UA74849C2 - Lactam - Google Patents

Description

Опис винаходу

Цей винахід належить до галузі фармацевтичної та органічної хімії і стосується сполуки, яка інгібує 9 вивільнення В-амілоїдного пептиду та/або його синтез.

Певні лактами, які інгібують вивільнення В-амілоїдного пептиду та/або його синтез і, відповідно, є корисними для лікування хвороби Альцгеймера, (описані в патентній заявці РСТ/О597/229861.

Сполука згідно Кк! цим винаходом, (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-о 70 н, є корисною для інгібування вивільнення В-амілоїдного пептиду та/або його синтезу і, відповідно, є корисною при лікуванні хвороби Альцгеймера і має сприятливі характеристики ефективності та безпечності.

Цей винахід пропонує (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он.

Згідно з одним із методичних аспектів, цей винахід стосується способу інгібування вивільнення 12 В-амілоїдного пептиду та/або його синтезу, який включає введення в організм пацієнта, що потребує такого інгібування, ефективної кількості (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-о ну. Згідно з конкретним варіантом здійснення цього способу, цей винахід пропонує спосіб лікування хвороби

Альцгеймера, який включає введення в організм пацієнта, що потребує такого лікування, ефективної кількості (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-о ну. Цей винахід пропонує також спосіб профілактики або інгібування розвитку хвороби Альцгеймера, який включає введення в організм пацієнта, що потребує такої профілактики або інгібування, ефективної кількості (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону.

Згідно з іншим варіантом здійснення, цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, яка містить с (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-о Ге) н та фармацевтично прийнятний розріджувач. Такі композиції є корисними для інгібування вивільнення

В-амілоїдного пептиду та/або його синтезу, в тому числі для лікування хвороби Альцгеймера.

Терміни, вживані в цьому описі, мають значення, вказані нижче.

Термін "ее", або "енантіомерний надлишок", стосується надлишку процентного вмісту одного енантіомера, о

Е:, в суміші обох енантіомерів (Е/їЕ»2), обчисленого за рівнянням (Е 1-Е2)ХЕї їЕ2))х100-ее. Як добре відомо в. 0 «КЕ практиці, енантіомерний надлишок можна визначити методом капілярного електрофорезу та рідинної со хроматографії високої ефективності (РХВЕ) згаданих сполук або їхніх похідних на хіральній нерухомій фазі.

В цьому описі для позначення стереохімічної конфігурації окремих ізомерів застосовано позначення (К)- та чЕ (5)- за Каном-Прелогом-Інгольдом (Сапп-Ргеіод-Іппоїа) та символи І - і О-.

Зо Сполуку згідно з цим винаходом можна одержати, як описано нижче. У поданих нижче Схемах усі замісники, - якщо не зазначено протилежне, відповідають поданим вище визначенням, а всі реагенти є добре відомими й прийнятими в практиці.

Схема 1 « - с . и? -І щ» (ее) щ» іЧе) іме) 60 б5 то Стадія

І ння щі ге; по М нм

У шт Й сн, сн, Мн и (2) «Код с (8) (22) « їн панни ж нм тадіяЯ М «

М ач - о сн, о си, - с Згідно зі Схемою 1, стадія 1, М-метилфенетиламін формули (1) адилюють придатним реагентом переносу . бісалкоксикарбонілацетату, одержуючи сполуку формули (2). М-метилфенетиламін є комерційно доступним, і а його легко одержати шляхом реакції 2-бром- або 2-хлоретилбензолу з метиламіном в умовах, добре відомих і прийнятих у практиці Придатним реагентом переносу бісалкоксикарбонілацетату є сполука, де К 4 є

С1-С;.-алкіл і яка переносить бісалкоксикарбонілацетил до сполуки формули (1), наприклад, -і бісалкоксикарбонілоцтові кислоти та бісалкоксикарбонілацетилхлориди |дивись Бен-Ішаї - Веп-ІзНаї|,

Теїгапейдгоп. 43, 439-450 (1987). те Наприклад, сполуку формули (1) уводять у контакт із придатною бісалкоксикарбонілоцтовою кислотою й

Го) одержують сполуку формули (2). Такі реакції сполучення є звичайними в синтезі пептидів, і при їх проведенні 5р Можна застосувати методи синтезу, використовувані в цій галузі. Наприклад, для полегшення цього адилювання те можна застосувати добре відомі агенти сполучення, наприклад, карбодіїміди, з використанням або без

Ге) використання добре відомих домішок, наприклад, М-гідроксисукциніміду, 1-гідроксибензотриазолу тощо. В таких реакціях сполучення часто застосовують придатну основу для зв'язування кислоти, що вивільнюється при реакції. До придатних основ належать, наприклад, триетиламін, М,М-діїззопропілетиламін, М-метилморфолін дв тощо. Реакцію зручно проводити в інертному апротонному полярному розріджувачі, наприклад, в диметилформаміді, хлористому метилені, хлороформі, ацетонітрилі, тетрагідрофурані тощо. Як правило, (Ф, реакцію проводять при температурі від приблизно 02С до приблизно 602С, і вона вимагає часу від приблизно ко 1год. до приблизно 24год. Після завершення реакції продукт формули (2) виділяють звичайними способами, в тому числі екстракцією, осадженням, хроматографією, фільтруванням, розтиранням, кристалізацією тощо. во В альтернативному варіанті, наприклад, сполуку формули (1) уводять у контакт із придатним бісалкоксикарбонілацетилхлоридом і одержують сполуку формули (2). Такі хлорангідриди кислот легко одержати з відповідних кислот способами, добре відомими в практиці, наприклад, дією трихлористого фосфору, оксихлориду фосфору, п'ятихлористого фосфору, тіонілхлориду або оксалілхлориду з використанням або без використання незначної кількості диметилформаміду в інертному розчиннику, наприклад, в толуолі, хлористому 65 метилені або хлороформі, при температурах приблизно від 0 до 802С Реакцію, як правило, проводять протягом часу від год. до 24год. Хлорангідрид кислоти можна виділити та очистити, або його часто можна використати безпосередньо, тобто з виділенням та/або очищенням або без цих операцій. В таких реакціях ацилювання, як правило, застосовують придатну основу для зв'язування кислоти, що вивільнюється при реакції. До придатних основ належать, наприклад, піридин, триетиламін, М,М-діззопропілетиламін, М-метилморфолін тощо. Реакцію

Зручно проводити в інертному апротонному полярному розріджувачі, наприклад, у хлористому метилені, хлороформі, тетрагідрофурані тощо. Як правило, реакцію проводять при температурі від приблизно -209С до приблизно 802С, і вона вимагає часу від приблизно 1год. до приблизно 24год. Після завершення реакції продукт формули (2) виділяють звичайними способами, в тому числі екстракцією, осадженням, хроматографією, фільтруванням, розтиранням, кристалізацією тощо.

Згідно зі Схемою 1, стадія 2, сполуку формули (2) циклізують і одержують сполуку формули (3).

Наприклад, сполуку формули (2) уводять у контакт із кислотою, наприклад, із метансульфокислотою або сірчаною кислотою. Як правило, реакцію проводять із використанням вибраної кислоти як розчинника. В типових випадках реагенти спочатку змішують при температурі від приблизно -202С до приблизно 02С, після чого дають суміші нагріватися до температури в межах від температури навколишнього середовища до приблизно 60260. 75 Реакція циклізації вимагає, як правило, часу від приблизно 12год. до приблизно 72год. Після завершення реакції продукт формули (3) виділяють звичайними способами, в тому числі екстракцією, осадженням, хроматографією, фільтруванням, розтиранням, кристалізацією тощо.

Згідно зі Схемою 1, стадія З, від сполуки формули (3) віддеплюють групу захисту й одержують сполуку формули (4).

Відщеплення таких алкоксикарбонільних груп захисту аміну є добре відомим і прийнятим у практиці. Дивись, наприклад, монографію Т. Гріні "Групи захисту в органічному синтезі" (Тпеодога Огеепе, Ргоїесііпд ОгоиМрзг іп

Огдапіс Зупійевів. 15. апа 251 Еайопве, УМіеєу-Іпіегесіепсе) і роботу Бен-Ішаї (Веп-ІвНнаї, Тейманпеагоп. 43, 439-450 (1987)|.

Схема 2 с щі 6) (22) « с « і - - с . и? -І щ» (ее) щ» 3е)

Ф) іме) 60 б5

Схема 2

Стадія 1 о інн ОО ом ранауні о ДФ

Ю о й б по о сн, (5) й--св, (7) к

Стадія 2 с (8) ї (о) «Іф тінннийя

Х з рі о щ (ее)

М

М « х о ен, м о с , (8) (9) Стадія 4

У - с ;» - -І ї» на я со А, ї» ві сн,

Фо (4)

Згідно зі Схемою 2, стадія 1, придатну похідну фенілоцтової кислоти формули (5) сполучають із придатним ацеталем формули (6) і одержують сполуку формули (7). Придатною похідною фенілоцтової кислоти формули

ГФ) (5) є сполука, де А» є активуюча група, наприклад, -ОН, -СІ або -Вг. Придатним ацеталем формули (6) є сполука, 7 де Кв є С.і-С;-алкіл. Такі реакції сполучення є звичайними в синтезі пептидів, і при їх проведенні можна застосувати методи синтезу, використовувані в цій галузі, як описано для Схеми 1, стадія 1. во Сполучення, показане на Схемі 2, стадія 1, можна також виконувати в умовах реакції Шоттена-Баумана (Зспойцеп-Вацтапп), застосовуючи хлорангідрид кислоти формули (5) та придатний ацеталь формули (6) у змішаному розчиннику, наприклад, в метил-трет-бутиловому простому ефірі, етилацетаті, тетрагідрофурані, ацетоні або діетиловому ефірі з водою. Таку реакцію проводять із використанням придатної основи, наприклад, гідроксиду натрію, гідроксиду калію, карбонату натрію, карбонату калію, бікарбонату натрію або бікарбонату в калію. Як правило, реакцію проводять при інтенсивному перемішуванні при температурах від приблизно -202С до приблизно 802С, і вона вимагає часу від приблизно год. до приблизно 24год. Після завершення реакції продукт формули (7) виділяють звичайними способами, в тому числі екстракцією, осадженням, хроматографією, фільтруванням, розтиранням, кристалізацією тощо.

