).

Usunięcie takich alkoksykarbonylowych grup zabezpieczających aminę jest dobrze znane w dziedzinie i zostało opisane na przykład w Protecting Groups in Organic Synthesis, Theodora Greene (wydanie 1 i 2, Wiley- Interscience) i Ben-Ishai, Tetrahedron, 43, 439-450 (1987)).

PL 212 199 B1

Schemat 2

Według Schematu 2, etapu 1, odpowiedni kwas fenylooctowy o wzorze (5) sprzęga się z odpowiednim acetalem o wzorze (6) z wytworzeniem związku o wzorze (7). Odpowiednim kwasem fenylooctowym o wzorze (5) jest związek, w którym A2 oznacza grupę aktywującą, na przykład -OH, -Cl lub -Br. Odpowiednim acetalem o wzorze (6) jest związek, w którym R5 oznacza C1-C4alkil. Takie reakcje sprzęgania są znane w dziedzinie syntezy peptydu i można stosować przedstawione tutaj syntetyczne metody, opisane na Schemacie 1, w etapie 1.

Ponadto, sprzęganie przedstawione na Schemacie 2 w etapie 2, można prowadzić metodą Schotten-Baumanna stosując halogenek kwasowy związku o wzorze (5) i odpowiedni acetyl o wzorze (6) w mieszanym rozpuszczalniku takim jak, eter metylo-t-butylowy, octan etylu, tetrahydrofuran, aceton lub eter dietylowy i woda. Taką reakcję prowadzi się stosując odpowiednią zasadę, taką jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, węglan sodu, węglan potasu, wodorowęglan sodu lub wodorowęglan potasu. Na ogół mieszaninę reakcyjną miesza się lub wytrząsa energicznie i reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od oko ło -20°C do okoł o 80°C i zazwyczaj wymaga ona od oko ł o 1 do okoł o 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (7) odzyskuje się stosując typowe metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Według Schematu 2, etapu 2, związek o wzorze (7) cyklizuje się z wytworzeniem związku o wzorze (8). Takie reakcje cyklizacji prowadzi się stosując kwas taki jak kwas siarkowy. Zazwyczaj kwas stosuje się, jako rozpuszczalnik. Na ogół, reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od około -20°C do około 150°C i zazwyczaj wymaga ona od około 1 do około 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (8) odzyskuje się stosując typowe metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

PL 212 199 B1

Według Schematu 2, etapu 3, związek o wzorze (8) ulega reakcji przeniesienia grupy aminowej z wytworzeniem zwią zku o wzorze (9). Wedł ug Schematu 2 przeprowadza się oksymowanie. Takie oksymowanie osiąga się kontaktując enolan związku o wzorze (8) z reagentami przeniesienia oksymu, takimi jak ester typu azotynu alkilu. Enolan związku o wzorze (8) można wytworzyć przez reakcję związku o wzorze (8) z odpowiednią zasadą, taką jak t-butanolan potasu, diizopropyloamid litu, heksametylosilazydek litu, heksametylosilazydek sodu, heksametylosilazydek potasu itp. Takie reakcje oksymowania zostały przedstawione przykładowo przez Wheelera i in. w Organic Syntheses, Coll. tom VI, str. 840, gdzie jest opisana reakcja azotynu izoamylu z zastosowaniem ketonu w celu otrzymania pożądanego oksymu. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w rozpuszczalniku, takim jak tetrahydrofuran. Na ogół, reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od około -20°C do około 50°C i zazwyczaj wymaga ona od około 1 do około 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (8) odzyskuje się stosując typowe metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Alternatywnie, taką reakcję przeniesienia grupy aminowej można przeprowadzić poprzez azydek. Azydek można otrzymać na drodze reakcji enolanu związku o wzorze (8) z reagentem przeniesienia azydku, takim jak azydek toluenosulfonylu i azydek triizopropylobenzenosulfonylu. Taka reakcja została przedstawiona przykładowo przez Evansa i in., J. Am. Chem. Soc., 112: 4011-4030 (1990) 41. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w rozpuszczalniku, takim jak tetrahydrofuran. Na ogół, reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od około -20°C do około 50°C i zazwyczaj wymaga ona od około 1 do około 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (8) zawierający azydek zamiast oksymu odzyskuje się stosując typowe metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Jak przedstawiono na Schemacie 2, w etapie 4, oksym redukuje się do związku o wzorze (4). Takie reakcje redukcji przeprowadza się z zastosowaniem wodoru i odpowiedniego katalizatora, takiego jak nikiel Raney'a lub katalizatory palladowe, takie jak pallad na węglu. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w rozpuszczalniku, takim jak tetrahydrofuran, octan etylu lub niższe alkohole, takie jak metanol, etanol i izopropanol, w kwasie octowym, wodzie, wodnym roztworze amoniaku itp. oraz w ich mieszaninach. Reakcję zazwyczaj prowadzi się pod ciśnieniem wodoru w zakresie od ciśnienia atmosferycznego do około 600 psi (4137 kPa). Na ogół, reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od około 20°C do około 100°C i zazwyczaj wymaga ona od około 1 do około 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (4) odzyskuje się stosując typowe metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Alternatywnie, jeśli aminę przenosi się poprzez azydek, wówczas redukuje się grupę azydową. Takie reakcje redukcji prowadzi się przez uwodornienie, sposobem opisanym powyżej.

Sposoby wytwarzania N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu przedstawiono na Schemacie A.

PL 212 199 B1

Schemat A

Według schematu A, etap 1, przeprowadza się rozdział stereochemiczny odpowiedniego laktamu o wzorze (4) z wytworzeniem laktamu o wzorze (10), którym jest w zasadzie czysty (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on. Stosowany tu termin „w zasadzie czysty odnosi się do czystości enancjomerycznej (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu. Według powyższego sposobu można wytworzyć w zasadzie czysty (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on zawierający enancjomer (S) w ilości powyżej 80%, korzystnie powyżej 90%, korzystniej powyżej 95%, najkorzystniej powyżej 97%.

Na przykład izomer (S) związku o wzorze (4) można rozdzielić metodą krystalizacji frakcjonowanej soli dibenzoilowinianu, kwasu (R)-(-)-d-kamforosulfonowego i kwasu (D)-(-)-migdałowego. Stwierdzono, że do tego celu są odpowiednie rozmaite dibenzoilowiniany. W szczególności, korzystne są estry dibenzoilowe zawierające podstawnik w pozycji para, wybrany z grupy obejmującej atom wodoru, atom fluorowca, C1-C4alkil i C1-C4alkoksyl, przy czym szczególnie korzystny jest di-p-toluoilowinian. Di-p- toluoilo-L-winian stosuje się do otrzymania izomeru (S).

Według przedstawionego sposobu, związek o wzorze (4) kontaktuje się z wybranym kwasem. Na ogół, można stosować od około 0,4 molowych równoważników do dużego nadmiaru wybranego kwasu, przy czym korzystnie stosuje się około 0,4 do 1,5 molowych równoważników i jeszcze bardziej korzystnie około 0,5 do 1,1 równoważników molowych.

Proces zazwyczaj prowadzi się przez krystalizację soli addycyjnej z kwasem z roztworu. W szczególności, odpowiednie są rozpuszczalniki takie jak niższe alkohole, obejmujące metanol, etanol, n-propanol, izopropanol, butanol, sec-butanol, izo-butanol, t-butanol, alkohol amylowy, alkohol izo-amylowy, alkohol t-amylowy, heksanol, cyklopentanol i cykloheksanol, przy czym metanol, etanol i izopropanol są korzystne. Korzystne może być zastosowanie rozpuszczalnika o przeciwnych właściwościach. Stosowany tu termin „rozpuszczalnik o przeciwnych właściwościach odnosi się do rozpuszczalnika, w którym sól jest znacznie słabiej rozpuszczalna w porównaniu z rozpuszczalnikiem.

PL 212 199 B1

Korzystnie, gdy stosuje się rozpuszczalnik o przeciwnych właściwościach, wówczas miesza się on z wybranym rozpuszczalnikiem. Odpowiednie rozpuszczalniki o przeciwnych wła ś ciwoś ciach obejmują etery, takie jak eter dietylowy, eter metylo-t-butylowy itp. oraz niższe octany alkili, takie jak octan metylu, octan etylu, octan izopropylu, octan propylu, octan izo-butylu, octan sec-butylu, octan butylu, octan amylu, octan izo-amylu itp., oraz alkany, takie jak pentan, heksan, heptan, cykloheksan itp.

