CZ20031351A3 - Laktamová sloučenina pro inhibici uvolňování nebo syntézy beta-amyloidového peptidu - Google Patents

Description

beta-amyloidového peptidu

Oblast techniky

Předložený vynález se týká oblasti farmaceutické a organické chemie a konkrétně sloučeniny, která inhibuje uvolňování a/nebo syntézu β-amyloidového peptidu.

Dosavadní stav techniky

Jisté laktamy, které inhibují uvolňování a/nebo syntézu βamyloidového peptidu, a z tohoto důvodu jsou užitečné pro léčení Alzheimerovy nemoci, jsou popsány v PCT přihlášce č. PCT/US97/22986.

Sloučenina podle předloženého vynálezu, (N)-((S)-2-hydroxy3-methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on, je užitečná pro inhibici uvolňování a/nebo syntézy β-amyloidového peptidu a z tohoto důvodu je užitečná pro léčení Alzheimerovy nemoci a má výhodné vlastnosti týkající se účinnost a bezpečnosti.

···» ·· ···· ·· ···· • · · · · · · •0 0 0 · 000· •00* 00 0 fc · ··

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká sloučeniny (N)-((S)-2-hydroxy-3methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu.

V jednom ze svých způsobových znaků se předložený vynález týká způsobu inhibice uvolňování a/nebo syntézy βamyloidového peptidu zahrnující podávání pacientovi, který má jeho potřebu, účinného množství (N)-((S)-2-hydroxy-3methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl4.5.6.7- tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu. V jednom provedení tohoto způsobu se předložený vynález týká způsobu léčení Alzheimerovy nemoci, zahrnujícího podávání pacientovi, který má jeho potřebu, účinného množství (N)((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu. Předložený vynález se také týká způsobu prevence nebo inhibice postupu Alzheimerovy nemoci zahrnujícího podávání pacientovi, který má jeho potřebu, účinného množství (N)((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu.

V jiném provedení se předložený vynález se týká farmaceutické kompozice obsahující (N)-((S)-2-hydroxy-3methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl4.5.6.7- tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on a farmaceuticky přijatelné ředidlo. Takové kompozice jsou použitelné pro • * β · β · ínhibici uvolňování a/nebo syntézy β-amyloidového peptidů, včetně léčení Alzheimerovy nemoci.

Detailní popis předloženého vynálezu

Jak jsou zde používány, níže uvedené výrazy mají následující významy:

Výraz ee nebo enantiomerní přebytek znamená procento, ve kterém jeden enantiomer, El, je v přebytku ve směsi obou enantiomerů (El + E2), vypočtený podle rovnice ((E1-E2)/(E1 + E2)) x 100% = ee. Jak je dobře známo v oboru, enatiomerní přebytek může být určen kapilární elektroforézou a chirální HPLC sloučenin nebo jejich derivátů.

Pro označování specifických isomerů je použito Cahn-PrelogIngoldovo označení (R) - a (S)- a označení L- a D- pro stereochemii isomerů glyceraldehydů.

Sloučenina podle předloženého vynálezu může být připravena způsobem popsaným dále. V následujících Schématech mají všechny substituenty, pokud není uvedeno jinak, dříve definované významy a všechna činidla jsou dobře známa v oboru.

···· ·· ···· ·· ···· • · · » · · 0

Schéma 1

Ve Schématu 1, krok 1, se N-methylfenethylamin obecného vzorce (1) acyluje vhodným bisalkoxykarbonylacetátovým přenosovým činidlem pro získání sloučeniny obecného vzorce (2) . N-methylfenethylamin je komerčně dostupný a snadno se připraví reakcí 2-brom- nebo 2-chlorethylbenzenu s methylaminem za podmínek dobře známých v oboru. Vhodné bisalkoxykarbonylacetátové přenosové činidlo je takové, ve kterém R⁴ je C1-C4 alkyl a přenáší bisalkoxykarbonylacetylovou skupinu na sloučeninu obecného vzorce (1), jako jsou bisalkoxykarbonyloctové kyseliny a bisalkoxykarbonylacetylchloridy. (Viz Ben-Ishai, Tetrahedron, 43,439-450 (1987)) .

Například sloučenina obecného vzorce (1) se uvede do kontaktu s vhodnou bisalkoxykarbonyloctovou kyselinou pro získání sloučeniny obecného vzorce (2). Takové kopulační reakce jsou obvyklé v syntéze peptidů a mohou být použity takové způsoby syntézy. Například mohou být použita dobře známá kopulační činidla jako jsou karbodiimidy s použitím nebo bez použití dobře známých aditiv jako je Nhydroxysukcinimid, 1-hydroxybenzotriazol a podobně, což může usnadnit tuto acylaci. Takové kopulační reakce často používají vhodné báze pro vychytávání kyseliny, vytvořené v průběhu reakce. Vhodné báze zahrnují například triethylamin, N,N-diisopropylethylamin, N-methylmorfolin a podobně. Reakce se obvykle provádí v inertním aprotickém polárním ředidle jako je dimethylformamid, methylenchlorid, chloroform, acetonitril, tetrahydrofuran a podobně. Typicky se reakce provádí za teplot od přibližně 0 °C do přibližně 60 °C a typicky vyžaduje od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po ukončení reakce se produkt obecného vzorce (2) izoluje obvyklými způsoby zahrnujícími extrakci, precipitaci, chromatografií, filtraci, rozetření, krystalizací a podobně.

Alternativně se například sloučenina obecného vzorce (1) uvede do kontaktu s vhodným bisalkoxykarbonylacetylchloridem pro získání sloučeniny obecného vzorce (2). Takové acetylchloridy se snadno připraví z odpovídajících kyselin způsoby dobře známými v oboru, jako je působení chloridu fosforitého, fosforoxychloridu, chloridu fosforečného, fosforthionylchloridu nebo oxalylchloridu, s nebo bez malého množství dimethylformamidu, v inertním β

• ···· ·· ···· 99 ···· •« · · · · 9 9 · • 9 999 999

9 9999 999 9

9 9 · 9 9 · 9

9999 99 » · · 99 rozpouštědle jako je toluen, methylenchlorid, nebo chloroform; za teplot od přibližně 0 do 80 °C. Reakce se typicky provádí po dobu, které je v rozmezí od 1 hodiny do 24 hodin. Kyselý chlorid může být izolován a čištěn nebo může být často použit přímo, to jest s nebo bez izolace a/nebo čištění. Taková acylační reakce obecně používá vhodnou bázi pro vychytávání kyseliny vytvořené během reakce. Vhodné báze zahrnují například pyridin, triethylamin, N,N-diisopropylethylamin, N-methylmorfolin a podobně. Reakce se obvykle provádí v inertním aprotickém polárním ředidle jako je methylenchlorid, chloroform, tetrahydrofuran a podobně. Typicky se reakce provádí za teplot od přibližně -20 °C do přibližně 80 °C a typicky vyžaduje od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po ukončení reakce se produkt obecného vzorce (2) izoluje obvyklými způsoby zahrnujícími extrakci, precipitaci, chromatografií, filtraci, rozetření, krystalizaci a podobně.

Ve Schématu 1, krok 2, se sloučenina obecného vzorce (2) cyklizuje pro získání sloučeniny obecného vzorce (3).

Například se sloučenina obecného vzorce (2) uvede do kontaktu s kyselinou, jako je kyselina methansulfonová nebo kyselina sírová. Reakce se typicky provádí použitím zvolené kyseliny jako rozpouštědla. Typicky se činidla nejprve smíchají za teplot od přibližně -20 °C do přibližně 0 °C a potom se ponechají zahřát na teplotu od přibližně teploty okolí do' přibližně 60 °C. Cyklizační reakce typicky vyžaduje od přibližně 12 do přibližně 72 hodin. Po ukončení reakce se produkt obecného vzorce (2) izoluje obvyklými

způsoby zahrnujícími extrakci, precipitaci, chromatografii, filtraci, rozetření, krystalizaci a podobně.

Ve Schématu 1, krok 3, se sloučenina obecného vzorce (3) zbaví ochrany pro získání sloučeniny obecného vzorce (4).

Odebrání takových alkoxykarbonylových aminových ochranných skupin je dobře známo v oboru. Například viz Protecting Groups in Organický Synthesis, Theodora Greene (1. a 2. vydání, Wiley-Interscience) a Ben-Ishai, Tetrahedron, 43, 439-450 (1987).

·· · · ·· ····

Schéma 2

Ve Schématu 2, krok 1, se vhodná fenyloctová kyselina obecného vzorce (5) kopuluje s vhodným acetalem obecného vzorce (6) pro získání sloučeniny obecného vzorce (7). Vhodná fenyloctová kyselina obecného vzorce (5) je taková, ve které A₂ je aktivovaná skupina, například -OH, -Cl nebo

- 9 » · to· · • to • · • to • · ·

-Br. Vhodný acetal obecného vzorce (6) je takový, ve kterém R⁵ je C1-C4 alkyl. Takové kopulační reakce jsou obvyklé v syntéze peptidů a tam používané syntetické způsoby mohou být použity jak je popsáno ve Schématu 1, krok 1.

