HU228117B1 - Lactam compound, pharmaceutical composition containing it and use of it for producing pharmaceutical composition - Google Patents

Description

Laktam vegyület, a vegyületet tartalmazó gyógyszerkészítmény és alkalmazása gyógyszerkészítmény előállítására.

A jelen találmány tárgyát a béta-aniíloíd pepiid felszabadulását és/vagy szintézisét gátló vegyületek képezik.

Bizonyos laktámok, amik gátolják a béta-amiloid pepiid félszabadulását és/vagy szintézisét, jól használhatók az Alzheimer kór kezelésében, ezeket a PCT Application No. PCT/US97/22986

A jelen találmány szerinti vegyület, az (N)-((S)~2bidroxi-3metil-hutíríl}- l-(L-alaninil)~(Sj-1 -amino-3-metil-(2,3,4, .5)-tetrahid~ ro~(lH)-3-benzazepin-2-on jól használható a béta-amiloid peptid felszabadulásának és/vagy szintézisének gátlására, és ennek mint előnyös hatékonysági és biztonságossági tulajdonságai vannak.

A. jelen találmány tárgyát az (N)-((S)-2-hidroxí-3-metílbutiríl)-! -(L-alanmil)-(S)-l-amíno~3-metíl-.(2,3,4,5)-tetrahidro~ ÍlH)-3-benzazepin-2-on vegyület képezi.

A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint a jelen találmány tárgya eljárás a béta-amiloid peptid felszabadulásának és/vagy szintézisénak gátlására, ami abból áll. hogy hatékony mennyiséget adunk be az (N)-(fS)-2-bid.roxi-3-metil-butirü)^:-l-(Lalaninil)-(S)-1 -amíno-3-mebl-(2,3,4,5)-tetrahidro-( 1 H)-3-benzazé~ pin-2-on vegyületből, Egy kiemelt megvalósítási mód szerint a ·\ jelen találmány tárgya eljárás az Alzheimer kór kezelésére, ami abból áll, hogy az ilyen kezelésre szoruló betegnek hatékony⁷ mennyiséget adunk be az (N}:-((S|-2-hidroxi-3-'metil-butírÍl)~l~(L·alaninü)-(S)-l-amino-3-metil-(2,3,4,5)-tetráh.ídro-(lH)-3-benzazepin-2-on vegyűletbot A jelen találmány tárgya továbbá eljárás az Alzheimer kór továbbfejlődésének megelőzésére vagy gátlása, ami abból áll, hogy az ilyen kezelésre szoruló betegnek hatékony mennyiséget adunk be az (N)-((S|-2-hidroxí-3-metil-butíríl)-l-(L~ alanil):-(S)·- l-a.mmO3-metil-(2,3_;Í4_;S}-tetrahidro-(lH)-benzazepm2~on vegyületből.

tárgya egy gyógyászati készítmény, ami az (N)-((S)-2-hidroxi-3·metil-butiril}-l-(L-aIaninil):~(S):-l~amino-3~metil(2,3._J4,5)“tetrahÍdro-{lH)-3-benzazepin-2-on vegyületet és egy gyógyászatilag elfogadható higítószert tartalmaz. Ezek a készítmények jól használhatók a béta-amiloid pepiid felszabadulásának. és/vagy szintézisének .gátlásában, beleértve az Alzheimer kör kezelését ís.

Az alábbiakban megadjuk a leírásban használt szakkifejezések jelentését.

Az ,,ee” vagy „enantiomer fölösleg* szakkifejezés arra a százalékra utal, amivel az egyik enantiomer, az Ei fölöslegben van. egy mindkét enantiomert tartalmazó keverékben (Ei+Ea), és a következő egyenlettel lehet kiszámítani:

((Ei:-E₂HEi*B2$*löO%=ee.

XX *Χ

X * X X +

Amint az a szakterületen jól ismert, az enantíomer fölösleg meghatározható a. vegyületek vagy azok származékai kapilláris elektroforézísével és királis BPLC-jéveL

A továbbiakban a Cahn-Prelog-Ingold jelöléseket, azaz az (R) és (8) jelölést, valamint az L és D jelölést használjuk, a glleeraldehid ízomerjeíbez viszonyítva, ha egy specifikus izomerekre hivatkozunk.

A jelen találmány szerinti vegyületek az alábbiakban ismertetett módon állíthatók elő. Az alábbi A reakcióegyenletben az összes szobsztituens jelentése, hacsak külön nem jelezzük az eltérést, ugyanaz, mint amint az előzőkben definiáltunk, és az összes reagens a szakterületen jól ismert és elfogadott.

Az A reakcióegyenlet 1. lépésében a I képletű Nmetilfe.nila.mint acilezzük egy megfelelő biszalkozikarbonilacetát transzfer reagenssel, így kapjuk a 11 általános képletű vegyületet. Az N~metilfenilamin kereskedelmi forgalomban van, és könnyen előállítható 2-brőm- vagy 2~klór-eíílbenzol reagáltatásával, a szakterületen jól ismert és elfogadott körülmények között. Azt tekintjük megfelelő biszalkoxikarbon.ilaeetát transzfer reagensnek, amiben az R4 jelentése Cj-Cx alkilcsoport, és a biszalkoxikarbonilacetá.t csoportot átviszi a í képletű vegyületre jBen-íshai: Tetrahedron 43, 439-450 (1987)].

Például a I képletű vegyületet reagáltatjuk egy megfelelő biszalkoxikarbonil-ecetsawal, így kapjuk a Π általános képletű vegyületet. Az ilyen kapcsolási reakciók elfogadottak a peptidszintézisben, és az itt használt szintetikus módszerek hasznaibatök. Például jól ismert kapcsoló reagensek, úgymint a ka dümidek használhatók ennek az acilezésnek a megkönnyítésére, a jól ismert adalékanyagok, azaz- például az N-hidrosdszukcinímid, l-hidroxibenztriazol, stb. használatával vagy anélkül. Az ilyen kapcsolási reakciókban gyakran használnak egy alkalmas bázist a reakcióban keletkező sav megkötésére. A használható bázisok közé tartozik például a tríe diám ín, az Ν,Ν-diízopropiletilamín, az N-etilmorfolin és hasonlók. Ezt a reakciót hagyományos módon egy inért apród kus poláros oldószerben, azaz például dimeiilíormamidhan, áiklőrmetánhan, kloroformban, acetonitrilhen, tetrahidrofuránban és hasonlóban hajúak végre. A reakciót tipikus esetben körülbelül 0-60 ^C'G közötti hőmérsékleten hajtjuk végre, és ehhez tipikus esetben 1-24 óra kelt A reakció teljes befejeződése után a II általános képletű terméket hagyományos módszerekkel nyerjük ki, beleértve az extrakciót, a kicsapást, a kromatográfiát, a szűrést, a trittirálást, a kristályosítást és hasonlókat.

Egy másik változat szerint például a 1 képletű vegyületet érintkezésbe hozzuk egy megfelelő biszalkoxikarbonil-aeetilkloriddal, így kapjuk a II általános képletű vegyületet. Az ilyen savklorídok könnyen előállíthatök a megfelelő savakból, a szakterületen jól ismert módszerek alkalmazásával, azaz például foszfortriklorid, foszforoxikiorid, foszforpentaklorid, tíonüklorid vagy Qxaiilklorid használatával, kismennyíségu dímedlforniamiddal vagy anélkül, egy inért oldószerben, azaz például tokióiban, díklőrmetánban vagy kloroformban; 0-80 °C közötti * » Ο

hőmérsékleten. A reakciót tipikus esetben körülbelül 1-24 óra hosszat hajtjuk végre. A savklorid izolálható és tisztítható, de •gyakran használható közvetlenül is, izolálással és/vagy tisztítással vagy anélkül Ezekben az acilezési reakciókban gyakran használnak egy megfelelő bázist a reakcióban keletkező sav megkötésére. A megfelelő bázisok közé tartozik például a piridin, a. írietilamm, az N,N~dhzopropilefilaram, az N-metilmorfolin és hasonlók. Á reakciót hagyományosan ínért aprotikus poláros oldószerben, azaz például diklórmetánban, kloroformban, tetrahídrofuránban és hasonlóban hajtjuk végre. A reakciót tipikus esetben körülbelül -20 °C és körülbelül 80 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre, és tipikus esetben ebhez körülbelül 1-24 óra kell. A reakció teljes lejátszódása után a II általános képletű terméket hagyományos módszerekkel nyerjük ki. beleértve az extrakciőt, a kícsapást, a kromatográfíát, a szűrést, a triturálást, a kristályosítást és hasonlókat.

.gyűletet ciklízálva kapjuk a KI általános képletű vegyűletet.

A II általános képletű vegyűletet például egy savval, azaz például metánszulfonsawal vagy kénsavvai hozzuk érintkezésbe. A reakciót tipikus esetben ügy hajtjuk végre, hogy a. kiválasztott savat használjuk oldószerként. A. reaklánsokat. tipikus esetben először körülbelül -20 ^CC és körülbelül 80 ^C'C közötti hőmérsékleten keverjük össze, majd hagyjuk felmelegedni, körülbelül környezeti hőmérséklettől körülbelül 60 °C-ig terjedő hőfokig. A cíklizációs reakcióhoz tipikus esetben körülbelül 12-72 óra szűk* X .*·♦ » » « * A * <· , * · «

V Φ * »«»* X* <» séges. A reakció teljes lejátszódása után a II általános képletü terméket hagyományos módszerekkel nyerjük ki, beleértve az extrakcíőt, a kicsapást, a kromatográfiát, a szűrést, a triturálást, a kristályosítást és hasonlókat.

Az A reakcióegyenlet 3. lépésében a Ifi képletü vegyűletről eltávolítjuk a védőcsoportot, így kapjuk a IV képletü vegyületet.

Az ilyen alkoxikarbonil amin védőcsoportok eltávolítása a szakterületen jól ismert és elfogadott (Frotecting Groups ín örganíe Synthesis, Theodora Greene, 1. és 2. kiadás, WileyInterscience; Ben-íshak Tetraheöron 43, 439-450 (1987)].

A B reakcióegyenlet 1. lépésében egy megfelelő, V általános képletü fenilecetsavat kapcsolunk egy⁷ megfelelő, VI általános képletü aeetállal, így kapjuk a Vlí általános képletü vegyületet. A V általános képletnek megfelelő fenilecetsavban A2 jelentése aktivált csoport, például -OH, -Cl vagy -Br, Egy megfelelő VI általános képletü ace·tálban Rs jelentése C1-C4 alkilcsoport, .Ezek a kapcsolási reakciók gyakoriak a peptíd-színtézísben és az ott használt szintetikus módszerek használhatók, az A reakcióegyenlet I . lépésében ismertetett módon.

Emellett az A reakcióegyenlet 2. lépésében ismertetett kapcsolást Schotten- Barim körülmények között hajthatjuk végre, a V általános képlet savhalogenidet és egy megfelelő, VI általános képletü acetált egy oldószer-keverékben, azaz például metil-tercbutiléter, etilacetát, tetrahídroíurán, aceton vagy díetiléter és víz. Ezeket a reakciókat egy megfelelő bázissal hajtjuk végre, azaz például nátrium, -hidroxiddal, kálium-hídroridd&l, nátrium-karbo• « V &

náttal, kálium-karbonáttal, nátrium-hidrogénkarbonáttal vagy kálíum-hidrogénkarbonáttal. Λ reakcióelegyet tipikus esetben erősen kevertetjűk vagy rázatjuk, és -20 °C valamint 80 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre, amihez tipikus esetben körülbelül 1-24 óra keik A reakció teljes lejátszódása után a VII általános képletö vegyületet hagyományos módszerekkel nyerjük ki, beleértve az extrakeíót. a kicsapást, a kromatográfiát, a szűrést, a triturálást, a kristályosítást és hasonlókat.