Gdy przedstawiony sposób prowadzi się przez krystalizację soli addycyjnej z kwasem z mieszaniny racemicznej, wówczas należy zwrócić szczególną uwagę stosując rozpuszczalnik o przeciwnych właściwościach w celu uniknięcia krystalizacji niepożądanej soli diastereomerycznej.

Zazwyczaj krystalizację prowadzi się początkowo w temperaturze około 40°C do temperatury wrzenia wybranego rozpuszczalnika (rozpuszczalników) i z początkowymi stężeniami od około 0,05 molowych do około 0,25 molowych. Następnie mieszaninę ochładza się uzyskując sól. Korzystne może być zaszczepianie krystalizacji. Ponadto korzystne może być mieszanie początkowego osadu przez od około 4 do 48 godzin. Korzystnie roztwór krystalizacyjny ochładza się powoli. Roztwór krystalizacyjny najbardziej dogodnie ochładza się od temperatury otoczenia aż do około -20°C. Sól można zebrać stosując techniki dobrze znane w dziedzinie, obejmujące filtrację, dekantowanie, odwirowywanie, odparowanie, suszenie itp. Związek o wzorze (10) można stosować bezpośrednio jako sól addycyjną wybranego kwasu. Alternatywnie, przed użyciem, związek o wzorze (10) można wydzielić w postaci innej soli addycyjnej z kwasem, po wymianie kwasu lub można wydzielić w postaci zasady metodą ekstrakcji w warunkach zasadowych, co jest dobrze znane w dziedzinie.

Korzystnym sposobem uzyskuje się (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin2-on o znacznej czystości enancjomerycznej, przez krystalizację 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu w postaci jego soli addycyjnej z kwasem wybranym z grupy obejmującej kwas di-p-tolilo-L-winowy, kwas (R)-(-)-d-kamforosulfonowy i kwas (D)-(-)-migdałowy sposobem dynamicznym, w obecności aromatycznego aldehydu. Sposób dynamiczny ma tę zaletę, że podczas krystalizacji 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on ulega konwersji w pojedynczy izomer, a zatem umoż liwia polepszenie wydajności i uniknięcie powstawania strumienia odpadowego, który zawiera niepożądany izomer.

Stwierdzono, że w sposobie dynamicznym odpowiednie są rozmaite aromatyczne aldehydy, oraz że niektóre aldehydy są szczególnie odpowiednie w praktyce. Specyficznie, stwierdzono, że w opisanym sposobie dynamicznym korzystne są kwasy salicylowe, a jeszcze bardziej korzystne są aldehyd salicylowy, aldehyd 5-nitrosalicylowy oraz aldehyd 3,5-dichlorosalicylowy.

Zgodnie z tym, gdy przedstawiony proces prowadzi się jako rozdzielanie dynamiczne, wówczas 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on kontaktuje się z wybranym kwasem, w obecności aromatycznego aldehydu. Na ogół, w celu dynamicznego rozdzielania stosuje się od około 0,9 do 1,2 molowych równoważników kwasu, przy czym korzystny jest około 1 równoważnik molowy. Aldehyd aromatyczny na ogół stosuje się w ilości katalitycznej. Zazwyczaj stosuje się około 0,5 do 0,001 równoważników molowych aromatycznego aldehydu, przy czym korzystnie około 0,1 do około 0,01 równoważników molowych.

Sposób dynamiczny zazwyczaj prowadzi się w rozpuszczalniku, bez rozpuszczalnika o przeciwnych właściwościach opisanego powyżej. Mieszaninę 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu, wybranego kwasu i aromatycznego aldehydu miesza się w celu umożliwienia konwersji do pożądanego izomeru. Na ogół konwersję prowadzi się w zakresie temperatur od temperatury otoczenia do temperatury wrzenia rozpuszczalnika. Na ogół konwersja wymaga 6 do 48 godzin.

Fachowcy w dziedzinie docenią, że gdy przedstawiony proces prowadzi się jako rozdzielanie dynamiczne, zastosowanie soli addycyjnej (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu z kwasem może być skomplikowane przez obecność małej ilości aromatycznego aldehydu w wydzielonym produkcie. Zatem po dynamicznym rozdzielaniu korzystne jest, aby (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on wydzielać przez wymianę soli, korzystnie w postaci chlorowodorku, przed jego zastosowaniem lub wytwarzaniem zasady.

Według schematu A, etapu 2, przeprowadza się reakcję sprzęgania odpowiedniej alaniny z zabezpieczoną grupą aminową o wzorze PgNH-CHCH3-C(O)-A i odpowiedniego laktamu o wzorze (10). Odpowiednią alaniną z zabezpieczoną grupą aminową jest związek, w którym Pg oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową, w konfiguracji L, a A oznacza grupę aktywującą np. -OH lub -Cl, zdolną do sprzęgania z grupą aminową związku o wzorze (10). Takie alaniny z zabezpieczoną grupą aminową są łatwo dostępne dla fachowców w dziedzinie.

PL 212 199 B1

Reakcja sprzęgania przedstawiona na Schemacie A, w etapie 2, obejmuje reakcje, które zazwyczaj prowadzi się w syntezie peptydu i można także stosować syntetyczne metody przedstawione tutaj. Takie metody są opisane szczegółowo na Schemacie 1, w etapie 1.

Według Schematu A, etap 3, przeprowadza się odbezpieczenie związku o wzorze (11) z wytworzeniem związku o wzorze (12). Takie odbezpieczanie grup zabezpieczających grupę aminową jest dobrze znane w dziedzinie.

Według schematu A, etapu 4, przeprowadza się reakcję sprzęgania odpowiedniego związku o wzorze (13), (CH3)2CH-CHOH-C(O)A1 i związku o wzorze (12) z wytworzeniem związku o wzorze I. Izomer S związku o wzorze (13) jest dostępny w handlu i jest dobrze znany w dziedzinie z ujawnienia w publikacji PCT nr PCT/US97/22986, złożonej 22 grudnia 1997. Reakcję sprzęgania przedstawioną w etapie 3 prowadzi się stosują c kwas o wzorze (13) (zwią zki, w których A1 oznacza -OH) lub halogenek kwasowy pochodzący od nich (związki, w których A1 oznacza -Cl lub -Br), sposobem podobnym do opisanego na Schemacie 1, etap 1.

Alternatywny sposób otrzymywania związków o wzorze I jest przedstawiony na Schemacie A, etap 5, który przedstawia reakcję sprzęgania odpowiedniego związku o wzorze (10) z odpowiednim związkiem o wzorze (14), (CH3)2CH-CHOH-C(O)-NH-CHCH3-C(O)A2 z uzyskaniem bezpośrednio związku o wzorze I. Odpowiedni związek o wzorze (10) jest opisany w etapie 2. Odpowiedni związek o wzorze (14) obejmuje związek, który ma pożądaną stereochemię w koń cowym produkcie o wzorze I.

Związki o wzorze (14) łatwo wytwarza się przez sprzęganie aminokwasów z zabezpieczoną grupą karboksylową, H2N-CHCH3-C(O)OPg1, ze związkami o wzorze (13) jak opisano powyżej. Ponownie takie reakcje sprzęgania są dobrze znane w dziedzinie i uzyskuje się produkt, który po odbezpieczeniu daje związek o wzorze (14).

Związek o wzorze I można wydzielić i oczyścić stosując różne techniki, obejmujące krystalizację. Można stosować krystalizację z roztworu i techniki zawieszania. W szczególności związek według wynalazku można wytworzyć metodą krystalizacji z rozmaitych bezwodnych i wodnych rozpuszczalników. Odpowiednie rozpuszczalniki obejmują aceton, niższe alkohole (jak metanol, etanol i izopropanol), kwas octowy i acetonitryl z dodatkiem lub bez wody i octanu etylu, eteru dietylowego i eteru metylo-t-butylowego. W praktyce, stwierdzono, że korzystny jest roztwór acetonu w wodzie. W danym wodnym rozpuszczalniku, wodę stosuje się w ilości związanej ze względną rozpuszczalnością N-(((S)-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1-3-benzoazepin-2-nu w rozpuszczalniku, w porównaniu z wodą oraz w zależności od tego czy stosuje się krystalizację czy technikę zawieszania.