Kopulace znázorněná ve Schématu 2, krok 2, může také být provedena za Schotten-Baumannových podmínek použitím kyselého halogenidu sloučeniny obecného vzorce (5) a vhodného acetalu obecného vzorce (6) ve směsném rozpouštědle, jako je methyl-terc.-butylether, ethylacetát, tetrahydrofuran, aceton nebo diethylether a voda. Takové reakce se provedou použitím vhodné báze, jako je hydroxid sodný, hydroxid draselný, uhličitan sodný, uhličitan draselný, hydrogenuhličitan sodný, nebo hydrogenuhličitan draselný. Typicky se reakční směs intenzívně míchá a provádí se za teplot od přibližně -20 °C do přibližně 80 °C a typicky vyžaduje od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po ukončení reakce se produkt obecného vzorce (7) izoluje obvyklými způsoby zahrnujícími extrakci, precipitaci, chromatografií, filtraci, rozetření, krystalizaci a podobně.

Ve Schématu 2, krok 2, se sloučenina obecného vzorce (7) cyklizuje pro získání sloučeniny obecného vzorce (8). Takové cyklizační reakce se provádějí v kyselině jako je kyselina sírová. Typicky se kyselina použije jako rozpouštědlo. Obecně se reakce provádí za teplot od přibližně -20 °C do přibližně 150 °C a typicky vyžaduje od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po ukončení reakce se produkt obecného vzorce (8) izoluje obvyklými způsoby • · » · »· · ·* ·· zahrnujícími extrakci, precipitaci, chromatografií, filtraci, rozetření, krystalizaci a podobně.

Ve Schématu 2, krok 3, sloučenina obecného vzorce (8) podstoupí aminovou přenosovou reakci pro získání sloučeniny obecného vzorce (9). Ve Schématu 2 je znázorněna oximace. Taková oximace se dosáhne kontaktem enolátu sloučeniny obecného vzorce (8) s oximovým přenosovým činidlem, jako je alkyldusitan ester. Enolát sloučeniny obecného vzorce (8) může být připraven reakcí sloučeniny obecného vzorce (8) s vhodnou bází, jako je terč.-butoxid draselný, lithný, hexamethylsilazid lithný, sodný, hexamethylsilazid draselný a diisopropylamid hexamethylsilazid podobně. Příklady takových oximinací jsou uvedeny v Wheeler a kol., Organic Syntheses, sv. VI, str. 840, kde je popisována reakce isoamyldusitanu s ketonem pro přípravu požadovaného oximu. Reakce se typicky provádí v rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran. Obecně se reakce provádí za teplot od přibližně -20 °C do přibližně 50 °C a typicky vyžaduje od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po ukončení reakce se produkt obecného vzorce (8) izoluje obvyklými způsoby zahrnujícími extrakci, precipitaci, chromatografií, podobně.

filtraci, rozetření, krystalizaci

Alternativně může být taková aminová přenosová reakce provedena pomocí azidu. Azid může být vytvořen reakcí enolátu sloučeniny obecného vzorce (8) s azidovým přenosovým činidlem, jako je toluensulfonylazid a triisopropylbenzensulfonylazid. Příklady takových reakcí ···· »0 ··*· ·· φφφφ φ · φ φφφ φ φ · φ · φφφ φ φφφ φφφφ φ φ «· φ φφφφ jsou uvedeny v Evans a kol., J. Am. Chem. Soc., 112: 40114030 (1990), 41. Reakce se typicky provádí v rozpouštědle jako je tetrahydrofuran. Obecně se reakce provádí za teplot od přibližně -20 °C to přibližně 50 °C a typicky vyžaduje od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po ukončení reakce se produkt obecného vzorce (8), který obsahuje azid namísto oximu, izoluje obvyklými způsoby zahrnujícími extrakci, precipitaci, chromatografii, filtraci, rozetření, krystalizaci a podobně.

Jak je znázorněno ve Schématu 2, krok 4, oxim se redukuje na sloučeninu obecného vzorce (4). Takové redukce se dosahují zpracováním vodíkem a za přítomnosti vhodného katalyzátoru, jako je Raney-nikl nebo paládiový katalyzátor, jako je paládium na uhlí. Reakce se typicky provádí v rozpouštědle jako je tetrahydrofuran, ethylacetát nebo nižší alkoholy jako je methonol, ethanol a isopropanol, v kyselině octové, vodě, vodném Čpavku a podobně a jejich směsích. Reakce se obecně provádí za tlaku vodíku v rozmezí od atmosférického tlaku do přibližně 600 psi (4137 kPa) . Obecně se reakce provádí za teplot od přibližně 20 °C do přibližně 100 °C a typicky vyžaduje od přibližně 1 do přibližně 24 hodin. Po ukončení reakce se '4) izoluje obvyklými způsoby precipitaci, chromatografii, produkt obecného vzorce zahrnujícími extrakci, filtraci, rozetření, krystalizaci a podobně.

Alternativně, pokud je amin přenesen pomocí azidu, se azido skupina redukuje. Takové redukce se provedou hydrogenaci, jak je popsáno výše.

• ♦ ··· «« ··»· ·· ···· * · · · · ·»· * • · ··« « · · ·· · · 9 · · · · · ·· * *· ··

Způsoby výroby (N)-((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu jsou popsány ve Schématu A.

Schéma A

• ··«· ·« φφ*· φφ ···· • · φ · · · · · φ • · · · ♦ φφφ • φ φφφ ΦΦΦΦ ··· φ φφ φ φφ φφ

Schéma A, krok 1, znázorňuje stereochemickou separaci vhodného laktamu obecného vzorce (4) pro získání laktamu obecného vzorce (10), to znamená v zásadě čistého (S)—1— amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu.

Jak je zde používán výraz v zásadě čistý znamená enantiomerní čistotu (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu. Podle předloženého vynálezu může být připraven v zásadě čistý (S)-l-amino-3methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on obsahující (S)-enantiomer v množství větším než 80%, výhodně větším než 90%, výhodněji větším než 95%, nejvýhodněji větším než 97%.

Lze očekávat, dibenzolyvínanů. para-substituent

Například může být (S)-isomer sloučeniny obecného vzorce (4) separován frakční krystalizaci dibenzoylvínanu nebo solí kyseliny (R)-(-)-d-kafrsulfonové a (D) -(-)-mandelové.

že je pro tento účel vhodná široká řada Konkrétně dibenzoylestery, které mají zvolený ze souboru, zahrnujícího atom vodíku, halogen, Ci-C4-alkyl a Ci-C₄-alkoxy jsou výhodné a di-p-toluoylvínan je výhodnější. Di-p-toluoyl-l-vínan se použije pro získání (S)-isomeru.

Ve způsobu podle předloženého vynálezu se sloučenina obecného vzorce (4) uvede do kontaktu se zvolenou kyselinou. Obecně může být použito od přibližně 0,4 molárních ekvivalentů do velkého přebytku zvolené kyseliny, přičemž přibližně od 0,4 do 1,5 molárních ekvivalentů je výhodných a od přibližně 0,5 do 1,1 molárních ekvivalentů je výhodnější.

• ··*· ·· ···· ·· ···· • · · · · ··· · • · · ♦ · · · · « · ··· ···· • · · · · · · · · * ♦

Způsob se typicky provádí krystalizací adiční sole kyseliny z roztoku. Vhodná jsou obzvláště rozpouštědla jako jsou nižší alkoholy, včetně alkoholů, jako je methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, butanol, sek.-butanol, isobutanol, terč.-butanol, amylalkohol, iso-amylalkohol, terc.-amyl alkohol, hexanol, cyklopentanol a cyklohexanol, methanol, ethanol a isopropanol jsou výhodné. Může být výhodný použití protirozpouštědla.

Jak je zde používán, výraz protirozpouštědlo znamená rozpouštědlo, ve kterém je sůl významně méně rozpustná než v rozpouštědle. Výhodně pokud je použito protirozpouštědlo, pak je mísitelné se zvoleným rozpouštědlem. Vhodná protirozpouštědla zahrnují ethery jako je diethylether, methyl-terc.-butylether a podobně a nižší alkylacetáty jako je methylacetát, ethylacetát, iso-propylacetát, propylacetát, iso-butylacetát, sek.-butylacetát, butylacetát, amylacetát, iso-amylacetát a podobně, a alkany, jako je pentan, hexan, heptan, cyklohexan a podobně.

Pokud se způsob podle předloženého vynálezu provádí krystalizací adiční sole kyseliny z racemické směsi, musí být protirozpouštědlo použito opatrně pro zabránění krystalizace soli na nežádoucí diastereomerní sůl.

Typicky se krystalizace provádí za počátečních teplot od přibližně 40 °C do teploty zpětného toku zvoleného rozpouštědla nebo rozpouštědel a za počátečních koncentrací • ··*· ·« tttt 11 »*»· • · · · · · 1 · · • · 111 111

111 1111 1111 11 1 11 11 od přibližně 0,05 mol. do přibližně 0,25 mol. Směs se potom ochladí pro získání soli. Naočkování může být výhodné.

Míchání výchozího precipitátu po dobu od přibližně 4 do 48 hodin může být výhodné. Výhodně se krystalizační roztok ochlazuje pomalu. Krystalizační směs se nejvýhodnšji ochladí na teploty od teploty okolí do přibližné -20 °C. Sůl může být izolována použitím způsobů, které jsou dobře známy v oboru, včetně filtrace, usazování, centrifugace, odpařování, sušení a podobně.