A B reakcióegyenlet 2. lépésében a VII általános képletö vegyületet eíklízáljuk, így kapjuk a VJI1 képletű vegyületet. Az ilyen ciklizálási reakciót egy savban, azaz például kénsavban hajtjuk végre. A reakciót tipikus esetben úgy hajtjuk végre, hogy a. kiválasztott savat használjuk oldószerként. A reakciót általában körülbelül -20 °C és körülbelül 15Ö °C között hajtjuk végre, amihez tipikus esetben körülbelül 1-24 óra kell. A reakció teljes lejátszódása után a VII általános képletö vegyületet hagyományos módszerekkel nyerjük ki, beleértve az extrakciót, a kicsapást, a kromatográfiát, a. szűrést, a triturálást, a kristályosítást és haA B reakcióegyenlet 3. lépésében a Vili képletö vegyülettel amin- transzfer reakciót haj tunk végre, amivel megkapjuk a IX képletö vegyületet. A B reakcióegyenletben oximálást írunk le. Az ilyen oximálást úgy hajtjuk végre, hogy a VIII képletö vegyűlet enolátját egy oxím-transzfer reagenssel, azaz például egy aikii nitrít észterrel hozzuk érintkezésbe. A Vili képletű vegyűlet enolátját úgy állíthatjuk elő, hogy a VHI képletű vegyületet egy

V*0 * ' «Λ * megfelelő bázissal, azaz például terc-butoxiddai, lítium-diizopropilamiddal, lítium hexametiíszilaziddal, nátrium hexametílsziíazíddal, kálium hexanietílszilazíddal és hasonlókkal reagáltatjuk. Az ilyen oximinálásokat ismertetik a szakirodalomban flásd például Wheeler és mtsai: Organíe Syntheses, Coll. Vöt VI, 8401, amiben ismertetik az izoamil nítrit ketonnal való reakcióját, a kívánt oxim előállítása céljából, A reakciót tipikus esetben egy oldószerben, azaz például tetrahidroíuránban hajtjuk végre. A reakciót általában körülbelül -20 °C és körülbelül 50 °C között hajtjuk végre, amihez tipikus esetben körülbelül 1-24 óra kelt A reakció teljes lejátszódása, után a Vili képletű vegyületet hagyományos módszerekkel nyerjük ki, beleértve az extrakcíót, a leicsapást, a kromatográfiáf, a szűrést, a triturálást, a kristályosítást és hasonlókat.

Egy másik változat szerint egy ilyen amin-transzfer reakciót az azidon keresztül is végrehajthatunk.. Azidot úgy állíthatunk elő, hogy a Vili képletű vegyületet egy azid transzfer reagenssel, azaz például toluolszulibnsav azidda.1 és triízopropítbenzolszulfonii aziddal reagáltatjuk, Ezeket a reakciókat is ismertetik a szakirodalomban [Evans és mtsai: Journal of the American Chemical Society 112, 4011-4030 (1990)[. A reakciót tipikus esetben egy oldószerben, azaz például tetrahidroíuránban hajtjuk végre. A reakciót általában körülbelül -20 °C és körülbelül 50 °C között hajtjuk végre, amihez tipikus esetben körülbelül 1-24 óra kell. A reakció teljes lejátszódása után a Vili képletű vegyületet hagyományos· módszerekkel nyerjük ki, beleértve az

X * » X <>

extrakciót, a kicsapást, a kromatográfiai, a. szűrést, a tríturálá a kristályosítást és hasonlókat.

Amint azt a B reakcióegyenlet 4. lépésében ismertetj ük, egy oximot redukálunk a IV képletű vegyűletté. Ezeket a reakciókat hidrogén és megfelelő katalizátor, azaz például Raney-nikkel vagy palládium katalizátor, úgymint csontszenes palládium használatával hajtjuk végre. A reakciót tipikus esetben oldószerben, azaz például tetrahidrofuránban, etilacetátban vagy alacsony szénatomszámú alkoholokban, úgymint metanolban, etanolban és izopropanolban hajtjuk végre, vagy ecetsavban,, vízben, vizes ammóniában és hasonlókban, valamint ezek keverékében. A reakciót általában, atmoszférikus és 4137 kPa közötti nyomású hidrogén atmoszférában hajtjuk' végre. A reakciót általában körülbelül 20 °C és körülbelül 100 ^CC között haitiúk vésre, amihez tipikus esetben körülbelül 1-24 óra kell A reakció teljes lejátszódása után a IV általános képletű. vegyületet hagyományos módszerekkel nyerjük ki, beleértve az extrakciót, a kicsapást, a kromatográ.üát, a szűrést, a triturálást, a kristályosítást és hasonlókat.

Egy másik változat szerint az amint egy aziddal visszük át, és az azido-csoportot. redukáljuk. Ezeket a redukciókat az előzőkben ismertetett módon, redukcióval hajtjuk végre.

Az (N)~((S)-2”hídroxí~3-metíl~butiri.l)- l-(L-alaníl)-(S)-l-amino3-metil-(2,3,.4,5)~tetrahidro-(lHj~benzazepm-2-on előállítási eljárásait. a C reakcióegyenletben ismertetjük.

« *

A C reakcióegyenlet 1. lépésében egy megfelelő. IV általános éplet laktám sztereokémiái .rezolváíását ismertetjük, így kapjuk aX képletű laktámot, azaz lényegében tiszta (Sj-l-amánö-3-metil(2,3.4,5)-tetrahídro· (1 HJ~3~benzazepin-2~ont. A jelen találmány szerint lényegében tiszta (Sj-l~amino~3~metil~f2,3,4,5)~tetrahidro~ 3-benzazepin~2~ont lehet előállítani, ami az (S)-enantiomert %-nál, előnyösen 90%-nál, még előnyösebben 95%-nál, és légelőnyösebben 97%-nál nagyobb mennyiségben tartalmazza, iul a. IV általános képletű v a dibenzoiltartarát, (RHri’ő-kámforszulfonsav és (D)-(~)-mandulasav sók frakeionált kristályosításával rezolválhatjuk. Az várható, hogy számos különböző dibenzoiltartarát használható erre a célra. Pontosabban,, azokat a dibenzoil észtereket részesítjük előnyben, amik para helyzetű helyettesítőket tartalmaznak az alábbi csoportokból.; hidrogén, halogén, C1-C4 alkil és C1-C4 alkoxi, és a dip-toluo.il-tart&rátot részesítjük előnyben. A di-p-toluoil-L-tartarátot használjuk az (Sj izomer előállítása céljából.

A jelen találmány szerinti eljárásban a IV általános képletű vegyületet érintkezésbe hozzuk a kiválasztott savval. Általában a kiválasztott sav körülbelül 0,4 mól-ekvivalenstől a nagy fölöslegig terjedő mennyisége használható, ebből a körülbelül 0,4-1,5 mólekvivalenst részesítjük előnyben, illetve a körülbelül 0,5-1,1 mólekvivalenst részesítjük leginkább előnyben.

Az eljárást .tipikus esetben, ügy hajtjuk végre, hogy a savaddíciős sót egy oldatból kristályosítjuk. Pontosabban a következő oldószereket részesítjük előnyben: alacsony szénatomszámú alkoholok, beleértve a metanolt, az etanolt, az npropánok, az izopropanolt, a butanolt, a szek-butanolt, az izobutanolt, a terc-butanolt, az amilalkoholt, az ízoamilalkohoit, a terc-amílalkoholt, a hexánok, a ciklopentanolt és a ciklohexanolt, ezek közül leginkább a metanolt, az etanolt és az izopropanolt részesítjük előnyben.. Egy antí-oldöszer használata, előnyös lehet. A továbbiakban az „anti-oldószer” szakkifejezés olyan oldószert jelent, amiben a só szignifikánsan rosszabbul oldódik mint az oldószerben. Előnyösen, ha egy anti-oldőszert használunk, akkor az elegyedik a kiválasztott oldószerrel. Az alkalmas anti-oldoszerek közé tartoznak az éterek, azaz például a dietíléter, a metil-tere-butil éter és hasonlók, valamint az alacsony szénatomszámű alkíl-aeétátok, azaz például a metilacetát, az etílacetát, az ízopropílacetát, a propílacetát, az izobutil acetát, a szek-butil acetát, a butílaeetát, az amllacetát, az izoamllacetát és hasonlók, valamint az alkánok, azaz például a pentán, hexán, heptán, oiklohexán és hasonlók. Ha a. jelen találmány szerinti eljárást úgy hajtjuk végre, hogy a savaddíciős sót kristályosítjuk a raeém elégyből, akkor vigyázni kell arra, hogy egy anti-oldőszert használjunk, azért, hogy elkerüljük a nemkívánt díasztereomer só kristályosodását.

A kristályosítást tipikus esetben körülbelül 40 °C kiindulási hőmérséklettől a kiválasztott oldószerfek) reilux hőmérsékletéig terjedő hőfokon hajtjuk végre, körülbelül 0,05 mól és körülbelül 0,25 mól kiindulási koncentrációval, A keveréket azután lehűtjük, így kapjuk meg a. sőt. A beoltás előnyös lehet. A khndulásí csapadék körülbelül 4-48 óráig tartó keverése előnyös lehet. A kristályosodó oldatot előnyösen lassan hűtjük le. A kristályosodáshoz az oldatot szobahőmérséklet és körülbelül -20' °C közötti hőfokra hűtjük le. A. sót azután a szakterületen jól ismert, technikával gyűjthetők össze, beleértve a szűrést, a dekán tálast, a centriíugáiást, a bepárlást, szárítást és hasonlókat. A X képietű vegyület használható közvetlenül, a kiválasztott sav savaddíciós sójaként. Egy másik változat szerint felhasználás előtt a X képietű vegyületet izolálhatjuk egy másik savaddícíós só formájában, a sav lecserélése után, vagy bázisként, izolálhatjuk, lúgos körülmények között való exirakeiéval, amint az a szakterületen jól ismert és elfogadott.

Egy előnyben részesített eljárással az (S)-I-amino-3-m.et.il-(2,3,4,5)-tetrahidro- (1 H|-benzazepm-2-on-t lényegében enaníiome-r tisztaságban kapjuk meg, az 1-amíno~3-metil~(2·,3,4,5)tetrahidro-(lH)~benzazepín-2-ont savaddícíós só formájában, egy olyan sőt használva erre a célra, amit a következő csoportból választhatunk ki: di-p-tolil-h-börkosav, (R}~{-)~d~kámíörszulfonsav és (D)-(-)-mandulasav, dinamikus eljárásként, aromás aldehid jelenlétében. A dinamikus eljárásnak az az előnye, hogy az 1amraó-3-metil-(2,3,4,5)- tetrahidro- {1 H)-benzazepin-2-on. a kristályosítás során egyetlen izomerré való konverzión megy át, javul a hozam, és el lehet kerülni egy mellékterméket, ami tartalmazza a nem-kívánt izomert.

Az várható, hogy számos különböző aromás aldehid alkalmas a dinamikus eljáráshoz, és mi azt tapasztaltuk, hogy számos * X

♦.« ♦* különböző aldehid a gyakorlatban különösen jól használható. Specifikusan azt találtuk, hogy a szalicilsavak különösen előnyösek, és a szalicilaldehid, az S-nítro-sz&líeilaldehid és a 3,5diklőrszalicílaldehid különösen jól használható a jelen találmány szerinti dinamikus rezolválási eljárásban.

