KR100819679B1

KR100819679B1 - 베타-아밀로이드 펩티드 방출 또는 합성을 억제하는 락탐화합물

Info

Publication number: KR100819679B1
Application number: KR1020037006721A
Authority: KR
Inventors: 제임스 에드문드 아우디아; 바기즈 존; 리 에이치. 라티머; 스테이시 레이 맥다니엘; 제프리 스코트 니센; 유진 디. 토르세트; 제이 에스. 텅
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니; 엘란 파마슈티칼스, 인크.
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2001-11-05
Publication date: 2008-04-04
Also published as: EP1341531A2; ECSP034600A; BR0115427A; CZ20031351A3; HRP20030383B1; MXPA03004292A; AU4319202A; NO324324B1; ZA200303789B; ES2278804T3; NZ525854A; AR035927A1; TWI305204B; EA200300580A1; SK288065B6; DK1341531T3; NO20032236D0; HUP0301842A2; SK5592003A3; HU228117B1

Abstract

본 발명은 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 화합물, 그의 조성물 및 그를 이용하는 방법을 제공한다.

알쯔하이머, 락탐, N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온

Description

베타-아밀로이드 펩티드 방출 또는 합성을 억제하는 락탐 화합물{LACTAM COMPOUND TO INHIBIT BETA-AMYLOID PEPTIDE RELEASE OR SYNTHESIS}

본 발명은 β-아밀로이드 펩티드 방출 및/또는 그의 합성을 억제하는 화합물에 관련된 제약 및 유기화학 분야에 관한 것이다.

β-아밀로이드 펩티드 방출 및/또는 그의 합성을 억제하며 따라서 알쯔하이머 질환을 치료하는데 유용한 어떠한 락탐은 PCT 출원 PCT/US97/22986호에 기술되어 있다.

본 발명의 화합물인 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온은 β-아밀로이드 펩티드 방출 및/또는 그의 합성을 억제하는데 유용하며 따라서 알쯔하이머 질환을 치료하는데 유용하고 유리한 효능 및 안전한 성질을 갖는다.

발명의 요약

본 발명은 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 화합물을 제공한다.

그 방법 측면에 있어서, 본 발명은 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 유효량을 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, β-아밀로이드 펩티드 방출 및/또는 그의 합성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 특정한 방법의 실시태양에서, 본 발명은 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 유효량을 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 알쯔하이머 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 유효량을 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 알쯔하이머 질환의 진행을 예방하거나 또는 억제하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시태양에서 본 발명은 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-l-(L-알라니닐))-(S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 및 약제학적으로 허용가능한 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 알쯔하이머 질환의 치료를 포함하는, β-아밀로이드 펩티드 방출 및/또는 그의 합성을 억제하는데 유용하다.

본원에서 사용된 용어들의 의미는 다음과 같다:

"ee" 또는 "거울상 이성체 과량"이란 식 ((E₁－E₂) ÷(E₁＋E₂)) ×100 % ＝ ee에 의해 계산된 값으로서, 하나의 거울상 이성체, E₁이 2 가지 거울상 이성체의 혼합물 (E₁＋E₂)에서 과량으로 존재하는 퍼센트를 의미한다. 당업계에서 공지된 바 와 같이, 거울상 이성체 과량은 화합물 또는 그 유도체의 모세관 전기영동 및 키랄 HPLC로 측정될 수 있다.

여기서, 글리세르알데하이드의 이성체에 대해 우선 순위 결정법 (Cahn-Prelog-Ingold)에 의한 (R)-과 (S)-의 명시 및 입체 화학에 있어서 L-과 D-의 명시는 특정한 이성체를 나타낼 때 사용된다.

본 발명의 화합물은 하기된 것과 같이 제조될 수 있다. 하기 반응식에서, 달리 언급되지 않는 한 모든 치환기들은 상기 정의된 바와 같고, 모든 반응 시약은 당업계에 공지이며 인식된 것들이다.

반응식 1, 단계 1에서 화학식 (1)의 N-메틸페네틸아민은 적절한 비스알콕시카르보닐아세테이트 전달제로 아실화되어 화학식 (2)의 화합물을 얻는다. 상기 N-메틸페네틸아민은 시판되고 있으며, 당업계에 공지되고 인식된 조건하에서 2-브로모 또는 2-클로로에틸벤젠을 메틸아민과 반응시켜 용이하게 제조한다. 적절한 비스알콕시카르보닐아세테이트 전달제는 비스알콕시카르보닐아세트산 및 비스알콕시카르보닐아세틸 클로라이드와 같이 R₄가 C₁-C₄ 알킬이면서 비스알콕시카르보닐아세틸기를 화학식 (1)의 화합물로 전달하는 것이다 (Ben-Ishai, Tetrahedron, 43, 439-450 (1987)).

예를 들면, 화학식 (1)의 화합물을 적절한 비스알콕시카르보닐아세트산과 접촉시켜 화학식 (2)의 화합물을 얻는다. 상기 커플링 반응은 펩티드 합성에서 통상적이며, 여기에 이용된 합성 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, N-히드록시숙신이미드, 1-히드록시벤조트리아졸 등과 같은 공지된 첨가제와 함께 또는 첨가제 없이 카르보디이미드와 같은 공지된 커플링제를 사용하여 상기 아실화반응을 촉진시킬 수 있다. 상기 커플링 반응은 반응 동안에 생성되는 산을 제거하기 위하여 종종 적절한 염기를 사용한다. 적절한 염기는, 예를 들면 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린 등을 포함한다. 상기 반응은 디메틸포름아미드, 염화메틸렌, 클로로포름, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 등과 같은 불활성 비양성자성 극성 희석제 중에서 수행되는 것이 통상적이다. 전형적으로는, 상기 반응은 약 0 ℃ 내지 약 60 ℃의 온도에서, 약 1 내지 약 24 시간 동안 수행된다. 반응이 완결되면, 화학식 (2)의 산물은 추출, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연마, 결정화 등을 포함하는 통상적인 방법에 의해 회수된다.

대안적으로, 예를 들면, 화학식 (1)의 화합물을 적절한 비스알콕시카르보닐아세틸 클로라이드와 접촉시켜 화학식 (2)의 화합물을 얻는다. 상기 산 클로라이 드는, 톨루엔, 염화메틸렌 또는 클로로포름과 같은 불활성 용매 중에서 약 0 내지 80 ℃의 온도에서 소량의 디메틸포름아미드와 함께 또는 없이 삼염화인, 옥시염화인, 오염화인, 염화티오닐 또는 염화옥살릴의 작용과 같은 공지된 방법에 의해 상응하는 산으로부터 용이하게 제조된다. 반응은 전형적으로는 1 내지 24 시간 범위의 시간 동안 수행된다. 산 클로라이드는 분리되고 정제될 수 있거나 또는 직접 사용될 수 있으며, 즉 분리 및/또는 정제를 하거나 또는 하지 않고 사용될 수 있다. 아실화 반응은 일반적으로 반응 동안에 생성되는 산을 제거하기 위해 적절한 염기를 사용한다. 적절한 염기는, 예를 들어 피리딘, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린 등을 포함한다. 상기 반응은 통상적으로 염화메틸렌, 클로로포름, 테트라히드로푸란 등과 같은 불활성 비양성자성 극성 희석제 중에서 수행된다. 전형적으로는 상기 반응은 약 -20 ℃ 내지 약 80 ℃의 온도에서 약 1 내지 약 24 시간 동안 수행된다. 반응이 완결되면, 화학식 (2)의 산물은 추출, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연마, 결정화 등을 포함하는 통상적인 방법에 의해 회수된다.

반응식 1, 단계 2에서, 화학식 (2)의 화합물은 고리화되어 화학식 (3)의 화합물을 얻는다.

예를 들어, 화학식 (2)의 화합물은 메탄술폰산 또는 황산과 같은 산에 접촉한다. 반응은 전형적으로 선택된 산을 용매로 이용하여 수행된다. 전형적으로 반응물은 처음에 약 -20 ℃ 내지 약 0 ℃의 온도에서 혼합되고, 그 후 주위 온도 내지 약 60 ℃까지 가온한다. 고리화 반응은 전형적으로 약 12 내지 약 72 시간을 필요로 한다. 반응의 완결시에, 화학식 (2)의 산물은 추출, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연마, 결정화 등을 포함하는 통상적인 방법에 의하여 회수된다.

반응식 1, 단계 3에서는, 화학식 (3)의 화합물은 탈보호화되어 화학식 (4)의 화합물을 얻는다.

그러한 알콕시카르보닐 아민 보호기의 제거는 당업계에 공지되고 인식된 것이다. 예를 들어 문헌 [Protecting Groups in Organic Synthesis, Theodora Greene (l^st 및 2^nd Editions, Wiley-Interscience) 및 Ben-Ishai, Tetrahedron, 43, 439-450 (1987)] 참조.

반응식 2의 단계 1에서는, 화학식 (5)의 적절한 페닐 아세트산 유도체는 화학식 (6)의 적절한 아세탈과 커플링되어 화학식 (7)의 화합물이 얻어진다. 화학식 (5)의 적절한 페닐 아세트산은 A₂가 활성화기, 예를 들어 -OH, -Cl 또는 -Br인 것이다. 적절한 화학식 (6)의 아세탈은 R₅가 C₁-C₄ 알킬인 것이다. 그러한 결합 반응은 펩티드 합성에서 통상적이고, 여기에 이용된 합성 방법은 반응식 1의 단계 1에서 기술된 바와 같이 이용될 수 있다.