Krystalizację na ogół prowadzi się przez rozpuszczenie N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metyIo-2,3,4,5-tetrahydro-1-3-benzoazepin-2-onu w wodnym rozpuszczalniku, a następnie umożliwienie oziębienia roztworu, z dodatkiem lub bez wody, z wytworzeniem ciała stałego. Zazwyczaj, krystalizację prowadzi się początkowo w temperaturze około 40°C do temperatury wrzenia wybranego wodnego rozpuszczalnika. Mieszaninę następnie ochładza się uzyskując krystaliczny dihydrat. Korzystne może być zaszczepianie krystalizacji. Korzystnie roztwór krystalizacyjny ochładza się powoli. Roztwór krystalizacyjny najbardziej dogodnie ochładza się od temperatury otoczenia aż do około -20°C.

Wynalazek zilustrowano poniżej za pomocą następujących przykładów i preparatów.

Terminy stosowane w przykładach i preparatach mają ich zwyczajne znaczenia, jeśli nie wskazano tego inaczej. Na przykład „°C odnosi się do stopni Celsiusa; „mmol odnosi się do milimola lub milimoli; „g odnosi się do grama lub gramów; „ml odnosi się mililitra lub mililitrów; „solanka odnosi się do nasyconego wodnego roztworu chlorku sodu; „THF odnosi się do tetrahydrofuranu; „HPLC odnosi się do wysokosprawnej chromatografii cieczowej; itp.

Przykład przygotowawczy 1

Synteza 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1-3-benzoazepin-2-onu

Do zawiesiny wodorku sodu (1,1 równoważnika) w 15 ml suchego DMF dodano 2,3,4,5-tetrahydro-1H-benzoazepin-2-on (0,0042 mola) w postaci roztworu w 10 ml DMF. Następnie dodano jodek metylu (około 2 równoważników). Gdy analiza TLC wykazała, że reakcja przebiegła całkowicie, wówczas mieszaninę reakcyjną wlano na lód i ekstrahowano octanem etylu. Warstwę organiczną przemyto wodą, a następnie solanką. Warstwę organiczną osuszono następnie nad Na2SO4 przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą HPLC (LC 2000), eluując mieszaniną octan etylu/heksan uzyskując 3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1-3-benzoazepin-2-on.

PL 212 199 B1

3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on (1 równoważnik) rozpuszczono w THF i dodano azotyn izoamylu (1,2 równoważnika). Mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C w łaźni lodowej. Kroplami dodano kolejno NaHMDS (1,1 równoważnika, 1M roztwór w THF). Po mieszaniu przez 1 godzinę lub po zakończeniu reakcji, mieszaninę zatężono, a następnie zakwaszono 1N wodnym roztworem kwasu chlorowodorowego i ekstrahowano octanem etylu. Frakcję organiczną osuszono i zatężono uzyskując surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym uzyskując 1-hydroksyimino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on: Spektroskopia masowa (M+H)*, 205,1.

1-hydroksyimino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on rozpuszczono w mieszaninie EtOH/NH3 (20:1) i uwodorniano w bombie, stosując Nikiel Raney'a i wodór (500 psi/3447 kPa) w temperaturze 100°C przez 10 godzin. Uzyskaną mieszanin ę przesą czono i zatężono, uzyskują c olej, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym, uzyskując tytułowy związek.

Przykład przygotowawczy 2

Synteza 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu

Do kolby Morton'a o pojemności 20 l dodano MTBE (5,52 l, 7 objętości) i dimetyloacetal (N-metyloamino)-acetaldehydu (614 g, 5 moli), uzyskując roztwór w temperaturze pokojowej. Roztwór wodorowęglanu sodu wytworzono przez dodanie wodorowęglanu sodu (546 g, 6,5 mola) i wody (6,31 l, 8 objętości) do kolby reakcyjnej Morton'a. Mieszaninę ochłodzono do temperatury poniżej 10°C i do tej ochłodzonej mieszaniny reakcyjnej kroplami dodawano przez 1 godzinę roztwór MTBE (789 ml) w chlorku fenyloacetylu (789 g, 5 moli). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Na tym etapie metodą analizy HPLC wykazano zakończenie reakcji. Ekstrahowano MTBE (4 objętości), osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i zatężono na wyparce obrotowej, uzyskując 1,187 kg (98%) N-metylo-N-(2,2-dimetoksyetylo)fenyloacetamidu w postaci cieczy, (M+H)⁺ = 237,9.

Do kolby Morton'a o pojemności 5 l w atmosferze azotu dodano H2SO4 (1,42 l). Kroplami do kolby reakcyjnej dodano N-metylo-N-(2,2-dimetoksyetylo)fenyloacetamid (712 g, 3 mole), co wywołało silną reakcję egzotermiczną (22 do 78°C). Uzyskaną mieszaninę ogrzewano następnie w temperaturze 110°C przez 3 godziny, po czym ochłodzono do temperatury pokojowej i przeniesiono do kolby Morton'a o pojemności 20 I. W temperaturze poniżej 10°C reakcję zatrzymano wodnym roztworem wodorotlenku sodu (9,18 l, 5N). Ekstrahowano octanem etylu (2 x 2,85 l), osuszono siarczanem sodu, po czym zatężono, uzyskując 3-metylo-2,3-dihydro-1H-3-benzoazepin-2-on w postaci ciała stałego (520 g, 73,5%). Tę substancję można krystalizować ponownie z MTBE w celu zwiększenia czystości, uzyskując ciało stałe o temperaturze topnienia = 81-82°C; (M+H)⁺ = 174,2.

Roztwór 3-metylo-2,3-dihydro-1H-3-benzoazepin-2-onu (113,8 g, 0,657 mola) w THF (0,5 l) ochłodzono do temperatury 0°C i dodano kroplami azotyn izoamylu (100,75 g, 0,86 mola). Do uzyskanej mieszaniny dodawano LiHMDS (1N roztwór THF, 854 ml, 0,854 mola) tak, aby temperaturę utrzymać poniżej 10°C. Następnie mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2-3 godziny i przebieg reakcji monitorowano metodą HPLC. Po zakończeniu reakcji, mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C i wartość pH uregulowano od 12 do 2-3, stosując wodny roztwór HCl (2N). Uzyskany osad mieszano przez 12-16 godzin, po czym przefiltrowano, osuszono, uzyskując 1-hydroksyimino-3-metylo-2,3-dihydro-1H-3-benzoazepin-2-on (86,3 g, 64,9%), temperatura topnienia = 225-226°C; (M+H)⁺ = 203,0.

Roztwór 1-hydroksyimino-3-metylo-2,3-dihydro-1H-3-benzoazepin-2-onu (35 g, 0,173 mola) w etanolu (525 ml) umieszczono w autoklawie wraz z palladem na wę glu (10%, 3,5 g) w postaci zawiesiny rozcieńczonej w HCl (stężony wodny roztwór, 17,5 g w 17 ml wody). Uzyskaną mieszaninę uwodorniano w temperaturze 50°C i pod ciśnieniem 250 psi (1723 kPa) do zakończenia reakcji. Mieszaninę reakcyjną przesączono przez warstwę Celitu, stosując etanol jako rozpuszczalnik i przesącz zatężono do objętości 90 ml. Do koncentratu dodano wodę (350 ml), a następnie uzyskany roztwór zatężono do około 200 ml. Do roztworu dodano wodny roztwór dichlorometanu (350 ml), wartość pH uregulowano do 11-11,5 wodnym roztworem wodorotlenku sodu (1N). Organiczną część oddzielono, a wodną część ekstrahowano dichlorometanem (175 ml). Połączone ekstrakty zatężono do pozostałości, która krystalizowała po odstaniu, uzyskując tytułowy związek: temperatura topnienia = 69-81°C; (M+H)⁺ = 191,0.

PL 212 199 B1

Przykład przygotowawczy 3

Synteza 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu

Do kolby Morton'a o pojemności 22 l dodano dichlorometan (4,73 l, 8 objętości), N-metylofenetyloaminę (591 g, 4,33 mola) i wodny roztwór wodorowęglanu sodu (436,7 g, 5,2 mola w 4,73 l wody). Mieszaninę ochłodzono do temperatury poniżej 5°C i do ochłodzonej mieszaniny reakcyjnej dodawano kroplami roztwór dichlorometanu (887 ml) w chlorku chloroacetylu (513,7 g, 4,55 mol) przez 70 minut. Zakończenie reakcji wykazano metodą analizy HPLC. Warstwy rozdzielono i warstwę wodną ekstrahowano dichlorometanem. Połączone warstwy organiczne osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i zatężono na wyparce obrotowej, uzyskując 915,7 g (99,8%) N-metylo-N-(2-fenyloetylo)-1-chloroacetamidu: (M+H) = 212,1.