Ennek megfelelően, ha a jelen találmány szerinti eljárást dina(2,3,4,5htetrahidro-~(lH)-benzazepin-2-ont egy aromás aldehid jelenlétében érintkezésbe hozzuk a kiválasztott savval. A dinamikus rezolváláshoz körülbelül 0,9-1,2 mól ekvivalens savat használunk, ebből a körülbelül 1 mól ekvivalenst részesítjük előnyben. Az aromás aldehidet általában katalitikus mennyiségban használjuk. Tipikus esetben körülbelül 0,5-0,001 mól ekvivalens aromás aldehidet használunk, ebbel a. körülbelül 0,ΙΑ dinamikus eljárást tipikus esetben egy oldószerben hajtjuk végre, az előzőkben ismertetett antí-oldószer nélkül. Az 1amino-3~metil-(2,3,4,5)-tetrahidro-(lH)-benzazepin-2“On, a. kiválasztott sav és az aromás aldehid keverékét kevertetjük, és hagyjuk, hogy lejátszódjon a kívánt izomerré való konverzió. Ezt a. konverziót általában, szobahőmérséklettől az oldószer reflux hőmérsékletéig terjedő hőfokon hajtjuk végre. A konverzióhoz általában 6-48 óra szükséges,

Amint az a szakterületen jártas szakember számára .nyilvánvaló, ha a jelen találmány szerinti, eljárást dinamikus rezolválásként hajtjuk végre, akkor az I-amino-3-metí!-(2,3,4,5)¢4 ♦ X tetrahidro/ 1 H)-benzazepin~2~on savaddícíós sójának használatát bonyolíthatja az izolált termékben levő kísmennyiségű aromás aldehid jelenléte. Tehát a dinamikus rezol válás után az az előnyős, ha az (S)-l-amino^3-metil-(2,3-,4,5}~tetrahidro-(lH).benzazepin-2-ont sócserével izoláljuk, előnyösen sösavas sóként, felhasználás, vagy bázissá való alakítás előtt.

A C reakcióegyenlet 2. lépésében ismertetjük egy megfelelő, PgXH-CHCH.3-C(O)-A képietü amino-védett alanin és egy megfelelő, X képietü laktam kapcsolását A megfelelő amino-védett alaninban a Pg jelentése egy amino védőcsoport, konfigurációja L, és A jelentése aktiváló csoport, például -OH vagy -Cl, és képes kapcsolódni a X képietü vegyület aminocsoportjához. Az ilyen amino-védett alaninok könnyen hozzáférhetők a szakterületen jártas szakember számára.

C reakcióegyenlet 2. lépésében ismertetett kapcsolási magában foglal egy olyan reakciót, amit hagyományosan a peptid-szintézis során alkalmaznak, és az itt használt szintetikus módszerek is alkalmazhatók. Ezeket a módszereket az A reakcióegyenlet 1. lépésében ismertetjük.

A C reakcióegyenlet 3. lépésében ismertetjük a XI képietü vegyület védőcsoport-mentesítését, így kapjuk a XII képietü vegyületet. Az amino védőcsoportok ilyen védőcsoport-mentesítése a szakterületen jól ismert és elfogadott.

A C reakcióegyenlet 4. lépésében ismertetjük egy megfelelő, XIII képietü vegyület, (CH3)2€H~€HÖH-€(0)Ai, és a XII képietü vegyület kapcsolási reakcióját, amivel megkapjuk a XVI képietü vegyületet. A XIII képletű vegyület S-ízomerje kereskedelmi forgalomban van, és a szakterületen jól ismert, beleértve a PCT/US97/22986 számú PCT szabadalmi bejelentés (benyújtva: 1997. december 22.}. A 3. lépésben ismertetett kapcsolási reakciót a ΧΠΙ képletű savval hajtjuk végre (olyan vegyüíetek, amikben Ai jelentése -011 csoport}, vagy az ezekből származó savhalogenidekkel (olyan vegyüíetek, amikben Aj jelentése -Cl vagy -Br), ahhoz hasonló módszerrel, amit az A reakcióegyenlet

1. lépésében ismertettünk.

A XVI képletű vegyület előállításának egy alternatív módszerét ismertetjük a C reakcióegyenlet 5. lépésében, ami egy megfelelő, X képletű vegyület, egy megfelelő, XIV képletű vegyület, és a (CH₃}2-CH-CHOH-C(O}-NH CHCFÍ3 kapcsolási reakcióját mutatja be, ezzel közvetlenül előállítva a. XVI képletű vegyületet. Egy megfelelő, X képletű vegyületet ismertetünk a 2. lépésben. Egy megfelelő, XIV képletű vegyüleíben ugyanaz a sztereokémia, mint a XVI képletű végtermékben.

A XIV képletű vegyületet könnyen előállíthatjuk, ha karboxi-védett ammosavakat (HgX-CHCH3-C(O}OPgi) kapcsolunk a XIII képletű vegyületekkel, az előzőkben Ismertetett módon. Ismét azt kell mondanunk, hogy ezek a kapcsolási reakciók a szakterületen jól ismertek, és lehetővé teszik a termék előállítását, ami a, védőcsoport eltávolítása után biztosítja a XIV

A XVI képletű vegyület számos különböző technikával izolálható és tisztítható, beleértve a kristályosítást. Az oldatból φ* való kristályosítási és az iszapolási technikák használhatók. Fontosabban. a jelen találmány szerinti vegyület előállítható, számos különböző vízmentes és vizes oldószerből. A megfelelő oldószerek közé tartozik az aeeton, az alacsony szénatornszámű alkoholok (mint például a metánok etanol és hopropanol), az ecetsav és az acetonitril. vízzel és etilacetáttal, vagy ezek nélkül, dietiléter és metil-tere-butiléter, A gyakorlatban azt találtuk, hogy a. vizes aeeton az előnyős. Egy adott vizes oldószer esetében, a használt víz mennyisége függ az (N)-((S)-2-hidroxi~3~metíí~butiril)-l-(Lalaninil)- (S)~ 1 -mnino~3~metil- (2,3,4,5) - tetrahidro- (1H) -3 -benzaze pin-2~onnak az oldószerben a vízhez való relatív oldhatóságától, és attól, hogy kristályosítási vagy iszapolási technikát haszA kristályosítást általában ügy hajtjuk végre, hogy 2-hidroxi-3-metíl-buti.rilJ-1 -(L-alanmilk(S)-1 -amino-3-metil(2,3,4,5)-tetrahidFO~(lli)-3-benzazepin.-2-ont oldjuk egy vizes oldószerben, majd hagyjuk az oldatot lehűlni, több vizet adva hozzá, vagy anélkül, így kapunk szilárd anyagot. A kristályosítást tipikus esetben körülbelül 40 °C és a kiválasztott vizes oldószer reflux-hömérsékletete közötti hőfokon hajtjuk végre. A keveréket azután lehűtjük, így kapjuk a kristályos dihidrátot. A beoltás előnyös leheti A kristályosítási oldatot előnyösen lassan hűljük le. A kristályosításnál az a legjobb, ha a a keveréket szobahőmérklet és -20 °C közötti hőfokra hűtjük.

A jelen találmányt az alábbi, példákkal, és készítményekkel illusztráljuk. Ezek a példák és készítmények: csak az il₄ *♦».« V* ** ♦· * * * ' « XX* ** * ** ψ X ♦ * * * <♦« ΦΧΧ «* **

Insztráeiót szolgálják, és nem szándékunk, hogy ezek a. jelen találmányt bármilyen módon korlátozzák.

A példákban és a készítményekben használt szakkifejezések jelentése a. szokásos, normális jelentésük, hacsak külön nem jelezzük az eltérést. Például a szakkifejezés jelentése Celsius fok; a „mmol” szakkifejezés jelentése míllimól vagy millímólok; A „g” szakkifejezés jelentése gramm vagy grammok; a „ml” szakkifea „adóidat” nézés jezés jelentése milliliter vagy miiül jelentése telített vizes nátríum-klorid oldat; a „THF”' szakkifejezés jelentése tetrahidrofurán; a ,,HPLC” szakkifejezés jelentése nagynyomású íölyadékkromatográfía; stb.

1. Példa

Az l-amino-3-metil-<'2,3;4.5)-tefrahidro-(lH)-ber

-2~on szintézisé

1,1 ekvivalens, 15 ml száraz dímetilformamidban levő nátríum-hídroxid szuszpenzióhoz 0,0042 mól 2,3,4,5-tetrahidro-ÍHbenzazepin-2-ont adunk, 10 ml dímetilformamidban készült oldat formájában. Körülbelül 2 ekvivalens metiljodidot adunk hozzá. Amikor a vékonyréteg kromafográfia alapján teljesen lejátszódott a reakció, akkor a. keveréket jégre öntjük, és etilacetátba extraháljuk. A szerves fázist vízzel, majd só-oldattal mossuk. A szerves fázist azután Na2S04-en szárítjuk, megszűrjük, és csökkentett nyomáson töményítjük. A maradékot HPLC-vel tisztítjuk (LC 2000), etílacetát/hexán rendszerrel eluáljuk, így kapjuk a. 3-~metil-2,3,4,5-tetrahidro-1 B~benzazepín-2-ont, !8 j, ί « *·» * « V Φ φ ♦

Κ»» φφ '» φ «» β » *^: ♦ * ekvivalens 3-metil- (2,3,4,5) --tetrahidrof 1 H)~benzazepin~2~ont oldunk tetrahidroiúránhan és 1,2 ekvivalens- izoamílnitritet adunk hozzá. Az elegyet jégfürdőben (3 °C-ra kötjük. Cseppenként 1,1 ekvivalens NaHMDS-t (1 M) adunk hozzá tetrahídrofuFanban. Miután I óra. hosszat, vagy a reakció teljes lejátszó£>

M. az elegyet töményítjük, majd 1 mol/I vizes sósav oldattal savanyítjuk, és etílacetáttal extraháljuk. A szerves részt megszárítjuk, majd töményítjük, így kapjuk a nyers terméket, amit szilikagéi krom&tográfiávái tisztítva kapjuk az lhidroxííminO“3-metiÍ~(2,3,4_í5)-tetrahidro~(lH)~benzazepin~2-ont. M+H)> 205,1,

Az 1 -hídroxümino3 -metö- (2,3,4,5) -tetrahidro- (1H)-benzaze-pin-2-ont 20:1 arányú EtOH/NKs elegyben oldjuk, majd bombában. hidrogénezzük, Raney nikkelt és 3447 kPa nyomású hidrogént használva, 100 °C~on, 10 óra hosszat. A kapott keveréket megszűrjük és töményítjük, így kapunk egy olajat, amit szilikagéi kramatográfiával tisztítva. kapjuk a címben szereplő vegyületet.