또한 반응식 2, 단계 2에서 나타낸 커플링은 적절한 화학식 (5)의 화합물의 산 할라이드 및 적절한 화학식 (6)의 아세탈을 혼합용매, 예를 들어 메틸 t-부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 테트라히드로푸란, 아세톤 또는 디에틸에테르 및 물에서 이용하는 쇼튼-바우만(Schotten-Baumann) 조건하에서 수행될 수 있다. 상기 반응은 적절한 염기, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산수소나트륨, 또는 탄산수소칼륨를 이용하여 수행된다. 전형적으로, 반응은 격렬하게 교반되거나 또는 휘저어지고, 약 -20 ℃ 내지 약 80 ℃의 온도에서 수행되어지고, 전형적으로 약 1 내지 약 24 시간이 필요하다. 반응 종결시에는, 화학식 (7)의 산물은 추출, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연마, 결정화 등과 같은 통상적 방법에 의해 회수된다.

반응식 2, 단계 2에서는, 화학식 (7)의 화합물은 고리화되어 화학식 (8)의 화합물을 얻는다. 상기 고리화 반응은 예를 들어 황산과 같은 산 내에서 수행된다. 전형적으로, 산이 용매로서 이용된다. 일반적으로, 반응은 약 -20 ℃ 내지 약 150 ℃의 온도에서 수행되고, 약 1 시간 내지 약 24 시간이 필요하다. 반응 종결시에서는, 화학식 (8)의 산물은 추출, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연마, 결정화 등을 포함하는 통상적인 방법에 의해 회수된다.

반응식 2, 단계 3에서는, 화학식 (8)의 화합물은 아민 전달 반응을 거쳐서 화학식 (9)의 화합물을 얻는다. 반응식 2에서는 옥심화가 묘사되어 있다. 상기 옥심화는 화학식 (8)의 화합물의 에놀레이트를 알킬니트라이트 에스테르와 같은 옥심 전달 시약과 접촉하여 이루어진다. 화학식 (8)의 에놀레이트 화합물은 화학식 (8)의 화합물을 포타슘 t-부톡시드, 리튬 디이소프로필아미드, 리튬 헥사메틸디실라지드, 소듐 헥사메틸디실라지드, 포타슘 헥사메틸디실라지드 등과 같은 적절한 염기와 함께 반응시켜 제조될 수 있다. 상기 옥심화는 이소아밀 니트라이트와 케톤의 반응으로 목적하는 옥심의 제조를 기술하고 있는 문헌 [Wheeler, et al., Organic Syntheses, Coll. Vol. VI, p. 840]에 예시되어 있다. 반응은 전형적으로 테트라히드로푸란과 같은 용매내에서 수행된다. 일반적으로, 약 -20 ℃ 내지 약 50 ℃의 온도에서 반응이 수행되고, 약 1 시간 내지 약 24 시간이 필요하다. 반응 종결시에는, 화학식 (8)의 산물은 추출, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연마, 결정화 등을 포함하는 통상적 방법에 의해 회수된다.

대안적으로, 상기 아민 전달 반응은 아지드를 통하여 이루어질 수 있다. 아지드는 화학식 (8)의 화합물의 에놀레이트를 톨루엔술포닐아지드 및 트리이소프로필벤젠술포닐아지드와 같은 아지드 전달제와 반응시켜 형성시킬 수 있다. 그러한 반응은 문헌 [Evans, et al., J. Am. Chem. Soc., 112: 4011-4030 (1990) 41.]에 예시되어 있다. 반응은 통상적으로 테트라히드로푸란과 같은 용매내에서 수행된다. 일반적으로, 반응은 약 -20 ℃ 내지 약 50 ℃의 온도에서 수행되고 전형적으로 약 1 시간 내지 약 24 시간이 필요하다. 반응 종결시에는 옥심 대신 아지드를 갖는 화학식 (8)의 산물은 추출, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연마, 결정화 등을 포함하는 통상적인 방법에 의해 회수된다.

반응식 2, 단계 4에서 묘사되어 있듯이, 옥심은 환원되어 화학식 (4)의 화합물이 된다. 상기 환원 반응은 수소 및 적절한 촉매, 예를 들어 라니-니켈 또는 탄소 상의 팔라듐과 같은 팔라듐 촉매로 처리하여 달성된다. 반응은 전형적으로 테 트라히드로푸란, 에틸 아세테이트 또는 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올과 같은 저급 알콜, 아세트산, 물, 암모니아 수용액 등 및 그들의 혼합물과 같은 용매 내에서 수행된다. 반응은 일반적으로 대기압 내지 약 600 psi (4137 kPa) 범위의 수소압에서 수행된다. 일반적으로, 반응은 약 20 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도에서 수행되고 전형적으로 약 1 내지 약 24 시간이 필요하다. 반응 종결시에는, 화학식 (4)의 산물은 추출, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연마, 결정화 등을 포함하는 통상적인 방법에 의해 회수된다.

대안적으로, 아민이 아지드를 경유하여 전달되는 경우에는 아지도기를 환원시킨다. 상기 환원은 상기된 수소화에 의하여 수행된다.

N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온을 제조하는 방법이 하기 반응식 A에서 기술되어 있다.

반응식 A, 단계 1에서는, 화학식 (4)의 적절한 락탐의 입체화학적 분리로 화학식 (10)의 락탐, 즉 실질적으로 순수한 (S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온을 얻는 것을 묘사하고 있다. 본원에서 이용되는 용어로서 "실질적으로 순수한"은 (S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 거울상 이성체 순도를 나타낸다. 본 발명에 따라서, 80 ％ 초과, 바람직하게는 90 ％ 초과, 더 바람직하게는 95 ％ 초과, 가장 바람직하게는 97 ％ 초과의 (S)-거울상 이성체를 포함하는 실질적으로 순수한 (S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온이 제조될 수 있다.

예를 들어, 화학식 (4)의 화합물의 (S)-이성체는 디벤조일타르트레이트, (R)-(-)-d-캄포르술폰산, 및 (D)-(-)-만델산 염의 분별 결정에 의해 분리될 수 있다. 다양한 범위의 디벤조일타르트레이트가 이 목적에 적합하다고 예상된다. 특히, 수소, 할로겐, C₁-C₄ 알킬 및 C₁-C₄ 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된 파라 치환기를 가진 디벤조일 에스테르가 바람직하고, 디-p-톨루오일-타르트레이트가 더욱 바람직하다. 디-p-톨루오일-L-타르트레이트가 (S)-이성체를 얻는데 이용된다.

본 방법에 따라서, 화학식 (4)의 화합물은 선택된 산과 접촉된다. 일반적으로, 약 0.4 몰 당량 내지 과량의 선택된 산, 바람직하게는 약 0.4 내지 1.5 몰 당량, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1.1 몰 당량으로 이용될 수 있다.

본 방법은 전형적으로 용액으로부터 산첨가 염의 결정화에 의해 수행된다. 특히, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, 부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올, t-부탄올, 아밀 알콜, 이소-아밀 알콜, t-아밀 알콜, 헥산올, 시클로펜탄올 및 시클로헥산올을 포함하는 저급 알콜과 같은 용매가 적합하고, 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올이 바람직하다. 역용매의 이용도 유리할 수 있다. 본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "역용매"는 염이 그 용매와 비교하여 현저하게 덜 가용성인 용매를 나타낸다. 바람직하게는, 역용매가 이용될 때 그것은 선택된 용매와는 혼화성이다. 적절한 역용매는 디에틸에테르, 메틸 t-부틸에테르 등과 같은 에테르 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 이소-프로필아세테이트, 프로필아세테이트, 이소-부틸아세테이트, sec-부틸아세테이트, 부틸아세테이트, 아밀아세테이트, 이소-아밀아세테이트 등과 같은 저급 알킬 아세테이트 및 펜탄, 헥산, 헵탄, 시클로헥산 등과 같은 알칸을 포함한다. 본 방법이 라세미 혼합물로부터 산첨가염을 결정화함으로써 수행될 때, 원하지 않는 부분입체 이성체 염의 결정화를 피하기 위해 역용매를 이용하는데 있어 주의를 기울여야 한다.

전형적으로, 결정화는 약 40 ℃ 내지 선택된 용매의 환류 온도인 초기 온도에서, 약 0.05 몰 내지 0.25 몰의 초기 농도에서 수행된다. 이 후 혼합물을 냉각하여 염을 얻는다. 접종이 유리할 수 있다. 약 4 시간 내지 48 시간의 초기 침전물의 교반이 유리할 수 있다. 바람직하게는, 결정화 용액을 천천히 냉각시킨다. 결정화는 주위 온도 내지 약 -20℃까지 냉각되는 것이 가장 편리하다. 염은 여과, 디칸팅, 원심분리, 증발 및 건조 등과 같은 당업계 공지의 기술을 이용하여 수집될 수 있다. 화학식 (10)의 화합물은 선택된 산의 산첨가염으로서 직접 이용될 수 있다. 대안적으로, 이용 전에 화학식 (10)의 화합물이 산 교환 후에 다른 산첨가염으로 분리될 수 있거나 또는 당업계에서 공지되고 있듯이, 염기성 조건하에서 추출에 의해 염기로서 분리될 수 있다.