Sloučenina obecného vzorce (10) může být použita přímo jako adiční sůl zvolené kyseliny. Alternativně před použitím může být sloučenina obecného vzorce (10) izolována jako další adiční sůl kyseliny po výměně kyseliny nebo může být izolována ve formě báze extrakcí za bázických podmínek, jak je dobře známo v oboru.

Výhodný způsob dává (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on v zásadě enantiomericky čistý krystalizaci l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H3-benzazepin-2-onu ve formě jeho adiční soli kyseliny, kde kyselina je zvolena ze souboru, zahrnujícího kyselinu di-ptolyl-L-vinnou, kyselinu (R)-(-)-d-kafrsulfonovou a kyselinu (D)-(-)-mandlovou v dynamickém procesu v přítomnosti aromatického aldehydu. Dynamický proces má výhodu, spočívající v tom, že l-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on podstoupí přeměnu na jediný isomer během krystalizace, což vede k zlepšení výtěžku a • 000« 00 0000 «· ·»·· • 0 000 000 0

0 000 000

000 0000 000 0 00 0 00 00 zabraňuje vzniku odpadního proudu, obsahujícího nežádoucí isomer.

Lze očekávat, že pro dynamický proces je vhodná široká řada aromatických aldehydů a bylo zjištěno, že v praxi je mnoho aldehydů obzvláště výhodných. Konkrétně bylo zjištěno, že jsou výhodné salicylové kyseliny jsou a salicylaldehyd, 5nitrosalicylaldehyd a 3,5-dichlorsalicylaldehyd jsou výhodnější v uvažovaném dynamickém separačním procesu.

V souladu s tím, pokud se způsob podle předloženého vynálezu provádí jako dynamická separace, l-amino-3-methyl4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on se uvede do kontaktu se zvolenou kyselinou v přítomnosti aromatického aldehydu. Obecně se pro dynamickou separaci použije od přibližně 0,9 do 1,2 molárních ekvivalentů kyselin, přičemž přibližně 1 molární ekvivalent je výhodný. Aromatický aldehyd se obecně použije v katalytickém množství. Typicky se použije od přibližně 0,5 do 0,001 molárních ekvivalentů aromatického aldehydu, přičemž od přibližně 0,1 do přibližně 0,01 molárních ekvivalentů je výhodné.

Dynamický proces se typicky provádí v rozpouštědle bez protirozpouštědla, jak je popsáno výše. Směs l-amino-3methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on, zvolená kyselina a aromatický aldehyd se míchá pro umožnění přeměny na požadovaný isomer. Obecně se tato přeměna provádí za teplot od teploty okolí do teploty zpětného toku rozpouštědla. Obecně přeměna vyžaduje od 6 do 48 hodin.

• »999 • · 9 9	9 9 « 9	99·· • 9 9 9	99 9 9 9 9	9 99 9 « 9
9 9	9	• 9	9 9	• 9
• 9 9	9 9	•	• 9	9 9

Odborníkovi v oboru je jasné, že pokud se způsob podle předloženého vynálezu provádí jako dynamická separace, použití adiční sole kyseliny (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu může být komplikováno přítomností malých množství aromatického aldehydu v izolovaném produktu. Proto je po dynamické separaci výhodné, aby (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H~3benzazepin-2-on byl izolován výměnou soli, výhodně ve formě hydrochloridové sole, před jeho použitím nebo vytvářením báze.

Schéma A, krok 2, znázorňuje kopulační reakci vhodného aminově chráněného alaninu obecného vzorce PgNH-CHCH₃-C(0)A a vhodného laktamu obecného vzorce (10) . Vhodný aminově chráněný alanin je takový, ve kterém Pg je ochranná skupina aminu, je v L-configuration a A je aktivující skupina, například -OH nebo -Cl, schopná kopulace s aminovou skupinou sloučeniny obecného vzorce (10). Takové aminově chráněné alaniny jsou pro odborníka v oboru snadno dostupné.

Kopulační reakce znázorněná v reakčním Schématu A, krok 2, zahrnuje reakci, která se obvykle provádí v syntéze peptidů a tam používaných syntetických způsobů je také možno použít. Takové způsoby jsou popsány detailně ve Schématu 1, krok 1.

Reakční Schéma A, krok 3, znázorňuje odstranění ochranné skupiny ze sloučeniny obecného vzorce (11) pro získání

9 a···		«a ····	aa		····
• ·	Φ	a ·	a	a
• a	•	• T	•	a	•
• a		• ·	•	a	• a
·(· ·		©a a	··		aa

sloučeniny obecného vzorce (12). Taková odstranění ochranné skupiny aminu jsou dobře známa v oboru.

Reakce Schéma A, krok 4, znázorňuje kopulační reakci vhodné sloučeniny obecného vzorce (13), (CH3)₂CH-CHOH-C(O)A_x a sloučeniny obecného vzorce (12) pro získání sloučeniny obecného vzorce I. S-isomer sloučeniny obecného vzorce (13) je komerčně dostupný a je dobře znám v oboru, viz například PCT přihláška č. PCT/US97/22986, podaná 22. prosince 1997. Kopulační reakce znázorněná v kroku 3 se provede použitím kyseliny obecného vzorce (13) (sloučeniny ve kterých Αχ je -OH) nebo halogenidu kyseliny, který je z ní odvozen (sloučenin ve kterých Αχ je -Cx nebo -Br), způsobem podobným způsobu uvedenému ve Schématu 1, krok 1.

Alternativní způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I je znázorněn ve Schématu A, krok 5, které ukazuje kopulační reakci vhodné sloučeniny obecného vzorce (10) a vhodné sloučenina obecného vzorce (14), (CH₃) ₂CH-CHOH-C(O)-NHCHCH₃-C (O) A₂, pro přímé získání sloučeniny obecného vzorce I. Vhodná sloučenina obecného vzorce (10) je jak bylo popsanáno v kroku 2. Vhodná sloučenina obecného vzorce (14) je taková, která má stereochemistrii stejnou jako je požadována u konečného produktu obecného vzorce I.

Sloučeniny obecného vzorce (14) se snadno připraví kopulací karboxy-chráněných aminokyselin, H₂N-CHCH₃-C (O) OPgx, kde sloučeniny obecného vzorce (13) jsou jako bylo popsáno výše. Opětně jsou takové kopulační reakce dobře známy v • · · ·

Λ Λ Λ Λ

oboru a dávají produkt, který po odstranění ochranné skupiny dává sloučeninu obecného vzorce (14).

Sloučenina obecného vzorce I může být izolována a čištěna řadou způsobů, včetně krystalizace. Může být použita krystalizace z roztoku a suspenzní techniky. Obzvláště může být sloučenina podle předloženého vynálezu připravena krystalizaci z řady bezvodých a vodných rozpouštědel. Vhodná rozpouštědla zahrnují aceton, nižší alkoholy (jako je methanol, ethanol a isopropanol), kyselinu octovou a acetonitril s použitím nebo bez použití vody a ethylacetát, diethylether a methyl-terc.-butylether. V praxi bylo zjištěno, že vodný aceton je výhodný. Pro dané vodné rozpouštědlo použité množství vody použit závisí na relativní rozpustnosti (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amíno-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu v rozpouštědle ve srovnání s vodou a zda je použita krystalizace nebo suspenzní techniky.

Krystalizace se obecně provádí tak, že se (N)-((S)-2hydroxy-3-methyl-butyryl) -1- (L-alaninyl) - (S) -l-amino-3methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu rozpustí ve vodném rozpouštědle a potom se roztok ponechá chladnout, s přidáním nebo bez přidání další vody, pro získání pevné látky. Typicky se krystalizace provádí za počátečních teplot od přibližně 40 °C do teploty zpětného toku zvoleného vodného rozpouštědla. Směs se potom ochladí pro získání krystalického dihydrátu. Očkování může být výhodné.

Výhodně se krystalizační roztok ochladí pomalu. Krystalizační směs se nejvýhodněji ochladí na teploty od teploty okolí do přibližně -20 °C.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález je dále ilustrován následujícími příklady a přípravami. Tyto příklady a přípravy jsou pouze illustrativní a nemají za cíl omezit rozsah předloženého vynálezu žádným způsobem.

Výrazy použité v příkladech a přípravách mají jejich obvyklý význam, pokud není uvedeno jinak. Například °C znamená stupně Celsia; mmol znamená milimol nebo milimoly ; g znamená gram nebo gramy; ml znamená mililitr nebo mililitry; solný roztok znamená nasycený vodný roztok chloridu sodného; THF znamená tetrahydrofuran; HPLC znamená vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií; a podobně.

Příklad 1

Syntéza l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu

Do kašovité suspenze hydridu sodného (1,1 ekviv.) v 15 ml bezvodého DMF byl přidán 4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on (0,0042 molů) jako roztok v 10 ml DMF. Potom byl přidán ethyljodid (přibližně 2 ekviv.). Když bylo pomocí TLC určeno, že reakce je ukončena, reakční směs byla ·· · · · «

vlita na led a extrahována do ethylacetátu. Organická vrstva byla promývána vodou, následovanou solným roztokem. Organická vrstva byla potom sušena nad Na₂SO₄, filtrována a koncentrována za sníženého tlaku. Residuum bylo čištěno pomocí HPLC (LC 2000), vymývajíce systémem ethylacetát/hexan pro získání 3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro2H-3-benzazepin-2-onu.