Az_1 -amíno-3“metil-(2,3,4,51-tetrahidn>“< ÍH)-benzazepin-2-on szintézise

Egy húszliteres Marton lombikhoz 5,52 liter (7 térfogat) MTBE-í, valamint 614 g, 5 mól (N-metUamínojacetaldehid dímetil acetált adunk, hogy szobahőmérsékleten oldatot kapjunk. A nátrium-hidrogénkarbonát oldatát úgy állítjuk elő, hogy 546 g (6,5 mmol) nátrium-Mdrogénkarfoonátot és 6,31 liter (8 térfogat) vizet φ φ adunk a Marton reakció-lombikhoz. Az elegyet 10 °C alá hűtjük és 789 gramm (5 mól) fenilacetíl klorid 789 μΐ MTBE ben készített oldatát adjuk 1 óra alatt, cseppenként, a lehűtött reakciöelegyhez. A hozzáadás után a .reakcióelegyet szobahőmérsékleten 1 óra hosszat kevertetjük. Ebben a stádiumban a HPLC elemzés azt mutatja, hogy a reakció teljesen lejátszódott. A 4 térfogatnyi MTBE-vel végzett extraktív feldolgozást és a vízmentes magnézium -szulfáttal való szárítást köve ti egy rotációs bepárlön való tőményítés, így kapunk 1,1.87 kg (98%) N-metil^LN-(2,2dimetoxietil)fenitacetamidot folyadék formájában, (M+H)⁺ ~ 237,9, Egy ötliteres Morton palackhoz erős nitrogén atmoszférában 1,42 liter .kénsavat és 712 g (3 mól) N-metil-M-(2,2-dimetoxietil)fénilacetamidot adunk cseppenként, ami hőt termel (22 °C~ről 78 °C~ ra). A kapott reakcióelegyet azután 3 óra hosszat 110 ^c€~on tartjuk:, majd szobahőmérsékletre hütjük és egy hűszliteres Morton palackba visszük át 10 °C-nál kisebb hőmérsékleten a .reakcióelegyet 9,18 liter (5 mol/1) vizes nátrium-hidroxid hozzáadásával leállítjuk. 2*2,85 liter etilaeetáttal végzett extraktív feldolgozás, nátríumsznliattal való szántás után bepárolva kapunk 520 g (73,5%) 3--metii-6,7~díhidro-2H--3--hen2azepm~2ont szilárd anyag formájában. A további tisztításhoz ezt az anyagot MTBE-ből átkristályosithatjuk, így kapunk egy szilárd anyagot, op~81~82 °C; (ΜΉΚ)⁴·» 174,2.

A 1.13,8 g (0,657 mól) 3-metil-ó,7~dihidro-2'H-3~benzazepin2-on. 0,5 liter tetralndrofuránban készített oldatát 0 °C-ra hűtjük, majd cseppenként 100.75 g (0,86 mól) ízoamil-nitritet adunk hozza. A kapott elegyhez lÁHMDS-t (1 mol/1 tetrahidrofurán oldat, 854 ml, 0,854 mól) adunk, olyan sebességgel, hogy a hőmérséklet 10 °C alatt maradjon. A hozzáadás után a reakcióelegyet 2-3 óra hosszat hagyjuk szobahőmérsékleten kevertetni, miközben a reakció előrehaladását HPLC-vel követjük. A reakció befejeződése után az elegye! 0 ^öC-ra hűtjük, majd a pH-t 12-ről 2-3-ra állítjuk, vizes HC1 használatával (2 mol/1). A kapott csapadékot 12-16 óra hosszat kevertetjók a szűréssel és szárítással való izolálás előtt, így kapunk 86,3 g (64,9%) 1 -hidro2dímino-3metil-ö,7-dihidro~2H-3-benzazepín-2-ont; op«225~226 °C;

(Mriih-203,0.

gramm (0,173 mól) l-hidroxiimino-3-metil-6,7-dÍhidro~ 2H--3--henzazepm-2-on 525 ml etanolhan készített oldatát tesszük egy autokiávba, csontszenes palládiummal együtt (10%, 3,5 g)> híg sósavas (tömény vizes oldatból 17,5 g, 17 ml vízben) szuszpenzió formájában. A kapott keveréket 50 °C-on és 1723 kPa nyomáson hidrogénezzük, amíg a reakció teljesen lejátszódik. A reakcióelegyet egy celitágyon megszüljük, oldószerként etanolt használva, majd a szűrletet 90 ml-re töményítjük. 350 ml vizet adunk a koncentrátumhoz, majd a kapott oldatot újra töményítjük körülbelül 200 ml-re. A vizes oldathoz 350 ml díklörmetánt adunk, mielőtt a vizes oldat pH-ját 11-1.1,5-re állítjuk 1 mol/1 vizes nátrium-hidroxiddal. A szerves részt elválasztjuk, majd a vizes részt 175 ml diklórmetánnal extraháljuk, A kombinált extraktumokat egy maradékig töményítjük, ami állás közben

Ψ > «X **'' ♦♦ * ^f h. » «> *♦* :♦·· kristályosodik, így kapjuk a címben sz op - 69-81 “C; (M+Hh = 191,0.

o vés

Az_1 - amino- 3 - metil- (2,3,4,5b d íhídro- Π H l· 3 -benzazepín - 2 -on szintézise

Egy 22 literes Mórién palackba 4_;73 liter (8 térfogatnál) diklórmetánt, 591 g (4,33 mól) N-metilfenetilamint és 436,7 g (5,2 mól 4,7.3 liter vízben) nátríum-hidrogénkarbonátot teszünk. Az elegvet 5 °C alá hűtjük, majd 70 perc alatt 513,7 g (4,55 mól) klóracetílklorid 887 ml diklórmetánban készített oldatát adjuk cseppenként a lehűtött elegyhez. A hozzáadás után a H.PLC elemzés azt mutatja., hogy a reakció teljesen lejátszódott. A rétegeket szétválasztjuk, majd a vizes fázist diklónnetánnal extraháljuk. A kombinált szerves fázisokat vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, majd rotációs bepárlón tőményítve kapunk 915,7 g (99,8%) .N-metil-N-(2-fenil.etil)-l-klőracetamidot; (M+H)*212,1.

Egy 12 literes palackba nitrogén atmoszférában 883 g: (4,17 mól) N-metil~N-(2-feniletil|- 1-klóracetamidot és 6,18 liter ortodiklórbenzolt teszünk. 1319 g, 10,13 mól) alumíniumkloridot adunk hozzá, ami exoterm reakciót okoz (22-ről 50 ^c,C-ra melegedés). A kapott reakciőelegyet 165 °C-on tartjuk 2,5 óra hosszat, majd szobahőmérsékletre hűtjük, és körülbelül 14 óra hosszat ott tartjuk. A reakciőelegyet körülbelül 0 °'C~ra hűtjük, majd 4 részletben 8,86 liter, körülbelül 5 ®C-os vízhez adjuk, hogy ül 40 ^eC-ra való r ?··>

X * rétegeket elválasztjuk, és a vizes fázist 7,07 liter diklőrmetánnal extraháljuk, majd a rétegeket elválasztjuk. A szerves fázisokat kombináljuk, majd 8,83 liter (1 mol/I) vizes sósavval extraháljuk, utána pedig 7,07 liter telített vizes nátrium-hidrogénkarbonáttal, 'magnézium-szulfáton szántjuk, 88g szílíkagélhez adjuk, majd szilikagél oszlopra visszük (3,53 kg, zsugorított üvegtölcsér 1, diklórmetános szuszpenzióként pakolva. Az oszlopot addig eluáljuk diklönnetánnal, amíg 25 liter összegyűlik, majd etílacetáttal eluáljuk, így kapjuk a terméket. A terméket tartalmazó frakciót bepároljuk, így kapunk 608 gramm (83%) 3-met.ü-(2,3,4,5)tetrahidro-í IH)“3-henzazepin-2-on vörösesbarna szilárd anyagot.

Egy 22 literes lombikban 606 gramm (3,46 mól) 3-metil(2,3,4,5)-tetrahidro-(lHj-3~benzazepin-2-on és 543 gramm (4,35 mól) izoamílnitrit van 7,88 liter tetrahídrofuránban. Az elegyet körülbelül ö ^C-ra hűljük, mielőtt LÍHMD8-t (1 mol/l-es tetrahidrofurán oldat, 4,5 liter, 04,5 mól) adunk hozzá, olyan sebességgel hogv a hőmérséklet körülbelül 7 ^eC alatt maradion. A hozzáadás után a reakcióelegyet körülbelül 2 óra hosszat szobahőmérsékleten kevertetjük, miközben a reakció lejátszódását HPLC-vel követjük. A reakció teljes lejátszódása után az elegyet körülbelül 0 °C-ra hűtjük, majd a pH-t 2 mol/l-es vizes sósavval körülbelül 12-ről körülbelül 2-1-re állítjuk. A kapott csapadékot körülbelül 6 óra hosszat kevertetjük a szűréssel való izolálás és szárítás előtt, így kapunk 604,7 gramm (85,6%) l-hidroximíno-3metíl- (2,3,4,5)- tetrahidr o - (1H) - 3- benzazepin- 2 ~on t.

»*♦ ««X

625 gramm (3,06 mól) l~hídroximmo~3-~metil-(2_s3,4,5)tetrahidro-(lH)-3-benzazepm~2~ont és 15,6 liter 3A eí&nolt elegyítünk. Á kapott elegye! 50 'C-on 1.723 kPa. nyomással hidrogénezzük, erős kevertetés közben, amíg a reakció teljesen lejátszódik (körülbelül 4 óra hosszat), A reakcióelegyet celit-ágyon szűrjük át, oldószerként etanolt használva, majd a szűrletet koncentrálva szilárd anyagot kapunk. A szilárd anyagot 6 liter diklórmetánnal kezeljük, és 1 mol/1 vizes nátrium-hidroxid oldatot adunk hozzá, amíg a vizes réteg pH-ja 11-11,5 közé nem nő. A keveréket kevertetjük, a fázisokat szétválasztjuk, majd a vizes fázist 2 liter diklórmetánnal extraháljuk. A szerves fázisokat magnézium-szulfáton szántjuk, szűrjük, majd rotációs hepárlón bepárolva kapunk 477 g címben szereplő vegyületet (81,9%)..

4. Példa

Az ÍSf-1 -am.mo-3-inetil-í2,3,4,5l-tetrahidro-(lH|-benz.azepln-2-on szintézise

1,544 g (8,1.2 mmol) l~amíno-3-metil-(2,3,4,5)•dib.ídro-(lH)3~benzazepín-2-oní 15 ml metanolban óvatosan addig melegítünk, amíg egy oldatot kapunk. Egy másik lombikban 3,12 g (8,08 mmol) di-p-toluoil-1-borkősavat oldunk 15 ml metanolban, majd a meleg amin-oldatba pipettázzuk. Az elegyet melegítjük, ahogy a szilárd anyag kicsapódik. Újabb 30 ml metanolt adunk hozzá, hogy oldatot kapjunk, amit 30-40 percig relluxáltatunk, majd lassan szobahőmérsékletre bűtjük. így kapunk egy szilárd anyagot. Körülbelül 18 óra hosszat kevertetjük, majd a szilárd

Μ anyagot szűréssel kinyerjük, kismennyiségű hideg metanollal öblítjük, így' kapunk 2,.24 g (S)-l-amino-3-metil-(2,3,4,5)-dihidro~ (lH)-3-benzazepin-2-ont {96%-os hozam, 94,7% ee).

11,83 g (20,5 mmol) (S)-l-amin.o-3-metil-.(2,3,4,5}-dihidro~ (lH)-3-benzazepin--2-on di-p-toluoü-l-borkősav sót oldunk 45 ml vizes nátrium-hidroxid oldatban, és 3*25 ml diklőrmetánnal extrahálj ük. Az egyesített diklórmetán fázisokat. 35 ml vizes nátrrum-bídroxid oldattal mossuk, majd sóoldattal, utána vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. Az oldószer csökkentett nyomáson való eltávolításával kapjuk a. címben, szereplő vegyületet (3,38 g), színtelen olaj formájában (87%-os hozam, 93,2% ee)„ o . Példa

6,0 gramm (31,5 mmol) l-aminO“3-metil-(2.,3,4,5)-dihídro~ (lH)-3“benzazep.ín“2-ont 75 ml metanolban óvatosan melegítünk, hogy oldatot, kapjunk, majd 12,2 g (31,5 mmol) di-p-toluoil-Lborkősav oldattal elegyítjük. 75 ml meleg metanolban. Az oldatot beoltjuk, ekkor szilárd anyag keletkezik. Újabb 100 ml metanolt adunk, hozzá, és az elegyet kevertetjűk. 18 órás ke verte tés után a. szilárd anyag szűréssel összegyűjtjük, kismennyiségű hideg metanollal öblítjük, így kapunk 6,7 g szilárd anyagot, 18 őrá elteltével a. szilárd anyagot kinyerjük, így kapunk 4,4 g (5)-1ami.no-3~metil~(2,3_í4,5)~tetrabídro-(lH)-benzazepin-2-o.nt, A bázis * ♦ * * * * *'*'* »«.«· ¢,

4. példában ismertetett módon való izolálásával kapjuk a címben szereplő vegyületet (96% ee).