바람직한 방법은 방향족 알데하이드의 존재하에 동적 방법으로서 디-p-톨릴-L-타르타르산, (R)-(-)-d-캄포르술폰산 및 (D)-(-)-만델산으로 이루어진 군으로부터 선택된 산의 그의 산 첨가염으로서 1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온을 결정화하여 실질적인 거울상 이성체 순도를 갖는 (S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온을 제공한다. 동적 방법은 1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온이 결정화 동안에 단일 이성체로 전환하여, 따라서 수율을 향상시키고 원하지 않는 이성체를 포함하는 폐기물 스트림을 피하는 잇점을 갖고 있다.

다양한 범위의 방향족 알데하이드가 동적 방법에 적합한 것으로 기대되어 본 발명자는 일련의 알데하이드가 특히 실제에서 적합하다는 것을 밝혔다. 특히, 본 발명자는 살리실산이 바람직하고 살리실알데하이드, 5-니트로살리실알데하이드 및 3,5-디클로로살리실알데하이드가 본 발명의 동적 분리 방법에서 보다 바람직하다는 것을 밝혔다.

따라서, 본 발명의 방법이 동적 분리로서 실행될 때, 1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온은 방향족 알데하이드의 존재하에 선택된 산과 접촉된다. 일반적으로, 동적 분리를 위하여 약 0.9 내지 1.2 몰 당량의 산이 이용되는데, 1 몰 당량이 바람직하다. 방향족 알데하이드는 일반적으로 촉매의 양으로 이용된다. 전형적으로 약 0.5 내지 0.001 몰 당량의 방향족 알데하이드가 이용되는데, 약 0.1 내지 약 0.01 몰 당량이 바람직하다.

동적 방법은 전형적으로 상기된 것과 같이 역용매 없는 용매에서 수행된다. 1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온, 선택된 산 및 방향족 알데하이드의 혼합물이 교반되어 원하는 이성체로 전환된다. 일반적으로 이런 전환은 주위 온도 내지 용매의 환류 온도의 온도에서 수행된다. 일반적으로 전환은 6 내지 48 시간이 필요하다.

당업자에게 숙지될 것과 같이, 본 방법이 동적 분리로 실행될 때, (S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 산첨가염의 용도는 분리된 산물에 방향족 알데하이드가 소량 존재하는 것 때문에 복잡해질 수 있다. 따라서, 동적 분리 후에 (S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀 -2-온을 그의 이용 또는 염기의 형성 전에 염 교환에 의해 분리하고, 바람직하게는 염산염으로서 분리하는 것이 바람직하다.

반응식 A, 단계 2는 화학식 PgNH-CHCH₃-C(0)-A의 적절한 아미노 보호된 알라닌 및 화학식 (10)의 적절한 락탐의 커플링 반응을 묘사한다. 적절한 아미노 보호된 알라닌은 Pg가 아민 보호기이고 L-배위이고, A가 활성화기, 예를 들면 화학식 (10)의 화합물의 아미노기와 커플링이 가능한 -OH 또는 -Cl인 것이다. 상기 아미노 보호된 알라닌은 당업자에게 용이하게 입수될 수 있다.

반응식 A, 단계 2에 묘사된 커플링 반응은 펩티드 합성에 대해 통상적으로 수행되는 반응을 포함하며 그에 이용된 합성 방법이 또한 이용될 수도 있다. 이러한 방법은 반응식 1, 단계 1에 기술되어 있다.

반응식 A, 단계 3은 화학식 (12)의 화합물을 얻기 위한 화학식 (11)의 화합물의 탈보호를 묘사한다. 아미노 보호기의 상기 탈보호화는 당업계에 공지이고 이해되고 있다.

반응식 A, 단계 4는 화학식 I의 화합물을 얻기 위하여 화학식 (13), (CH₃)₂CH-CHOH-C(O)A₁의 적절한 화합물 및 화학식 (12)의 화합물의 커플링 반응을 묘사한다. 화학식 (13)의 S-이성체는 시판되고 있으며 1997년 12월 22일에 출원된 PCT 출원 PCT/US97/22986호를 포함하여 당업계에 공지이다. 단계 3에 묘사된 커플 링 반응은 반응식 1, 단계 1에 교시된 것과 비슷한 방법으로 화학식 (13)의 산 (A₁이 -OH인 화합물) 또는 그로부터 유래된 산 할라이드 (A₁이 -Cl 또는 -Br인 화합물)를 이용하여 수행된다.

화학식 I의 화합물을 제조하는 대체 방법은 반응식 A, 단계 5에 묘사되어 있는데, 직접적으로 화학식 I의 화합물을 얻기 위하여 화학식 (10)의 적절한 화합물 및 화학식 (14), (CH₃)₂CH-CHOH-C(O)-NH-CHCH₃-C(O)A₂의 적절한 화합물의 커플링 반응을 보여준다. 화학식 (10)의 적절한 화합물은 단계 2에 기술되어 있다. 화학식 (14)의 적절한 화합물은 입체화학이 화학식 I의 최종 산물에서 목적하는 것이다.

화학식 (14)의 화합물은 카르복시 보호된 아미노산, H₂N-CHCH₃-C(0)OPg₁을 상기한 화학식 (13)의 화합물과 커플링하여 용이하게 제조된다. 다시 상기 커플링 반응이 당업계에 공지이고 탈보호 후에 화학식 (14)의 화합물을 제공하는 생성물을 얻게 한다.

화학식 I의 화합물은 결정화를 포함하는 여러 기술에 의해 분리되고 정제될 수 있다. 용액으로부터의 결정화 및 슬러리화 기술이 이용될 수 있다. 특히 본 발명의 화합물은 다양한 무수 및 수성 용매로부터의 결정화에 의해 제조될 수 있다. 적절한 용매는 아세톤, 저급 알콜 (예를 들면, 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올), 아세트산 및 물 및 에틸 아세테이트가 있거나 없는 아세토니트릴, 디에틸 에테르 및 메틸 t-부틸 에테르이다. 실상에서, 수성 아세톤이 바람직한 것으로 나타났다. 주어진 수성 용매에 대하여 사용될 수분량은, 물과 비교하여 해당 용매 중의 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 상대적 용해도 및 결정화 또는 슬러리화 기술의 사용 여부에 달려 있다.

결정화는 통상적으로, 수성 용매에 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온을 용해시킨 다음, 용액을 냉각시키고 물을 더 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 고체를 얻는 방식으로 이루어진다. 전형적으로, 결정화는 약 40℃의 초기 온도에서 선택된 수성 용매의 환류 온도까지 수행된다. 그 후, 결정성 이수화물이 생성되도록 혼합물을 냉각시킨다. 접종이 유리할 수 있다. 바람직하게는, 결정화 용액은 서서히 냉각된다. 결정화 용액은 가장 편리하게는 주위 온도 내지 약 -20 ℃의 온도로 냉각된다.

본 발명은 추가로 하기 실시예 및 제조에 의하여 예증된다. 이러한 실시예 및 제조는 오직 예증을 위한 것이고 어떠한 방법으로도 본 발명을 제한하려 의도하지 않는다.

실시예 및 제조에 이용된 용어는 달리 명시되어 있지 않으면 그의 정상적인 의미를 갖는다. 예를 들면, "℃"는 섭씨를 나타내고, "mmol"은 밀리몰(들)을 나타내고; "g"는 그램(들)을 나타내고; "mL"은 밀리리터(들)를 나타내고; "염수"는 포화 염화나트륨 수용액을 나타내고; "THF"는 테트라히드로푸란을 나타내고; "HPLC"는 고압 액체 크로마토그래피를 나타낸다.

실시예 1:

l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 합성

건조 DMF 15 mL 중의 수소화 나트륨 (1.1 당량)의 슬러리에 2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (0.0042 몰)을 DMF 10 mL 중의 용액으로서 첨가하였다. 그 후 메틸 요오다이드 (약 2 당량)을 첨가하였다. TLC로 반응 완결을 확인하고, 반응 혼합물을 얼음 위로 붓고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고 염수로 세척하였다. 그 후 유기층을 Na₂S0₄ 상에서 건조하고, 여과하고 감압하에서 농축하였다. 잔여물을 HPLC (LC 2000)로 정제하고, 에틸 아세테이트/헥산 시스템으로 용출하여 3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온을 얻었다.

3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (1 당량)을 THF에 용해하고 이소아밀니트라이트 (1.2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 얼음 배쓰에서 0 ℃로 냉각하였다. NaHMDS (1.1 당량, THF 중의 1M)을 적가하였다. 1 시간 동안 교반 시킨 후에 또는 반응이 완결될 때까지, 혼합물을 농축하고 1 N 염산 수용액으로 산성화시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층 부분을 건조하고 농축하여 조생성물을 수득하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 1-히드록시이미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온을 얻었다: 질량 분광법 (M+H)⁺, 205.1.

1-히드록시이미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온을 EtOH/NH₃ (20:1)에 용해하고 10 시간 동안 100 ℃에서 라니 니켈 및 수소 (500 psi/3447kPa)을 이용하여 가스통에서 수소화하였다. 결과 혼합물을 여과하고 농축하여 오일을 얻고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.