3-Methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on (1 ekviv.) byl rozpuštěn v THF a byl přidán isoamyldusitan (1,2 ekviv.). Směs byla ochlazena na teplotu 0 °C v Ledové lázni. Po kapkách byl přidán NaHMDS (1,1 ekviv., 1M v THF). Po míchání po dobu 1 hodiny nebo dokud reakce nebyla ukončena byla směs koncentrována a potom okyselena IN vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a extrahována ethylacetátem. Organická část byla sušena a koncentrována pro získání surového produktu, který byl· čištěn silikagelovou chromatografií pro získání l-hydroxyimino-3methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu:

Hmotová spektroskopie (M+H)⁺, 205,1.

1- Hydroxyimino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin2- on byl rozpuštěn v EtOH/NH3 (20:1) a hydrogenován v bombě použitím Raney niklu a vodíku (500 psi/3447 kPa) při teplotě 100 °C po dobu 10 hodin. Výsledná směs byl filtrována a koncentrována pro získání oleje, který byl čištěn silikagelovou chromatografií pro získání sloučeniny z názvu.

···· ·· ···· ·· ····

Příklad 2

Syntéza l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu

Do 20 1 Mortonovy láhve byl přidán MTBE (5,52 1, 7 objemů) a (N-methylamino)-acetaldehyd-dimethyl-acetal (614 g, 5 molů) pro vytvoření roztoku za teploty okolí. Roztok hydrogenuhličitanu sodného, připravený přidáním hydrogenuhličitanu sodného (546g, 6,5 molů) do vody (6,31

1, 8 objemů), byl přidán do Mortonovy reakční láhve. Směs byla ochlazena na méně než 10 °C a do ochlazené reakční směsi byl po kapkách přidáván MTBE (789 ml) roztok fenylacetylchloridu (789 g, 5 molů) po dobu 1 hodiny. Po přidání byla reakční směs míchána za teploty okolí po dobu 1 hodiny. V této etapě HPLC analýza indikovala, že reakce byla ukončena. Extrakční zpracování pomocí MTBE (4 objemy), sušení nad bezvodým síranem hořečnatým, následované koncentrací v rotační odparce, dalo 1,187 kg (98%) Nmethyl-N-(2,2-dimethoxyethyl)fenylacetamidu ve formě kapaliny.

(M+H) + = 237,9.

Do 5 L Mortonovy láhve pod silnou dusíkovou atmosférou byla přidána H₂SO₄, (1,42 1) a N-methyl-N-(2,2-dimethoxyethyl)fenylacetamid (712 g, 3 molů) byl přidán po kapkách do reakční láhve, což způsobilo exothermu (22 až 78 °C). Výsledná reakční směs byla potom zahřívána na teplotu 110 °C po dobu 3 hodin a potom ochlazena na teplotu okolí a přenesena do 20 1 Mortonovy láhve. Za teploty menší než 10 °C byla reakce zastavena vodným hydroxidem sodným (9,18

1, 5 N) . Extrakční zpracování ethylacetátem (2 X 2,85 1) , sušení nad síranem sodným, následované koncentrací na pevnou látku, poskytlo 520 g (73,5%) 3-methyl-6,7-dihydro2H-3-benzazepin-2-onu ve formě pevné látky. Tento materiál může být rekrystalizován z MTBE pro zvětšení čistoty pro získání pevné látky.

Teplota tání = 81-82 °C;

(M+H) + = 174,2.

THF (0,5 1) roztok 3-methyl-6,7-dihydro-2H-3-benzazepin-2onu (113,8 g, 0,657 molů) byl ochlazen na teplotu 0 °C a po kapkách byl přidán isoamyldusitan (100,75 g, 0,86 molů). Do výsledné směsi byl přidán LiHMDS (1 N THF roztok, 854 ml, 0,854 molů) takovou rychlostí, aby teplota zůstala pod 10 °C. Po přidání byla reakční směs ponechána za míchání za teploty okolí po dobu 2-3 hodin za monitorování postupu reakce pomocí HPLC. Po ukončení reakce byla směs ochlazena na teplotu 0 °C a pH bylo upraveno na hodnotu z 12 na 2-3 použitím vodného HC1 (2N) . Výsledný precipitát byl míchán po dobu 12-16 hodin před izolací filtrací a sušením pro získání 86,3 g (64,9 %) l-hydroxyimino-3-methyl-6,7dihydro-2H-3-benzazepin-2-onu.

Teplota tání = 225-226 °C;

(M+H) + = 203,0.

Ethanolový (525 ml) roztok l-hydroxyimino-3-methyl-6,7dihydro-2H-3-benzazepin-2-onu (35 g, 0,173 molů) byl přidán do autoklávu s paládiem na uhlí (10%, 3,5 g) ve formě zředěné HC1 (koncentrovaný vodný, 17,5 g v 17 ml vody) kašovité suspenze. Výsledná směs byla hydrogenována za teploty 50 °C a 250 psi (1723 kPa) dokud reakce nebyla ukončena. Reakční směs byla filtrována přes vrstvu celitu použitím ethanolu jako rozpouštědla a filtrát byl koncentrován na 90 ml.. Voda (350 ml) byla přidána do koncentrátu a výsledný roztok byl dále koncentrován na přibližně 200 ml. Do vodného roztoku byl přidán dichloromethan (350 ml) před úpravou pH na 11-11,5 vodným hydroxidem sodným (1 N) . Organická část byla separována a vodná část byla extrahována dichlormethanm (17 5 ml) . Zkombinované extrakty byly koncentrovány na residuum, které v klidu krystalizovalo pro získání sloučeniny z názvu: Teplota tání = 69-81 °C ; (M+H) + = 191,0.

Příklad 3

Syntéza l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu

Do 22 1 Mortonovy láhve byl přidán dichloromethan (4,73 1, 8 objemů), N-methylfenethylamin (591 g, 4,33 molů) a vodný hydrogenuhličitan sodný (436,7 g, 5,2 molů v 4,73 1 vody). Směs byla ochlazena na teplotu méně než 5 °C a do ochlazené reakční směsi byl po kapkách přidán dichloromethanový (887 ml) roztok chloracetylchloridu (513,7 g, 4,55 molů) v průběhu 70 minut. Po přidání HPLC analýza ukázala, že reakce byla ukončena. Vrstvy byly separovány a vodná vrstva byla extrahována dichlormethanem. Kombinované organické vrstvy byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým a koncentrovány v rotační odparce pro získání 915,7 g (99,8%) N-methyl-N-(2-fenylethyl)-1-chloracetamidu:

(M+H) = 212,1.

• · • 0 0 0 0 0

- 25 Do 12 1 láhve byl pod dusíkovou atmosférou přidán N-methylN-(2-fenylethyl)-l-chloracetamid (883,3 g, 4,17 molů) a ortho-dichlorbenzen (6,18 1). Přidání chloridu hlinitého (1319 g, 10,13 molů) způsobilo exothermu (22 až 50 °C) . Výsledná reakční směs byla potom zahřívána na teplotu 165 °C po dobu 2,5 hodin a potom ochlazena na teplotu okolí v průběhu přibližně 14 hodin. Reakční směs byla ochlazena na teplotu přibližně 0 °C a byla přidána do studené vody (8,86 1, přibližně 5 °C) ve čtyřech částech pro udržení exothermy na přibližně 40 °C. Vrstvy byly separovány a vodná vrstva byla extrahována dichlormethanm (7,07 1) a vrstvy byly separovány. Organické vrstvy byly zkombinovány a extrahovány vodnou kyselinou chlorovodíkovou (8,83 1, IN) a potom nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (7,07 1), sušeny nad síranem hořečnatým, zkombinovány se silikagelem (883 g) a vloženy do kolony silikagelu (3,53 kg, v sinterované skleněné nálevce, naplněné jako kašovitá suspenze v dichloromethanu) . Kolona byl vymývána dichlormethanm, dokud nebylo získáno 25 1 a potom ethylacetátem pro získání produktu. Frakce obsahující produkt byly odpařeny na 3-methyl-4,5,6, 7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on ve formě zlatově hnědé pevné látky, 608 g (83%) .

V 22 1 láhvi a pod dusíkem byl 3-methyl-4,5, 6, 7-tetrahydro2H-3-benzazepin-2-on (606 g, 3,46 molů) a isoamyldusitan (543 g, 4,5 molů) v THF (7,88 1). Směs byla ochlazena na teplotu přibližně 0 °C před přidáním LiHMDS (1 N THF roztok, 4,5 1, 04,5 molů) takovou rychlostí, že teplota

• · 9 4 9 9 ·	99 9999 9 9 9	99 9999 9 9 9
9 9
9 ·	9 9 4	9 9 9 ·
9 9 9	99 9	9 9 9 9

zůstala pod přibližně 7 °C. Po přidání byla reakční směs ponechána za míchání za teploty okolí po dobu přibližně 2 hodiny za monitorování postupu reakce pomocí HPLC. Po ukončení reakce byla směs ochlazena na teplotu přibližně 0 °C a pH bylo upraveno z 12 na přibližně 2-1 použitím vodného HC1 (2N). Výsledný precipitát byl míchán po dobu přibližně 6 hodin před izolací filtrací a sušením pro získání l-hydroxyimino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu, 604,7 g (85,6%).