Згідно зі Схемою 2, стадія 2, сполуку формули (7) циклізують і одержують сполуку формули (8). Такі реакції циклізації проводять у кислоті, наприклад, у сірчаній кислоті. Як правило, цю кислоту використовують як розчинник. В типових випадках згадану реакцію проводять при температурі в межах від приблизно -209С до приблизно 1502С, і вона вимагає, як правило, часу від приблизно год. до приблизно 24год. Після завершення реакції продукт формули (8) виділяють звичайними способами, в тому числі екстракцією, осадженням, хроматографією, фільтруванням, розтиранням, кристалізацією тощо.

Згідно зі Схемою 2, стадія З, сполуку формули (8) піддають реакції переносу аміну для одержання сполуки формули (9). На Схемі 2 показано оксимування. Таке оксимування проводять шляхом уведення еноляту сполуки формули (8) у реакцію з реагентами переносу оксиму, наприклад, складним ефіром - алкілнітритом. Енолят сполуки формули (8) можна одержати шляхом реакції сполуки формули (8) із придатною основою, наприклад, із трет-бутилатом калію, діізопропіл амідом літію, гексаметилсилазидом літію, гексаметил сил азидом натрію, 75 гексаметилсилазидом калію тощо. Приклади таких реакцій оксимування наведені в монографії Уїлера та інших "Органічні синтези" ЦМУпееіег ей аїЇ., Огдапіс Бупіпевзез, СоїЇ. Мої. Мі, р.840)Ї), де описані реакції ізоамілнітриту з кетоном для одержання цільового оксиму. Цю реакцію, як правило, проводять у розчиннику, наприклад, в тетрагідрофурані. У типових випадках реакцію проводять при температурі від приблизно -202С до приблизно 502С, і вона, як правило, вимагає часу від приблизно год. до приблизно 24год. Після завершення реакції продукт формули (9) виділяють звичайними способами, в тому числі екстракцією, осадженням, хроматографією, фільтруванням, розтиранням, кристалізацією тощо.

В альтернативному варіанті таку реакцію переносу аміну можна проводити за участю азиду. Азид можна одержати шляхом реакції еноляту сполуки формули (8) із реагентами переносу азиду, наприклад, із толуолсульфонілазидом та тріїззопропілбензолсульфонілазидом. Приклади таких реакцій наведено в роботі С

Еванса та інших (Емапз еї аї., 9). Ат. Спет. Зос. 112:4011-4030 (1990)411. Цю реакцію, як правило, проводять у (5) розчиннику, наприклад, в тетрагідрофурані У типових випадках реакцію проводять при температурі від приблизно -202С до приблизно 502С, і вона вимагає часу від приблизно ігод. до приблизно 24год. Після завершення реакції продукт формули (9), який містить азидогрупу замість оксиму, виділяють звичайними способами, в тому числі екстракцією, осадженням, хроматографією, фільтруванням, розтиранням, (є) кристалізацією тощо. «

Як показано на Схемі 2, стадія 4, оксим відновлюють, одержуючи сполуку формули (4). Таке відновлення виконують шляхом оброблення воднем та відповідним каталізатором, наприклад, нікелем Ренея або г) паладієвими каталізаторами, наприклад, паладієм на вугіллі. Цю реакцію, як правило, проводять у розчиннику, « наприклад, у тетрагідрофурані, етилацетаті або в нижчих спиртах, наприклад, у метанолі, етанолі та ізопропанолі, в оцтовій кислоті, воді, водному розчині аміаку тощо або в їх сумішах. В типових випадках ї- реакцію проводять під тиском водню в межах від атмосферного тиску до приблизно 600 фунтів на кв. дюйм (4137кПа). Як правило, реакцію проводять при температурі від приблизно 202С до приблизно 1002С, і вона, як правило, вимагає часу від приблизно год. до приблизно 24год. Після завершення реакції продукт формули (4) « виділяють звичайними способами, в тому числі екстракцією, осадженням, хроматографією, фільтруванням, розтиранням, кристалізацією тощо. в) с В альтернативному варіанті, де амін переносять за участю азиду, відновлюють азидогрупу. Такі реакції "» проводять шляхом гідрування, як описано вище. " Способи одержання (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-о ну показані на Схемі А. - Схема щ» (ее) їз 50 3е)

Ф) іме) 60 б5

Схема А

Стадія 1 пічне пон роль нм нм

М . М о в, а) (10 уз

Стадія 2 о Стадія 5 сч же а: х

Сн АХ Ф з з (11) б сн, . « с он х «

Стадія 3 М їм ух "М - нн М о сн, К Мен « з 2 - Стадія 4 (формула І)

І» р нм

Ї Е . в сн В" ї 5 (12) о сн, (ее)

На Схемі А, стадія 1, представлено стереохімічне розділення придатного лактаму формули (4) з одержанням ве лактаму формули (10), тобто практично чистого (5)-1-аміно-3З-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону. (Че) Термін "практично чистий" у значенні вживаному в цьому описі, стосується енантіомерної чистоти (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ІН-3-бензазепін-2-ону. Згідно з цим винаходом, практично чистий (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ІН-3-бензазепін-2-он можна одержати з умістом (5)-енантіомера більше

Ніж 8095, у варіанті, якому віддається перевага, більше ніж 9095, у варіанті, якому віддається ще більша перевага, більше ніж 9595, у варіанті, якому віддається найбільша перевага, більше ніж 97905. о Наприклад, (5)-ізомер сполуки формули (4) можна виділити шляхом фракційної кристалізації його солей - ко дибензоїлтартрату, солей з (К)-(-)-4-камфорасульфоновою кислотою і (0)-(-У-мигдалевою кислотою. Очікується, що для цієї мети придатними є різноманітні дибензоїлтартрати. Зокрема, перевага віддається дибензоїльним бо складним ефірам, які мають у яяря-положенні замісник, вибраний із групи, до якої входять водень, галоїд,

Сі-С/-алкіл та С4-С/-алкоксигрупа, а найбільша перевага віддається ди-п-толуїлтартрату. Для одержання (5)-ізомеру застосовують ди-п-толуїл-і -тартрат.

Згідно із представленим способом, сполуку формули (4) уводять у контакт із вибраною кислотою. Як правило, можна використовувати кількість кислоти в межах від приблизно 0,4 молярного еквівалента до значного 65 надлишку; перевага віддається кількості від приблизно 0,4 до 1,5 молярного еквівалента, а більша перевага - кількості від приблизно 0,5 до 1,1 молярного еквівалента.

Процес проводять звичайно шляхом кристалізації солі кислоти з розчину. При цьому придатними є, зокрема, такі розчинники, як нижчі спирти, в тому числі метанол, етанол, н-пропанол, ізопропанол, бутанол, втор-бутанол, ізобутанол, трет-бутанол, аміловий спирт, ізоаміловий спирт, трет-аміловий спирт, гексанол, циклопентанол та циклогексанол, а перевага віддається метанолу, етанолу та ізопропанолу. Може виявитися доцільним застосування осаджувача. Термін "осаджувач" у вживаному значенні означає розчинник, в якому розчинність солі значно нижче, ніж у розчиннику. В разі застосування осаджувача перевага віддається речовинам, які змішуються з вибраним розчинником. До придатних осаджувачів належать прості ефіри, наприклад, діетиловий ефір, метил-трет-бутиловий ефір тощо, та нижчі алкілацетати, наприклад, метилацетат, 7/0 етилацетат, ізопропілацетат, пропілацетат, ізобутилацетат, втор-бутилацетат, бутилацетат, амілацетат, ізоамілацетат тощо, а також алкани, наприклад, пентан, гексан, гептан, циклогексан тощо. Якщо описаний процес здійснюють шляхом кристалізації солі кислоти з рацемічної суміші, то застосовувати осаджувач слід обережно для запобігання кристалізації небажаної діастереомерної солі.

Як правило, кристалізацію виконують при початковій температурі від приблизно 402С до температури кипіння 75 (із зворотним холодильником) вибраного розчинника (розчинників) і при початкових концентраціях від приблизно 0, 05М до приблизно 0,25М. Потім суміш охолоджують і одержують згадану сіль. Може бути доцільним застосування затравки. Може бути доцільним перемішування початкового осаду протягом від приблизно 4год. до 48год. Кристалізаційний розчин у варіанті, якому віддається перевага, охолоджують повільно. Найбільш зручно виконувати кристалізацію при охолодженні до температур у межах від температури навколишнього середовища 20. дО приблизно -202С. Сіль можна відділити від маточного розчину, застосовуючи добре відомі в практиці способи, в тому числі фільтрування, декантацію, центрифугування, випаровування, сушіння тощо. Сполуку формули (10) можна використовувати безпосередньо у формі солі з вибраною кислотою. В альтернативному варіанті сполуку формули (10) перед використанням можна виділити у формі солі з іншою кислотою після заміни кислоти або у формі основи шляхом екстракції в основному середовищі, як добре відомо в практиці. Га

У варіанті здійснення, якому віддається перевага, цей спосіб забезпечує одержання (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ЯН-3-бензазепін-2-ону високої енантіомерної чистоти шляхом і) кристалізації 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ІН-3-бензазепін-2-ону у формі його солі з кислотою, вибраною із групи, до якої входять ди-п-толіл-І -винна кислота, (К)-(-)3-4-камфорасульфонова кислота і (0)-(-)-мигдалева кислота, в динамічному процесі у присутності ароматичного альдегіду. Перевага цього динамічного процесу Фу полягає в тому, що під час кристалізації 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он зазнає конверсії в індивідуальний ізомер, що забезпечує підвищення виходу та уникнення утворення відходів, які З містять небажаний ізомер. ее)

Очікується, що для згаданого динамічного процесу придатні різноманітні ароматичні альдегіди; виявлено, що певні альдегіди є особливо придатними у практиці. Конкретно, з'ясовано, що перевагу слід віддавати З саліциловим кислотам і що більшу перевагу при здійсненні цього динамічного процесу розділення слід віддавати /-|че саліциловому альдегіду, 5-нітро-саліциловому альдегіду та З,5-дихлор-саліциловому альдегіду.