실시예 2:

1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 합성

20 L 모르톤 플라스크에 MTBE (5.52 L, 7 부피) 및 (N-메틸아미노)-아세트알데하이드 디메틸 아세탈 (614 g, 5 mol)을 첨가하여 실온에서 용액을 형성하였다. 탄산수소나트륨 (546g, 6.5 mol) 및 물 (6.31 L, 8 부피)을 첨가하여 제조한 탄산수소나트륨 용액을 모르톤 반응 플라스크에 첨가하였다. 혼합물을 10 ℃ 미만으로 냉각하고 페닐아세틸 클로라이드 (789 g, 5 mol)의 MTBE (789 mL) 용액을 1 시간 기간에 걸쳐서 냉각된 반응 혼합물에 적가하였다. 첨가 후에, 반응 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 단계에서 HPLC 분석은 반응이 완결된 것을 보여주였다. MTBE (4 부피)의 추출 워크업 및 무수 황산 마그네슘 건조와 이후 회전식 증발에 의한 농축으로 액체로서의 N-메틸-N-(2,2-디메톡시에틸)페닐아세트아미드 1.187 kg (98%)을 제공하였다. (M+H)⁺ = 237.9. 강한 질소 분위기하에서 5 L 모르톤 플라스크에 H₂SO₄ (1.42 L)를 첨가하고, N-메틸-N-(2,2-디메톡시에틸)페닐아세트아미드 (712 g, 3 mol)를 반응 플라스크에 적가하여 발열 반응을 일으켰다 (22 ℃에서 78 ℃로). 그 후 결과 반응물을 3 시간 동안 110 ℃로 가열하고 그 후 실온으로 냉각한 후 20 L 모르톤 플라스크로 옮겼다. 10 ℃ 미만에서, 반응 혼합물을 수산화나트륨 수용액 (9.18 L, 5 N)으로 급냉시켰다. 에틸 아세테이트 (2 X 2.85 L)으로 추출 워크업하고, 황산나트륨으로 건조한 후 고체로 농축하여 고체로서 3-메틸-2,3-디히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 520 g (73.5 %)을 제공하였다. 이 물질을 순도 증가를 위하여 MTBE로부터 재결정화하여 고체를 얻었다. mp = 81-82 ℃; (M+H)⁺ = 174. 2.

3-메틸-2,3-디히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (113.8 g, 0.657 mol)의 THF (0.5 L) 용액을 0 ℃로 냉각하고 이소아밀 니트라이트 (100.75 g, 0.86 mol)를 적가하였다. 결과 혼합물에 LiHMDS (1 N THF 용액, 854 mL, 0.854 mol)를 온도가 10 ℃ 미만으로 유지되는 속도로 첨가하였다. 첨가 후에, 반응 경과를 HPLC로 모니터하면서 반응물을 2-3 시간 동안 실온에서 교반되도록 하였다. 반응 완결시에, 혼합물을 0 ℃로 냉각하고 HCl (2 N) 수용액을 이용하여 pH를 12에서 2-3으로 조정하였다. 결과 침전물을 12-16 시간 동안 교반한 후 여과 분리하고 건조하여 1-히드록시이미노-3-메틸-2,3-디히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 86.3g (64.9 %)을 얻었다. mp = 225-226 ℃; (M+H)⁺ = 203.0.

l-히드록시이미노-3-메틸-2,3-디히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (35 g, 0.173 mol)의 에탄올 용액 (525 mL)을 희석 HCl (진한 수용액, 물 17 mL 중의 17.5 g) 슬러리로서 탄소상의 팔라듐 (10%, 3.5 g)과 함께 오토클레이브에 첨가하였다. 반응이 완결될 때까지 결과 혼합물을 50 ℃ 및 250 psi (1723 kPa)에서 수소화하였다. 반응 혼합물을 용매로서 에탄올을 이용하여 셀라이트 패드 상에서 여과하고 여과액을 90 mL로 농축하였다. 물 (350 mL)을 농축물에 첨가하고 결과 용액을 약 200 mL로 추가 농축하였다. 디클로로메탄 (350 mL)을 수산화나트륨 수용액 (1 N)으로 pH를 11-11.5로 조정하기 전에 수용액에 첨가하였다. 유기층 부분을 분리하고 수성층 부분을 디클로로메탄 (175 mL)으로 추출하였다. 합한 추출물을 잔여물로 농축하여 그 상태에서 결정화하여 표제 화합물을 얻었다. mp = 69-81 ℃; (M+H)⁺ = 191.0.

실시예 3:

22 L 모르톤 플라스크에 디클로로메탄 (4.73 L, 8 부피), N-메틸페네틸아민 (591 g, 4.33 mol) 및 탄산수소나트륨 수용액 (436.7 g, 물 4.73 L 중의 5.2 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 5 ℃ 미만으로 냉각하고 클로로아세틸 클로라이드 (513.7 g, 4.55 mol)의 디클로로메탄 (887 mL) 용액을 70 분 기간에 걸쳐서 냉각된 반응 혼합물에 적가하였다. 첨가 후에 HPLC 분석은 반응이 완결된 것을 보여주었다. 층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합해진 유기층을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조하고 회전식 증발기에서 농축하여 N-메틸-N-(2-페닐에틸)-1-클로로아세트아미드 915.7 g (99.8%)를 얻었다. (M+H) = 212. 1.

질소 분위기하에서 12 L 플라스크에 N-메틸-N-(2-페닐에틸)-l-클로로아세트아미드 (883.3 g, 4.17 mol) 및 오르토-디클로로벤젠 (6.18 L)을 첨가하였다. 염화 알루미늄 (1319 g, 10.13 mol)을 첨가하여 발열 반응을 일으켰다 (22 ℃에서 50 ℃로). 그 후 결과 반응물을 2.5 시간 동안 165 ℃로 가열하고 그 후 약 14 시간 동안 실온으로 냉각하였다. 반응 혼합물을 약 0 ℃로 냉각하고 발열을 약 40 ℃로 유지하기 위하여 4 부분으로 나누어 냉수 (8.86 L, 약 5 ℃)에 첨가하였다. 층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄 (7.07 L)으로 추출하고 층을 분리하였다. 유기층을 합하고 염산 수용액(8.83 L, 1 N)으로 추출하고 그 후 포화 탄산수소나트륨 수용액 (7.07 L)으로 추출하고, 황산 마그네슘 상에서 건조하고, 실리카겔 (883 g)과 합하여 실리카겔 칼럼 (소결된 유리 깔대기에서의 3.53 kg, 디클로로메탄 중의 슬러리로 패킹된 것)에 적용하였다. 칼럼을 25 L가 수집될 때까지 디클로로메탄으로 용출하고 그 후 에틸 아세테이트로 용출하여 산물을 얻었다. 분획을 함유하는 산물을 황갈색 고체로서의 3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온으로 증발시켰다. 608 g (83 %).

질소하 22 L 플라스크에 THF (7.88 L) 중의 3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (606 g, 3.46 mol) 및 이소아밀 니트라이트 (543 g, 4.5 mol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 약 0 ℃로 냉각하고 LiHMDS (1 N THF 용액, 4.5 L, 0.45 mol)을 온도가 약 7 ℃ 미만으로 유지될 수 있는 속도로 첨가하였다. 첨가 후에, 반응 경과를 HPLC로 모니터하면서 반응물을 약 2 시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 종결시에, 혼합물을 약 0 ℃로 냉각하고, pH를 HCl (2 N) 수용액을 이용하여 12에서 약 2-1로 조정하였다. 결과 침전물을 약 6 시간 동안 교반한 후 여과 분리하고 건조하여 1-히드록시이미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 604.7 g (85.6 %)을 얻었다.

1-히드록시이미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (625 g, 3.06 mol) 및 3A 에탄올 (15.6 L)의 결과 혼합물을 50 ℃ 및 250 psi (1723 kPa)에서 반응이 완결될 때까지 (약 4 시간) 격렬하게 교반시키며 수소화하였다. 이 반응 혼합물을 용매로서 에탄올을 이용하여 셀라이트 패드 상에서 여과하고 농축된 여과액은 고체를 제공하였다. 고체를 디클로로메탄 (6 L)으로 처리하고 수성층의 pH가 11-11.5가 될 때까지 1 N 수산화나트륨 수용액을 첨가하였다. 혼합물을 교반하고, 층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄 (2 L)으로 추출하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 회전식 증발기로 증발시켜서 표제 화합물 477 g (81.9 %)을 얻었다.

실시예 4:

(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 합성

l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (1.544 g, 8.12 mmol)을 메탄올 15 mL에서 천천히 가열하여 용액을 형성하였다. 다른 플라스크에서, 디-p-톨루오일-1-타르타르산 (3.12 g, 8.08 mmol)을 15 mL 메탄올에 용해하고 따뜻한 아민 용액에 피펫으로 첨가하였다. 혼합물을 고체 침전이 되도록 가열하였다. 추가의 메탄올 30 mL을 첨가하여 용액을 얻고, 이 용액을 30-40 분 동안 환류하고 그 후 천천히 주위 온도로 냉각하여 고체를 얻었다. 약 18 시간 동안 교반한 후, 이 고체를 여과로 수집하고 소량의 차가운 메탄올로 헹구어 (S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 디-p-톨루오일-L-타르타르산염 (96 % 수율, 94.7 % ee) 2.24 g을 얻었다.

(S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 디-p-톨루오일-L-타르타르산염 (11.83 g, 20.5 mmol)을 1.0 N 수산화나트륨 수용액 45 mL에 용해하고 염화 메틸렌 (3X 25mL)으로 추출하였다. 결합된 염화 메틸렌층을 35 mL 1.0 N 수산화나트륨 수용액으로 세척하고 그 후 염수로 세척하고 무수 MgS0₄ 상에서 건조하였다. 진공하에서 용매를 제거하여 무색 오일 (87 % 수율, 93.2 % ee)로서 표제 화합물 (3.38 g)을 얻었다.