1- Hydroxyimino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin2- on (625 g, 3,06 molů) a 3A ethanol (15,6 1). Výsledná směs byla hydrogenována za teploty 50 °C a tlaku 250 psi (1723 kPa) za intenzivního míchání dokud reakce nebyla ukončena (přibližně 4 hodin). Reakční směs byla filtrována přes vrstvu celitu použitím ethanolu jako rozpouštědla a filtrát byl koncentrován pro získání pevné látky. Pevná látka byla zpracovávána dichlormethanem (6 1) a byl přidáván IN vodný roztok hydroxidu sodného dokud pH vodné vrstvy nebylo mezi 11-11,5. Směs byla míchána, vrstvy byly separovány a vodná vrstva byla extrahována dichlormethanm (2 1). Organické vrstvy byly sušeny nad síranem hořečnatým, filtrovány a odpařeny v rotační odparce pro získání sloučeniny z názvu 477 g (81,9%).

• 99 9

999·

Příklad 4

Syntéza (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu l-Amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on (1,544 g, 8,12 mmolů) byl mírně zahříván v 15 ml methanolu pro vytvoření roztoku. V další láhvi byla rozpuštěna kyselina di-p-toluoyl-L-vinná (3,12 g, 8,08 mmolů) v 15 ml methanolu a přidána pipetou do horkého roztoku aminu. Směs byla zahřívána do precipitace pevných látek. Bylo přidáno dalších 30 ml methanolu pro vytvoření roztoku, který byl zahříván na teplotu zpětného toku po dobu 30-40 minut a potom pomalu ochlazen na teplotu okolí pro získání pevné látky. Po míchání po dobu přibližně 18 hodin byla pevná látka izolována filtrací a promývána malým množstvím studeného methanolu pro získání 2,24 g (S)-l-amino-3methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu ve formě soli kyseliny di-p-toluoyl-L-vinné (96% výtěžek, 94,7% ee).

(S)-l-Amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2on ve formě soli kyseliny di-p-toluoyl-L-vinné (11,83 g, 20,5 mmolů) byl rozpuštěn v 45 ml vodného roztoku 1,0 N hydroxidu sodného a extrahován methylenchloridem (3 x 25 ml) . Zkombinované methylenchloridové vrstvy byly promývány 35 ml vodným 1,0 N roztokem hydroxidu sodného, potom solným roztokem a sušeny nad bezvodým MgSO₄. Odstranění rozpouštědla za vakua dalo sloučeninu z názvu (3,38 g) ve formě bezbarvého oleje (87% výtěžek, 93,2% ee).

···· ·* 999 ·

9999

Příklad 5

Syntéza (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu l-Amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on (6,0 g, 31,5 mmolů) byl mírně zahříván v 75 ml methanolu pro vytvoření roztoku a zkombinován s roztokem kyseliny dip-toluoyl-L-vinné (12,2 g, 31,5 mmolů) v 75 ml horkého methanolu. Roztok byl naočkován a vytvořila se pevná látka. Bylo přidáno dalších 100 ml methanolu a směs byla ponechána za míchání. Po míchání po dobu přibližně 18 hodin byla pevná látka izolována filtrací a promývána malým množstvím studeného methanolu pro získání 6,7 g pevné látky. Pevná látka byl zkombinována s methanolem (200 ml) a míchána. Po uplynutí 18 hodin byla pevná látka izolována pro získání (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2onu ve formě soli kyseliny di-p-toluoyl-L-vinné (4,4 g) . Izolace báze způsobem popsaným v Příkladu 4 dala sloučeninu z názvu (96% ee).

Příklad 6

Syntéza (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu

V 22 1 nádobě byl pod dusíkovou atmosférou l-amino-3methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on (438 g, 2,3 molů) zahříván (přibližně 40 °C) pro získání roztoku v methanolu (4,38 ml). V další láhvi byla rozpuštěna kyselina di-p-toluoyl-L-vinná (889,7 g, 2,3 molů) v 4,38 1 methanolu a zahřívána na přibližně 40 °C před přidáním roztoku 129

0000 0· 0000 00 0000 * * · 0 0 · 0 0 · * 0 0 0 0 · ··· 0 ♦ · 000 0000 • 0 » · 00 0 00 0« amino-3-methyl-4, 5,β,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu. Zahřívání pokračovalo a bylo přidáno dalších 6, 13 1 methanolu předtím než směs byla zahřívána na teplotu zpětného toku po dobu přibližně 45 minut a potom pomalu ochlazena na teplotu okolí pro získání pevné látky. Po míchání po dobu přibližně 18 hodin byla pevná látka izolována filtrací a promývána malým množstvím matečné tekutiny a po sušení na vzduchu přibližně 2 1 ethylacetátu pro získání 561,6 g (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu ve formě soli kyseliny dip-toluoyl-L-vinné. (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro2H-3-benzazepin-2-on ve formě soli kyseliny di-p-toluoyl-Lvinné, dichlormethan (6,57 1) a IN vodný roztok hydroxidu sodného (6,57 1) byly zkombinovány a míchány. Vrstvy byly odděleny a organická vrstva byla dvakrát extrahována -IN vodným roztokem hydroxidu sodného (3,28 1) , jednou solným roztokem (2,46 1) před sušením nad síranem hořečnatým, filtrací a odpařením na rotační odparce pro získání sloučeniny z názvu, 250 g (57,4%, 94,1% ee).

Příklad 7

Syntéza hydrochloridu (S)-l-amino-3-methyl-4,5, 6,7tetrahydro-2H-3-benzazepín-2-onu l-Amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on (31,9g, 168 mmolů) byl suspendován na kaši v přibližně 300 ml isopropylacetátu a zahříván na teplotu 45 °C. V jiné láhvi byla zahřívána kyselina (R)-(-j-D- mandlová (25, Og, 164 mmolů) v přibližně 130 ml isopropylalkoholu do vytvoření roztoku a byla přidána do kašovité suspenze 130

9999 9· ···· ·· ···· • 9 9 9 9 9 ·

9 toto· 9 9 9 9

9 9 99 · ·· ·· amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on/ isopropylacetát získané výše pro získání roztoku, ze kterého se rychle tvořil precipitát. Směs byla míchána za teploty 45 °C po dobu přibližně 3 hodin. Do horkého roztoku byl přidán 5-nitrosalicylaldehyd (2-hydroxy-5nitrobenzaldehyd) (1,40 g, 8,38 mmol, 5 % mol.) a směs byla míchána za teploty 45 °C. Po uplynutí přibližně 14 hodin byla kašovitá suspenze ochlazena na teplotu okolí a míchána po dobu 2 hodin před izolací pevných látek filtrací a promýváním 70 ml studeného isopropylacetátu a sušením ve vakuové peci za teploty 40 °C pro získání 46,62 g (S)-lamino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu ve formě soli kyseliny (R)-mandlové (82,9% výtěžek, 98,4% ee) .

(S)-l-Amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2on ve formě soli kyseliny (R)-mandlové (2,42 g, 7,06 mmol, 98,4% ee) byl suspendován na kaši v 25 ml ethylacetátu za teploty okolí. Byla přidána koncentrovaná vodná kyselina chlorovodíková (1,1 ml, přibližně 11,2 mmolů) a směs byla zahřívána na teplotu 50 °C za intenzivního míchání po dobu 3,5 hodin. Kašovitá suspenze byla ochlazena na teplotu okolí a filtrována, promývána methyl-terc.-butyletherem (přibližně 10 ml) pro získání 1,48 g sloučenina z názvu (92,5% výtěžek, 97,9% ee).

·* «·· · «· ©··· • · · © · · • » · · · · • · · · · · · ·· · ·· ··

Příklad 8

Syntéza (N)-((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-amino-3-methyl-4, 5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu

Baňka byla naplněna N-t-Boc-L-alaninem (1,0 ekviv.), hydrátem hydroxybenzotriazolu (přibližně 1,1 ekviv.) a (S)l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onem (1,0 ekviv.) v THF pod dusíkovou atmosférou. Do dobře míchané směsi byla přidána Hunigova báze (N,Ndiisopropylethylamin, 1,1 ekviv.) následovaná EDC (1,1 ekviv. ) . Po míchání po dobu od 4 do 17 hodin za teploty okolí bylo rozpouštědlo odstraněno za sníženého tlaku, residuum bylo vyjmuto v ethylacetátu a vodě, promýváno nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, 1 N vodným HC1, solným roztokem, sušeno nad bezvodým síranem sodným, filtrováno a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku pro získání 1-(N-t-Boc-L-alanínyl)-amino-3methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu:

Hmotová spektroskopie (M+H)⁺ 362,3.

Proud bezvodého plynného HC1 byl ponechán procházet přes míchaný roztok 1-(N-t-Boc-L-alaninyl)-amino-3-methyl1,4-dioxanu na teplotu Roztok byl roztok byl

4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu v (0,03-0,09 M) , chlazeného v ledové lázni přibližné 10 °C pod N₂ po dobu 10-15 minut uzavřen, chladící lázeň byla odstraněna a ponechán zahřát se na teplotau okolí za míchání po dobu 2-8 hodin, monitorujíce 1.0 pomocí TLC na spotřebování výchozího materiálu. Roztok byl koncentrován pro získání 1φφφφ φφ φφφφ

φφ φφφφ (L-alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu, který byl použit bez dalšího čištění.