Відповідно, якщо згаданий процес здійснюється ов режимі динамічного розділення, 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ІН-3-бензазепін-2-он уводять у контакт із вибраною кислотою у присутності « ароматичного альдегіду. Як правило, для динамічного розділення використовують від приблизно 0,9 до 1,2 мМолярного еквівалента кислоти, перевага віддається використанню приблизно 1 молярного еквівалента. - с Ароматичний альдегід, як правило, застосовують у каталітичній кількості. В типових випадках застосовують від ц приблизно 0,5 до 0,001 молярного еквівалента ароматичного альдегіду, перевага віддається використанню від "» приблизно 0,1 до 0,01 молярного еквівалента.

Згаданий динамічний процес звичайно здійснюють у розчиннику без протирозчинника, як описано вище.

Суміш 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-їН-3-бензазепін-2-ону, вибраної кислоти та ароматичного альдегіду -І перемішують для забезпечення конверсії в бажаний ізомер. Як правило, цю конверсію здійснюють при температурах від температури навколишнього середовища до температури кипіння розчинника. Конверсія е вимагає часу, як правило, 6-48 год. (оо) Для обізнаного фахівця зрозуміло, що, в разі проведення згаданого процесу в режимі динамічного розділення, використання солі (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ТН-3-бензазепін-2-ону з кислотою може ве ускладнюватися внаслідок присутності у виділеному продукті незначної кількості ароматичного альдегіду. Тому (Че) перевага віддається виділенню (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ІН-3-бензазепін-2-ону після динамічного розділення шляхом сольового обміну, переважно у формі гідрохлориду, перед його використанням або одержанням основи.

На Схемі А, стадія 2, показано реакцію сполучення придатного аланіну із захищеною аміногрупою формули

РОаМН-СНСН 3-С(0)-А та придатного лактаму формули (10). Придатними аланінами із захищеними аміногрупами о є сполуки, де Ро є група захисту аміну, стереохімія відповідає І-конфігурації, а А є активуюча група, ко наприклад, -ОН або -СІ, здатна сполучатися з аміногрупою сполуки формули (10). Такі аланіни із захищеними аміногрупами легко одержати обізнаному фахівцеві. 60 Реакція сполучення, показана на Схемі А, стадія 2, включає реакцію, яку звичайно проводять при синтезі пептидів, і при її проведенні можна застосовувати методи синтезу, використовувані в цій галузі. Такі методи детально описані для Схеми 1, стадія 1.

Схема А, стадія З, ілюструє відщеплення групи захисту від сполуки формули (11) з одержанням сполуки формули (12). Відщеплення таких груп захисту аміну є добре відомим і прийнятим у практиці. 65 Схема А, стадія 4, ілюструє реакцію сполучення придатної сполуки формули (13), (СН 3)аСН-СНОН-С(ОА, зі сполукою формули (12) для одержання сполуки формули І. (5)-ізомер сполуки формули (13) є комерційно доступним і добре відомим у практиці; він описаний, в тому числі, в патентній заявці РСТ/О597/22986, поданій 22 грудня 1997р. Реакцію сполучення, показану на стадії З, проводять із використанням кислоти формули (13) (сполуки, де Аї є -ОН) або галоїдангідриду такої кислоти (сполуки, де А є -СІ або -Вг) за методикою, аналогічною описаній для Схеми 1, стадія 1.

Альтернативний спосіб одержання сполук формули І! показано на Схемі А, стадія 5, де ілюстрована реакція сполучення придатної сполуки формули (10) із придатною сполукою формули (14), (Снз»сСснАСНОН-С(ОМН-СНСН 3-С(0)-А», із безпосереднім одержанням сполуки формули !/. Придатною сполукою формули (10) є сполука, описана на стадії 2. Придатною сполукою формули (14) є сполука, що має 7/о стереохімічну структуру, бажану для кінцевого продукту формули І.

Сполуки формули (14) легко одержати шляхом сполучення амінокислот із захищеною карбоксильною групою,

НьМ-СНОНУі-ФК(ООра, зі сполуками формули (13), описаними вище. Такі реакції сполучення також добре відомі в практиці і дають продукти, які після відщеплення групи захисту утворюють сполуки формули (14).

Сполуку формули І можна виділити та очистити численними способами, в тому числі кристалізацією. Можна /5 застосовувати способи кристалізації з розчину та суспендування. Зокрема, сполуку згідно з цим винаходом можна одержати кристалізацією з різноманітних неводних та водних розчинників. До придатних розчинників належать ацетон, нижчі спирти (наприклад, метанол, етанол та ізопропанол), оцтова кислота й ацетонітрил із домішкою води або без неї, а також етилацетат, діетиловий ефір і метил-трет-бутиловий простий ефір.

З'ясовано, що у практиці перевагу слід віддавати водному ацетону. Для даного водного розчинника кількість застосовуваної води залежить від відношення розчинності (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-о ну в розчиннику й у воді і від застосовуваного способу (кристалізації або суспендування).

Кристалізацію, як правило, проводять шляхом розчинення (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-о сч

НУ У водному розчиннику, після чого дають розчину охолоджуватися (із додаванням або без додавання додаткової кількості води) для утворення твердої речовини. В типових випадках кристалізацію проводять при і) початкових температурах приблизно від 4092 до кипіння (із зворотним холодильником) вибраного водного розчинника. Потім суміш охолоджують, причому утворюється кристалічний дигідрат. Може бути доцільним застосування затравки. Кристалізаційний розчин у варіанті, якому віддається перевага, охолоджують повільно. Ге»)

Найбільш зручно виконувати кристалізацію при охолодженні до температур у межах від температури навколишнього середовища до приблизно -2020. в

Цей винахід додатково ілюстрований поданими нижче прикладами та препаративними методиками. Ці со приклади та препаративні методики мають лише ілюстративний характер і не призначені для будь-якого обмеження обсягу винаходу. З

Терміни, вживані в згаданих прикладах та препаративних методиках, мають звичайні значення, за винятком рч- спеціально вказаних випадків. Наприклад, "С" означає градуси за Цельсієм; "ммоль" означає мілімоль або мілімолі; "г" означає грам або грами; "мл" означає мілілітр або мілілітри; "розсіл" означає насичений водний розчин хлориду натрію; "ТГФ" означає тетрагідрофуран; "РХВЕ" означає рідинну хроматографію високої « ефективності (під високим тиском); тощо.

Приклад 1 - с Синтез 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону а До суспензії гідриду натрію (1,Текв.) в 15мл безводного дМФ додавали "» 2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он (0,0042моль) у формі розчину в їТОмл ДМФ. Потім додавали метилйодид (приблизно 2екв.). Після завершення реакції, посвідченого ТШХ (хроматографією в тонкому шарі), реакційну суміш виливали на лід і екстрагували етилацетатом. Органічний шар промивали водою, а потім розсолом. Потім -і органічний шар сушили над Ма»5ЗО), фільтрували й концентрували під зниженим тиском. Залишок очищали їз РХВЕ ІС 2000) при елююванні системою етилацетат/гексан і одержували

З-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он. (ее) З-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он (Текв.) розчиняли в ТГФ і додавали ізоамілнітрит їз 50 (1,2екв.). Охолоджували суміш до 02С у бані з льодом. Додавали крапля за краплею МаНМОЗ5 (1,1екв., 1М у

ТГФ). Після перемішування протягом год. або до завершення реакції суміш концентрували, а потім 3е) підкислювали 1н. водною хлористоводневою кислотою й екстрагували етилацетатом. Органічний шар сушили й концентрували, одержуючи неочищений продукт, який очищали хроматографією на силікагелі й одержували 1-гідроксіїміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он. Мас-спектр (МАН) 205,1. 1-гідроксіїміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ТЯН-3-бензазепін-2-он розчиняли в ЕН/МН з (20:1) і гідрували в

ГФ! автоклаві із застосуванням нікелю Ренея і водню (500 фунтів на кв. дюйм, 3447кПа) при 1002 протягом 10Огод.

Одержану суміш фільтрували й концентрували, одержуючи масло, яке очищали хроматографією на силікагелі й о одержували сполуку, вказану в заголовку.

Приклад 2 60 Синтез 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону

У посудину Мортона місткістю 20л завантажували МТБЕ (5,52л, 7 об'ємів) і диметилацеталь (М-метиламіно)-ацетальдегіду (614г, моль) і одержували розчин при кімнатній температурі. Додавали в реакційну посудину Мортона розчин бікарбонату натрію, приготований шляхом додавання бікарбонату натрію (546г, 6,5моль) до води (6,31л, 8 об'ємів). Одержану суміш охолоджували до температури нижче ніж 109С і бо додавали до охолодженої суміші крапля за краплею протягом 1 год розчин фенілацетилхлориду (789г, 5моль) в

МТБЕ (789мл). Після завершення додавання реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 1Тгод. На цей час аналіз методом РХВЕ посвідчив завершення реакції. Після екстракції МТБЕ (4 об'єми), висушування над безводним сульфатом магнію й концентрування в роторному випарнику одержано 1,187кг (9895) М-метил-М-(2,2-диметоксіетил)фенілацетаміду у вигляді рідини. (МАН) 237,9.