실시예 5:

l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (6.0 g, 31.5 mmol)을 메탄올 75 mL에서 가열하여 용액을 형성하고 따뜻한 메탄올 75 mL 중의 디-p-톨루오일-L-타르타르산 (12.2 g, 31.5 mmol) 용액과 합하였다. 추가의 메탄올 100 mL을 첨가하고 혼합물을 교반하였다. 약 18 시간 동안 교반한 후에, 고체를 여과하여 수집하고 소량의 차가운 메탄올로 헹구어서 고체 6.7 g을 얻었다. 고체를 메탄올 (200 mL)과 합하고 교반하였다. 18 시간 후에, 고체를 수집하여 (S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 디-p-톨루오일-L-타르타르산염 (4.4 g)을 얻었다. 실시예 4에 기술된 방법에 의하여 염기를 분리하여 표제 화합물 (96 % ee)을 얻었다.

실시예 6:

(S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 합성

질소 하 22 L 용기에, l-아미노-3-메틸- 2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (438 g, 2.3 mol)을 가열하여 (약 40 ℃) 메탄올 (4.38 mL) 중의 용액을 얻었다. 다른 플라스크에 디-p-톨루오일-1-타르타르산 (889.7 g, 2.3 mol)을 메탄올 4.38 L에 용해하고 40 ℃로 가열한 후 l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 용액을 첨가하였다. 가열을 계속하고 추가의 메탄올 6.13 L을 첨가한 후 혼합물을 약 45 분 동안 환류하고 그 후 천천히 주위 온도로 냉각하여 고체를 얻었다. 약 18 시간 동안 교반한 후, 고체를 여과로 수집하고 소량의 모액으로 헹구고, 공기 건조 후에 에틸 아세테이트 2 L로 헹구어 (S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 디-p-톨루오일-L-타르타르산염 561.6 g을 얻었다. (S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 디-p-톨루오일-L-타르타르산염, 디클로로메탄 (6.57 L) 및 1 N 수산화나트륨 수용액 (6.57 L)을 합하고 교반하였다. 층을 분리하고 유기층을 1 N 수산화나트륨 수용액 (3.28 L)으로 두 번 추출하고, 염수 (2.46 L)로 한 번 추출한 후 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 회전식 증발기로 증발시킨 후 표제 화합물 250 g (57.4 %, 94.1 % ee)을 얻었다.

실시예 7:

(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 염산염의 합성

1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (31.9g, 168 mmol)을 이소프로필 아세테이트 약 300 mL에서 슬러리화하고 45 ℃로 가열하였다. 별개의 플라스크에 (R)-(-)-D-만델산 (25.0g, 164 mmol)을 용액이 형성될 때까지 이소프로필알콜 약 130 mL에서 가열하고, 상기 얻은 1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온/이소프로필 아세테이트 슬러리에 첨가하여 침전물이 신속하게 형성되는 용액을 얻었다. 혼합물을 약 3 시간 동안 45 ℃에서 교반하였다. 5-니트로살리실알데하이드 (2-히드록시-5-니트로벤즈알데하이드) (1.40 g, 8.38 mmol, 5 mol %)을 따뜻한 용액에 첨가하고 이 혼합물을 45 ℃에서 교반하였다. 약 14 시간 후에, 슬러리를 주위 온도로 냉각하고 2 시간 동안 교반한 후 고체를 여과로 수집하고 차가운 이소프로필 아세테이트 70 mL로 헹구고 40 ℃ 진공 오븐에서 건조하여 (S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (R)-만델산염 (82.9 % 수율, 98.4 % ee) 46.62 g을 얻었다.

(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (R)-만델산염 (2.42g, 7.06 mmol, 98.4% ee)을 주위 온도에서 에틸 아세테이트 25 mL에서 슬러리화하였다. 진한 염산 수용액 (1.1 mL, 약 11.2 mmol)을 첨가하고 이 혼합물을 3.5 시간 동안 격렬하게 교반시키며 함께 50 ℃로 가열하였다. 이 슬러리를 주위 온도로 냉각하고, 여과하고 메틸 t-부틸에테르 (약 10 mL)로 헹구어 표제 화합물 (92.5 % 수율, 97.9 % ee) 1.48 g을 얻었다.

실시예 8:

N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 합성

둥근 바닥 플라스크를 질소 분위기 하에서 THF 중의 N-t-Boc-L-알라닌 (1.0 당량), 히드록시벤조트리아졸 수화물 (약 1.1 당량) 및 (S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (1.0 당량)으로 채웠다. 후니그 염기 (Hunig's base) (N,N-디이소프로필에틸아민, 1.1 당량)을 잘 교반된 혼합물에 첨가한 후 EDC (1.1 당량)을 첨가하였다. 주위 온도에서 4 내지 17 시간 동안 교반한 후 용매를 감압에서 제거하고, 잔여물을 에틸 아세테이트 및 물에 흡수시키고, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 1 N HCl 수용액, 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 용매를 감압에서 제거하여 1-(N-t-Boc-L-알라니닐)-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온을 얻었다. 질량 분광법 (M+H)⁺, 362.3.

무수 HCl 기체의 스트림을 1,4-디옥산 (0.03-0.09 M) 중의 1-(N-t-Boc-L-알라니닐)-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 교반된 용액을 통해서 통과시키고, 10-15 분 동안 NZ하에서 얼음 배쓰에서 약 10 ℃로 냉각하였다. 용액에 마개를 한 후, 냉각 배쓰를 제거하고 용액을 출발 물질의 소비를 TLC로 모니터하면서 2-8 시간 동안 교반시키며 주위 온도로 가온하였다. 이 용액을 농축하여 추가의 정제없이 이용되는 1-(L-알라니닐)-(S)-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온을 얻었다.

둥근 바닥 플라스크를 질소 분위기 하에서 THF 중의 1-(L-알라니닐)-(S)-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-3-메틸-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (1.0 당량), 히드록시벤조트리아졸 수화물 (1.1 당량) 및 (S)-2-히드록시-3-메틸-부티르산 (1.0 당량)으로 채웠다. 후니그 염기 (N,N-디이소프로필에틸아민, 1.1 당량)를 잘 교반된 혼합물에 첨가한 후 EDC (1.1 당량)를 첨가하였다. 주위 온도에서 4 내지 17 시간 동안 교반한 후 용매를 감압에서 제거하고, 잔여물을 에틸 아세테이트 (또는 유사한 용매) 및 물에 흡수시키고, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 1 N HCl, 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 용매를 감압에서 제거하여 표제 화합물을 얻었다.

실시예 9:

둥근 바닥 플라스크를 질소 분위기 하에서 THF (3.76 L) 중의 N-t-Boc-L-알라닌 (249.5 g, 1.32 mol), 히드록시벤조트리아졸 수화물 (232.2 g, 1.52 mol) 및 (S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (250.8 g, 1.32 mol)으로 채웠다. 혼합물을 5 ℃ 미만으로 냉각한 후 후니그 염기 (N,N-디이소프로필에틸아민, 188.4 g, 1.45 mol)를 첨가하고 EDC (283.7 g, 1.45 mol)을 첨가하였다. 6 시간 동안 교반한 후 반응 혼합물을 주위 온도로 가온하고 약 14 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압에서 제거하고, 잔여물을 에틸 아세테이트 (3.76 L) 및 물 (1.76 L)에 흡수시킨 후, 층을 분리하고, 유기층을 물 (1.76 L)로 추출하고, 수성층을 합하고 에틸 아세테이트 (1.76 L)로 추출하였다. 유기층을 합하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액 (1.76 L)으로 추출하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 회전식 증발기로 증발시켜서 1-(N-t-Boc-L-알라니닐)-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 463 g (97.2 %) 얻었다.

HCl의 에틸 아세트테이트 용액을 지하 분산관을 이용하여 무수 HC1 가스를 약 0 ℃로 냉각된 에틸 아세테이트 (1.76 L)를 통과시켜 제조하였다. 상기 제조된 HCl의 에틸 아세테이트 용액을 격렬하게 교반되는 에틸 아세테이트 (3.7 L) 중의 1-(N-t-Boc-L-알라니닐)-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (462 g, 1.28 mol)의 슬러리에 첨가하였다. 에틸 아세테이트 (1 L)의 추가량을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 가온하고 22 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여 고체를 얻었다. 이 고체를 아세토니트릴 (5 L)로 슬러리화하고, 가열하여 환류시킨 후 약 60 ℃로 냉각한 후 여과하고 건조하여 1-(L-알라니닐)-(S)-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 389.8 g (94.7 %)을 얻었다.