1-(L-Alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-3methyl-2H-3-benzazepin-2-on (1,0 ekviv.), hydrát hydroxybenzotriazolu (1,1 ekviv.) a kyselina (S)-2-hydroxy3-methyl-máselná (1,0 ekviv.) v THF pod dusíkovou atmosférou. Hunigova báze (N,N-diisopropylethylamin, 1,1 ekviv.) byl přidán do dobře míchané směsi, následovaný EDC (1,1 ekviv.). Po míchání po dobu od 4 do 17 hodin za teploty okolí bylo rozpouštědlo odstraněno za sníženého tlaku, residuum bylo vyjmuto v ethylacetátu (nebo podobném rozpouštědle) a vodě, promýváno nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, 1 N HC1, solným roztokem, sušeno nad bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku pro získání sloučeniny z názvu.

Příklad 9

Syntéza (N)-((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu

Baňka byla naplněna N-t-Boc-L-alaninem (249,5 g, 1,32 molů), hydrátem hydroxybenzotriazolu (232,2 g, 1,52 molů) a (S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2onem (250,8 g, 1,32 molů) v THF (3,76 1) pod dusíkovou atmosférou. Směs byla ochlazena na teplotu menší než 5 °C před přidáním Hunigovy báze (N,N-diisopropylethylamin, 188,4 g, 1,45 molů) následovanou EDC (283,7 g, 1,45 molů).

• ···· 99 999« 99 9999 ·< 999 9*9 9 • · 999 999 • 9 9999 999 9 *9 999 9999 «·♦ 9 «99 99 99

Po míchání po dobu 6 hodin byla reakční směs zahřáta na teplotu okolí a míchána po dobu přibližně 14 hodin. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku, residuum bylo vyjmuto v ethylacetátu (3,76 1) a vodě (1,76 1) , vrstvy byly separovány, organická vrstva byla extrahována vodou (1,76 1), vodné vrstvy byly zkombinovány a extrahovány ethylacetátem (1,76 1). Organické vrstvy byly zkombinovány, extrahovány nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (1,76 1), sušeny nad bezvodým síranem sodným, filtrovány a odpařeny v rotační odparce pro získání 1-(N-t-Boc-L-alaninyl)-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu, 463 g (97,2%).

Ethylacetátový roztok HC1 byl připraven průchodem bezvodého plynného HCl, použitím podpovrchové disperzní trubice, ethylacetátem (1,76 1) ochlazaným na teplotu přibližně °C. Ethylacetátový roztok HCl připravený výše byl přidán do intenzívně míchané kašovité suspenze 1-(N-t-BocLalaninyl)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu (462 g, 1,28 molů) v ethylacetátu (3,7 1). Bylo přidáno další množství ethylacetátu (11) a reakční směs byla ponechána zahřát se na teplotu okolí a míchána po dobu 22 hodin. Reakční směs byla filtrována pro získání pevné látky. Pevná látka byl suspendována v acetonitrilu (5 1), zahřívána na teplotu zpětného toku a potom ochlazena na teplotu přibližně 60 °C před filtrací a sušenín pro získání 1-(L-laninyl)-(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu, 389,8 g (94,7%).

···· *· «·<« *» *·«· • » · · · · · • » » « · · ·

1-(L-Alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-3methyl-2H-3-benzazepin-2-on (369,5 g, 1,18 molů), hydrát hydroxybenzotriazolu (207,6 g, 1,36 molů), Hunigova báze (N,N-diisopropylethylamin, 352,2 g, 2,71 molů) a kyselina (S)-2-hydroxy-3-methyl-máselná (140,6 g, 1,18 molů) v THF (4,8 1) byly zkombinovány po dusíkovou atmosférou a ochlazeny na teplotu nižší než 5 °C. Byl přidán EDC (253,7 g, 1,3 molů) a reakční směs byla ponechána zahřát se na teplotu okolí a míchána. Po uplynutí přibližně 25 hodin byla reakční směs zředěna dichlormethanem (5,54 1) a extrahována vodou (2,22 1). Organická vrstva byla extrahována vodou (2,22 1), vodné vrstvy byly zkombinovány a extrahovány dichlormethanem (5,54 1). Organické vrstvy byly zkombinovány, extrahovány dvakrát vodou (2,22 1), nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2,22 1), sušeny nad bezvodým síranem sodným, filtrovány a odpařeny v rotační odparce pro získání pevné látky 428 g (100%). Pevná látka byla za mírného zahřívání (40 °C) vyjmuta ve směsi rozpouštědel obsahující aceton (3,42 1) a vodu (0,856 1). Roztok byl rozdělen na 2 1 části a do každé byla přidána voda (7,19 1) za zahřívání zakaleného roztoku na teplotu 50 °C. Po ukončení adice vody byl zakalený roztok ponechá ochladnout na teplotu okolí pro získání pevné látky, která byla míchána ve formě kašovité suspenze za teploty okolí po dobu přibližně 14 hodin před filtrací a sušením pro získání sloučeniny z názvu 310,6 g (66,2%) ve formě dihydrátu.

Pokud je použita ve formě farmaceutického přípravku, sloučenina podle předloženého vynálezu se obvykle podává ve • 0 0·0 ·

9 · «00 • · • ·	··	«000 0 •	• 0
*	• 0
• ·	•	•	0	•
« · 0		00	•

formě farmaceutické kompozice. Proto se v jiném provedení předložený vynález týká farmaceutických kompozic, obsahující účinné množství N-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu a farmaceuticky přijatelné ředidlo.

Takové kompozice se používají pro inhibicí uvolňování a/nebo syntézy β-amyloidového peptidu, včetně léčení Alzheimerovy nemoci. Předložený vynález proto zahrnuje použití (N)— ( (S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu pro výrobu léčiva pro inhibicí uvolňování a/nebo syntézy amyloidového peptidu a konkrétně pro léčbu Alzheimerovy nemoci.

(N)-((S)-2-Hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on může být podáván řadou způsobů. Sloučenina může být podávána v libovolné formě nebo módu, ve kerých je sloučenina biologicky dostupná v účinném množství, včetně cesty orální a parenterální. Například může být sloučenina podávána orálně, inhalací, subkutánnš, intramuskulárně, intravenózně, transdermálně, intranasálně, rektálně, okulárně, topicky, sublingválně, bukálně a podobně.

Při výrobě kompozic podle předloženého vynálezu se účinná složka obvykle míchá s excipientem, ředí excipientem nebo uzavírá v takovém nosiči, který může být ve formě kapsle, sáčku, papíru nebo dalšího obalu. Sloučenina podle

·· ···« předloženého vynálezu může být podávána samotná nebo ve formě farmaceutické kompozice, to znamená zkombinována s farmaceuticky přijatelnými ředidly, jako jsou nosiče nebo excipienty, jejichž proporce a povaha jsou určeny rozpustností a chemickými vlastnostmi sloučeniny, zvoleným způsobem podávání a standardní farmaceutickou praxí. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, Mack Publishing Co. (1990)).

Farmaceutické kompozice se připraví způsoby dobře známými ve farmaceutickém oboru. Nosič nebo excipient může být pevný, polotuhý nebo kapalný materiál, který může sloužit jako vehikulum nebo médium pro účinnou složku. Vhodné nosiče nebo excipienty jsou dobře známy v oboru. Farmaceutická kompozice může být upravena pro orální použití, inhalace, parenterální nebo topické podávání a může být podávána pacientovi ve formě tablet, kapslí, aerosolů, inhalantů, čípeků, roztoků, suspenzí a podobně.

Pro účely orálního terapeutického podávání může sloučenina být zabudována do excipientů a použita ve formě tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzí, sirupů, oplatek, žvýkaček a podobné.

Tyto přípravky by měly obsahovat alespoň 4% sloučeniny podle předloženého vynálezu, účinné složky, ale množství sloučeniny se může měnit v závislosti na konkrétní formě a může být výhodně mezi 2% až přibližně 90% hmotnosti jednotky. Množství sloučeniny přítomné v kompozici je takové, že se získá vhodná dávka. Výhodné kompozice a • 999 ·· ·»·· 99 ···* ©· · · · · · · φ • ♦ · * 9 · 9 Ο • * 9 9 9 » «99 φ ·· · 9 · 9··· ··> · ·· » 94» 99 přípravky podle předloženého vynálezu mohou být určeny odborníkem v oboru.

Tablety, pilulky, kapsle, pastilky a podobné mohou také obsahovat jeden nebo více z následujících adjuvans: vazebná činidla jako je mikrokrystalická celulóza, tragakant nebo želatina; excipienty jako je škrob nebo laktóza, desintegranty jako je kyselina alginová, Primogel, kukuřičný škrob a podobně; lubrikanty jako je stearát hořečnatý, silikonový olej nebo Sterotex; glidanty jako je koloidní oxid křemičitý; a mohou být přidána sladidla jako je sacharóza nebo sacharin nebo chuťová činidla jako je pepermint, methylsalicylát nebo pometančová příchuť. Pokud dávková jednotka tvoří kapsli, může obsahovat kromě výše uvedených materiálů ještě kapalný nosič jako je polyethylenglykol nebo mastný olej. Jiné dávkové jednotky obsahují další různé materiály, které modifikují fyzikální formu dávkové jednotky, například jako povlaky. Tablety nebo pilulky proto mohou být povlečeny cukrem, šelakem nebo dalšími činidly. Sirup může obsahovat kromě účinné sloučeniny sacharózu jako sladidlo a jistá konzervační činidla, barviva a chuťová činidla. Materiály použité pro přípravu těchto různých kompozic by měly být farmaceuticky čisté a netoxické v použitém množství.