У посудину Мортона місткістю бл завантажували в сильному потоці азоту Н»ЗО) (1,42л) і крапля за краплею додавали в реакційну посудину М-метил-М-(2,2-диметоксіетил)фенілацетамід (712г, Змоль), при цьому за рахунок тепла реакції температура суміші підвищувалася на 22-789С. Одержану реакційну суміш потім нагрівали при 11023 протягом Згод., після чого охолоджували до кімнатної температури і переносили в посудину 70 Мортона місткістю 20л. При температурі нижче ніж 102 реакційну суміш гасили водним розчином гідроксиду натрію (9,1вл, 5н.). Після екстракції етилацетатом (двічі по 2,85л), висушування над сульфатом натрію й концентруванням досуха одержано 520г (73,595) З-метил-6,7-дигідро-2Н-3-бензазепін-2-ону у вигляді твердої речовини. Цей матеріал можна з метою додаткового очищення перекристалізувати із МТБЕ, одержуючи твердий продукт із т. пл. 81-822С; (МАН) -174,2.

Розчин З-метил-6,7-дигідро-2Н-3-бензазепін-2-ону (113,8г, 0,657моль) в ТГФ (0,б5л) охолоджували до 09С і додавали крапля за краплею ізоамілнітрит (100,75г, О,8бмоль). До одержаної суміші додавали ГІНМО5 (854мл, 1М розчин в ТГФ, 0,854моль) із такою швидкістю, щоб температура залишалася нижче 102С. Після завершення додавання реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 2-Згод., контролюючи хід реакції за допомогою РХВЕ. Після завершення реакції суміш охолоджували до 0 С і знижували рН із 12 до 2-3, застосовуючи водну НСІ (2н.) Одержаний осад перемішували протягом 12-16бгод., після чого відділяли фільтруванням і сушили, одержуючи 86,3г (64,990) 1-гідроксііміно-З-метил-6,7-дигідро-2Н-3-бензазепін-2-ону; т. пл. 225-2262С; (МАН) -203,0.

Розчин 1-гідроксіїміно-3-метил-б,7-дигідро-2Н-3-бензазепін-2-ону (З35г, 0,17З3моль) в етанолі (525мл) сч завантажували в автоклав разом із паладієм на вугіллі (1095, З,5г) У формі суспензії в розбавленій НОСІ (17,5г 25 . . й й й й концентрованої водної НСІ у 17мл води). Одержану суміш гідрували при 502С і тиску водню 250 фунтів на кв. (о) дюйм (1723кПа) до завершення реакції. Реакційну суміш фільтрували через шар целіту, використовуючи етанол як розчинник, і концентрували фільтрат до об'єму 9УОмл. Додавали до концентрату воду (ЗБОмл) і знов концентрували одержаний розчин до об'єму приблизно 200мл. До цього водного розчину додавали дихлорметан Фо зо (З5Омл), після чого доводили рН до 11-11,5 водним розчином гідроксиду натрію (Тн.). Органічну фазу відділяли, а водну фазу екстрагували дихлорметаном (175мл). Об'єднані екстракти концентрували, одержуючи залишок, Ж який при стоянні кристалізувався, і одержували сполуку, вказану в заголовку: т. пл. 69-812С; (МН) -191,0. со

Приклад З

Синтез 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3З-бензазепін-2-ону У посудину Мортона місткістю 22л - зв завантажували дихлорметан (4,73л, 8 об'ємів), М-метилфенетиламін (591г, 4,33моль) і водний розчин М бікарбонату натрію (436,7г, 5,2ммоль в 4,73л води). Одержану суміш охолоджували до температури нижче ніж 590 і додавали до охолодженої суміші крапля за краплею розчин хлорацетилхлориду (513,7г, 4,55моль) у дихлорметані (887мл) на протязі 7/Охв. Після завершення додавання аналіз методом РХВЕ посвідчив « завершення реакції. Розділлли шари й екстрагували водний шар дихлорметаном. Об'єднані органічні фази сушили над безводним сульфатом магнію і концентрували в роторному випарнику; одержано 915,7г (99,895) --й с М-метил-М-(2-феніл етил)-1-хлорацетаміду: (М'АН)-212 1. ц У посудину місткістю 12л в атмосфері азоту завантажували М-метил-М-(2-фенілетил)-1-хлорацетамід (883,3Гг, "» 4,17моль) і орто-дихлорбензол (6,18л). Додавали хлористий алюміній (1319г, 10,1Змоль), при цьому за рахунок тепла реакції температура суміші підвищувалася на 22-50 С. Одержану реакційну суміш потім нагрівали при 16590 протягом 2,5год., після чого охолоджували до кімнатної температури на протязі приблизно 14год. -і Охолоджували реакційну суміш приблизно до 02С і додавали до холодної води (8,8бл, приблизно 592) чотирма їз частинами з метою підтримувати температуру, яка підвищується за рахунок тепла реакції, на рівні приблизно 4020. Розділяли шари, водний шар екстрагували дихлорметаном (7,07л) і знов розділяли шари. Органічні шари со об'єднували й екстрагували водною хлористоводневою кислотою (8,83л, 1н.), а потім насиченим водним ї» 20 розчином бікарбонату натрію (7,07л), сушили над сульфатом магнію, змішували із силікагелем (883Гг) і вносили в колонку із силікагелем (3,53кг, колонка з пористим скляним фільтром, заповнення за допомогою суспензії в с дихлорметані). Через колонку пропускали як елюент дихлорметан до об'єму елюату 25л, а потім етилацетат для елюювання продукту. Фракцію, що містила продукт, випаровували Й одержували

З-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он у вигляді жовтувато-коричневої твердої речовини в кількості 22 в08г (8396).

Ф! У посудину місткістю 22л в атмосфері азоту завантажували З-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он (606г, 3,4бмоль) і ізоамілнітрит (543г, 4,5моль) в ТГФ (7,8вл). Суміш охолоджували приблизно до 02С і додавали о ІІНМО5 (Ін. розчин в ТГФ, 4,5л, 4,5моль) із такою швидкістю, щоб температура залишалася нижче приблизно 726. Після завершення додавання реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом приблизно бо 2год., контролюючи хід реакції за допомогою РХВЕ. Після завершення реакції суміш охолоджували приблизно до 02С і знижували рН із 12 до 2-1, застосовуючи водну НСІ (2н.) Одержаний осад перемішували протягом приблизно бгод., після чого відділяли фільтруванням і сушили, одержуючи 1-гідроксіїміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он (604,7г, 85,695).

Розчин 1-гідроксіїміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону (625г, 3,0бмоль) в етанолі сорту б5 й й о, й ш не

ЗА (15,бл) завантажували в автоклав разом із паладієм на вугіллі (1095, 120г) у формі суспензії в розбавленій

НСЇ (312г концентрованої водної НСІ у З320мл води). Одержану суміш гідрували при 509С і тиску водню 250 фунтів на кв. дюйм (1723кПа) при інтенсивному перемішуванні до завершення реакції (приблизно 4год).

Реакційну суміш фільтрували через шар целіту, використовуючи етанол як розчинник, і концентрували фільтрат, одержуючи тверду речовину. Цей твердий продукт обробляли дихлорметаном (бл) і додавали Ін. водний розчин гідроксиду натрію до значення рН водного шару в межах 11-11,5. Суміш перемішували, розділяли шари й екстрагували водний шар дихлорметаном (2л). Органічні шари сушили над сульфатом магнію, фільтрували й випаровували в роторному випарнику, одержуючи сполуку, вказану в заголовку (477г, 81,990).

Приклад 4 70 Синтез (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ІН-3-бензазепін-2-он (1,544г, 8,12ммоль) обережно нагрівали в 15Бмл метанолу до розчинення. У другій склянці розчиняли ди-я-толуїл-І -винну кислоту (3,12г, 8,0вммоль) в 15мл метанолу й одержаний розчин додавали за допомогою піпетки до теплого розчину аміну. Після випадання твердого продукту в осад суміш підігрівали. Додавали ще ЗОмл метанолу для одержання розчину, який нагрівали 75 Зі зворотним холодильником протягом 30-40хв., а потім повільно охолоджували до температури навколишнього середовища, при цьому утворювався твердий продукт. Після перемішування протягом приблизно 18год. цей продукт відділяли фільтруванням і промивали невеликою кількістю охолодженого метанолу. Одержано 2,24г солі (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ІН-3-бензазепін-2-ону і ди-п-толуїл-Ї-винної кислоти (вихід 9695, ее 94,790).

Сіль (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону і ди-п-толуїл-Ї-винної кислоти (11,83Г, 20,5ммоль) розчиняли в 45мл 1,О0н. водного розчину гідроксиду натрію й екстрагували хлористим метиленом (тричі по 25мл). Об'єднані розчини в хлористому метилені промивали Збмл 1,Он. водного розчину гідроксиду натрію, потім розсолом і сушили над безводним М950О5. Після видалення розчинника у вакуумі одержано сполуку, вказану в заголовку (3,38г) у вигляді безбарвного масла (вихід 8790, ее 93,290). с

Приклад 5

Синтез (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону о 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он (6б,0г, 31,5ммоль) обережно нагрівали в 75мл метанолу для розчинення і поєднували з розчином ди-п-толуїл-І-винної кислоти (12,2г, 31,5МммМмоль) в 7/5мл теплого метанолу. В розчин вносили затравку, причому утворювався твердий продукт. Додавали ще 100мл метанолуі дФ3 зо перемішували суміш. Після перемішування протягом приблизно 18год. твердий продукт відділяли фільтруванням і промивали невеликою кількістю охолодженого метанолу. Одержано 6,7г твердої речовини. Цю в речовину змішували з метанолом (200мл) і перемішували. Через 18год. відділяли твердий продукт, одержуючи Ге) сіль (5)-1-аміно-3З-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-З-бензазепін-2-ону і ди-п-толуїл-/-винної кислоти /(4,4г).