THF (4.8 L) 중의 l-(L-알라니닐)-(S)-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-3-메틸-1H-3-벤즈아제핀-2-온 (369.5 g, 1.18 mol), 히드록시벤조트리아졸 수화물 (207.6 g, 1.36 mol), 후니그 염기 (N,N-디이소프로필에틸아민, 352.2 g, 2.71 mol) 및 (S)-2-히드록시-3-메틸-부티르산 (140.6 g, 1.18 mol)을 질소 분위기 하에서 결합하고 5 ℃ 미만으로 냉각하였다. EDC (253.7 g, 1.3 mol)를 첨가하고 반응 혼합물을 주위 온도로 가온하고 교반하였다. 약 25 시간 후에 반응 혼합물을 디클로로메탄 (5.54 L)으로 희석하고 물 (2.22 L)로 추출하였다. 유기층을 물 (2.22 L)로 추출하고, 수성층을 합하고 디클로로메탄 (5.54 L)으로 추출하였다. 유기층을 합하고, 물 (2.22 L)로 2 번 추출하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액 (2.22 L)으로 추출하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 회전식 증발기로 증발시켜서 고체 428 g (100%)을 얻었다. 이 고체를 약간 가온하며 아세톤 (3.42 L) 및 물 (0.856 L)을 함유하는 용매 혼합물에 흡수시켰다. 이 용액을 ~2 L 부분으로 나누고, 흐린 용액을 50 ℃로 가온하면서 각각에 물 (7.19 L)을 첨가하였다. 물 첨가 종결시에 흐린 용액을 주위 온도로 냉각시키고 고체를 얻어, 이 고체를 약 14 시간 동안 주위 온도에서 슬러리로서 교반한 후, 여과하고 건조하여 이수화물로서 표제 화합물 310.6 g (66.2 %)을 얻었다.

제약으로 이용될 때, 본 발명은 통상적으로 약제학적 조성물로서 투여된다. 따라서, 다른 실시태양에서, 본 발명은 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 알쯔하이머 질환을 치료하는 것을 포함하는 β-아밀로이드 펩티드 방출 및/또는 그의 합성을 억제하는데 이용된다. 따라서, 본 발명은 특히 알쯔하이머 질환을 치료하는 것을 포함하는 β-아밀로이드 펩티드 방출 및/또는 그의 합성을 억제하는 의약의 제조에 대한 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 용도를 포함한다.

N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온은 다양한 경로를 통해서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 그 화합물을 유효량에서 생체이용 가능하게 만드는 어떤 형태 또는 방식, 예를 들면 경구 및 비경구 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 화합물은 경구로, 흡입으로, 피하로, 근육내로, 정맥으로, 경피로, 비강내로, 직장으로, 눈으로, 국소적으로, 설하로, 볼내 등으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물을 제조하는데 있어서, 활성 성분은 통상적으로 부형제와 함께 혼합되거나, 부형제로 희석되거나 또는 캡슐, 샤세, 종이 또는 다른 용기의 형태일 수 있는 담체내에 내포될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독으로 투여되거나 또는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있는데, 즉, 약제학적으로 허용가능한 희석제, 예를 들면 담체 또는 부형제와 결합될 수 있는데, 그의 비율과 성질은 본 발명의 화합물의 용해도 및 화학적 성질, 선택된 투여 경로 및 표준의 제약 실상 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (1990))에 의하여 결정된다.

본 약제학적 조성물은 당 제약 분야에 공지인 방법으로 제조된다. 담체 또는 부형제는 활성 성분에 대한 비히클 또는 매질로 작용할 수 있는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 적절한 담체 또는 부형제는 당분야에 공지이다. 본 약제학적 조성물은 경구, 흡입, 비경구 또는 국소적 용도에 적합할 수 있고, 정제, 캡슐, 에어로졸, 흡입제, 좌약, 용액, 현탁액 등의 형태로 환자에게 투여될 수 있다.

경구 치료적 투여의 목적을 위하여, 본 화합물은 부형제와 함께 혼합되어 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 츄잉검 등의 형태로 이용될 수 있다. 이러한 제제는 활성 성분인 본 발명의 화합물을 4 % 이상 함유하여야 하 지만, 특정한 형태에 따라서 변화될 수 있고 편리하게는 단위 중량의 2 % 내지 약 90 %일 수 있다. 조성물에 존재하는 본 발명의 화합물의 양은 적절한 용량이 얻어지도록 한다. 본 발명에 따르는 바람직한 조성물 및 제제는 업계의 숙련인에 의하여 결정될 수 있다.

정제, 환제, 캡슐, 트로키 등은 또한 하기 보조제 중 하나 이상을 함유할 수 있다: 결합제, 예를 들면 미세결정성 셀룰로오스, 트라가칸트 고무 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들면 전분 또는 락토오스, 붕해제, 예를 들면 알긴산, 프리모겔 (Primogel), 옥수수 전분 등; 윤활제, 예를 들면 스테아르산 마그네슘, 실리콘유 또는 스테로텍스 (Sterotex) ; 활주제 (glidant), 예를 들면 콜로이드성 이산화 규소 및 감미제, 예를 들면 수크로오스 또는 사카린이 첨가될 수 있거나 또는 향미제, 예를 들면 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향이 첨가될 수 있다. 용량 단위 형태가 캡슐일 때는 상기 유형의 물질 외에도, 액체 담체, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방산 오일을 함유할 수 있다. 다른 용량 단위 형태는 용량 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다른 각종 물질, 예를 들면 코팅제를 함유할 수 있다. 따라서, 정제 또는 환제는 설탕, 쉘락 또는 다른 코팅제로 코팅될 수 있다. 시럽은 본 발명의 화합물 외에도 감미제로서 수크로오스 및 어떤 보존제, 염료 및 색소 및 향료를 함유할 수 있다. 이들 다양한 조성물을 제조하는데 이용되는 물질은 제약적으로 순수하고 이용되는 양이 무독성이어야 한다.

비경구 투여의 목적을 위하여, 본 발명의 화합물은 용액 또는 현탁액에 혼입될 수 있다. 이러한 제제는 전형적으로 본 발명의 화합물을 0.1 % 이상 함유하나 그 중량의 0.1 내지 90 %로 변화될 수 있다. 이러한 조성물에서 본 발명의 화합물은 적절한 용량이 얻어지도록 한다. 용액 또는 현탁액은 또한 하기 보조제 중 하나 이상을 포함한다: 멸균 희석제, 예를 들면 주사용수, 염수 용액, 불휘발성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예를 들면 벤질알콜 또는 메틸파라벤; 항산화제, 예를 들면 아스코르빈산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트제, 예를 들면 에틸렌 디아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들면 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성 조절제, 예를 들면 염화나트륨 또는 덱스트로스. 비경구 제제는 앰풀, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 다중 투여 바이알에 내포될 수 있다. 바람직한 조성물 및 제제는 당업자에 의하여 결정될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 국소적으로 투여될 수 있는데, 이렇게 국소적으로 투여될 때 담체는 적당히 용액, 연고 또는 겔 베이스를 포함할 수 있다. 베이스는, 예를 들면 다음 성분 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 광유, 라놀린, 폴리에틸렌글리콜, 밀납, 미네랄 오일, 희석제, 예를 들면 물 및 알콜, 및 유화제 및 안정제. 국소 제제는 약 0.1 내지 약 10 % w/v (단위 부피 당 중량)의 농도의 화학식 I 또는 그의 제약염을 함유할 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 제제는 경피 전달 장치 ("패치")를 이용한다. 이러한 경피 패치는 조절량으로 본 발명의 화합물을 지속적 또는 비지속적으로 주입하는데 이용될 수 있다. 약제의 전달을 위한 경피 패치의 제조 및 용도는 당분야에서 공지이다. 예는 본원에 참고로 포함되어 있는 1991년 6월 11일에 허여된 미 국 특허 5,023,252호에 나와 있다. 상기 패치는 지속성 및 박동성 있게 또는 약제의 전달 요구에 따라 만들어질 수 있다.

더욱 완전하게 본 발명의 효과를 예증하기 위하여, 전형적인 약제학적 조성물이 하기 기술되어 있다. 이 실시예들은 예증만을 위한 것으로 어떤 방법으로든지 본 발명의 범위를 제한하려 의도하지 않는다.

배합예 1

하기 성분을 함유하는 경질 젤라틴 캡슐을 제조하였다:

성분	양 (mg/캡슐)
활성 성분	30.0
전분	305.0
스테아르산 마그네슘	5.0

상기 성분을 혼합하고 340 mg 양으로 경질 젤라틴 캡슐에 채웠다.

배합예 2

하기 성분을 이용하여 정제를 제조하였다:

성분	양 (mg/정제)
활성 성분	25.0
셀룰로오스, 미세결정성	200.0
콜로이드성 이산화규소	10.0
스테아르산	5.0

성분을 혼합하고 압축하여 각각 240 mg 중량의 정제를 형성하였다.

배합예 3

하기 성분을 함유하는 건조 분말 흡입제를 제조하였다:

성분	중량 %
활성 성분	5
락토오스	95

활성 성분을 락토오스와 혼합하고 이 혼합물을 건조 분말 흡입 기구에 첨가하였다.

배합예 4

각각 30 mg의 활성 성분을 함유하는 정제를 하기와 같이 제조하였다.

성분	양 (mg/정제)
활성 성분	30.0 mg
전분	45.0 mg
미세결정성 셀룰로오스	35.0 mg
폴리비닐피롤리돈 (멸균수 중의 10 % 용액으로서)	4.0 mg
소듐카르복시메틸 전분	4.5 mg
스테아르산 마그네슘	0.5 mg
탈크	1.0 mg
총	120 mg

활성 성분, 전분 및 셀룰로오스를 20 호 메시 U. S. 체에 통과시키고 완전하게 혼합하였다. 폴리비닐피롤리돈의 용액을 결과 분말과 혼합하고, 그 후 16 메시 U. S. 체에 통과시켰다. 이렇게 생산된 과립을 50 내지 60 ℃에서 건조하고 16 메시 U. S. 체에 통과시켰다. 그 후 미리 30 호 메시 U. S. 체를 통과시킨 소듐카르복시메틸 전분, 스테아르산 마그네슘 및 탈크를 과립에 첨가하고, 혼합 후에 정제 기계에서 압축하여 각각 150 mg 중량인 정제를 얻었다.