Do kolby o pojemności 12 l, w atmosferze azotu dodano N-metylo-N-(2-fenyloetylo)-1-chloroacetamid (883,3 g, 4,17 mola) i orto-dichlorobenzen (6,18 l). Dodano chlorek glinu (1319 g, 10,13 mola), który spowodował reakcję egzotermiczną (22 do 50°C). Uzyskaną mieszaninę ogrzewano następnie w temperaturze 165°C przez 2,5 godziny, pozostawiono ją w temperaturze pokojowej przez okoł o 14 godzin. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury około 0°C i dodano do zimnej wody (8,86 1, około 5°C), w czterech porcjach, w celu utrzymania reakcji egzotermicznej w temperaturze około 40°C. Warstwy rozdzielono i warstwę wodną ekstrahowano dichlorometanem (7,07 l), po czym warstwy ponownie rozdzielono. Warstwy organiczne połączono i ekstrahowano wodnym roztworem kwasu chlorowodorowego (8,83 l, 1N) i nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (7,07 l), osuszono nad siarczanem magnezu, połączono z żelem krzemionkowym (883 g) i zastosowano kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym (3,53 kg, w lejku ze spiekanego szkła, upakowanie w postaci zawiesiny w dichlorometanie). Kolumnę eluowano dichlorometanem aż do zebrania 25 l, po czym eluowano octanem etylu, uzyskując produkt. Frakcje zawierające produkt zatężono, uzyskując 3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on w postaci brązowego ciała stałego (608 g, 83%).

W kolbie o obję toś ci 22 l, w atmosferze azotu umieszczono 3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on (606 g, 3,46 mola) i azotyn izoamylu (543 g, 4,5 mola) w THF (7,88 l). Mieszaninę ochłodzono do temperatury około 0°C. Dodawano porcjami LiHMDS (1N roztwór THF, 4,5 l, 4,5 mola) tak, aby temperaturę utrzymać poniżej około 7°C. Po zakończeniu dodawania, mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez około 2 godziny. Reakcję monitorowano metodą HPLC. Po zakończeniu reakcji, mieszaninę ochłodzono do temperatury około 0°C i wartość pH uregulowano od 12 do około 2 do 1, stosując wodny roztwór HCl (2N). Osad mieszano przez około 6 godzin, po czym oddzielono przez filtrację i osuszono, uzyskując 1-hydroksyimino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on (604,7 g, 85,6%).

1-hydroksyimino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on (625 g, 3,06 mola) i etanol 3A (15,6 l), w postaci rozcieńczonej w HCl (stężony wodny roztwór kwasu chlorowodorowego (312 g w 320 ml wody)) zawiesiny umieszczono w autoklawie wraz z palladem na wę glu (10%, 120 g). Uzyskaną mieszaninę uwodorniano w temperaturze 50°C i pod ciśnieniem 250 psi (1723 kPa), mieszając energicznie do zakończenia reakcji (około 4 godzin). Mieszaninę reakcyjną przesączono przez warstwę Celitu, stosując etanol jako rozpuszczalnik i przesącz zatężono, uzyskując ciało stałe. Ciało stałe potraktowano dichlorometanem (6 l) i dodawano 1N wodny roztwór wodorotlenku sodu aż wartość pH warstwy wodnej uregulowano do pomiędzy 11-11,5. Mieszaninę mieszano, warstwy rozdzielono i warstwę wodną ekstrahowano dichlorometanem (2 l). Warstwy organiczne osuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i odparowano na wyparce obrotowej, uzyskując tytułowy związek (477 g, 81,9%).

Przykład przygotowawczy 4

Synteza (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu

1amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on (1,544g, 8,12 mmola) ogrzewano łagodnie w 15 ml metanolu, uzyskując roztwór. W innej kolbie rozpuszczono kwas di-p-toluoilo-1-winowy (3,12 g, 8,08 mmola) w 15 ml metanolu i dodano pipetą do gorącego roztworu aminy. Mieszaninę ogrzewano i wytrąciły się części stałe. Dodatkowo dodano 30 ml metanolu w celu utworzenia roztworu, który ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 30-40 minut i następnie powoli ochłodzono do temperatury otoczenia, uzyskując ciało stałe. Po mieszaniu przez około 18 godzin, ciało stałe zebrano przez filtrację i przepłukano niewielką ilością zimnego metanolu, uzyskując 2,24 g soli kwasu di-p-toluoilo-L-winowego (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu (wydajność 96%, 94,7% ee (nadmiar enancjomeryczny)).

Sól (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu z kwasem di-p-toluoilo-L-winowym (11,83 g, 20 mmoli) rozpuszczono w 45 ml wodnego 1,0N roztworu wodorotlenku sodu

PL 212 199 B1 i ekstrahowano chlorkiem metylenu (3 x 25 ml). Połączone warstwy chlorku metylenu przemyto 35 ml wodnego 1,0 N roztworu wodorotlenku sodu, następnie roztworem solanki i osuszono nad bezwodnym MgSO₄. •Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując tytułowy związek (3,38 g) w postaci bezbarwnego oleju (wydajność 87%, 93,2% ee).

Przykład przygotowawczy 5

Synteza (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu

1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on (6,0 g, 31,5 mmola) ogrzewano łagodnie w 75 ml metanolu, uzyskując roztwór i połączono go z roztworem kwasu di-p-toluoilo-L-winowego (12,2 g, 31,5 mmola) w 75 ml gorącego metanolu. Roztwór zaszczepiono i otrzymano ciało stałe. Dodatkowo dodano 100 ml metanolu i mieszaninę mieszano. Po wymieszaniu przez około 18 godzin, ciało stałe zebrano przez filtrację i przepłukano niewielką ilością zimnego metanolu, uzyskując 6,7 g ciała stałego. Ciało stałe połączono z metanolem (200 ml) i mieszano. Po 18 godzinach, ciało stałe zebrano, uzyskując sól (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu z kwasem di-p-toluoilo-L-winowym (4,4 g). Oddzielenie zasady metodą opisaną w Przykładzie przygotowawczym 4 dało tytułowy związek (96% ee).

Przykład przygotowawczy 6

Synteza (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu

W kolbie o objętości 22 l, w atmosferze azotu, ogrzewano (temperatura około 40°C) 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on (438 g, 2,3 mola), uzyskując roztwór w metanolu (4,38 ml). W innej kolbie, rozpuszczono kwas di-p-toluoilo-L-winowy (889,7 g, 2,3 mola) w 4,38 1 metanolu i ogrzewano w temperaturze około 40°C, po czym dodano roztwór 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu. Ogrzewanie kontynuowano i dodatkowo dodano 6,13 l metanolu, a następnie mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez około 45 minut, po czym powoli ochłodzono do temperatury otoczenia, uzyskując ciało stałe. Po mieszaniu przez około 18 godzin, ciało stałe zebrano przez filtrację i przepłukano niewielką ilością ługów macierzystych i po osuszeniu powietrzem, łącznie około 2 litrami octanu etylu, uzyskano 561,6 g soli (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu z kwasem di-p-toluoilo-L-winowym. Połączono sól (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu z kwasem di-p-toluoilo-L-winowym, dichlorometan (6,57 I) i 1N wodny roztwór wodorotlenku sodu (6,57 l) i mieszano. Warstwy rozdzielono i warstwę organiczną ekstrahowano dwukrotnie 1N wodnym roztworem wodorotlenku sodu (3,28 l), jednokrotnie solanką (2,46 l), po czym roztwór osuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i zatężono na wyparce obrotowej, uzyskując tytułowy związek (250 g, 57,4%, 94,1% ee).

Przykład przygotowawczy 7

Synteza chlorowodorku (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu

1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on (31,9 g, 168 mmoli) przeprowadzono w zawiesinę (objętość około 300 ml) w octanie izopropylu i ogrzewano w temperaturze 45°C. W oddzielnej kolbie ogrzewano kwas (R)-(-)-D-migdałowy (25,0 g, 164 mmoli) w około 130 ml alkoholu izopropylowego do utworzenia roztworu, który dodano do otrzymanej powyżej zawiesiny 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on/octan izopropylu, uzyskując roztwór, w którym szybko utworzył się osad. Mieszaninę mieszano w temperaturze 45°C przez około 3 godziny. Do gorącego roztworu dodano aldehyd 5-nitrosalicylowy (2-hydroksy-5-nitrobenzaldehyd) (1,40 g, 8,38 mmola, 5% molowych) i mieszaninę mieszano w temperaturze 45°C. Po około 14 godzinach rzadką zawiesinę ochłodzono do temperatury otoczenia i mieszano przez 2 godziny, po czym ciało stałe zebrano przez filtrację i przepłukano 70 ml zimnego octanu izopropylu i osuszono w piecu próżniowym, w temperaturze 40°C, uzyskując 46,62 g soli (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu z kwasem (R)-migdałowym (wydajność 82,9%, 98,4% ee).