Виділення основи за методикою, описаною в Прикладі 4, дало сполуку, вказану в заголовку (ее 9690). в

Приклад 6 ї-

Синтез (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ТІН-3-бензазепін-2-ону В апараті місткістю 22л нагрівали в атмосфері азоту 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он (438г, 2,3моль) приблизно до 4092С для одержання його розчину в метанолі (4,38л). У другій посудині розчиняли ди-п-толуїл-І -винну кислоту (889,7г, « 2,3моль) в 4,3вл метанолу, одержаний розчин нагрівали приблизно до 402С і додавали до нього розчин 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону. Продовжували нагрівання і додавали ще 6б,13л/л - с метанолу, після чого суміш нагрівали зі зворотним холодильником протягом приблизно 45хв., а потім повільно ц охолоджували до температури навколишнього середовища, причому утворювався твердий продукт. Після "» перемішування протягом приблизно 18год. цей продукт відділяли фільтруванням і промивали невеликою кількістю маточного розчину, сушили на повітрі і промивали приблизно 2л етилацетату. Одержано 561,6г солі (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ІН-3-бензазепін-2-ону і ди-я-толуїл-Ї-винної кислоти. Змішували сіль -| (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ЯН-3-бензазепін-2-ону і ди-п-толуїл-Ї-винної кислоти, дихлорметан їз (б,57л) і їн. водний розчин гідроксиду натрію (6б,57л) і перемішували. Розділяли шари і двічі екстрагували органічний шар їн. водним розчином гідроксиду натрію (3,2в8л), один раз розсолом (2,4бл), сушили над ее) сульфатом магнію, фільтрували й випаровували в роторному випарнику. Одержано сполуку, вказану в заголовку (250г, 57,490, ее 94,1965). те п риклад 7 іЧе) Синтез гілрохлориду (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ЯН-3-бензазепін-2-ону 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ІН-3-бензазепін-2-он (31,9г, 168ммоль) суспендували приблизно в ЗО0Омл ізопропілацетату і нагрівали до 459С. В окремій посудині нагрівали (К)-(--3-Ю-мигдалеву кислоту (25,0г, 1б4ммоль) приблизно в 1ЗОмл ізопропілового спирту до утворення розчину і додавали цей розчин до о вищезгаданої суспензії 1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону в ізопропілацетаті, одержуючи розчин, з якого швидко випадав осад. Суміш перемішували при 4592 протягом приблизно Згод. До теплого де розчину додавали 5-нітросаліциловий альдегід (2-гідрокси-5-нітробензальдегід) (1,40г, 8,3в8ммоль, 5905 (моль)) і перемішували суміш при 4523. Приблизно через 14год. суспензію охолоджували до температури навколишнього 60 середовища і перемішували протягом 2год., після чого відділяли твердий продукт фільтруванням, промивали 7Омл охолодженого ізопропілацетату і сушили у вакуумній шафі при 409С. Одержано 46,62г солі (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону і (К)-мигдалевої кислоти (вихід 82,995, ее 98,49).

Сіль (5)-1-аміно-3З-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3З-бензазепін-2-ону і (К)-мигдалевої кислоти /(2,42г, 7,Обммоль, ее 98,4905) суспендували в 25мл етилацетату при температурі навколишнього середовища. Додавали бо концентровану водну хлористоводневу кислоту (1,1мл, приблизно 11,2ммоль) і при інтенсивному перемішуванні нагрівали суміш при 509 протягом З,5год. Охолоджували суспензію до температури навколишнього середовища, фільтрували й промивали осад метил-трет-бутиловим простим ефіром (приблизно 1Омл).

Одержано 1,48г сполуки, вказаної в заголовку (вихід 92,595, ее 97,990).

Приклад 8

Синтез (-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону

У круглодонну колбу завантажували М-трет-Вос-і -аланін (1,Оекв.), гідрат гідроксибензотриазолу (приблизно 1,Текв.) ії (5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ТН-3-бензазепін-2-он (1,0екв.) в ТГФ в атмосфері азоту. До 70 цієї суміші при ефективному перемішуванні додавали основу Хуніга (Нипід) (М,М-діїізопропілетиламін, 1,Текв.), а потім ЕОС (1,Текв.). Після перемішування протягом 4-17год. при температурі навколишнього середовища розчинник видаляли під зниженим тиском, залишок розчиняли в етилацетаті та воді, промивали насиченим водним розчином бікарбонату натрію, їн. водною НС, розсолом, сушили над безводним сульфатом натрію, фільтрували Й видаляли розчинник під зниженим тиском. Одержано 75..1-(М-трет-Вос-І -аланініл)аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ТН-3-бензазепін-2-он: мас-спектр (МАН) 362,3.

Через перемішуваний розчин 1-(М-трет-Вос-І -аланініл)аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону в 1,4-діоксані (0,03-0,09М), охолоджений у бані з льодом приблизно до 1092 в атмосфері Мо, пропускали протягом 10-15хв. потік газоподібного безводного НОСІ. Закривали колбу з розчином, відстороняли охолоджувальну баню і давали розчину нагріватися до температури навколишнього середовища при перемішуванні протягом 2-8год., контролюючи витрачання вихідного матеріалу за допомогою ТШХ. Розчин концентрували й одержували 1-(І-аланініл)-(5)-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он, який використовували без додаткового очищення. 1-(І-аланініл)-(5)-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-3-метил-1Н-3-бензазепін-2-он (1,Оекв.), гідрат Се гідроксибензотриазолу (ІД екв.) і (5)-2-гідрокси-3-метилмасляну кислоту (1,0екв.) змішували в ТГФ в атмосфері (5) азоту. Додавали основу Хуніга (М,М-діізопропілетиламін, 1,1екв.), а потім ЕОС (1,1екв.). Після перемішування протягом 4-17год. при температурі навколишнього середовища розчинник видаляли під зниженим тиском, залишок розчиняли в етилацетаті (або аналогічному розчиннику) та воді, промивали насиченим водним розчином бікарбонату натрію, Ін. НСІ, розсолом, сушили над безводним сульфатом натрію і видаляли розчинник «3 під зниженим тиском, одержуючи сполуку, вказану в заголовку. «

Приклад 9

Синтез с (-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону

У круглодонну колбу завантажували М-трет-Вос-І -аланін (249,5г, 1,32моль), гідрат гідроксибензотриазол З руглодонну У У р р р р У (232,2г, 1,52моль) і (5)-1-аміно-3З-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3З-бензазепін-2-он (250,8г, 1,32моль) в ТГФ ї- (3,7бл) в атмосфері азоту. Суміш охолоджували до температури нижче ніж 59С і додавали основу Хуніга (М,М-діізопропілетиламін, 188,4г, 1,45моль), а потім ЕОС (283,7г, 1,45моль). Після перемішування протягом б год реакційну суміш нагрівали до температури навколишнього середовища і перемішували протягом приблизно « 14год. Видаляли розчинник під зниженим тиском, залишок розчиняли в етилацетаті (З3,7бл) та воді (1,7бл), розділяли шари, органічний шар екстрагували водою (1,7бл), водні шари об'єднували й екстрагували ші с етилацетатом (1,7бл). Органічні шари об'єднували, екстрагували насиченим водним розчином бікарбонату м натрію (1,7бл), сушили над безводним сульфатом натрію, фільтрували й випаровували в роторному випарнику. я Одержано 1-(М-трет-Вос-І -аланініл)аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-Т1Н-3-бензазепін-2-он (463г, 972905).

Готували розчин НСІ в етилацетаті шляхом пропускання газоподібного безводного НСІ через етилацетат (1,7бл), охолоджений приблизно до 09С, із використанням диспергувальної трубки, зануреної в рідину. і Виготовлений таким чином розчин НС! в етилацетаті додавали до інтенсивно переміщуваної суспензії їх 1-(М-трет-Вос-І -аланініл)аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ТН-3-бензазепін-2-ону (462г, 1,28моль) в етилацетаті (3,7л). Додавали ще 1л етилацетату і давали реакційній суміші нагрітися до кімнатної температури бо і перемішували протягом 22год. Фільтрували реакційну суміш і одержували твердий продукт. Цей продукт їх 250 суспендували в ацетонітрилі (бл), нагрівали до кипіння зі зворотним холодильником, після чого охолоджували приблизно до 609, фільтрували Й сушили осад, одержуючи ср 1-(-аланініл)-(5)-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он (389,8г, 94,7905). 1-(І-аланініл)-(5)-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-3-метил-1Н-3-бензазепін-2-он (369, 5г, 1,18моль), гідрат гідроксибензотриазолу (207,6г, 1,3бмоль), основу Хуніга (М,М-діїізопропілетиламін, 352,2г, 2,71моль) і о (5)-2-гідрокси-З-метилмасляну кислоту (140,6г, 1,13моль) змішували в ТГФ (4,8л) в атмосфері азоту і

ГФ) охолоджували до температури нижче ніж 59С. Додавали ЕОС (253,7г, 1,3моль) і давали реакційній суміші нагріватися до температури навколишнього середовища при перемішуванні. Приблизно через 25год. реакційну о суміш розбавляли дихлорметаном (5,54л) і екстрагували водою (2,22л). Органічний шар екстрагували водою (2,22л), водні шари об'єднували й екстрагували дихлорметаном (5,54л). Органічні шари об'єднували, бо екстрагували двічі водою (2,22л), насиченим водним розчином бікарбонату натрію (2,22л), сушили над безводним сульфатом натрію, фільтрували й випаровували в роторному випарнику. Одержано тверду речовину (428г, 10095). Цей твердий продукт розчиняли у змішаному розчиннику, що містив ацетон (3,42л) і воду (0,856л) при слабкому нагріванні (40). Одержаний розчин ділили на порції об'ємом приблизно по 2л і додавали до кожної воду (7,19л) при нагріванні каламутного розчину до 502С. Після додавання всієї води каламутному бо розчину давали охолодитися до температури навколишнього середовища й одержували твердий продукт,

суспензію якого перемішували при температурі навколишнього середовища протягом приблизно 14год., після чого фільтрували й сушили, одержуючи сполуку, вказану в заголовку (310,6г, 66,290) у формі дигідрату.