배합예 5

각각 40 mg의 의약을 함유하는 캡슐을 하기와 같이 제조하였다:

성분	양 (mg/캡슐)
활성 성분	40.0 mg
전분	109.0 mg
스테아르산 마그네슘	1.0 mg
총	150.0 mg

활성 성분, 전분 및 스테아르산 마그네슘을 혼합하고 20 호 메시 U. S. 체에 통과시키고 150 mg 양으로 경질 젤라틴 캡슐에 채웠다.

배합예 6

각각 25 mg의 활성 성분을 함유하는 좌약을 하기와 같이 제조하였다:

성분	양
활성 성분	25 mg
포화 지방산 글리세라이드	2,000 mg까지

활성 성분을 60 호 메시 U. S. 체에 통과시키고 가능한 최소열로 미리 녹인 포화 지방산 글리세라이드에 현탁시켰다. 그 후 이 혼합물을 명목상 2.0 g 용량의 좌약 몰드에 붓고 냉각시켰다.

배합예 7

5.0 ml 용량 당 각각 의약 50 mg를 함유하는 현탁액을 하기와 같이 제조하였다:

성분	양
활성 성분	50.0 mg
크산탄검	4.0 mg
소듐카르복시메틸 셀룰로오스 (11 %)
미세결정성 셀룰로오스 (89 %)	50.0 mg
수크로오스	1.75 g
안식향산나트륨	10.0 mg
향료 및 색소	적량
정제수	5.0 ml까지

활성 성분, 수크로오스 및 크산탄검을 혼합하고 10 호 메시 U. S. 체에 통과시킨 후 미리 제조된 미세결정성 셀룰로오스 및 소듐카르복시메틸 셀룰로오스 수용액과 혼합하였다. 안식향산나트륨, 향료 및 색소는 약간의 물로 희석하고 교반하며 첨가하였다. 그 후 충분한 물을 첨가하여 필요한 부피를 형성하였다.

배합예 8

각각 15 mg의 의약을 함유하는 캡슐을 하기와 같이 제조하였다:

성분	양 (mg/캡슐)
활성 성분	15.0 mg
전분	407.0 mg
스테아르산 마그네슘	3.0 mg
총	425.0 mg

활성 성분, 전분 및 스테아르산 마그네슘을 혼합하고, 20 호 메시 U. S. 체 에 통과시키고 560 mg 양으로 경젤라틴 캡슐에 채웠다.

배합예 9

피하 제제를 하기와 같이 제조할 수 있다:

성분	양
활성 성분	1.0 mg
옥수수 오일	1 ml

옥수수 오일에서의 활성 성분의 용해도에 따라서, 원한다면 약 5.0 mg 이하 또는 그 이상의 활성 성분이 이 배합물에서 이용될 수 있다.

배합예 10

국소 제제를 하기와 같이 제조할 수 있다:

성분	양
활성 성분	1-10 g
유화 왁스	30 g
액체 파라핀	20 g
백색 연질 파라핀	100 g 까지

백색 연질 파라핀을 녹을 때까지 가열하였다. 액체 파라핀 및 유화 왁스를 혼입하고 용해될 때까지 교반하였다. 활성 성분을 첨가하고 분산될 때까지 교반을 계속하였다. 그 후 혼합물을 고체가 될 때까지 냉각하였다.

그 방법 측면의 하나에 있어서, 본 발명은 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 유효량을 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 β-아밀로이드 펩티드 방출 및/또는 그의 합성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 특정한 방법 실시태양에서, 본 발명은 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 유효량을 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 알쯔하이머 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

당업자가 현재 알쯔하이머 질환으로 고통을 당하는 환자를 치료하거나 또는 질환이 발생될 위험이 있는 환자를 예방적으로 치료하는 것으로 알쯔하이머 질환에 영향을 미칠 수 있음이 또한 인지된다. 따라서, 용어 "치료" 및 "치료하는"은 알쯔하이머 질환의 진행을 느리게 하고, 방해하고, 정지시키고, 조절하거나 또는 중지시키는 모든 방법을 의미하는 것으로 의도되지만, 반드시 모든 증상의 완전한 제거를 나타내는 것은 아니다. 이와 같이, 본 발명의 방법은 알쯔하이머 질환이 발생될 위험이 있는 환자에게서 알쯔하이머 질환의 개시를 예방하고, 알쯔하이머 질환의 진행을 억제하고 진행된 알쯔하이머 질환을 치료하는 것을 포함한다.

본원에 이용된 것과 같이, 용어 "환자"는 알쯔하이머 질환을 포함하는, β-아밀로이드 펩티드 방출 및/또는 그의 합성의 증가와 관련된 장애를 겪는 온혈동물, 예를 들면 포유류를 나타낸다. 기니아 피그, 개, 고양이, 래트, 마우스, 말, 소, 양 및 사람이 이 용어의 의미 범위내에 있는 동물의 예이다. 상기 치료가 필요한 환자는 쉽게 진단된다.

본원에서 이용된 것과 같이, 용어 화학식 I의 화합물의 "유효량"은 β-아밀로이드 펩티드 방출 및/또는 그의 합성을 억제하는데, 특히 알쯔하이머 질환을 치료하는 유효량을 나타낸다.

유효량은 통상적인 기술의 이용 및 비슷한 상황하에서 얻어진 결과의 관찰로 당업자인 주치 진단자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 용량인 유효량을 결정하는데 있어서 많은 인자들, 예를 들면 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-l-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 효능 및 특징; 환자의 종; 환자의 크기, 연령 및 일반적인 건강; 질환의 연루 정도 또는 질환의 심각성; 개별적 환자의 반응; 투여 방식; 투여된 제제의 생체이용성; 선택된 용량 섭생; 다른 동시 복용 약물의 용도 및 다른 관련 상황이 주치 진단자에 의하여 고려된다.

N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 유효량은 하루에 체중 킬로그램당 약 0.1 밀리그램 (mg/kg/일) 내지 약 100 mg/kg/일로 다양할 것으로 예상된다. 바람직한 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온의 무수물은 하루에 체중 킬로그램당 약 0.1 밀리그램 (mg/kg/일) 내지 약 100 mg/kg/일로 다양할 것으로 예상된다. 바람직한 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))- (S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 무수물은 하기를 포함하는 다양한 생체 시스템에서 시험될 수 있다.

실시예 A

β-아밀로이드 생산의 억제제를 검출하기 의한 세포적 선별

화학식 I의 많은 화합물을 스웨덴 돌연변이를 갖고 있는 세포주에서 β-아밀로이드의 생산을 억제하는 능력을 분석하였다. 상기 선별 분석은 국제 특허 출원 공개 94/10569호⁸ 및 시트론 등 (Citron et al.)¹²에 기술된 방법으로 Lys₆₅₁Met₆₅₂ 에서 Asn₆₅₁Leu₆₅₂ (APP751 넘버링)로의 이중 돌연변이를 함유하는 아밀로이드 전구 단 백질 751 (APP751)의 유전자로 안정적으로 형질감염된 세포 (K293 = 사람 신장 세포주)를 이용하였다. 이 돌연변이는 통상적으로 스웨덴 돌연변이라고 호칭하고, "293 751 SWE"로 명기된 그 세포를 둘베코의 최소 필수 배양액 (시그마 (Sigma, St. Louis, MO)) 및 10 % 우태아 혈청에서 웰당 2-4 x 10⁴ 세포로 코닝 (Corning) 96-웰 플레이트에 평판배양하였다. 세포수는 분석의 선형 범위내에서 β-아밀로이드 ELISA 결과 (mL당 ~0.2 내지 2.5 ng)를 달성하기 위하여 중요하다.

10 % 이산화탄소로 평형을 유지시킨 배양기에서 37 ℃에서 밤새 배양을 한 후 배지를 제거하고 2 시간 전처리 기간 동안 웰 당 200 μL의 화학식 I 의 화합물 (약물) 함유 배지로 교체하고 세포를 상기와 같이 배양하였다. 약물 원료를, 치료에 이용된 최종 약물 농도에서 디메틸술폭시드의 농도가 0.5 %를 넘지 않도록, 실상 통상적으로는 0.1 %와 같도록 100 % 디메틸술폭시드에서 제조하였다.

전처리 기간 말에, 배지를 다시 제거하고 상기와 같은 새로운 약물을 함유하는 배지로 교체하고 세포를 추가 2 시간 동안 배양하였다. 처리 후에, 플레이트를 조정 배지로부터 세포 잔해를 펠릿화하기 위해 실온에서 5 분 동안 1200 rpm으로 베크만 (Beckman) GPR에서 원심분리하였다. 각각의 웰로부터, 조정 배지 또는 그의 적절한 희석물 100 μL를 국제 특허 출원 공개 제94/10569호⁸에 기술된 것과 같은 β-아밀로이드 펩티드의 13-28 아미노산에 대한 항체 266 [P. Seubert, Nature (1992) 359: 325-327]으로 미리 도포된 ELISA 플레이트로 옮기고 밤새 4 ℃에서 보관하였다. β-아밀로이드 펩티드의 1-5 아미노산에 대한 표지된 항체 3D6 [P. Seubert, Nature (1992) 359: 325-327]을 이용한 ELISA 분석을 다음날 행하여 생산된 β-아밀로이드 펩티드의 양을 측정하였다.