Sól (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu z kwasem (R)-migdałowym (2,42 g, 7,06 mmola, 98,4% ee) przeprowadzono w zawiesinę w 25 ml octanu etylu w temperaturze otoczenia. Dodano wodny roztwór kwasu chlorowodorowego (1,1 ml, około 11,2 mmola) i ogrzewano w temperaturze 50°C energicznie mieszając przez 3,5 godziny. Rzadką zawiesinę ochłodzono do temperatury otoczenia, przesączono i przepłukano eterem metylowo t-butylowym (około 10 ml), uzyskując 1,48 g tytułowego związku (wydajność 92,5%, 97,9% ee).

PL 212 199 B1

P r z y k ł a d 1

Synteza N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu

W okrą głodennej kolbie umieszczono w atmosferze azotu N-t-Boc-L-alaninę (1,0 równoważnik), hydrat hydroksybenzotriazolu (około 1,1 równoważnika) i (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on (1,0 równoważnik) w THF. Do silnie mieszanej mieszaniny dodano zasadę Huniga (N,N-diizopropyloetyloamina, 1,1 równoważnika), a następnie EDC (1,1 równoważnika). Po mieszaniu przez od 4 do 17 godzin w temperaturze otoczenia, rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i wodzie, przemyto nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, 1N wodnym roztworem HCl, solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 1-(N-t-Boc-L-alaninylo)amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on: spektroskopia masowa (M+H)⁺, 362,3.

Strumień bezwodnego gazowego HCl przepuszczono przez mieszany roztwór 1-(N-t-Boc-L-alaninylo)amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu w 1,4-dioksanie (0,03-0,09 M), chłodzono w łaźni lodowej do około 10°C w atmosferze azotu przez 10-15 minut. Roztwór zamknięto, następnie łaźnię chłodzącą usunięto i roztwór pozostawiono do ogrzania do temperatury otoczenia, mieszając przez 2-8 godzin, monitorując 1,0 metodą TLC zużycie substancji wyjściowej. Roztwór zatężono, uzyskując 1-(L-alaninylo)-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on, który użyto bez dalszego oczyszczania.

1-(L-alaninylo)-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-3-metylo-1H-3-benzoazepin-2-on (1,0 równoważnik), hydrat hydroksybenzotriazolu (1,1 równoważnika) i kwas (S)-2-hydroksy-3-mety-lomasłowy (1,0 równoważnik) umieszczono w THF w atmosferze azotu. Do starannie mieszanej mieszaniny dodano zasadę Huniga (N,N-diizopropyloetyloamina, 1,1 równoważnika), następnie EDC (1,1 równoważnika). Po mieszaniu przez od 4 do 17 godzin w temperaturze otoczenia rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (lub podobnym rozpuszczalniku) i wodzie, przemyto nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, 1N HCl, solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując tytułowy związek.

P r z y k ł a d 2

Synteza N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu

W okrą g ł odennej kolbie umieszczono N-t-Boc-L-alanin ę (249,5 g, 1,32 mola), hydrat hydroksybenzotriazolu (232,2 g, 1,52 mola) i (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on (250,8 g, 1,32 mola) w THF (3,76 1) w atmosferze azotu. Mieszaninę ochłodzono do temperatury poniżej 5°C, po czym dodano zasadę Huniga (N,N-diizopropyloetyloaminę, 188,4 g, 1,45 mola) następnie EDC (283,7 g, 1,45 mola). Po mieszaniu przez 6 godzin mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury otoczenia i mieszano przez około 14 godzin. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (3,76 l) i wodzie (1,76 l), warstwy rozdzielono, warstwę organiczną ekstrahowano wodą (1,76 l), warstwę wodną połączono i ekstrahowano octanem etylu (1,76 l). Warstwy organiczne połączono, ekstrahowano nasyconym, wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (1,76 l), osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i odparowano na wyparce obrotowej, uzyskując 1-(N-t-Boc-L-alaninylo)amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on (463 g, 97,2%).

Roztwór octanu etylu w HCl wytworzono przepuszczając bezwodny gazowy HCl, przez podpowierzchniową rurkę dyspersyjną, przez octan etylu (1,76 l) ochłodzony do temperatury około 0°C. Wytworzony roztwór HCl w octanie etylu dodano do energicznie mieszanej zawiesiny 1-(N-t-Boc-L-alaninylo)amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu (462 g, 1,28 mola) w octanie etylu (3,7 l). Dodatkowo dodano octan etylu (1 l) i mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i mieszano przez 22 godziny. Mieszaninę reakcyjną przesączono, uzyskując ciało stałe. Ciało stałe przeprowadzono w zawiesinę w acetonitrylu (5 l), ogrzano do temperatury wrzenia, po czym ochłodzono do temperatury około 60°C, przesączono i osuszono, uzyskując 1-(L-alaninylo)-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on (389,8 g, 94,7%).

1-(L-alaninylo)-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-3-metylo-1H-3-benzoazepin-2-on (369,5 g, 1,18 mola), hydrat hydroksybenzotriazolu (207,6 g, 1,36 mola), zasadę Huniga (N,N-diizopropyloetyloamina, 352,2 g, 2,71 mola) i kwas (S)-2-hydroksy-3-metylomasłowy (140,6 g, 1,18 mol) w THF (4,8 l) połączono w atmosferze azotu i ochł odzono do temperatury poniż ej 5°C. Dodano EDC

PL 212 199 B1 (253,7 g, 1,3 mola) i mieszaninę reakcyjną pozostawiono, mieszając, do ogrzania do temperatury otoczenia. Po około 25 godzinach, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono dichlorometanem (5,54 l) i ekstrahowano wodą (2,22 l). Warstwę organiczną ekstrahowano wodą (2,22 l), warstwy wodne połączono i ekstrahowano dichlorometanem (5,54 l). Warstwy organiczne połączono, ekstrahowano dwukrotnie wodą (2,22 l), nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2,22 l), osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono na wyparce obrotowej, uzyskując tytułowy związek (428 g, 100%).

Ciało stałe rozpuszczono w mieszaninie rozpuszczalników acetonu (3,42 l) i wody (0,856 l), po czym mieszaninę nieznacznie ogrzano (40°C). Roztwór podzielono na ~2 l porcje i do każdej dodawano wodę (7,19 l), podczas gdy mętny roztwór ogrzewano do temperatury 50°C. Po dodaniu całej ilości wody, mętny roztwór pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej uzyskując ciało stałe, które w postaci zawiesiny mieszano w temperaturze otoczenia przez około 14 godzin, a następnie przesączono i suszono z wytworzeniem 310,6 g (66,2%) tytułowego związku w postaci jego dihydratu.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające związek według wynalazku stosuje się do hamowania uwalniania i/lub syntezy peptydu β-amyloidu, w tym do leczenia choroby Alzheimera. Zatem związek według wynalazku ((N)-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on) można zastosować do wytwarzania leku do hamowania uwalniania i/lub syntezy peptydu β-amyloidu i specyficznie do leczenia choroby Alzheimera.

(N)-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on można podawać różnymi sposobami. Związek według wynalazku można podawać w dowolnej postaci lub dowolnym sposobem, który zapewnia biodostępność związku w skutecznej ilości, obejmującym podawanie doustne i pozajelitowe. Na przykład związek według wynalazku można podawać doustnie, inhalacyjnie, podskórnie, domięśniowo, dożylnie, przezskórnie, donosowo, doodbytniczo, doocznie, miejscowo, podjęzykowo, podpoliczkowo itp.

Podczas wytwarzania kompozycji według wynalazku, substancję czynną zazwyczaj miesza się z rozczynnikiem, rozcieńcza rozczynnikiem lub zamyka w takim nośniku jak kapsułka, saszetka, bibułka lub inny pojemnik. Związek według wynalazku można podawać sam lub w formie kompozycji farmaceutycznej, tj. w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozcieńczalnikami, takimi jak nośniki lub rozczynniki, których ilość i własności określa się w odniesieniu do rozpuszczalności i chemicznych właściwości związku według wynalazku, wybranego sposobu podawania i praktyki farmaceutycznej. (Remington's Pharmaceutical Sciences, Wydanie 18, Mack Publishing Co. (1990)).