При застосуванні сполуки згідно з цим винаходом як лікарський засіб її звичайно вводять в організм у формі фармацевтичної композиції. Таким чином, згідно з іншим варіантом здійснення, цей винахід пропонує фармацевтичні композиції, які містять ефективну кількість (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-о ну та фармацевтично прийнятний розріджувач. Такі композиції застосовують для інгібування вивільнення

В-амілоїдного пептиду та/або його синтезу, в тому числі при лікуванні хвороби Альцгеймера. Таким чином, цей /о винахід охоплює використання (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-о ну для виготовлення лікарського засобу для інгібування вивільнення В-амілоїдного пептиду та/або його синтезу, зокрема, при лікуванні хвороби Альцгеймера. (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін 7/5 7 2-он можна вводити в організм різноманітними шляхами. Сполуку згідно з цим винаходом можна вводити в організм в будь-яких формах або різновидах, які забезпечують біодоступність сполуки в ефективній кількості, У тому числі пероральними та парентеральними шляхами. Наприклад, сполуку згідно з цим винаходом можна вводити в організм пероральним, інгаляційним, підшкірним, внутрішньом'язовим, внутрішньовенним, черезшкірним, назальним, ректальним, внутрішньоочним, місцевим шляхами, способом розсмоктування під 2о язиком або за щокою тощо.

При виготовленні композицій згідно з цим винаходом активний інгредієнт звичайно змішують із наповнювачем, розбавляють наповнювачем або вміщують у носій, який може мати форму капсули, пакета-саше, паперового пакетика або іншого контейнера. Сполуку згідно з цим винаходом можна вводити в організм окремо або у формі фармацевтичної композиції, тобто в комбінації з фармацевтично прийнятними розріджувачами, (су об Наприклад, із носіями або наповнювачами, частка та природа яких визначаються розчинністю та хімічними властивостями згаданої сполуки, вибраного шляху введення та стандартною фармацевтичною практикою і) дивись "Фармацевтичні науки" Ремінгтона -- Бетіпдіоп'є Ріпагтасеціїса! Зсієпсев, 181" Едййоп, Маск Рибі. Со., 1990).

Фармацевтичні композиції згідно з цим винаходом виготовляють способами, добре відомими у Ге»! фармацевтичній практиці. Носієм або наповнювачем може бути твердий, напівтвердий або рідкий матеріал, який може бути носієм або середовищем для активного інгредієнта. Придатні для цього носії або наповнювачі добре М відомі в практиці. Фармацевтична композиція може бути пристосована для перорального, інгаляційного, ее) парентерального або місцевого застосування і може бути введена в організм пацієнта у формі таблеток, капсул, аерозолів, інгаляційних препаратів, супозиторіїв, розчинів, суспензій тощо. М

Для цілей перорального терапевтичного застосування сполуки можуть бути поєднані з наповнювачами і ча застосовуватися у формі таблеток, пастилок, капсул, еліксирів, суспензій, сиропів, вафель, жувальних гумок тощо. Такі препарати мають містити щонайменше 4905 сполуки згідно з цим винаходом як активний інгредієнт, проте його вміст може варіювати залежно від конкретної форми і може складати від 295 до приблизно 9095 маси « дозованої одиниці. Кількість згаданої сполуки, присутня в композиції, є такою, що забезпечує відповідне дозування. Композиції та препарати згідно з цим винаходом, яким слід віддавати перевагу, може визначити 8 с обізнаний фахівець. ц Згадані таблетки, пілюлі, капсули, пастилки тощо можуть також містити одну або кілька перелічених нижче "» допоміжних речовин: в'яжучі агенти, наприклад, мікрокристалічну целюлозу, камедь, трагант або желатин; наповнювачі, наприклад, крохмаль або лактозу; дезінтегратори, наприклад, альгінову кислоту, препарат "Ргітоде!", кукурудзяний крохмаль тощо; змащувальні агенти, наприклад, стеарат магнію, силіконове масло або -І препарат "Зіегоїех"; ковзні агенти, наприклад, колоїдний діоксид кремнію; та підсолоджувачі, наприклад, сахарозу або сахарин, або ароматизатори та смакові домішки, наприклад, м'яту, метилсаліцилат або е апельсиновий ароматизатор. Якщо формою дозованої одиниці є капсула, то вона може містити, окрім матеріалів (ее) вищезгаданих типів, рідкий носій, наприклад, поліетиленгліколь або нелетку олію. Інші форми дозованих одиниць можуть містити різноманітні інші матеріали, які модифікують фізичну форму дозованої одиниці, ве наприклад, у вигляді оболонок. Так, таблетки або пілюлі можуть мати оболонки з цукру, шелаку або інших (Че) покривних матеріалів. Сироп, окрім сполук згідно з винаходом, може містити сахарозу як підсолоджувач та деякі консерванти, фарбники та смакові домішки. Матеріали, використовувані при виготовленні згаданих різноманітних композицій, мають бути фармацевтично чистими й нетоксичними у застосовуваних кількостях.

Для цілей парентерального застосування сполука згідно з винаходом може бути введена в розчин або суспензію. Такі препарати, як правило, містять щонайменше 0,195 сполуки згідно з винаходом, проте її вміст о може варіювати й становити від 0,195 до приблизно 9095 маси композиції. Кількість згаданої сполуки, присутня в ко композиції, є такою, що забезпечує відповідне дозування. Згадані розчини або суспензії можуть також містити одну або кілька перелічених нижче допоміжних речовин: стерильні розріджувачі, наприклад, воду для ін'єкцій, бо сольовий розчин, нелеткі олії, поліетиленгліколі, гліцерин, пропіленгліколь або інші синтетичні розчинники; протимікробні агенти, наприклад, бензиловий спирт або метилпарабен; антиоксиданти, наприклад, аскорбінову кислоту або бісульфіт натрію; хелатоутворювальні агенти, наприклад, етилендіамінтетраоцтову кислоту; буферні сполуки, наприклад, ацетати, цитрати або фосфати; та агенти для забезпечення |ізотонічності, наприклад, хлорид натрію або декстрозу. Парентеральні композиції можуть бути вміщені в ампули, одноразові 65 шприци або багатодозові пляшечки, виготовлені зі скла або пластмаси. Композиції та препарати, яким слід віддавати перевагу, може визначити обізнаний фахівець.

Сполуку згідно з цим винаходом можна вводити в організм також місцевим способом; в такому разі носій може містити розчин, основу мазі або гелю. Згадана основа може містити, наприклад, одну або кілька таких речовин: вазелін, ланолін, поліетиленгліколі, бджолиний віск, мінеральне масло, розріджувачі, наприклад, воду або спирт, а також емульгатори та стабілізатори. Композиції для місцевого застосування можуть містити сполуку формули І! або її фармацевтичну сіль у концентрації від приблизно 0,195 до приблизно 1095 (маси на одиницю об'єму).

Іншою композицією згідно з цим винаходом, якій віддається перевага, є засоби для черезшкірного постачання ("пластирі"). Такі пластирі для черезшкірного постачання можна застосовувати для забезпечення безперервної 70 або періодичної інфузії сполуки згідно з цим винаходом у контрольованих кількостях. Будова та застосування пластирів для черезшкірного постачання фармацевтичних агентів добре відомі в практиці. |Дивись, наприклад, патент США Мо5,023,252, виданий 11 червня 1991р.)| включений до цього опису за посиланням. Такі пластирі можуть мати будову, розраховану на безперервне, імпульсне постачання фармацевтичних агентів або на їх уведення за потребою.

З метою більш повної ілюстрації здійснення цього винаходу нижче подано опис типових фармацевтичних композицій. Ці приклади є лише ілюстративними і не призначені для будь-якого обмеження обсягу винаходу.

Приклад композиції 1

Виготовляють тверді желатинові капсули, які вміщують такі інгредієнти:

Інгредієнт Кількість, мг/капсулу

Активний інгредієнт 0,0

Крохмаль 305,0

Стеарат магнію 50

Вищезгадані інгредієнти змішують і заповнюють сумішшю тверді желатинові капсули (по З4ОмгГг). сч 29 Приклад композиції 2 Ге)

Композицію для таблеток виготовляють, застосовуючи такі інгредієнти:

Інгредієнт Кількість, мг/таблетку

Активний інгредієнт 25,0 б»

Целюлоза мікрокристалічна 200,0 чІ

Колоїдний діоксид кремнію 10,0

Стеаринова кислота 50 со «

Вищезгадані компоненти змішують і пресують у таблетки масою по 240 мг кожна. 3о Приклад композиції З -

Композицію для інгаляції сухого порошку виготовляють, застосовуючи такі інгредієнти:

Інгредієнт Маса, 5 «

Активний інгредієнт 5

Лактоза 95 ші - Активний інгредієнт змішують із лактозою й одержану суміш уміщують у пристрій для інгаляції сухого " порошку.

Приклад композиції 4

Таблетки з умістом у кожній ЗОмг активного інгредієнта виготовляють, як описано нижче: -І що со я. т.

Фо стерильних) 000010 о ко Активний інгредієнт, крохмаль та целюлозу пропускають через сито 20меш за стандартом США (розмір отворів 0,84мм) і ретельно перемішують. З одержаним порошком змішують розчин полівінілпіролідону і 60 пропускають суміш через сито 1бмеш за стандартом США (розмір отворів 1,2мм). Одержані таким чином гранули сушать при 50-602С і пропускають через сито 1бмеш за стандартом США. Натрієву сіль карбоксиметильованого крохмалю, стеарат магнію й тальк, попередньо пропущені через сито ЗОмеш за стандартом США (розмір отворів

О,бмм), додають до гранул і після перемішування пресують на таблетувальній машині в таблетки масою по 150мг кожна. 65 Приклад композиції 5

Капсули з умістом у кожній 4Омг лікарської речовини виготовляють, як описано нижче:

Й

Активний інгредієнт, крохмаль та стеарат магнію змішують, пропускають через сито 20меш за стандартом

США (розмір отворів 0,84мм) і заповнюють сумішшю тверді желатинові капсули (по 15О0мгГ). то Приклад композиції б

Супозиторії з умістом у кожному 25мг активного інгредієнта виготовляють, як описано нижче:

Інгредієнт Кількість

Активний інгредієнт 25 12 Гліцериди насичених жирних кислот до 2000

Активний інгредієнт пропускають через сито бОмеш за стандартом США (розмір отворів 0,25мм) і суспендують у гліцеридах насичених жирних кислот, попередньо розплавлених із застосуванням мінімальної необхідної кількості тепла. Потім суміш розливають у форму для супозиторіїв номінальною місткістю 2г і дають захолонути.