본 발명의 화합물의 세포 독성 효과를 한센 등 (Hansen, et al.)에 의한 방법을 수정하여 측정하였다. 조직 배양 플레이트에 남아 있는 세포에 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) (시그마, St. Louis, MO)의 원액 (5 mg/mL) 25 μL를 1 mg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 1 시간 동안 37 ℃에서 배양하고 세포 활성을 동일 부피의 MTT 세포용해 완충액 (50 % 디메틸포름아미드 중의 20 % w/v 소듐도데실술페이트, pH 4.7)을 첨가하여 중지시켰다. 완전한 추출을 실온에서 밤새 진탕을 하여 달성하였다. OD_562nm 및 OD_650nm 간의 차이를 세포 생존의 지표로서 몰레큘러 디바이스사 (Molecular Device)의 UV_MAX 마이크로플레이트 판독기에서 측정하였다.

β-아밀로이드 펩티드 ELISA 결과를 표준 곡선에 맞추고 ng/mL β-아밀로이드 펩티드로서 표시하였다. 세포 독성을 표준화하기 위하여, 이 결과를 MTT 결과로 나누고 약물이 없는 대조군으로부터의 결과에 대한 퍼센트로 표시하였다. 모든 결과는 6 회 이상의 반복 분석의 평균 및 표준편차이다.

실시예 B

β-아밀로이드 방출 및/또는 합성의 생체내 억제

본 실시예는 본 발명의 화합물이 β-아밀로이드 방출 및/또는 합성의 생체내 억제에 대해 어떻게 시험되는 지를 예증한다. 이러한 실험을 위하여, 3 내지 4월 령 PDAPP 마우스를 이용하였다 [Games et al., (1995) Nature 373: 523-527]. 어떤 화합물이 시험되는지에 따라서, 화합물은 통상적으로 1 내지 10 mg/mL로 배합되었다. 본 화합물은 그것의 저용해도 인자 때문에 다양한 비히클, 예를 들면 옥수수 오일 (세이프웨이 (Safeway, South San Francisco, CA)); 옥수수 오일에서의 10 % 에탄올; 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린 (리서치 바이오메디칼즈 인터내셔날 (Research Biochemicals International, Natick MA)) 및 카르복시-메틸-셀룰로오스 (시그마 케미칼 코. (Sigma Chemical Co., St. Louis MO))과 함께 배합될 수 있다.

마우스에 26 게이지 바늘로 피하 투약하고 3 시간 후에 동물을 CO₂에 의한 혼수를 이용하여 안락사시키고, 0.5 M EDTA, pH 8.0의 용액으로 도포된 1 cc 25 G 5/8" 투베르쿨린 시린지/바늘을 이용하여 심장천자를 하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 EDTA를 함유하고 있는 벡톤-디킨슨사 (Becton Dickinson)의 진공주사기 튜브에 넣고 5 ℃에서 1500 xg에서 15 분 동안 회전분리하였다. 그 후 마우스 뇌를 분리하고 대뇌 피질 및 뇌의 해마를 해부 분리하여 얼음 위에 놓았다.

1. 뇌 분석

효소 결합 면역흡수 분석 (ELISA)를 위하여 대뇌 해마 및 피질 조직을 준비하기 위해서, 각 뇌 부위를 콘트 장동 막자 (Kontes motorized pestle, 피셔 (Fisher, Pittsburgh PA))를 이용하여 10 부피의 빙냉 구아니딘 완충액 (5.0 M 구아니딘-HCl, 50 mM Tris-HC1, pH 8.0)에서 균질화하였다. 균질물을 실온에서 3 내 지 4 시간 동안 회전 플랫폼에서 부드럽게 요동시키고 β-아밀로이드의 정량화 전까지 -20 ℃에서 보관했다.

뇌 균질물을 빙냉 카제인 완충액 [0.25 % 카제인, 인산염 완충 염수 (PBS), 0.05 % 소듐 아지드, 20 μg/ml 아프로티닌, 5 mM EDTA, pH 8.0, 10 μg/ml 류펩틴]으로 1:10 희석하여 구아니딘의 최종 농도를 0.5 M로 감소시킨 후, 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 xg로 원심분리하였다. 필요하다면 시료를 추가로 희석하여, 첨가된 0.5 M 구아니딘 염산염과 함께 카제인 완충액을 첨가하여 ELISA 측정을 위한 최적 범위를 달성하였다. β-아밀로이드 표준 (1-40 또는 1-42 아미노산)을 최종 조성물이 0.1 % 우혈청 알부민 (BSA)의 존재하에 0.5 M 구아니딘이 되도록 제조하였다.

β-아밀로이드(aa 1-40) 및 β-아밀로이드 (aa 1-42) 둘 모두를 정량하는 총 β-아밀로이드 샌드위치 ELISA는 β-아밀로이드에 대한 2가지 모노클로날 항체 (mAb)로 구성된다. 캡쳐 항체 266 [P. Seubert, Nature (1992) 359: 325-327]은 β-아밀로이드의 아미노산 13-28에 특이적이다. β-아밀로이드의 1-5 아미노산에 특이적인 항체 3D6 [Johnson-Wood et al., PNAS USA (1997) 94: 1550-1555]은 바이오티닐화되어 분석에서 리포터 항체로서 작용한다. 3D6 바이오티닐화 방법은 100 mM 탄산수소나트륨, pH 8.5 완충액을 이용하는 것을 제외하고는 면역 글로불린 항체의 NHS-바이오틴 라벨링에 대한 생산자 (피어스 (Pierce, Rockford IL))의 프로토콜을 이용하였다. 3D6 항체는 분비된 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 또는 전체 길이 APP를 인식하는 것이 아니라 오로지 아미노 말단 아스파르트산을 가진 β- 아밀로이드 종만을 감지한다. 분석은 ~50 pg/ml (11 pM)의 민감도 하한을 가지고 1 ng/ml까지의 농도에서 내인성 마우스 β-아밀로이드 펩티드에 대하여 교차 반응을 보이지 않는다.

β-아밀로이드 (aa 1-42) 수준을 정량화하는 샌드위치 ELISA의 구성은 mAb 21F12 [Johnson-Wood et al., PNAS USA (1997) 94: 1550-1555] (β-아밀로이드의 아미노산 33-42을 인식함)를 캡쳐 항체로서 이용한다. 바이오티닐화된 3D6은 또한 이 분석에서 ~ 125 pg/ml (28 pM)의 민감도 하한을 갖는 리포터 항체이다.

266 및 21F12 캡쳐 mAb를 실온에서 밤새 96 웰 면역분석 플레이트 (코스타 (Costar, Cambridge MA))에 10 μg/ml로 도포하였다. 그 후 플레이트에 공기를 공급하고 실온에서 1 시간 이상 동안 PBS 완충액 중의 0.25 % 사람 혈청 알부민으로 블로킹한 후 이용할 때까지 건조시켜 보관하였다. 플레이트를 이용 전에 세척 완충액 (트리스-완충 염수, 0.05 % 트윈 20)으로 재수화시켰다. 시료 및 표준을 플레이트에 첨가하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 분석의 각 단계 사이에서 세척 완충액으로 3 번 세척하였다. 카제인 배양 완충액 (0.25 % 카제인, PBS, 0.05 % 트윈 20, pH 7.4)에서 0.5 μg/ml로 희석된 바이오티닐화된 3D6을 실온에서 1 시간 동안 웰에서 배양하였다. 카제인 배양 완충액에서 1:4000으로 희석된 아비딘-HRP (벡터 (Vector, Burlingame CA))을 실온에서 1 시간 동안 웰에 첨가하였다. 비색 기질 슬로우 TMB-ELISA (Pierce, Cambridge MA)를 첨가하고 15 분 동안 반응시킨 후 효소 반응을 2 N H₂SO₄를 첨가하여 중지시켰다. 반응 생성 산물을 450 nm 및 650 nm에서의 흡광도 차이를 측정하는 몰레큘러 디바이스 V_max (Molecular Devices, Menlo Park CA)를 이용하여 정량화하였다.

2. 혈액 분석

EDTA 플라즈마를 시편 희석제 (0.2 gm/1 인산나트륨·H₂O (1 염기성), 2.16 gm/1 인산나트륨·7H₂O (2 염기성), 0.5 gm/l 티메로살, 8.5 gm/l 염화나트륨, 0.5 ml 트리톤 X-405, 6.0 g/l 글로불린이 없는 우혈청 알부민 및 물)로 1:1 희석을 하였다. 시편 희석제에서의 시료 및 표준을, 기술된 카제인 희석제 대신에 시편 희석제를 이용한 것을 제외하고는 뇌 분석에 대하여 상기된 총 β-아밀로이드 분석 (266 캡쳐/3D6 리포터)을 이용하여 분석하였다.

상기 기술로부터, 당업자는 조성물 및 방법을 다양하게 변형 및 변화시킬 것이다. 모든 이러한 첨부된 청구항의 범위 내에서의 변형은 그 안에 포함되어야 할 것이다.

Claims

하기 화학식의 N-(((S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴)-1-(L-알라니닐))-(S)-1-아미노-3-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-2-온 화합물.
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