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku wytwarza się sposobem dobrze znanym w przemyśle farmaceutycznym. Nośnik lub rozczynnik mogą być ciałem stałym, ciałem półstałym lub cieczą, które mogą służyć jako rozczynnik lub ośrodek substancji czynnej. Odpowiednie nośniki lub rozczynniki są dobrze znane w dziedzinie. Kompozycja farmaceutyczna może być przystosowana do podawania doustnego, inhalacyjnego, pozajelitowego lub miejscowego i można ją podawać pacjentowi w formie tabletek, kapsułek, aerozoli, środków do inhalacji, czopków, roztworu, zawiesiny lub podobnych.

W przypadku podawania doustnego, związki można wprowadzać z rozczynnikami i stosować w postaci tabletek, kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków, gumy do żucia itp. Preparaty te powinny zawierać co najmniej 4% związku według wynalazku, lecz ilość substancji czynnej może zmieniać się zależnie od stosowanej postaci i korzystnie mieści się w zakresie pomiędzy 2% a 90% masy jednostkowej. Ilość związku występującego w kompozycjach dobiera się tak, aby umożliwiać odpowiednie dawkowanie. Korzystne kompozycje i preparaty według wynalazku mogą określać fachowcy w dziedzinie.

Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki itp. mogą także zawierać jeden lub więcej następujących środków wspomagających: spoiwa takie jak mikrokrystaliczna celuloza, guma tragakantowa lub żelatyna; rozczynniki takie jak skrobia lub laktoza, substancje dezintegrujące takie jak kwas alginowy, Primogel, skrobia kukurydziana itp.; Iubrikanty takie jak stearynian magnezu, olej silikonowy lub Sterotex; środki poślizgowe takie jak koloidalny ditlenek krzemu oraz można także dodawać środki słodzące takie jak sacharoza lub sacharyna lub środki smakowe takie jak mięta pieprzowa, salicylan metylu lub smak pomarańczowy. Gdy dawkę jednostkową stanowi kapsułka, może ona zawierać oprócz powyższych substancji, ciekły nośnik taki jak glikol polietylenowy lub olej tłuszczowy. Inne dawki jednostkowe mogą zawierać różne inne substancje, które modyfikują ich właściwości fizyczne jak na przykład otoczki. Zatem tabletki lub pigułki mogą być powleczone cukrem, szelakiem lub innymi środkami powlekającymi. Syrop może zawierać, oprócz przedstawionych związków, sacharozę jako

PL 212 199 B1 środek słodzący oraz środki konserwujące, barwniki i pigmenty, a także środki smakowe. Substancje stosowane do przygotowania różnych kompozycji powinny być farmaceutycznie czyste i nietoksyczne w stosowanych iloś ciach.

Do podawania pozajelitowego, związek według wynalazku można wprowadzać do roztworu lub zawiesiny. Preparaty te zazwyczaj zawierają co najmniej 0,1% związku według wynalazku, lecz ilość ta może się zmieniać w zakresie od 0,1 do 90% całkowitej masy. Ilość związku występującego w takich kompozycjach dobiera się tak, aby umożliwiać odpowiednie dawkowanie. Roztwory lub zawiesiny mogą także obejmować jeden lub więcej następujących środków wspomagających: sterylne rozcieńczalniki takie jak woda do wstrzykiwania, roztwór solanki, oleje roślinne, glikole polietylenowe, gliceryna, glikol propylenowy lub inne syntetyczne rozpuszczalniki; środki przeciwbakteryjne takie jak alkohol benzylowy lub metyloparaben; antyutleniacze takie jak kwas askorbinowy lub wodorosiarczyn sodu; środki chelatujące takie jak kwas etylenodiaminotetraoctowy; bufory takie jak octany, cytryniany lub fosforany i środki do dopasowania toniczności roztworu takie jak chlorek sodu lub dekstroza. Preparat pozajelitowy można zamknąć w ampułkach, jednorazowych strzykawkach lub fiolkach wielodawkowych wykonanych ze szkła lub plastiku. Korzystne kompozycje i preparaty mogą określić fachowcy w dziedzinie.

Związek według wynalazku można także podawać miejscowo i w tym przypadku nośnik może odpowiednio obejmować roztwór, maść lub żel. Podłoże może obejmować jeden lub więcej następujących materiałów: wazelina żółta, lanolina, glikole polietylenowe, wosk pszczeli, olej mineralny, rozcieńczalniki takie jak woda i alkohol oraz emulgatory, a także stabilizatory. Preparat do miejscowego podawania może zawierać związek o wzorze I lub jego farmaceutyczną sól w ilości od około 0,1 do około 10% wagowo/objętościowych (masa na jednostkę objętości).

Inne korzystne preparaty według wynalazku obejmują materiały do podawania przezskórnego („opatrunki). Takie przezskórne opatrunki można stosować w celu uzyskania ciągłej lub nieciągłej infuzji związku według wynalazku w kontrolowanych ilościach. Budowa i zastosowanie przezskórnych opatrunków do dostarczania środków farmaceutycznych są dobrze znane w dziedzinie. Patrz, na przykład patent St. Zjedn. Ameryki Płn. o numerze 5023252, udzielony 11 czerwca, 1991. Takie opatrunki mogą umożliwiać dostarczanie środków farmaceutycznych w sposób ciągły, pulsacyjny lub na żądanie.

W celu lepszego zilustrowania działania związku według wynalazku, poniżej przedstawiono typowe kompozycje farmaceutyczne.

Przykładowy preparat 1

W następujący sposób przygotowano twarde kapsułki ż elatynowe zawierają ce następujące składniki:

Składnik Ilość (mg/kapsułkę)

Substancja czynna 30,0

Skrobia 305,0

Stearynian magnezu 5,0

Powyższe składniki miesza się i wprowadza do twardych kapsułek żelatynowych w ilości 340 mg.

Przykładowy preparat 2

Stosując poniższe składniki wytworzono tabletkę:

Składnik Ilość (mg/tabletkę)

Substancja czynna 25,0

Mikrokrystaliczna celuloza 200,0

Koloidalny ditlenek krzemu 10,0

Kwas stearynowy 5,0

Składniki miesza się i prasuje na tabletki, każda o masie 240 mg.

Przykładowy preparat 3

Suchy proszkowy preparat do inhalacji przygotowano z następujących składników:

Składnik Masa %

Substancja czynna 5

Laktoza 95

Substancję czynną zmieszano z laktozą i mieszaninę wprowadzono do inhalatora suchego proszku.

Przykładowy preparat 4

Tabletki, każda zawierająca 30 mg substancji czynnej, przygotowano w następujący sposób: Składnik Ilość (mg/tabletkę)

PL 212 199 B1

Substancja czynna 30,0 mg

Skrobia 45,0 mg

Mikrokrystaliczna celuloza 35,0 mg

Poliwinylopirolidon (w postaci 10% roztworu w sterylnej wodzie) 4,0 mg

Sól sodowa karboksymetyloskrobi 4,5 mg

Stearynian magnezu 0,5 mg

Talk 1,0 mg

Ilość całkowita 120 mg

Substancję czynną, skrobię i celulozę przepuszczono przez sito nr 20 i starannie wymieszano.

Roztwór poliwinylopirolidonu zmieszano z uzyskanymi proszkami, a następnie przepuszczono przez sito nr 16. Tak wytworzony granulat suszono w temperaturze 50°C do 60°C i przepuszczono przez sito nr 16. Następnie do granulatu wprowadzono sól sodową karboksymetyloskrobi, stearynian magnezu i talk, uprzednio przepuszczone przez sito nr 30, który po wymieszaniu prasowano w tabletkarce, uzyskując tabletki, każda o masie 150 mg.

Przykładowy preparat 5

Kapsułki, każda zawierająca 40 mg leku przygotowano w następujący sposób:

Składnik Ilość (mg/kapsułkę)

Substancja czynna 40,0 mg

Skrobia 109,0 mg

Stearynian magnezu 1,0 mg

Całkowita ilość 150,0 mg

Substancję czynną, skrobię i stearynian magnezu zmieszano, przepuszczono przez sito nr 20 i wprowadzono do twardych kapsułek ż elatynowych w iloś ci 150 mg.