Az (8)-l-am.ino-3-met.íl-(2,3,4,5)-t.etralúdro-(lH)-benzazepin-2“On szintézise

Egy 22 literes edényben nitrogén atmoszférában. 438 g (2.,3 mól) l--ainnio~3-metíl~(2,3,4,51~dihidro-(lH)-3-benzazepín-2-ont körülbelül 40 °C-ra. melegítünk. így kapunk egy metanolos oldatot (4,38 ml}. Egy másik lombikban 889,7 g (2,3 mól) dí-ptoIuoil-L-borkősavat oldunk 4,38 liter metanolban, és körülbelül °C-ra melegítjük, mielőtt az Í.--ammo-3-metil-(2,3,4_?5j-dihÍdro~ •3-benzazepin-2-on oldatot hozzáadjuk. A melegítést lytatjuk, és újabb 6,13 liter metanolt adunk hozzá, mielőtt ez elegyet körülbelül 43 percig refluxáltatjuk, majd lassan szobahőmérsékletre hütve kapunk egy szilárd anyagot. Körülbelül IS óra hosszat kevertetjük, majd a szilárd anyagot szűréssel őszszegyűjtjük, kismennyíségú anyalúggal öblítjük, majd levegőn való szárítás után körülbelül 2 liter etilacetattal öblítjük, így kapunk 561,6 g (8)-l-amino-3-metil~(2,3,4,5}-tetrahidro-(lH)benzazepin-2-on dÍ~p~toluoil-L-borkősavas sőt. Az (SJ-l-amino-Smetil- 2,3,4,5-tetrahidro -1 H-benzazepin -2-on di-p-tolnod- Lkosavas sót és 6,57 liter diklórmetánt, valamint 6,57 liter 1.

mol/1 vizes nátríum-hidroxidot összekeverünk, majd ke vertetjük. A fázisokat szétválasztjuk, majd a szerves fázist kétszer extraháljuk 3,28 liter, 1 mol/1 vizes nátrium-hidroxid oldattal, egyszer extraháljuk 2,46 liter sóoldattal, mielőtt magnéziumszulfáton szárítjuk, megszűrjük, majd rotációs bepárlőn bepámijük. így ee).

kapunk 250 g. címben szereplő vegyületet (57%, 94,1%

7.

,5)-tetrahidro-( 1 Hbbenzazepin-2-en sósavas só szintézise

31,9g (168 mmol) l-amíno-3-metíl-(2,3,4,5j-dihidro-(lH)-3benzazepín-2-ont szuszpendálunk körülbelül 300 ml izopropilacetátban, majd 45 °C-ra melegítjük. Egy külön lombikban 25,0 gramm (164 mmol) (R)-(-)~D~mandulasavat melegítünk körülbelül az előzőkben kapott l-aminO“3“metil-(2_J3_s4,5)-dibídro~(lH)-3benzazepin~2-on/ízopropílacetát szuszpenzióhoz, így kapunk egy oldatot, amiből gyorsan csapadék képződik. Az elegyet körülbelül 3 óra hosszat, kevertetjük 45 ^oC-on. 1,40 g (8,38 .mmal) 5-nitroszalicilaldehidet (3-hidroxi-5~nitrobenzaldehíd) adunk a meleg oldathoz, és az elegyet 45 °C-on kevertetjük. Körülbelül 14 óra elteltével a .szuszpenziót szobahőmérsékletre hütjük, majd 2 óra hosszat kevertetjük, mielőtt a szilárd anyagokat szűréssel összegyűjtjük, majd 70 ml hideg ízopropilacetáttal öblítjük, vákt szárítószekrényben szárítjuk 40 °C-on, így kapunk 46,62 g amino-3'-metíl~(2,3,4,5)-tetrahÍdro:-(lH)“benzazepin-2-on (R)mandulasavas sót (82,9%, 98,4% ee).

2,42 g (7,06 mmol, 98,4% ee) (S)~1 -ami.no-3~metil~(2,3,4,5)tetrahidro-(lH)-benzazepin-2~on (R)-mandulasavas sót 25 ml etil *♦ ♦ * acetátban sznszpendálunk, szobahőmérsékleten. Tömény vizes sósavat (1,1 ml, körülbelüli adunk hozzá, majd az elegyet 50 °Cra melegítjük, 3,5 óra hosszat erősen kevertetve. A. szuszpenziót szobahőmérsékletre hűtjük, majd megszűrjük, öblítjük, körülbelül 10 ml tere-butiléterrel, így kapunk 1,48 g címben, szereplő vegyűletet (92,5%-os hozam, 97,9% eep metil-(2,3.4,5}

Gömblombikba teszünk 1,0 ekvivalens N-t-Boc-L-alanínt, hidroxibenzotriazol hidrától (körülbelül 1,1 ekvivalens), majd (S}~ 1 -amino-3~m.eöl-(.2,3,4,5)-tetrahidro-(l H)~benzazepin~2~ont (1,0 ekvivalens) tetrahidroiüránba.n, nitrogén atmoszférában. Hunig bázist (N,N-diizopropÍletilamin, 1,1 ekvivalens} adunk, a jól kevertetett eiegyhez, majd EDC-t (1,1 ekvivalens}. 14-17 óra hosszat szobahőmérsékleten keverteíjűk, majd az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a maradékot etilacetátban és vízben felvesszük, telített vizes nátrium-hidrogénkarbonát, oldattal, 1 mol/1 vizes sósavval és sóoldattal mossuk, vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk, megszűrjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítva kapjuk az l-(N-t-Boc-L-alaninil)-amino~3-metil(2,3,4,5}-tetrahidro-( 1 H}-benzazepín--2-ont; tőmegspektroszkópia (MW 362,3.

Vízmentes sósavgázt hu.borekoltatunk át az l--(N-t--.Boe--Lalaninil}-amíno - 3 -metil - (2,3,4,5} -tetrahi dro-( 1H.}-benzazepin- 2 -on * « β « φ « «« · φ

Λ Φ φ Φ * > Φ « Φ »»♦ ·«. *»♦

1,4-dioxánban (0,03-0,09 m.ol/1) készített oldatán, aminek hőmérséklete a jégfürdőtől körülbelül 10 ^ö:C~ig terjedhet, NZ-ben, 10-15 percig. Az oldatot lezárjuk, majd a hűtöfördöt eltávolítjuk, és az oldatot hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, 2-8 óra hosszat kevertetve, vékonyréteg krornatogránával követve a kiindulási anyag fogyását Az oldatot beíőményítve kapjuk az 1-(.Lalaninil)-(S)~amino-3~metil-(2,3,4,5)-tetrahidro~( lH)~benzazepin~ 2-ont, amit további tisztítás nélkül használunk fel,

1,0 ekvivalens l~(L-alaninil)-(3)-amino-3-metíl-(2,3,4,5)-tet~ rab.idro-(].H)-benzazepin-2-ont₅ 1,1 ekvivalens hidroxibenztríazol hidrától és 1,0 ekvivalens (S)-2-hidroxi-3-metii-vajsavat elegyítünk. tetrahidroíuránban, nitrogén atmoszférában. 1,1 ekvivalens Hunig bázist (N,N--diizopropíIetílamin) adunk a jól keverhetett elegy hez, majd 1,1 ekvivalens EDC-t. Az oldatot 4-17 óra hosszat szobahőmérsékleten kevertetjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a maradékot etílaeetátban (vagy hasonló oldószerben) és vízben felvesszük, telített vizes nátrium-hidrogénkarbonát oldattal, 1 mol/1 sósavval és sóoldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítva kapjuk a címben, szereplő vegyületet.

Az (N)-((S)-2-hidro'XÍ-3-metil-butiril)- l-(b-alanmil)-(Sl-1 -amlno-3met.il- (2,3,4,5)-tetrahidro- (1 Hj-benzazepin-2-on szintézise

Gömblombikba teszünk 249,5 gramm (1,32 mól) K-t-Boc-Lalanínt, 2.32,2· gramm (1,52 mól) hidroxibenzotriazol hídrátot,

XX * « majd 250,8 g (1,32 mól) (S)“l-ammo-3-metil-(2_>3,4_J5j-tetrahidrO“ (lH)-benzazepin-2~ont, 3,76 liter tetrahidrofuránban, nitrogén atmoszférában. Az elegyet 5 °'C alá hűtjük, mielőtt hozzáadjuk a Hunig bázist (N,N-düzopropiletilamín, 188,4 gramm, 1,45 mmol), majd 283,7 gramm (1,45 mmol) EDC-t. 6 óra hosszat kevertetjük, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékletre .melegítjük, és körülbelül 14 óra hosszat kevertetjük. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a maradékot 3,76 liter etílacetát és 1,76 liter víz elegyében vesszük fel, a fázisokat elválasztjuk, a szerves fázist 1,76 liter vízzel extr.aháljuk, a vizes fázisokat egyesítjük, és 1,76 liter etilaeetattal extraháljuk. A szerves fázisokat egyesítjük, 1,76 liter telített vizes nátrium dúdrogénkarhonát oldattal extrabáljuk, megszűrjük, majd rotációs bepárlón bepároljuk, így kapunk 463 gramm (92,7%) l-(N-tere-Boc-h-alaninil)ammo-3nietil~(2,3,4,5)~tetrahídro~(lH)-3~foenzazepín-2-GHt.

Etilacetátos sósavoldatot készítünk, oly módon, hogy vízmentes sósavat büborékoltatunk át 1,76 liter, körülbelül 0 *C-ra hütött etílaeetáton, felszín alatti diszpergálő eső alkalmazásával. Az előzőek szerint előállított etilacetátos sósavoldatot hozzáadjuk 462 g (1,28 möl) l-(N-terc-Boc-L-alaninál)amíno-3-metil~(2,3,4,5)tetrahidro-(lH)-3-benzazepin-2~on 3,7 liter etilacetátban erősen kevertetett szuszpenziőjához. További 1 liter etilacetátot adunk hozzá, majd a reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, és 22 óra hosszat kevertetjük. A reakcióelegyet megszűrve szilárd anyagot kapunk. A szilárd anyagot 5 liter acetonitrilben szuszpendáljuk, refluxáltatjuk, majd szűrés és szárítás előtt ko~ ♦ ♦ > X X * X φ ♦ * ♦ «« »«.« » ♦ χ Φ < χ « * * * »♦* »« rülbelúl 60 °C-ra hütjűk, így kapunk 389,8 gramm (94,7%) 1-(Lalaniníl)“(S)~amíno~3~metil-(2_f3,4,5)-tetrahIdro-(l.H)-3-benzazepin-2-ont.