Приклад композиції 7

Суспензію з умістом лікарської речовини 5Омг у дозі 5мл виготовляють, як описано нижче:

Інгредієнт Кількість сеІ

Активний інгредієнт 50 Омг о

Ксантанова камедь А Омг

Натрієва сіль карбоксиметилцелюлози (1195) 50, Омг

Целюлоза мікрокристалічна (8995)

Сахароза 1,7Бмг (є)

Бензоат натрію 10,Омг «І

Ароматизатор та барвник за потребою

Вода очищена до Б. Омл со 0. , , «

Активний інгредієнт, сахарозу та ксантанову камедь змішують, пропускають через сито 1Омеш за стандартом

США (розмір отворів 2,О0мм), після чого змішують із попередньо приготованим розчином мікрокристалічної і - целюлози та натрієвої солі карбоксиметилцелюлози у воді. Бензоат натрію, ароматизатор і барвник розбавляють частиною води і додають при перемішуванні. Потім додають воду в кількості, необхідній для забезпечення бажаного об'єму. «

Приклад композиції 8

Капсули з умістом у кожній 15мг лікарської речовини виготовляють, як описано нижче: т - о - е Активний інгредієнт, крохмаль та стеарат магнію змішують, пропускають через сито 20меш за стандартом (оо) США (розмір отворів 0,84мм) і заповнюють сумішшю тверді желатинові капсули (по 56бОмг).

Приклад композиції 9 ве Композицію для підшкірного введення можна виготовити, як описано нижче: іЧе)

Інгредієнт Кількість

Активний інгредієнт 1,0мг

Кукурудзяна олія 1мл (Ф) Залежно від розчинності активного інгредієнта в кукурудзяній олії, в цю композицію в разі потреби можна

ГІ вводити до приблизно 5,Омг або більше активного інгредієнта.

Приклад композиції 10 во Композицію для місцевого застосування можна виготовити, як описано нижче:

Інгредієнт Кількість

Активний інгредієнт 1-10г

Емульгувальний віск Зог

Вазелінове масло 20г б5 й

М'який безбарвний парафін до 100г

М'який безбарвний парафін нагрівають до розплавлений. Додають вазелінове масло та емульгувальний віск і перемішують до розчинення. Додають активний інгредієнт і продовжують перемішування до утворення дисперсії.

Потім охолоджують суміш до затвердіння.

Згідно з одним із методичних аспектів, цей винахід стосується способу інгібування вивільнення

В-амілоїдного пептиду та/або його синтезу, який включає введення в організм пацієнта, що потребує такого інгібування, ефективної кількості (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-о ну. Згідно з конкретним варіантом здійснення цього способу, цей винахід пропонує спосіб лікування хвороби то Альцгеймера, який включає введення в організм пацієнта, що потребує такого лікування, ефективної кількості (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-ону.

Мається також на увазі, що обізнаний фахівець може вплинути на хворобу Альцгеймера шляхом лікування пацієнта, який на даний час уражений цим захворюванням, або ж шляхом профілактичного лікування пацієнта, у якого має місце ризик розвитку цього захворювання. Таким чином, терміни "лікування", "лікувати" стосуються їз усіх процесів, де може мати місце уповільнення, переривання, припинення, регулювання або затримання розвитку хвороби Альцгеймера, але не обов'язково вказують на повне усунення всіх симптомів. Таким чином, пропоновані способи охоплюють запобігання початку хвороби Альцгеймера у пацієнта, в якого має місце ризик розвитку хвороби Альцгеймера, інгібування розвитку хвороби Альцгеймера та лікування прогресуючої хвороби

Альцгеймера. 20 Термін "пацієнт" у значенні, вживаному в цьому описі, стосується теплокровної тварини, наприклад, ссавця, яка уражена розладом, пов'язаним із підвищеним вивільненням В-амілоїдного пептиду та/або його синтезом, в тому числі хворобою Альцгеймера. Мається на увазі, що прикладами тварин, які охоплюються цим терміном, є морські свинки, собаки, коти, пацюки, миші, коні, велика рогата худоба, вівці та люди. Пацієнтів, які потребують згаданого лікування, легко діагностувати. см 25 Термін "ефективна кількість" сполуки формули І| у значенні, вживаному в цьому описі, стосується кількості, Го) яка забезпечує ефективне інгібування вивільнення В-амілоїдного пептиду та/або його синтезу і, особливо, лікування хвороби Альцгеймера.

Ефективну кількість легко визначити діагносту-куратору як обізнаному фахівцеві, шляхом застосування б звичайних способів та спостереження результатів, одержаних в аналогічних випадках. При визначенні 30 ефективної кількості - дози «І (-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-ТН-3-бензазепін-2-он со у - діагност-куратор має брати до уваги численні фактори, в тому числі (але не тільки) ефективність та характеристики «І (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-о м 35 ну, вид пацієнта, його масу тіла, вік та загальний стан здоров'я; ступінь розвитку або тяжкість захворювання; індивідуальну реакцію пацієнта; шлях введення лікарського засобу; характеристики біодоступності застосовуваного препарату; обраний режим дозування; застосування інших способів лікування при комплексній терапії; та інші обставини. « дю Очікується, що ефективна кількість - (М)-((5)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-о с ну варіює від приблизно 0,їмг на кілограм маси тіла на день (мг/кг/день) до приблизно 1ООмг/кг/день. :з» Кількості, яким слід віддавати перевагу, має визначати обізнаний фахівець.

Дигідрат (М)-45)-2-гідрокси-3-метил-бутирил)- 1-1 --аланініл)(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-З-бензазепін-2-о - ну згідно з цим винаходом можна випробовувати в різноманітних біологічних системах, в тому числі в описаних нижче. ї Приклад А со Скринінг на культурах клітин для виявлення інгібіторів продукування В-амілоїду

Численні сполуки вищезазначеної формули | випробовували для з'ясування їх здатності інгібувати т» 50 продукування В-амілоїду в лінії клітин, що зазнали шведської мутації. При цьому скринінговому випробуванні с застосовували клітини (К293, лінія клітин нирок людини), які були стабільно трансфіковані геном попередника амілоїду - протеїном 751 (АРР7Б51), що містив подвійну мутацію із заміною ІУзе5іМеїсво на АвпевіЇ ейвво (нумерація АРР751), способом, (описаним у міжнародній заявці Мо94/10569 8 та в роботі Цитрона та ін.12 (Сйгоп еї а.) Цю мутацію звичайно називають "шведською мутацією". Згадані клітини, позначені "293 751 ЗУМЕ", висівали на 96-лункових планшетах "Сотіпод" по 2-4Х107 клітин на лунку в мінімальному необхідному середовищі

Ф) за Дюльбекко (ОМЕМ) (фірма Зідта, 51. І оціз, МО) із додаванням 1095 сироватки плоду корови. Кількість клітин ка має важливе значення з точки зору досягнення результатів визначення В-амілоїду методом ЕГІ5А (імуноферментного твердофазного аналізу), які лежать у лінійному діапазоні (від приблизно О,2нг/мл до 60 2,5НГг/мЛл).

Після інкубування протягом ночі при 37 2С в інкубаторі з рівноважною атмосферою з умістом СО» 1095 живильне середовище видаляли, замінювали на 200мкл на лунку середовища, яке містило сполуку формули (лікарську речовину), для 2-годинного попереднього оброблення, і інкубували клітини, як описано вище. Вихідні розчини лікарських речовин були виготовлені в 100906-ному диметилсульфоксиді з таким розрахунком, щоб при 65 Кінцевій концентрації лікарської речовини, застосованій при випробуванні, концентрація диметил сульфоксиду не перевищувала 0,595, а реально дорівнювала, як правило, 0,190.

Після закінчення попереднього оброблення живильні середовища знов видаляли й замінювали на свіжі вищевказані середовища, що містили лікарські речовини, і інкубували клітини додатково протягом 2год. Після оброблення планшети центрифугували в центрифузі "Весктап СР" при 1200об/хв. протягом 5хв. при кімнатній температурі для відділення залишків клітин від кондиціонованого середовища. По 100мкл кондиціонованого середовища з кожної лунки або відповідного розведення такого середовища переносили на планшет для ЕГІ5А, попередньо покритий антитілом 266 див. С"'юберт - Р.бецбегі, Майшге (1992) 359:325-327| до амінокислот 13-28

В-амілоїдного пептиду, як описано в публікації |міжнародної заявки Мо94/10569 8), і зберігали при 42С. протягом ночі. Наступного дня виконували аналіз методом ЕЇГ ІЗА з застосуванням міченого антитіла 306 |Р.Зешбегі, Майге 70 (1992) 359:325-327| до амінокислот 1-5 В-амілоїдного пептиду для вимірювання кількості продукованого

В-амілоїдного пептиду.

Цитотоксичний ефект згаданих сполук вимірювали модифікованим методом Гансена та інших (Напзеп еї аї.)

До клітин, які залишалися на планшеті з культурою тканини, додавали 25мкл вихідного розчину (5мг/мл) 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолійброміду (МТТ) (фірма бБідта, 5. Іоціз, МО) до кінцевої 75 концентрації 1Імг/мл. Інкубували клітини при 372С протягом год. і припиняли активність клітин додаванням рівного об'єму буфера лізису МТТ (2095(мас.) додецилсульфату натрію на об'єм 50956-ного диметилформаміду, рН4,7). Повну екстракцію забезпечували струшуванням протягом ночі при кімнатній температурі. Різницю між значеннями оптичної густини на довжинах хвиль 562нм і 650нм (ОО ввонм і ОЮввонм) як індикатор життєздатності клітин вимірювали із застосуванням пристрою для зчитування мікропланшетів ОМ лах фірми "Моіесціаг Оемісе".