Po účely parenterálního podávání mohou sloučeniny podle předloženého vynálezu být ve formě roztoku nebo suspenze. Tyto přípravky typicky obsahují alespoň 0,1% sloučeniny podle předloženého vynálezu, ale mohou být obsahovat množství od 0,1 do přibližně 90% hmotn. Množství sloučeniny přítomné v takových kompozicích je takové, které umožní získat vhodnou dávku. Roztoky nebo suspenze také obshovat jeden nebo více následujících adjuvans: sterilní ředidla jako je voda pro injekce, solný roztok, fixované oleje, polyethylenglykoly, glycerin, propylenglykol nebo další syntetická rozpouštědla; antibakteriální činidla jako je benzylalkohol nebo methylparaben; antioxidanty jako je kyselina askorbicová nebo hydrogensiřičitan sodný; chelační činidla jako je kyselina ethylendiamintetraoctová; pufry jako jsou acetáty, citráty nebo fosfáty a činidla pro úpravu tonicity jako je chlorid sodný nebo dextróza. Parenterální přípravek může být uzavřen v ampuli, stříkačce na jedno použití nebo nádobce s více dávkami, vyrobené ze skla nebo plastu. Výhodné kompozice a přípravky mohou být určeny odborníkem v oboru.

Sloučenina podle předloženého vynálezu může také být podávána topicky a pokud je tomu tak, nosič může obsahovat roztok, mast nebo gelovou bázi. Báze mohou například obsahovat jednu nebo více z následujících látek: petrolátum, lanolin, polyethylenglykoly, včelí vosk, minerální olej, ředidla jako je voda a alkohol a emulzifikátory a stabilizátory. Topické přípravky mohou obsahovat koncentraci sloučeniny obecného vzorce I nebo její farmaceutické soli přibližně 0,1 až přibližně 10% hmot./obj. (hmotnost na jednotku objemu).

Další výhodné přípravky podle předloženého vynálezu používají transdermální podávači zařízení (náplasti). Takové transdermální náplasti mohou být použity pro získání kontinuální nebo diskontinuální infúze sloučeniny podle předloženého vynálezu v kontrolovaných množstvích. Konstrukce a použití transdermálních náplastí pro podávánáí farmaceutických činidel je dobře známa v oboru. Viz například U.S. Patent 5,023,252, vydaný 11. června 1991, uvedený jako reference. Takové transdermální náplasti mohou být konstruovány pro kontinuální a nárazové podávání farmaceutických činidel nebo pro podávání v případě potřeby.

Pro další ilustraci předloženého vynálezu jsou dále uvedeny typické farmaceutické kompozice. Tyto příklady jsou pouze ilustrativní a nejsou zamýšleny jako jakékoli omezení rozsahu předmětu předloženého vynálezu.

Příklad přípravku 1

Připraví se tvrdé želatinové kapsle, obsahující následující složky:

Složka Množství (mg/kapsle)

Účinná složka 30,0

Škrob 305,0

Stearát hořečnatý 5,0

Výše uvedené složky se smíchají a plní do tvrdých želatinových kapslí v množství 340 mg.

Příklad přípravku 2

Tablety se připraví použitím následujících složek:

Složka

Účinná složka

Celulóza, mikrokrystalická Koloidní oxid křemičitý Kyselina stearová

Složkas se smíchají a lisují hmotnosti 240 mg.

Množství (mg/tabletu)

25,0

200,0

10,0

5,0 pro vytvoření tablet, každá o

Příklad přípravku 3

Vyrobí se suchý práškový inhalační přípravek obsahující následující složky:

Složka

Účinná složka

Laktóza

Účinná složka se smíchá inhalačního přístroje pro

Příklad přípravku 4 Tablety, každá obsahující následujícím způsobem:

Složka

Účinná složka

Škrob

Mikrokrystalická celulóza

Polyvinylpyrrolidon (jako 10% roztok ve sterií

Hmotnost % s laktózou a směs se přidá do suchý prášek.

mg účinné složky, se připraví

Množství (mg/tabletu) 30,0 mg 45,0 mg 35,0 mg ní vodě) 4,0 mg

Sodná sůl karboxymethyl škrobu	4,5	mg
Stearát hořečnatý	0,5	mg
Mastek	1,0	mg
Celkově	120	mg

Účinná složka, škrob a celulóza jsou se prosívají přes síto s velikostí ok 20 U.S. mesh. a důkladně se promící. S výsledným práškem se smíchá roztok polyvinylpyrrolidonu a prosívá se přes síto s velikostí ok 16 U.S. mesh. Takto získané granule se suší za teploty 50 až 60 °C a prosívají přes síto s velikostí ok 16 U.S. mesh. Sodná sůl karboxymethyl škrobu, stearát hořečnatý a mastek, předem prosáté přes síto s velikostí ok 30 U.S. mesh, se potom přidají ke granulím, které se po míchání lisují na tabletovacím stroji pro získání tablet, každá o hmotnosti 150 mg.

Příklad přípravku 5

Kapsle, každá obsahující 40 mg léku, se vyrobí následujícím způsobem:

Složka

Účinná složka Škrob

Stearát hořečnatý

Množství (mg/kapsle) 40,0 mg 109,0 mg

1,0 mg

Celkově

150,0 mg ···· ·· ··♦· tt ···· • · · · · ···· »«·· ·♦ ♦ ·· · ·

Účinná složka, škrob a stearát hořečnatý se smíchají, prosívají přes síto s velikostí ok 20 U.S. mesh a plní do tvrdých želatinových kapslí v množství 150 mg.

Příklad přípravku 6

Čípky, každý obsahující 25 mg účinné složky, se vyrobí následujícím způsobem:

Složka Množství

Účinná složka 5 mg

Glyceridy nasycených mastných kyselin do 2000 mg

Účinná složka se prosívá přes síto s velikostí ok 60 U.S. mesh a suspenduje v glyceridech nasycených mastných kyselin předem roztavených použitím minimálního nutného množství tepla. Směs se vleje do čípkové formy o nominální kapacitě 2,0 g a ponechá ochladnou.

Příklad přípravku 7

Suspenze, každá obsahující 50 mg léku na 5,0 ml, se vyrobí následujícím způsobem:

Složka Množství

Účinná složka 50,0 mg

Xanthanová guma 4,0 mg

Sodná sůl karboxymethylcelulózy (11%) Mikrokrystalická celulóza (89%) 50,0 mg

Sacharóza 1,75 g

Benzoát sodný 10,0 mg

Chuťové činidlo a barvivo q. v.

Čistá voda do 5,0 ml

Účinná složka, sacharóza a xanthanová guma se smíchají, prosívají přes síto s velikostí ok 10 U.S. mesh a potom smíchají s předem vyrobeným roztokem mikrokrystalické celulózy a sodné soli karboxymethylcelulózy ve vodě. Benzoát sodný, chuťové činidlo a barvivo se zředí částí vody a za míchání přidají. Dostatek vody se potom přidá pro dosažení požadovaného objemu.

Příklad přípravku 8

Kapsle, každá obsahující 15 mg léku, se vyrobí následujícím způsobem:

Složka

Účinná složka Škrob

Stearát hořečnatý Celkové

Množství (mg/kapsle)

15,0 mg

407,0 mg

3,0 mq

425,0 mg

Účinná složka, škrob a stearát hořečnatý se smíchají, prosívají přes síto s velikostí ok 20 U.S. mesh a plní do tvrdých želatinových kapslí v množství 560 mg.

Příklad přípravku 9

Subkutánní přípravek může být připraven následujícím způsobem:

Složka Množství

Účinná složka 1,0 mg

Kukuřičný olej 1 ml

V závislosti na rozpustnosti účinné složky v kukuřičném oleji může být použito přibližně 5,0 mg nebo více účinné složky (je-li to požadováno).

Příklad přípravku 10

Topický přípravek může být připraven následujícím způsobem:

Složka Množství

Účinná složka 1-10 g

Emulzifikační vosk 30 g

Kapalný parafín 20 g

Bílý měkký parafín do 100 g

Bílý měkký parafín se zahřívá do roztavení. Kapalný parafín a emulzifikační vosk se přidají a míchají do rozpuštění. Účinná složka se přidá a míchá dokud nevznikne disperze. Směs se potom ochladí do ztuhnutí.

V jednom ze svých způsobů se předložený vynález týká způsobu inhibice uvolňování a/nebo syntézy β-amyloidového peptidu, zahrnujícího podávání pacientovi, který má jeho potřebu, účinného množství (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu. V konkrétním způsobu provedení se předložený vynález týká způsobu léčení Alzheimerovy nemoci, zahrnujícího podávání pacientovi, který má jeho potřebu, účinného množství (N)—((S)—2— hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu.