369,5 g (1,18 mól) l-(L-áÍaninil)-(S)~am.Íno~3-metíl-(2,3,4,5)·· tetrahidro-(lH)-3-behzazepm~2~Gnt, 207,6 g (1,36 mól) hidroxihenzotriazo! hidrától, 352,2 gramm (2,71 möl) Hunig bázist (N,Ndiizopropiletilamin) és 140,6 gramm (1,18 mól) (S)-2-hidroxi.-3metil-vaj savat elegyítünk 4,8 liter tetr&hidroíuránhan, nitrogén atmoszférában, majd 5 °C alá hütjük. 253,7 g (1,3· mól) EDC-t adunk hozzá, majd. a reakcióeíegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni és kevertetjük... Körülbelül 25 óra elteltével a reákcióelegyet 5,54 liter díklórmetannal hígítjuk, majd 2,22 liter vízzel extraháljuk. A szerves fázist 2,22 liter vízzel extraháijuk, a vizes kát egyesítjük, majd 5,54 liter diklőnnetánnal extraháljuk.

liter telített vizes nátrium-hidrogénkarbonát oldattal extraháljuk, vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk, szüljük, majd rotációs bepárlón bepárolva kapunk 428 gramm (100%) szilárd anyagot, A szilárd anyagot 3,42 liter acetont és 0,856 liter vizet tartalmazó oldó-szerelegyben vesszük fel, enyhe (40 ^C'C) melegítés, közben. Az oldatot körülbelül kétliteres részekre osztjuk, majd mindegyikhez 7,19 liter vizet adunk, miközben a zavaros oldatot 50 °C-ra melegítjük. A víz teljes hozzáadása után hagyjuk a zavaros oldatot szobahőmérsékletre hűlni, így kapunk egy szilárd anyagot, amit 14 óra hosszat szuszpenziöként kevertetünk szóX #· 9 φ jfr φ «-» φφ * χ φ * ♦ * Φ X Φ ♦ » ♦ X «♦ » φφ φ φ

ΧΦΦ ΦΧΧ φφ« ΧΦ ΦΦ bahőmérsékleten, mielőtt megszűrjük és szántjuk, így kapjuk a címben szereplő vegyületet (310 gramm, 66,2%) dihldrátja formájában.

Ha a jelen találmány szerinti vegyületet gyógyszerként használjuk, .akkor általában gyógyászati készítmény formájában adjuk be. Tehát egy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgyát gyógyászati készítmények képezik, amik haté kony mennyiséget tartalmaznak az (N)-((S)~2~hídroxi-3-metil~ butiril)-1. -(L-alaninil)-(S)-1 ~amino-3-mehl-{2_?3,4,5)-tetra.hidro(IMj-S-benzazepin-S-onból, valamint tartalmaznak egy elfogadható higítöszert is. Az ilyen készítményeket használjuk a béta-amiloid peptid felszabadulásának és/vagy szintézisének gátlására, beleértve az Alzheimer kór kezelését is, Tehát a. jelen találmány tárgya, az (N)-((S)-2-hidroxí-3-metil-butÍril)-l“(L~ alaniniI)~(S}~ 1 -amino~3~metil- (2,3,4,5) -tetrahídro-< 1 H)~3~henz~ azepin-2-on használata gyógyszer előállításában, amivel a bétaamiloid peptid felszabadulását és/vagy szintézisét lehet gátolni, specifikusan ide értve az Alzheimer kór kezelését is.

Az (N)-((S)'-2~hidroxi~3~metil-butiril)'-l“(L-al'aninil)-(S)-l-amino-3~metil~(2,3,4,5)~tetrah.ídro-( 1H) -3-benzazepín-2-on számos különböző módon adható he. A jelen találmány szerinti vegyület bármilyen módon vágj’· formában beadható, ami a. vegyületet biológiailag hozzáférhetővé teszi hatékony mennyiségben, beleértve az orális és parenterálís utat is. A jelen, találmány szerinti vegyű let beadható például orálisan, inhalálással, szuhkután, íntramuszknlárisan, intravénásán, transzdermálisan, intranazálisan,.

rektálisan, okulárisan, topikálisan, szublíngválisan, bukkálisan és ezekhez hasonló módon.

A jelen találmány szerinti készítmények előállítása során az aktív adalékanyagot általában egy töltőanyaggal keverjük össze, vagy egy ilyen hordozóval zárjuk be például kapszulába, tasakba, papírba, vagy más tároló anyagba. A jelen találmány szerinti vegyölet beadható önmagában, vagy gyógyászati készítmény formájában, azaz .gyó^ászatilag: elfogadható higítoszerekkel, azaz például hordozókkal vagy töltőanyagokkal kombinálva, amiknek az arányát és természetét a jelen találmány szerinti vegyület oldhatósága és kémiai tulajdonságai, a beadás választott módja és a standard gyógyszerészeti gyakorlat határozza meg [Remington’s Pharmaceutical Sciences 18. kiadás, Mack Publishing Company (1990)].

gyógyszerészet területén jól ismert módon állítjuk elő. A hordozó vagy töltőanyag lehet szilárd anyag, félig szilárd anyag vagy folyadék, ami hordozóként vagy közegként szolgál az aktív adalékanyag számára. Az ilyen hordozók, vagy töltőanyagok jól ismertek a szakterületen. A gyógyászati készítmény adaptálható orális, inhalácios, parenterális vagy topikális felhasználáshoz, és a betegnek beadható tabletták, kapszulák, aeroszolok, inhalálószerek, kúpok, oldat, szuszpenziók vagy hasonlók formájában.

Az orális terápiás beadás céljaira a vegyületeket töltőanyagokba vihetjük be, és tabletták, pasztillák, kapszulák, kanalas orvosságok, szuszpenziók, szirupok, ostyák, rágógumik és hason3.5

X* lók formájában használhatók. Ezek a készítmények a jelen találmány szerinti vegyületből, az aktív adalékanyagból legalább 4%~ ot kell hogy tartalmazzanak, de ez változhat, az éppen használt formától függően, és az egység súlyára számítva kényelmesen lehet körülbelül 2-90% között. A készítményben levő vegyület mennyisége annyi, hogy megfelelő dózist lehessen használni. A jelen találmány szerinti előnyben részesített készítményeket és összetételeket a szakterületen jártas szakember meg tudja határozni.

A tabletták, pirulák, kapszulák, pasztillák és hasemlők tartalmazhatnak még egyet vagy többet az alábbi adjuvánsok közül: kötőanyagok, azaz például mikrokristályos cellulóz, tragantmézga vagy zselatin; töltőanyagok, azaz például keményítő vagy laktóz; dezintegráló szerek, azaz például alginsav, Primogel, kukoricakeményítő és hasonlók; sikosítőszerek, azaz például magnézíum-sztea.rát, szilokonolaj vagy' Sterotex; csúsztatószerek, azaz például kolloid szilieiumdíoxid; és édesítőszerek, azaz például szacharóz vagy szacharin, ízesítő ágens, azaz például borsmenta, metil szalicilát vagy narancs ízesítő. Ha a dózis-egység kapszula, akkor tartalmazhat, az előzőkben említett típusú anyagok mellett egy folyékony hordozószert, azaz például políetilénglíkolt vagy zsírolajat. Más dózisegység fonnák tartalmazhatnak, különböző más anyagokat, amik módosítják a dózisegység fizikái formáját, például bevonó anyagokat. Tehát a tabletták vagy pirulák cukorral, sellakkal, vagy más bevonószerrel lehetnek bevonva. Egy szirup, a jelen találmány szerinti vegyületek mellett tártál34 £ W ♦♦ 4 ♦ « ♦ X X 4 * 4

X'« » X 4 ♦ * 4 »4 X 4 < 4 mazhat szacharózt is, édesítőszerként, es bizonyos konzervaloszereket, festékeket és színező anyagokat, valamint: aromákat. Az ezeknek a különböző készítményeknek az előállítása során alkal mazott anyagoknak gyógyszerészebleg tisztának kell lenniük, és a használt mennyiségben nem szabad toxikusnak lenniük.

A parenterálís beadás céljára a jelen találmány szerinti ve->an, Ezek a tipikus esetben legalább 0,1%-ot tartalmaznak a jelen találmány szerinti vegyülethől, de ez változhat a vegyület 0,1 és körülbelül 90 tomegszázaléka között. Az ilyen készítményekben levő végyület mennyisége annyi, hogy megfelelő dózist kapjunk. Az oldatok vagy szuszpenziők tartalmazhatnak az alábbi adjuvánsok közül egyet vagy többet: steril higitószerek, azaz például injekciós víz, sóoldat, fixált olajok, poiietílénglíkolok, glicerin, propilénglikol, vagy más szintetikus oldószerek; anti bakteriális ágensek, azaz például benzílalkohol vagy metii parabén; antioxidánsok, azaz például aszkorbinsav vagy nátrium-lndrogénszulfit; kelátképző ágensek, azaz például etíléndiamín-tetraeeeisav; pufferek, azaz például aeetátok, nitrátok vagy foszfátok, és a tonícitás beállítására szolgáló ágensek, azaz például nátrium-klorid. vagy szőlőénható fecskendőkben vagy több dózist tartalmazó üveg- vagy műanyag fiolában. Az előnyben részesített összetételek és készítmények meghatározhatók a szakterületen jártas szakember által.

A. jelen találmány szerinti vegyületet beadhatjuk topikálisan is, és ha így teszünk, akkor a hordozó megfelelő módon tártál35 « « * » «-V « mazhat mazhat egyet víz es t vagy gél-alapot. Az alap például tartalvagy többet az alábbiak közül: petrolátum, lanolin, viasz, ásványolaj, hígítószerek, azaz például valamint emulgeálószerek és stahílízálőszerek. A toís készítmények tartalmazhatják a XVI képletű vegyület vagy annak gyógyásaaíílag elfogadható sója egy koncentrációját, ami körülbelül 0,1-10 tömeg/ téríogat% lehet.

A jelen találmány egy másik előnyben részesített kiszerelési formája a tr&nszdermális bejuttató eszköz („tapasz”). Az ilyen mány szerinti vegyület folyamatos vagy megszakításos infúzióját lehessen biztosítani, szabályozott mennyiségben. A transzdermális tapaszok készítése és használata gyógyászati ágensek bejuttatása céljából jól ismert a szakterületen (lásd például az 5,023,252 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást, megadva 1991. június 11-én, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk). Az ilyen tapaszok elkészíthetők a gyógyászati ágensek folyamatos, pulzálő vagy igény szerinti bejuttatására.

Ahhoz, hogy a jelen találmány működését részletesen ismertetünk. A példákat csak illusztrálás céljából adjuk meg, és nem számdékunk, hogy ezekkel a jelen találmány oltalmi körét bármilyen módon korlátozzuk.

1. Kiszerelési példa

Φ * * X- * ♦ * ♦ ι- ♦ ♦ « * * ♦ > «·φ

Kemény zselatin kapszulák, amik az alábbi adalékanyagokat tartalmazzák:

?ag

Aktív adalékanyag Keményítő ignézium- sztearát

Mennyiség (mg/l30,0 305.0

5,0

A lenti adalékanyagokat összekeverjük, majd kemény rng-os me

2. Kiszerelési

Tabletta kiszerelési formát készítünk, ami az alábbi adalékanyagokat tartalmazza:

Adalékanyag

Mikrokristályos cellulóz Kolloid szilíeiumdíoxid

Sztearinsav

Mennyiség (mg/tabletta) 25,0 200,0 10,0 5,0

A komponenseket összekeverjük és préseljük, így kapjuk a tablettákat, amiknek a súlya 240 mg.

3. Ki;_____________________

Száraz por ínhalációs készítményt állítunk elő, ami az alábbi komponenseket tartalmazza:

Adalékanyag zazSi * X

Aktív adalékanyag

Az aktív adalékanyagot összekeverjük a laktözzak és a keveréket beletesszük a száraz port inhaláltatö berendezésbe.