Przykładowy preparat 6

Czopki, każdy zawierający 25 mg substancji czynnej przygotowano w następujący sposób:

Składnik Ilość

Substancja czynna 25 mg

Glicerydy nasyconych kwasów tłuszczowych 2000 mg

Substancję czynną przepuszczono przez sito nr 60 i zawieszono w uprzednio stopionych glicerydach nasyconych kwasów tłuszczowych, przy minimalnym ogrzewaniu. Mieszaninę następnie odlewano do postaci czopka o nominalnej masie 2,0 g i pozostawiono do ochłodzenia.

Przykładowy preparat 7

Zawiesiny, każda zawierająca 50 mg leku w dawce 5,0 ml przygotowano w następujący sposób:

Składnik Ilość

Substancja czynna 50,0 mg

Guma ksantanowa 4,0 mg

Sól sodowa karboksymetylocelulozy (11%)

Mikrokrystaliczna celuloza (89%) 50,0 mg

Sacharoza 1,75 g

Benzoesan sodu 10,0 mg

Środek smakowy i barwiący dowolna ilość

Oczyszczona woda do 5,0 ml

Substancję czynną, sacharozę i gumę ksantanową zmieszano, przepuszczono przez sito nr 10, po czym zmieszano z uprzednio przygotowanym roztworem mikrokrystalicznej celulozy i soli sodowej karboksymetylocelulozy w wodzie. Benzoesan sodu, środek smakowy i barwiący rozpuszczono w niewielkiej iloś ci wody i po dodaniu wymieszano. Nastę pnie dodano wodę w iloś ci wystarczają cej do uzyskania wymaganej objętości.

Przykładowy preparat 8

Kapsułki, każda zawierająca 15 mg leku przygotowano w następujący sposób:

Składnik Ilość (mg/kapsułkę)

Substancja czynna 15,0 mg

Skrobia 407,0 mg

Stearynian magnezu 3,0 mg

Całkowita ilość 425,0 mg

PL 212 199 B1

Substancję czynną, skrobię i stearynian magnezu zmieszano, przepuszczono przez sito nr 20 i wprowadzono do twardych kapsułek żelatynowych w ilości 560 mg.

Przykładowy preparat 9

Preparat podskórny można wytworzyć w następujący sposób:

Składnik Ilość

Substancja czynna 1,0 mg

Olej kukurydziany 1 ml

Zależnie od rozpuszczalności substancji czynnej w oleju kukurydzianym, można w tym preparacie stosować do około 5,0 mg lub więcej substancji czynnej, jeśli to pożądane.

Przykładowy preparat 10

Preparat do miejscowego podawania można przygotować w następujący sposób:

Składnik Ilość

Substancja czynna 1-10 g

Wosk emulgujący 30 g

Ciekła parafina 20 g

Biała miękka parafina do 100 g

Białą miękką parafinę ogrzewano aż do stopienia. Wprowadzono ciekłą parafinę i wosk emulgujący, po czym mieszano aż do rozpuszczenia. Dodano substancję czynną i mieszano aż do rozproszenia. Następnie mieszaninę ochłodzono aż do uzyskania ciała stałego.

Fachowcy w dziedzinie wiedzą, że na chorobę Alzheimera można wpływać lecząc pacjenta już dotkniętego chorobą lub przez profilaktykę u pacjenta podejrzanego o możliwość rozwoju choroby. Zatem terminy „leczenie i „stosowanie leczenia odnoszą się do wszystkich sposobów pozwalających na spowolnienie, przerwanie, zatrzymanie, kontrolę lub wstrzymanie rozwoju choroby Alzheimera, lecz nie koniecznie umożliwiają wyeliminowanie wszystkich objawów. Przedstawione sposoby obejmują zapobieganie początkowemu rozwojowi choroby Alzheimera u pacjenta, hamowanie rozwoju choroby Alzheimera i leczenie zaawansowanej choroby Alzheimera.

Stosowany tu termin „pacjent odnosi się do ciepłokrwistego zwierzęcia, w szczególności ssaka, który cierpi na zaburzenie związane ze zwiększonym uwalnianiem i/lub syntezą peptydu β-amyloidu, obejmujące chorobę Alzheimera. Zrozumiałe jest, że świnki morskie, psy, koty, szczury, myszy, konie, bydło, owca oraz ludzie stanowią przykłady zwierząt objętych zakresem tego terminu. Pacjentów potrzebujących takiego leczenia diagnozuje się łatwo.

Stosowany tu termin „skuteczna ilość związku o wzorze I odnosi się do ilości skutecznej w hamowaniu uwalniania i/lub syntezy peptydu β-amyloidu i specyficznie, w leczeniu choroby Alzheimera.

Skuteczną ilość może łatwo określić leczący diagnosta czyli fachowiec w dziedzinie, przez stosowanie typowych technik i obserwowanie objawów w analogicznych przypadkach. Określając skuteczną dawkę N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu, leczący diagnosta rozważa wiele czynników obejmujących, lecz nie ograniczających się do: mocy i właściwości N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu; danego pacjenta; jego budowy, wieku i ogólnego stanu zdrowia; stopnia rozwoju lub stanu zaawansowania choroby; reakcji na lek przez poszczególnego pacjenta; sposobu podawania; biodostępności podawanego preparatu; wybranego reżimu dawkowania; stosowania innych towarzyszących lekarstw; oraz innych towarzyszących okoliczności.

Skuteczna ilość N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-onu mieści się w zakresie od około 0,1 miligrama na kilogram masy ciała dziennie (mg/kg/dzień) do około 100 mg/kg/dzień. Korzystne ilości mogą określić fachowcy w dziedzinie.

N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on można badać w różnych układach biologicznych, w tym za pomocą następujących sposobów.

Przykład A

Komórkowy test przesiewowy do wykrywania inhibitorów produkcji β-amyloidu

Liczne związki o powyższym wzorze I testowano pod względem ich zdolności do hamowania produkcji β-amyloidu w linii komórkowej posiadającej mutację szwedzką. W tym badaniu przesiewowym stosowano komórki (K293 = linia komórkowa nerki ludzkiej), które stabilnie transfekowano genem dla białka prekursorowego amyloidu 751 (APP751) zawierającym podwójną mutację Lys651Met652

PL 212 199 B1 na Asn651Leu652 (numeracja dla APP751) w sposób opisany w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr 94/105698 i Citron i in. 12. Ta mutacja jest powszechnie nazywana mutacją szwedzką i komórki, wskazane jako „293 751 SWE, posiano na 96-studzienkowych płytkach Corning w ilości 2-4 x

10⁴ komórek na studzienkę, w minimalnym podłożu Dulbecco (Sigma, St. Louis, MO) plus 10% płodowej surowicy bydlęcej. Liczba komórek jest ważna, aby osiągnąć wyniki ELISA β-amyloidu w liniowym zakresie testu (~0,2 do 2,5 ng na ml).

Po inkubacji przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze zrównoważonym 10% dwutlenkiem węgla, ośrodek usunięto i zastąpiono 200 μl ośrodka zawierającego związek o wzorze I (lek) na studzienkę, przez dwugodzinny okres wstępny i komórki inkubowano jak powyżej. Zapasy leku wytworzono w 100% sulfotlenku dimetylu tak, aby końcowe stężenie sulfotlenku dimetylu w leku stosowanym w leczeniu nie przekraczało 0,5% i właściwie zazwyczaj wynosiło 0,1%.

Pod koniec okresu wstępnego, ośrodek ponownie usunięto i zastąpiono świeżym lekiem zawierającym ośrodek jak powyżej i komórki inkubowano jeszcze przez dwie godziny. Po traktowaniu, płytki odwirowywano w urządzeniu Beckman GPR przy 1200 obrotów na minutę przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby wyizolować pozostałości komórek z kondycjonowanego ośrodka. Z każdej studzienki, 100 μl kondycjonowanego ośrodka lub jego odpowiedniego rozcieńczenia przeniesiono do płytki ELISA uprzednio pokrytej przeciwciałem 266 [P. Seubert, Nature (1992) 359:325-327] przeciw aminokwasom 13-28 białka β-amyloidu, jak opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym, nr 94/105698 i przechowywano w temperaturze 4°C przez noc. Test ELISA z zastosowaniem znakowanego przeciwciała 3D6 [P. Seubert, Nature (1992) 359:325-327] przeciw aminokwasom 1-5 białka β-amyloidu przeprowadzono następnego dnia, w celu pomiaru ilości wytwarzanego białka β-amyloidu.