Результати визначення В-амілоїдного пептиду методом ЕГ ІЗА зіставляли зі стандартною кривою і виражали як концентрацію В-амілоїдного пептиду в нг/мл. З метою нормалізації на цитотоксичність ці результати ділили на результати проби із МТТ і виражали в процентах від результатів для контрольних проб, які не містили лікарських речовин. Усі результати є середніми значеннями для щонайменше шести паралельних проб із визначенням стандартного відхилення. Ге!

Приклад В о

Пригнічення вивільнення та/або синтезу В-амілоїдного пептиду іп мімо

Цей приклад ілюструє можливий спосіб випробування сполук згідно з цим винаходом на пригнічення вивільнення та/або синтезу В-амілоїдного пептиду іп мімо. Для цих дослідів використовували мишей лінії РОАРР (ЇГгейме та інші - Сатевз еї аїЇ., Маїшге 373:523-527, 1995) у віці 3-4 місяців. Залежно від конкретної Ге) випробовуваної сполуки, її розчин звичайно готували в концентрації від тїмг/мл до 1Омг/мл. У зв'язку з низькою « розчинністю згаданих сполук, їх розчини можна готувати із застосуванням різних носіїв, наприклад, кукурудзяної олії (фірма Заїежау, Зоцій Зап Ргапсівсо, СА); 1095 етанолу в кукурудзяній «олії; (ее) 2-гідроксипропіл-В-циклодекстрині (фірма Кезеагсі Віоспетіса!Їв Іпіегпайіопаї, Майск, МА) та « карбоксиметилцелюлозі (фірма бідта Спет. Со., 5. І оців, МО).

Мишам уводили випробовувані речовини підшкірно із застосуванням голки 26 калібру. Через Згод. тварин ї- умертвляли за допомогою СО 5 і відбирали проби крові шляхом серцевої пункції із застосуванням туберкулінового шприца місткістю їсмУ і голки 25 калібру довжиною 5/8 дюйма (1бмм), попередньо промитих розчином ЕДТА (0,5М, рНеВ,0). Кров переносили у вакутейнер Бектона-Дікінсона, який містив ЕДТА, і « центрифугували при 1500х9 протягом 15хв. при 59С. Потім видаляли мозки мишей, відділяли кору та гіпокамп і 740 зберігали на льоду. в) с 1. Дослідження мозку "» Для підготовки тканин гіпокампу та кори до імуноферментного твердофазного аналізу (ЕГІЗА) кожну згадану " частину мозку гомогенізували в 10 об'ємах охолодженого льодом гуанідинового буферу (5,0М гуанідин-НСЇІ, 50ММ Трис-НСЇ, рНаеВ,0), застосовуючи механічну ступку "Копіев" (фірма Різпег, Рійзригой, РА). Гомогенати злегка струшували на обертовій платформі протягом 3-4год. при кімнатній температурі і зберігали при -209С до ш- виконання кількісного аналізу на В-амілоїд. ї» Гомогенати мозку розводили (1:10) охолодженим льодом казеїновим буфером (0,25905 казеїну, сольовий розчин із фосфатним буфером (РВ5), 0,05956 азиду натрію, 20мкг/мл апротиніну, хмМ ЕДТА, рНа,0, 1Омкг/мл

Со лейпептину), знижуючи тим самим кінцеву концентрацію гуанідину до 0,5М, після чого центрифугували при 42С «» 20 протягом 20хв. при 16000х49. В разі потреби проби додатково розводили казеїновим буфером із доданням 0,5М гуанідин-гідрохлориду з метою досягнення оптимального діапазону концентрацій для визначень методом ЕЇ ІЗА. шо Готували стандартні проби В-амілоїду (амінокислоти 1-40 або 1-42) таким чином, щоб кінцевий склад був еквівалентний 0,5М гуанідину в присутності 0,195 бичачого сироваткового альбуміну (В5А).

Реагент для визначення загального В-амілоїду методом сендвічевого Е ІЗА, який забезпечує кількісний 25 аналіз як В-амілоїду (амінокислоти 1-40), так і В-амілоїду (амінокислоти 1-42), складається із двох

ГФ) моноклональних антитіл (тАбБ) до В-амілоїду. Антитіло захоплення, 266 |Р.Зеицбегї, Маїиге (1992) 359:325-327| є т специфічним до амінокислот 13-28 В-амілоїду. Антитіло 306 |Джонсон-Вуд та інші - дхоппзоп-УУоса еї аї., Ргос.

Маї. Асад. Зеї. ОБА, 94:1550-1555, 1997), специфічне до амінокислот 1-5 В-амілоїду, біотинілували і використовували в аналізі як репортер-антитіло. При біотинілуванні 306 застосовували методику виробника 60 (фірми Ріегсе, КоскКкірга, І) для мічення імуноглобуліну МНО-біотином за тим винятком, що як буфер використовували 100мММ розчин бікарбонату натрію, рНеВ,5. Антитіло ЗОб не розпізнає ні продукований протеїн-попередник амілоїду (АРР), ні повну послідовність АРР, а детектує лише різновид В-амілоїду з амінотермінальною аспарагіновою кислотою. Аналіз має нижню границю чутливості приблизно 5Опг/мл (11пМ) і не виявляє перехресної реакційної здатності відносно ендогенного муринового В-амілоїдного пептиду в бо концентраціях до нг/мл.

В конфігурації сендвічевого кількісного визначення В-амілоїду (амінокислоти 1-42) методом ЕГІБА як антитіло захоплення використовували тАБ 2112 Юоппзоп-Уооса еї аї., Ргос. Маї. Асад. беї. ОБА, 94:1550-1555, 1997), яке розпізнає амінокислоти 33-42 В-амілоїду. Біотильоване антитіло ЗОб використовували як репортер-антитіло також і в цьому аналізі, який має нижню границю чутливості приблизно 125пг/мл (28пМ).

Антитіла захоплення 266 та 2112 наносили в концентрації 1Омкг/мл на 96б-лункові планшети для імунного аналізу (фірми Созіаг, Сатрбгідде, МА) і інкубували протягом ночі при кімнатній температурі. Потім планшети піддавали аспірації і блокували 0,2596-ним розчином сироваткового альбуміну людини в РВ5З-буфері протягом щонайменше год. при кімнатній температурі, після чого зберігали у висушеному вигляді при 4 9С до 7/0 використання. Перед використанням планшети знову зволожували промивальним буфером (сольовим розчином із Трис-буфером, 0,0595 Тмееп-20). На планшети наносили проби та стандартні зразки й інкубували протягом ночі при 420. Після кожної стадії аналізу планшети тричі промивали промивальним буфером. Біотинільоване антитіло 306, розведене до концентрації О,5мкг/мл інкубаційним казеїновим буфером (0,25905 казеїну, РВ5, 0,0590

Тмжееп-20, рН7,4), інкубували в лунках протягом год. при кімнатній температурі. Додавали в лунки авідин-НКР 75 (фірма Месіог, Випіпддате, СА), розведений 1:4000 інкубаційним казеїновим буфером, і інкубували протягом год. при кімнатній температурі. Додавали колориметричний субстрат Біо ТМВ-ЕГІ5ЗА (фірма Ріегсе, Сатьгідде,

МА) і витримували 15хв. для проходження реакції, після чого припиняли ензиматичну реакцію додаванням 2н.

Нь5БОХ. Продукт реакції кількісно визначали, застосовуючи пристрій ОМулах (фірми Моіесшаг Оемісе5з, Мепіо

Рак, СА) для вимірювання різниці поглинання на довжинах хвиль 45Онм і б5Онм. 2. Дослідження крові

Оброблену ЕДТА плазму розводили 1:1 розріджувачем для проб (0,2г/л фосфату натрію Н 20 (одноосновного), 2,1бг/л фосфату натрію -7НЬО (двоосновного), О,5г/л тимеросалу, 8,5г/л хлориду натрію,

О,бмл Тритон Х-405, б,Ог/л бичачого сироваткового альбуміну, вільного від глобуліну; і вода). Проби та стандартні зразки в розріджувачі для проб аналізували на загальний уміст В-амілоїду (266 як антитіло Ге захоплення/306 як репортер) за методикою, описаною вище, за тим винятком, що замість казеїнових буферів о застосовували розріджувач для проб.

На основі поданого вище опису обізнані фахівці можуть вносити у згадані композиції та способи різноманітні модифікації та зміни. Мається на увазі, що винахід охоплює всі такі модифікації, які не виходять за межі обсягу пунктів формули винаходу. (о)

Claims (6)

« Формула винаходу со

1. Сполука формули І, М (М)-((5)-2-гідрокси-3-метилбутирил)-1-(І -аланініл)-(5)-1-аміно-3-метил-2,3,4,5-тетрагідро-1Н-3-бензазепін-2-он: -

І. те « ОН 000 Е Н ші е я ща г» ше ше М о 7 х Ся 9 сн з ш-

2. Фармацевтична композиція, яка містить сполуку за п.1 та фармацевтично прийнятний розріджувач. їх

3. Спосіб інгібування вивільнення р -амілоїдного пептиду та/або його синтезу, при якому вводять в організм о пацієнта, що потребує такого інгібування, ефективну кількість сполуки за п.1.

4. Спосіб лікування хвороби Альцгеймера, при якому вводять в організм пацієнта, що потребує такого ї- лікування, ефективну кількість сполуки за п.1. Ге)

5. Спосіб профілактики хвороби Альцгеймера, при якому вводять в організм пацієнта, що потребує такої профілактики, ефективну кількість сполуки за п.1.

6. Спосіб інгібування розвитку хвороби Альцгеймера, при якому вводять в організм пацієнта, що потребує дво Такого інгібування, ефективну кількість сполуки за п.1. Ф) іме) 60 б5