Az egyenként 30 mg aktív adalékanyagot tartalmazó tabletLiekanyag

Keményítő

Mennyiség (rag/tabletta) 30,0 mg 4.5,0 mg

Pöííviníl-Pirrolidon ri 0%~os 4,0 mg oldat steril vízben)

Nátrium-karboximeül kexnényí-- 4,5 ms tő

Magnézium-sztearát 0,5 mg

Talknm 1,0 mg

Összesen 120 mg

Az aktív adalékanyagot keményítőt és cellulózt egy No.20 mesh U.S. szitán bocsátjuk át, majd alaposan összekeverjük. A polivinil-pirrolidorx oldatot összekeverjük a kapott porokkal, amiket azután egy 16 mesb U.S, szitán bocsátunk át. Az így előállított granulátumokat 50-60 °€~on szárítjuk, és egy 16 mesb * ♦ ♦

U.S. szitán bocsátjuk át. A nátrium-karboxámetil keményítőt, a magnézium-sztearátot és a talkumot, ámít előzőleg egy No. 30 mesh U,S. szítán bocsátottunk át, azután hozzáadjuk a granulátumokhoz, amiket keverés után tablettázőgépen préselünk, így kapunk egyenként 150 mg súlyú tablettákat.

5. Kiszerelési példa

Egyenként. 40 mg gyógyszert tartalmazó kapszulákat állítunk elő, az alábbiak szerint:

Adalékanyag Mennyiség (mg/kapszula)

Aktív adalékanyag 40,0 mg

Keményítő 109,0 mg

Magnézium-sztearát 1,0 mg

Az aktív adalékanyagot, a keményítőt és a. magnéziumsztearátot összekeverjük, egy No.20 mesh U.S. szitán, bocsátjuk át, majd kemény zselatin kapszulákba töltjük, 150 mg mennyiségben.

6. Kiszerelési példa

Egyenként 25 mg aktív adalékanyagot tartalmazó kúpokat állítunk elő, az alábbiak szerint:

Adalékanyag m ennyiség

Aktív adalékanyag 25 mg

Telített zsírsavas glieeridek mg-ra

Az aktív adalékanyagot egy No. 60 mesh U.S. szitán bocsátjuk át, majd az előzőleg a minimálisan szükséges hőmennyiséggel megolvasztott telített zsírsav gliceridekben szuszpendáljuk, A keveréket azután 2,0 g névleges kapacitású kűpformába öntjük,

5,0 ml-es dózisonként 50 mg gyógyszert tartalmazó szuszpenziókat készítünk, az alábbiak szerint:

Adalékanyag mennyiség

Aktív adalékanyag 50,0 mg

Xantángumí 4,0 mg

Nátrium karboximetilcellulőz (11%)

Mikrokristályos cellulóz (89%) 50,0 mg

Szacharóz 1,75 g

Nátrium-benzoát 10,0 mg

Aroma és színező anyag tetszés szerint

Tisztított víz 5,0 ml re

Az aktív adalékanyagot, a szacharózt és a xantángumit összekeverjük, egy No. 10 mesh U.S. szítán bocsátjuk át, majd összekeverjük a mikrokristályos cellulóz és a nátrium karboximetilcellulőz vízben készített oldatával. A nátrium-benzoátot, az aromát és a színező anyagot kevés vízzel hígítjuk, majd kever4<ί tetés közben hozzáadjuk. Ezután a kívánt térfogathoz szükséges mennyiségű vizet adunk hozzá.

mg gyógyszert tartalmazó kapszulákat állí~ tünk elő az alábbiak szerint;

Adalékanyag

Aktív adalékanyag Keményítő Magnézíum-sztearát Összesen

Mennyiség (mg/kapszula)

15,0 mg

407,0 mg

3,0 mg

425,0 mg

Az aktív adalékanyagot, a keményítőt és a magnéziumsztearátot összekeverjük, egy No.20 mesh bkS. szítán bocsátjuk át, majd 560 mg mennyiségben kemény zselatin kapszulákba

9. Kiszerelési példa

Szuhkulán készítményt az alábbiak szerint állíthatunk elő: Adalékanyag Mennyiség

Aktív adalékanyag 1,0 mg

Kukoricaolai 1 ml

Az aktív adalékanyag kukorica-olajban való oldhatóságától függően, az aktív adalékanyagból 5,0 mg-ot vagy még többet használhatunk ebben a kiszerelési formában, ha szükséges.

* * » ♦ ♦ « * ♦ ν«« *♦ »4* *χ.χ *·♦»

Egy topikálís készítményt az alábbiak szerint állíthatunk elő:

Adalékanyag Aktív adalékanyag Fmulgoálő viasz Folyékony paraffin Fehér lágy paraffin

Mennyiség l~10 g

100 g-ra

A fehér lágy paraffint megolvadásig melegítjük. A. folyékony paraffint és az emulgeálö viaszt beletesszük, majd oldódásig kevertetjük. Hozzáadjuk az aktív adalékanyagot, majd diszpergálodásíg kevertetjűk. A. keveréket sziláráulásig hűtjük.

A jelen találmány egyik tárgya, eljárás a béta-amiloid pepiid felszabadulás és/vagy szintézis, gátlására, ami abból áll. hogy egy ilyen .kezelésre szoruló betegnek hatékony mennyiséget adunk, be az (N)-((Sk2-hidroxi-3-metil-butiril)-l-(L-alaninü)-(S)~l~amino-3metál- (2,3,4,5) -tetrahidro- (1H) -3- henzazepin -2-ónból. Egy bizonyos megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya eljárás az. Alzheimer kór kezelésére, ami abból áll, hogy egy ilyen, kezelésre szoruló betegnek hatékony mennyiséget adunk he az (N)~ ((S)~2~hidroxi-3-metíl~butíriI)~ 1 ~(L- alaniníly (Sj-1 -&mino-3-metíI(2,3,4,5)-tetrahidro-(lH)-3-benzazepin-2-onból.

Az is nyilvánvaló, hogy a szakterületen jártas szakember képes befolyásolni az Alzheimer köri., oly módon, hogy egy olyan beteget kezel, akit jelenleg érint a betegség, vagy profilaktíkusan kezel egy beteget, aki a betegség kifejlődésének kockázatával él. Tehát a „kezelés” és „kezelni” szakkifejezés jelentése szándékaink szerint minden olyan eljárásra, vonatkozik, amivel az AIzheimer kórt lassítani, megszakítani, leállítani, szabályozni, vagy fejlődését megállítani lehet, de nem szükségszerűen jelenti az. összes tünet teljes eliminálását. A jelen találmány szerinti eljárások közé tartozik az AIzheimer kór felléptének megakadályozása az AIzheimer kór fejlődésének kockázatával élő betegben, az

AIzheimer kór továbbfejlődésének gátlása, és az előrehaladott AIzheimer kór kezelése.

A továbbiakban a „beteg” szakkifejezés vonatkozik melegvérű állatra, azaz például emlősre, amit a béta-amiloid pepiid felszabadulásának és/vagy szintézisének növekedéséhez kapcsolódó rendellenesség érint, beleértve az AIzheimer kórt. Az nyilvánvaló, hogy a tengerimalacok, kutyák, macskák, patkányok, egerek, lovak, szarvasmarhák, birkák és emberek a szakkifejezés körébe tartozó állatoknak a példái. Az ilyen kezelésre szoruló betegeket könnyen diagnosztizálni lehet.

A továbbiakban a XVI képiéin vegyület „hatékony mennyisége” szakkifejezés jelentése az a mennyiség, ami hatékonyan gátolja a béta-amiloid peptid felszabadulását és/vagy szintézisét, és specifikusan az- AIzheimer kór kezelésére használható.

A hatékony mennyiséget a kezelőorvos, mint a szakterületen jártas szakember könnyen meghatározhatja, hagyományos technikák, alkalmazásával és az analóg körülmények között •«:b ♦

xíx ·> > «»*· κ»;«· * a * * ** β>« .kapott eredmények megfigyelésével. A hatékony mennyiség, az (N)-((SÍ-2“hidroxi-3-metil“hutirilúl-(L-alaninil)-íS)-l-amino-3metíl~(2,3>4j5)~tetrahidro-(lH)-3~benzazepin-2-On dózisa meghatározásánál a kezelőorvos számos faktort vesz figyelembe, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a kővetkezőket; az (N)-((S)~2-hidrexi-3-metíl-butiril)~ 1 - (L-alaninil)(S)~ 1 -ammo~3~ -m.etil-(2,3.4,5)-tetrahídro-( 1 'Hj-3-hen.zazepin-2-on potenciája és jellemzői, a beteg fajtája; mérete, életkora és általános egészségi állapota; a. betegség súlyosságának mértéke; az egyes beteg válasza; a beadás módja; a beadott beadott készítmény biológiai hozzáférhetőségi jellemzői; a kiválasztott dózistartomány; más, egyidejűleg beadott gyógyszerek; és más releváns körülmények.

Az {N)-((S)-2-hidroxi-3-metíl-butiril}-1 -(L~alanmíl)~(S}~ 1 ~ ami.n.o-3-metíl-(2,3,4,5)-fetrahidro-(lH)-3-ben.zazepín-2-on hatékony mennyisége a várakozások szerint körülbelül 0,1 míllígram per testsűlykg per nap (mg/kg/nap) és körülbelül 100 mg/kg/.nap között változik, A szakterületen jártas szakember képes meghatározni az előnyben részesített mennyiségeket.

Az (N)-((S)-2-hidroxi-3-meiíl-butíril)-l-(L-alaninil)-.(S)-lammo-3“metil-(2,3,4,5)-tetrahidro-1 H-3-benzazepm-2-on anhidrát hatékony mennyisége a várakozások szerint körülbelül 0,1 milligramm per testsűlykg per nap (mg/kg/nap) és körülbelül ΊΌΟ mg/kg/nap között változik. A szakterületen jártas szakember képes meghatározni az előnyben részesített mennyiségeket.

A jelen találmány szerinti (N)~((S)~2-hidroxi-3-mefÍl-butiril)l-(L-alaniníl)~(S)-1 -•ammo-3~metfi-(2_>3,4,5j-tetrahidro-( 1 Hj-3-bez44

4« ♦ *

4 * * χ 4 ♦ 4 * * χ 44 4* 4 4 azepin-2-on anhidrát különböző biológiai rendszerekben vizsgálható, beleértve·: az alábbiakat.

Celluláris szűrővizsgálat a béta-amiloid termelés inhibitorainak kimutatására.

Számos, az előzőkben említett XVI képletü vegyületet vizsgáltunk, hogy képesek-e gátolni a béta-amiloid termelést egy Svéd mutációt hordozó sejtvonalban. Ebben a szűrővizsgálatban olyan sejteket használunk (E293 ~ humán vese sejtvonal), amik stabilan transzfektálva vannak a 751-es amíloíd prekurzor fehérje (APP7.51) génjével, ami tartalmazza a Lys6SiMet&s2 Asnss.ileu652 kettős mutációt (APP751 számozás), a szakirodalomban ismertetett módon (94/10569^s számú nemzetközi szabadalmi bejelentési publikáció; Cítron és munkatársai¹²). Ezt a mutációt hívják általában Svéd mutációnak, és a sejteket (jelzésűk ,,293 751 SWE^W) 96-lukas Corning lemezekre széíesztjük 2-4* 1Ό⁴ sejt per luk mennyiségben Dulbecco féle Módosított Esszenciális Táptalajban (Sigrna, Sí. Louis, MO), ami még 10% borjúmagzat szérumot is tartalmaz. A sejtszám fontos, azért, hogy az esszé lineáris tartományában (~ö,2 - 2,5 ng per ml) kapjuk meg a bétaamiloid ELISÁ eredményeket.

Miután éjszakán át ínkufaálínk 37 °C~on. 10% CÖ2~vel egyensúlyban levő inkubátorban, a közegeket eltávolítjuk, és 200 μΐ XVI képletü vegyületet tartalmazó közeggel, helyettesítjük egy kétórás előkezelési periódusra, majd a sejteket az előzőkben is45 ** * ♦ y* Φ ♦ tf ♦·* ♦ * * * * χ ♦ * * * φ-φ «φ ♦♦ mertetett módon eltávolítjuk.. Gyógyszer hatóanyag törzsoldatokat készítőnk 100%-os dimetiiszulfoxidban, oly módon, hogy a kezelés során használt végső hatóanyag koncentrációnál a dimeíüszulfoxíd koncentrációja ne haladja meg a 0,5%-ot, valójában általában 0,1.%-kal egyenlő.