Efekty cytotoksyczne związków zmierzono stosując zmodyfikowaną metodę Hansena i in. Do komórek pozostałych na płytce do hodowli tkankowej dodano 25 μl roztworu podstawowego bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-di-fenylotetrazoliowego (MTT) (Sigma, St. Louis, MO) (5 mg/ml) do końcowego stężenia 1 mg/ml. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez jedną godzinę i aktywność komórkową zatrzymano przez dodanie równej objętości buforu do Iizy MTT (20% wagowo/objętościowych dodecylosiarczanu sodu w 50% dimetyloformamidzie, pH 4,7). Całkowitą ekstrakcję osiągnięto przez wytrząsanie w ciągu nocy w temperaturze pokojowej. Różnicę pomiędzy OD562 nm i OD650 nm jako wskaźnik żywotności komórek zmierzono w czytniku mikropłytkowym Molecular Device UVmax^.

Wyniki testu ELISA białka β-amyloidu dopasowano do standardowej krzywej i wyrażono jako ng/ml białka β-amyloidu. W celu znormalizowania do cytotoksyczności, te wyniki podzielono przez wyniki MTT i wyrażono jako zawartość procentową wyników z kontroli bez leku. Wszystkie wyniki uśredniono i policzono odchylenie standardowe z co najmniej sześciu równoległych testów.

Przykład B

Hamowanie in vivo uwalniania i/lub syntezy β-amyloidu

Ten przykład ilustruje jak można badać związki według wynalazku pod kątem hamowania in vivo uwalniania i/lub syntezy β-amyloidu. Do tych doświadczeń zastosowano 3- do 4-miesięczne myszy PDAPP [Games i in., (1995) Nature 373:523-527]. Zależnie od tego, który związek badano, zazwyczaj komponowano go w ilości pomiędzy 1 i 10 mg/ml. Ze względu na niskie współczynniki rozpuszczalności związków, komponowano je z różnymi rozczynnikami, takimi jak olej kukurydziany (Safeway, South San Francisco, CA); 10% etanol w oleju kukurydzianym; 2-hydroksypropylo-β-cyklodekstryna (Research Biochemicals International, Natick MA); i karboksymetyloceluloza (Sigma Chemical Co., St. Louis MO).

Lek podawano myszom podskórnie za pomocą igły nr 26 i 3 godziny później zwierzęta zabijano metodą narkozy CO2 i pobierano krew metodą nakłucia serca, stosując strzykawkę/igłę tuberkulinową 1 cm³ 25G 5/8 z roztworem 0,5 M EDTA, pH 8,0. Krew umieszczano w pojemniku próżniowym Becton-Dickinson zawierającym EDTA i odwirowywano przez 15 minut przy 1500 x g w temperaturze 5°C. Następnie usuwano myszom mózgi, a korę i hipokamp wypreparowywano i umieszczano w lodzie.

1. Badanie mózgu

W celu przygotowania tkanki hipokampa i kory do testów immunoabsorpcji enzymozależnej (ELISA) każdy obszar mózgu homogenizowano w 10 objętościach oziębionego lodem buforu guanidynowego (5,0 M guanidyna-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) stosując tłuczek napędzany silnikiem Kontes (Fisher, Pittsburgh PA). Homogenaty łagodnie kołysano na obrotowej platformie przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej i przechowywano przed oznaczeniem ilościowym β-amyloidu w temperaturze -20°C.

PL 212 199 B1

Homogenaty mózgu rozcieńczano 1:10 oziębionym lodem buforem kazeinowym [0,25% kazeiny, buforowana fosforanem solanka (PBS), 0,05% azydek sodu, 20 μm/ml aprotyniny, 5 mM EDTA, wartość pH 8,0, 10 μg/ml leupeptyny], tym samym zmniejszając końcowe stężenie guanidyny do 0,5 M, przed odwirowaniem przy 16000 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C. Następnie próbki rozcieńczano, jeśli to konieczne, aby osiągnąć optymalny zakres dla pomiarów ELISA przez dodanie buforu kazeiny z dodatkiem 0,5 M chlorowodorku guanidyny. Wzorce dla β-amyloidu (1-40 lub 1-42 aminokwasów) wytworzono tak, aby końcowa kompozycja zawierała 0,5 M guanidyny w obecności 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).

Wielowarstwowy test ELISA całkowitego β-amyloidu, oznaczający ilościowo zarówno β-amyloid (aa 1-40) jak i β-amyloid (aa 1-42) składał się z dwu monoklonalnych przeciwciał (mAb) dla β-amyloidu. Zastosowano przeciwciało wychwytujące 266 [P. Seubert, Nature (1992) 359:325-327], które jest specyficzne dla aminokwasów 13-28 β-amyloidu oraz przeciwciało 3D6 [Johnson-Wood i in., PNAS USA (1997) 94:1550-1555], które jest specyficzne dla aminokwasów 1-5 β-amyloidu i było biotynylowane i służyło w teście jako przeciwciało reporterowe. W procedurze biotynylacji 3D6 stosowano protokół wytwórcy (Pierce, Rockford IL) oznaczania biotyną NHS immunoglobulin, z tym wyjątkiem, że stosowano 100 mM bufor wodorowęglanu sodu, pH 8,5. Przeciwciało 3D6 nie rozpoznawało wydzielanego białka prekursorowego amyloidu (APP) lub pełnej długości APP, ale wykrywało tylko postacie β-amyloidu z kwasem asparaginowym przy końcu aminowym. Test ma dolną granicę czułości ~50 pg/ml (11 pM) i nie wykazuje reaktywności krzyżowej na endogenne mysie białko β-amyloidu w stężeniach aż do 1 ng/ml.

W konfiguracji wielowarstwowego ELISA oznaczającego ilościowo poziom β-amyloidu (aa 1-42) stosowano mAb 21F12 [Johnson-Wood i in., PNAS USA (1997) 94:1550-1555] (które rozpoznaje aminokwasy 33-42 β-amyloidu) jako przeciwciało wychwytujące. Biotynylowane 3D6 było także w tym teście przeciwciałem reporterowym, które ma dolną granicę czułości ~125 pg/ml (28 pM).

Wychwytujące mAb 266 i 21F12 nakładano w ilości 10 μg/ml do 96-studzienkowych płytek do testu immunologicznego (Costar, Cambidge MA), przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie zawartości płytek zasysano i blokowano 0,25% albuminą osocza ludzkiego w buforze PBS przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym przechowywano je osuszone w temperaturze 4°C aż do zastosowania. Płytki przed użyciem ponownie uwodniono buforem do przemywania (solanka buforowana Tris, 0,05% Tween 20). Próbki i standardy dodano do płytek i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Płytki przemyto 3 razy buforem do przemywania pomiędzy poszczególnymi etapami testu. Biotynylowane 3D6, rozcieńczone do 0,5 μg/ml w kazeinowym buforze do inkubacji (0,25% kazeina, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) inkubowano w studzience przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Do studzienki dodano awidynę-HRP (Vector, Burlingame CA) rozcieńczoną 1:4000 w kazeinowym buforze do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodano substrat kolorymetryczny, Slow TMB-ELISA (Pierce, Cambridge MA) i pozostawiono do przereagowania przez 15 minut, po czym reakcję enzymatyczną zatrzymywano przez dodanie 2N H2SO4. Produkt reakcji oceniano ilościowo stosując urządzenie Molecular Devices Vmax (Molecular Devices, Menlo Park CA) mierzące różnicę absorbancji przy 450 nm i 650 nm.

2. Badanie krwi

Osocze EDTA rozcieńcza się 1:1 w rozcieńczalniku do próbek (0,2 gm/l fosforanu sodu · H₂O (jednozasadowy), 2,16 g/l fosforanu sodu · 7 H₂O (dwuzasadowy), 0,5 g/l timerozalu, 8,5 g/l chlorku sodu, 0,5 ml Tritonu X-405, 6,0 g/l pozbawionej globulin albuminy surowicy bydlęcej; i woda). Próbki i wzorce w rozcieńczalniku do próbek testowano stosując test całkowitego β-amyloidu (266 wychwytujące/3D6 reporterowe) opisany powyżej dla badania mózgu, z tym wyjątkiem, że zamiast opisanych rozcieńczalników kazeinowych stosowano rozcieńczalnik do próbek.

Claims (2)

1. Związek o wzorze 1, N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyryIo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzoazepin-2-on:

2. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera związek określony w zastrz. 1 i farmaceutycznie dopuszczalny rozcień czalnik.