Az előkezelési periódus végén a közegeket ismét eltávolítjuk, és friss gyógyszertartalmú közeggel helyettesítjük, az előzőkben ismertetett módon, majd a sejteket újabb 2 óra hosszat inkubáljuk. Á kezelés után a lemezeket ót percig szobahőmérsékleten Beekman GRP-ben centrifugáljuk 1200 per perc fordulatszámmal, hogy a kondicionált táptalajból kiülepítsük a sej túledéket. Az egyes Inkákból 100 ,μΐ kondicionált táptalajt, vagy annak megfelelő higitását. egy ELISA lemezre visszük át, amit a béta-amiloid peptid 13-28-as aminosavaí elleni 266 ellenanyaggal előre bevontunk (94/10569® számú nemzetközi szabadalmi bejelentési publikáció) (P. Seuhert: Natúré 359, 325-327 (1992)], majd éjszakán ál 4 °C-on tároljuk. A béta-amíloid pepiid 1-5-ös aminosavaí elleni 3D6 jelzett ellenanyagot alkalmazó EbISA esszét ]P, Seubert: Natúré 359, 325-327 (1992)] futtatunk a következő napon, hogy' mérjük a keletkezett béta-amíloid peptid mennyiségét.

A vegyuletek citotorfkus hatásait Hansen és munkatársai módszerének módosításával mérjük, A szövettenyésztő lemezben maradó sejtekhez 25 pl 3~(4,5“dit»etiltíazol2“il)2,5-difemltetrazólium bromid (MTT) (Sigma, St, Louis, MO) tőrzsoldatot (5 mg/ml) adunk, I mg/ml végkoncentráeióhan. A sejteket egy óra

V « ♦ ' φ: Φ φ * ' *

.. » Λ ♦ $ Φ ♦ φ-φ-«-φ «**·»· *Χ ♦* ** hosszat: 37 ®C-on inkubáljuk, majd a ceíluláris aktivitást azonos térfogatú MTT lízis puffer (20 tömeg/térfogat % nátrium-dodecilszulfát 50% dimetilformamidban, pH«4,7) hozzáadásával leállítjuk. A teljes extrakciót éjszakán át, szobahőmérsékleten való rázatássaí érjük el. Az ODseznm és az OD&sonm közötti különbséget, egy Molecular Devíce UVmax mikrotiter leolvasóval mérjük, a cél·· luláris életképesség indikátoraként.

A béta-amiioid peptid ELISA eredményeit egy standard görbére illesztjük, és ng/ml héta-amiloid peptid formában fejezzük: ki. Ahhoz, hogy a citotoxícitásra normalízáljuk, ezeket az eredményeket osztjuk az MTT eredményekkel, és a gyógyszer hatóanyagot nem tartalmazó kontroll eredményeinek százalékában fejezzük ki. Minden eredmény legalább 6 párhuzamos vizsgálat átlaga és standard deviációja.

is példa

A béta-amllold felszabadulás és/vagy szintézis in idoo

Ez a példa azt illusztrálja, hogy a jelen találmány szerinti vegyületekef miként lehet tesztelni a héta-amiloid felszabadulás és/vagy szintézis m fovo szuppressziójának tesztelésében. Ezekben a kísérletekben 3-4 hónapos PDAPP egereket használunk (Garnes és mtsai: Natúré 373.» 523-527 (1995)}, Attól függően, hogy melyik vegyületet vizsgáljuk, a vegyületet általában 1-10 mg/ml koncentrációban szereljük ki. A vegyületek alacsony oldhatósági faktora miatt különböző hordozókkal., azaz például kuίί ΦφΦ» * ♦ · · » * *·* * ♦ ψ Φ Φ * Φ *

4*«- -ΦΧ ** korícaolapal [Safeway, South San Francisco, CA); kukoricaolajban 10% etanoöal, 2-hidroxipropil-j3-ciklodextrinnel (Research Biochemicals International, Natick, MA), és karboximetílcellulózzal (Sigma Chemical Co., St Louís MO) szerelhetők ki.

Az egereket szubkután injekciózzuk egy 26-os tűvel, majd 3 órával később az állatokat CO2 narkózissal eutanizáljuk, majd szívpimkcióval veszünk vért:, egy 1 cm³-es 25 5/8' tuberkulin fecskendő/tű kombinációval, erre 0,5 mol/1 EDTA (pH=8,0) oldatot rétegzünk. A vért egy EDTA-t tartalmazó BectonDickinson vacutaíner csőbe tesszük, majd 15 percig 5 °C-on centrifugáljuk 1500* g-vet Ezután eltávolítjuk az egerek agyát, majd az agykérget és a híppocampus t kivágjuk és jégre tesszük.

1.

essze

Ahhoz, hogy az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatokhoz (ELISA-k) híppocampus és agykéreg szövetet készítsünk, mindegyik agyrégiöt 10 térfogatnyi jéghideg guanidin pufferben (5,0 mol/1 gnanidm-HCI, 50 rnmoi/l TRIS-HC1 pH~8,0) homogenizáljuk, egy Kontes motoros mozsártörő használatával (Fisher, Pittsburgh PA). A homogenizátumokat 3-4 őrá hosszat óvatosan rázatjuk egy rotációs rázón, szobahőmérsékleten, majd a bétaamiloid mennyiségi meghatározása előtt ~20 °C-on tároljuk.

Az agt^r-homogenizátumokat 1:10 arányban higitjuk jéghideg kazein pufferrei (0,25% kazein, foszfáttal púdereit sóoldat (PBS), 0,05% nátrium.-azíd, 20 gg/mi aprotirűn, 5 mmol/I EDTA

4S pH~8,Ö, 10 pg/ml leupeptmj, ezzel a guanidin végkoncentrációját 0,5 mol/l-re csökkentjük, mielőtt centrifugáljuk {l6,0ÖÖ*g, 20 perc, 4 °C), A mintákat kazein puffer hozzáadásával (ami 0,5 mol/1 guanidin hídrokloridot tartalmaz) tovább hígítjuk, ha szükséges, hogy ezzel elérjük az ELISA mérések optimális tartományát. A béta-amiloid standardokat úgy állítjuk elő, hogy a végkoncentráció- azonos legyen 0,5 mol/1 guanidínnel, 0,1% szarvasmarha szérum--albumín (BSA) jelenlétében.

A teljes béta-amiloid szendvics ELISA, amivel mind az 1 -40es aminosavakat tartalmazó béta-amiloid, mind az 1-42-es amínosavat tartalmazó béta-amiloid mennyiségét meg lehet határozni, két, béta-amiloid elleni .monoklonális ellenanyagot (mAb) tartalmaz. A befogó ellenanyag, a 266~os jP.Seubert, Natúré 859, 325-327 (1992)) ^a béta-amiloid 13-28-as aminosavaira specifikus. A 3D6 ellenanyagot {Johnson-Wood és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 94, 1550-1555 (1997)), ami a béta-amiloid Ι-5-os aminosavaira specifikus, biotinilezzük, ez szolgál riporter ellenanyagként az esszében. A 3D6 biotínilezési eljárás a gyártó (Pierce, Rockford ILj protokollját használja az immunglobulinok NHS-bíotin jelölésére, azzal az eltéréssel, hogy ÍÖ'Ó mmol/1 nátrium-hídrogénkarbonát pH=8_:,5 pufiért használunk. A 3D6 ellenanyag nem ismeri fel a szekretált amiloid prekurzor fehérjét (APP), vagy a teljes hosszúságú APP-t, hanem csak azt a béta-amiloid fajtát mutatja ki, ami. tartalmaz egy N-terminális aszp-araginsavat.. Az esszék alsó érzékenységi «χ, S0.* v 4 * * * < » <· > fc* * * *' fr t Λ> * * * ♦ ♦*** *» *V *Mf határa ~5Ö pg/'rnl (11 pM), és néni ad keresztreakcíőt az endogén rágcsáló béta-amiloid pepiiddel, egészen 1 ng/mhíg.

A béta-amiloid 1 - 42- es aminosava.fi: mérő szendvics BLISA konfigurációja a 21F1.2 monoklonálís ellenanyagot [JohnsonWood és mtsak Proceedings of the National Acaderny of Sciences,

VSA 94, 1550-1555 (1997)} (ami a béta-amiloid 33-42-es aminosa.va.it Ismeri fel) használja, befogó ellenanyagként. A biotinílezett 3D6 ebben az esszében még egy riporter ellenanyag is, aminek az alsó érzékenységi határa -125 pg/ml (28 pM),

A 266-os és 21F!2~es befogó ellenanyagokkal 10 pg/ml koncentrációban borítunk be 96-lukas immunesszé lemezeket mezeket azután leszívjuk, és 0,25%-os, foszfáttal puffereit sóoldatban készített humán szérum-albuminnal blokkoljuk legalább 1 óra hosszat, szobahőmérsékleten, majd felhasználásig 4 °C~on, kiszárítva tároljuk. A lemezeket azután felhasználás előtt mosó puíferrel rehidráJjuk (Trísz-szel pukérelr sóoldat, 0,05% Tween 20). A mintákat és a standardokat hozzáadjuk a lemezekhez, és éjszakán át 4 ^:°C-on inkubáljnk. A lemezeket az esszé egyeslépései között háromszor mossuk mosópufferret A bíotímlezett 3D6-ot, amit 0,5 pg/ml-re hígítottunk kazein inkubációs pufferben (0,25% kazein, foszfáttal puffereit sóoldat, 0,05% Tween 20 pH™7,4). Kazein inkubációs púderben 1:4000 arányban hígított avidín-HRP-t. (Vector, Burlingaine, CA) adunk a Inkákhoz I órára, szobahőmérsékleten. A kolorimetriás szubsztrátot (Slow TMB-EL1SA, Pierce, Cambridge MA) hozzáadjuk, majd 15 percig hagyjuk reagálni, ezután az enzimreakciót 1 mól/1 H2SO4 hozzáa dásával leállítjuk. A reakciöíerm.ék mennyiségét egy Molecuíar Devices Vmax (Molecuíar Devices, Menlo Fark, CA) berendezéssel határozzuk meg.

2. Vér esszé

Az EDTA plazmát 1:1 arányban hígítjuk minta hígító-szerben (0,2 g/1 nátriunifoszfáriHaO (egybázisos), 2,16 g/1 nátriumfeszfátx? H2O (kétbázísos). 0,5 g/1 thímerosal, 8,5 g/1 nátriura-klorid, 0,5 ml Triton X-4Ö5, 6,0 g/1 globulin-mentes szarvasmarha szé.rum-albumin és víz). A minta higítószerben levő mintákat és standardokat az előzőkben az agy esszére ismertetett őssz-béta-amiloíd esszével (22-os beibgó/3D6-os riporter) vizsgáljuk meg, azzal a különbséggel, hogy az ismertetett kazein higítöszer helyett a minta bigítőszert használjuk.

Az előző leírásból a szakterületen jártas szakember számára az összetétel és a módszer különbózó módosításai nyilvánvalóak. Az összes ilyen módosítást a jelen találmány oltalmi körébe tartozónak tekintjük.

Claims (2)

1. A (XVI) képietű (N)-({(S)-2“hídroxi-3-metil-hutiril)-T-(L~aianí·· (S) -1 - amino-3 -méh!- (2,3,4,5)- tetrahidro- (1H) -3~benzazepin-2 - on.

2. Gyógyászati készítmény, amely az 1. igénypont szerinti, vegyületet és egy gyó-gyászatilag elfogadható hígítószert tartalmaz.