Je známo, že odborník v oboru může ovlivnit Alzheimerovu nemoc léčením pacienta postiženého onemocněním nebo profylakticky ošetřovat pacienta s rizikem vývinu onemocnění. Výrazy léčení a léčba jsou míněny tak, že se týkají všech způsobů, ve kterých může být zpomalen, přerušen, zbrzděn, řízen nebo zastaven postup Alzheimerovy nemoci, ale nemusí nutně znamenat úplné odstranění všech symptomů. Jako takové způsoby zahrnují prevenci nástupu Alzheimerovy nemoci u pacienta s rizikem vývinu Alzheimerovy nemoci, inhibici postupu Alzheimerovy nemoci a léčení pokročilé Alzheimerovy nemoci.

Jak je zde používán, výraz pacient znamená teplokrevného živočicha, jako je savec, který je postižen poruchou, související s vzrůstem uvolňování a/nebo syntézy βamyloidového peptidu, včetně Alzheimerovy nemoci. Příklady takových živočichů zahrnují křečky, psy, kočky, krysy, myši, koně, hovězí dobytek, ovce a člověka. Pacienti, kteří mají potřebu takového léčení, se snadno diagnostikují.

Jak je zde používán, výraz účinné množství sloučeniny obecného vzorce I znamená množství, které je účinné pro inhibici uvolňování a/nebo syntézy β-amyloidového peptidu a specificky pro léčení Alzheimerovy nemoci.

«· MM

Účinné množství může být snadno určeno ošetřujícím lékařem provádějícím diagnózu, jako odborníkem v oboru, použitím obvyklých technik a pozorováním výsledků dosažených za analogických okolností. Při určování účinného množství, dávky N-((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)(S) -l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2onu, musí být ošetřujícím lékařem provádějícím diagnózu vzata v úvahu řada faktorů, včetně ale neomezujícím způsobem: síly a vlastností N-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu; druhu pacienta; jeho velikosti, věku a obecného zdravotního stavu; stupně pokročilosti nebo závažnosti onemocnění; odezvy individuálního pacienta; způsobu podávání; vlastností podávaných přípravků, týkajících se biologické dostupnosti; zvoleného dávkového režimu; použití dalších současně podávaných léků; a další relevantní okolnosti.

hmotnosti denně Výhodná množství

Účinné množství N-((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu je obvykle v rozsahu od přibližně 0,1 miligramu na jeden kilogram tělesné (mg/kg/den) do přibližně 100 mg/kg/den mohou být snadno určena odborníkem v oboru. Předpokládá se, že účinné množství N-((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on anhydrátu je v rozmezí od přibližně 0,1 miligramu na jeden kilogram tělesné (mg/kg/den) do přibližně 100 mg/kg/den mohou být určena odborníkem v oboru.

hmotnosti denně Výhodná množství • »· ·

9999

Anhydrát N-((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2onu podle předloženého vynálezu může být testován v různých biologických systémech které zahrnují následující systémy.

Příklad A

Buněčné třídění pro detekci inhibitorů tvorby amyloidu

Řada sloučenin obecného vzorce I uvedeného výše byla testována na jejich schopnost inhibovat tvorbu β-amyloidu v buněčných liniích obsahujících švédskou mutaci. Tento test používá buněk (K293 = lidská ledvinová buněčná linie), které byly stabilně transfektovány genem pro amyloidový prekursorový protein 751 (APP751) obsahujícím dvojí mutaci Lys65iMet₆52 na Asn₆5iLeu652 (číslování APP751) způsobem popsaným v mezinárodní publikované patentové přihlášce č. 94/10569⁸ a Citron a kol.¹². Tato mutace je obvykle nazývána švédská mutace a buňky, označené jako 293 751 SWE, byly umístěny do 96-jamkových destiček Corning, 2-4 x 10⁴ buněk na jamku v Dulbeccově minimálním esenciálním médiu (Sigma, St. Louis, MO, USA) plus 10% fetální hovězí sérum. Počet buněk je důležitý pro dosažení výsledků ELISA testů na βamyloid v lineárním úseku testu (přibližně 0,2 až 2,5 ng na ml) .

Po inkubaci přes noc za teploty 37 °C v inkubátoru ekvilibrovaném 10% oxidem uhličitým bylo médium odebráno a nahrazeno 200 μΐ na jamku média obsahujícího sloučeninu ♦ ΦΦΦΦ 99 ΦΦ·· ΦΦ Φ··· φφ ΦΦΦ φφφ · • Φ φφφ φφφ φφ ΦΦΦ Φ Φ · Φ

ΦΦΦ Φ φφ Φ φφ ΦΦ obecného vzorce ošetřením a buňky Zásobní roztoky dimethylsulfoxidu použitého pro nepřesáhla 0,5% a

I (lék) po dvouhodinovou periodu před byly inkubovány výše uvedeným způsobem.

léku byly připraveny v 100% tak, že pro konečnou koncentraci léku ošetření koncentrace dimethylsulfoxidu obvykle byla rovna 0,1%.

Na konci periody před ošetřením byla média opět odebrána a nahrazena médiem obsahujícím čerstvý lék jak bylo uvedeno výše a buňky byly inkubovány po další dvě hodiny. Po ošetření byly destičky centrifugovány v přístroji Beckman GPR za 1200 ot./min. po pět minut za teploty okolí na pelet zbytků buněk z média. Z každé jamky bylo 100 μΐ média nebo jeho odpovídajícího zředění přeneseno na destičku ELISA předem pokrytou protilátkou 266 [P. Seubert, Nátuře (1992) 359: 325-327] proti aminokyselinám 13-28 β-amyloidového peptidů, jak je popsáno ve zveřejněné mezinárodní patentové přihlášce č. 94/105698 a uchováváno při teplotě 4 °C přes noc. Test ELISA, používající označenou protilátku 3D6 [P. Seubert, Nátuře (1992) 359: 325-327] proti aminokyselinám 1-5 β-amyloidového peptidů, byl prováděn následující den pro určení množství vytvořeného β-amyloidového peptidů.

Cytotoxické účinky sloučenin byly měřeny modifikací způsobu podle Hansen a kol. K buňkám zbývajícím na destičce s buněčnou kulturou bylo přidáno 25 μΐ zásobního roztoku (5 mg/ml) 3-(4,5-dímethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidu (MTT) (Sigma, St. Louis, MO, USA) na konečnou koncentraci 1 mg/ml. Buňky byly inkubovány za teploty 37 °C • ···· 4· 4449 49 4444

4 4 4 4 9 9 9 4

4 9 4 4 9 9 9

4 · 4 4 4 9 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 9

444 4 44 4 44 44 po jednu hodinu a buněčná aktivita byla zastavena přidáním stejného objemu MTT lýzového pufru (20% hmotn./obj. v dodecylsulfátu sodném v 50% dimethylformamidu, pH 4,7). Úplná extrakce byla dosažena třepáním přes noc za teploty okolí. Rozdíl OD562 a OD650 byl měřen na čtečce mikrodestiček Molecular Device UVmax jako indikátor životnosti buněk.

Výsledky testu ELISA na β-amyloidový peptid byly vyneseny do standardní křivky a vyjádřeny v ng/ml β-amyloidového peptidu. Pro normalizaci na cytotoxicitu byly tyto výsledky děleny výsledky MTT a vyjádřeny procentem výsledků z kontrolního vzorku bez léku. Všechny výsledky jsou střední hodnoty a standardní odchylky alespoň šesti opakovaných testů.

Příklad B

In vivo suprese uvolňování a/nebo syntézy β-amyloidu

Tento příklad ilustruje jak sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být testovány na in vivo supresi uvolňování a/nebo syntézy β-amyloidu. Pro tyto experimenty byly použity 3 až 4 měsíce staré PDAPP myši [Games a kol., (1995) Nátuře 373: 523-527] . V závislosti na tom, která sloučenina byla testována, sloučenina byla obvykle v koncentraci mezi 1 a 10 mg/ml. V důsledku nízké rozpustnosti sloučenin mohou tyto být podávány v různých vehikulech, jako je kukuřičný olej (Safeway, South San Francisco, CA, USA); 10% ethanol v kukuřičném oleji; 250 • »··· ·» ···· ·· ··«· «· ··» 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 99 9 99 99 hydroxypropyl-p-cyklodextrin (Research Biochemicals International, Natick, MA, USA); a karboxymethylcelulóza (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA).

Myši byly subkutánně dávkovány jehlou kalibru 26 a 3 hodiny poté byla zvířata usmrcena narkózou v CO₂ a krev byla odebrána srdeční punkcí použitím tuberkulinové stříkačky/jehly 1 cc 25G 5/8 pokryté roztokem roztok 0,5 M EDTA, pR 8,0. Krev byla uložeua do vakuové zkumavky Routou. Dickinson obsahující EDTA a centrifugována 15 minut při 1500 x g za teploty 5 °C. Mozky myší byly potom odebrány a kůra a hippocampus byly vyjmuty a uloženy na led.

1. Mozkový tst

Pro přípravu tkáně hippocampu a kůry pro testy ELISA byla každá mozková oblast homogenizována v 10 objemech ledově studeného guanidinového pufru (5,0 M guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) použitím motorového hmoždíře Kontes (Fisher, Pittsburgh PA, USA) . Homogenáty byly jemně kolébány na rotující platformě po tři až čtyři hodiny za teploty okolí a uchovávány za teploty -20 °C před měřením množství β-amyloidu.

Mozkové homogenáty byly zředěny 1:10 ledově studeným kaseinovým pufrem [0,25% kasein, fosfátově pufrovaný solný roztok (PBS), 0,05% azid sodný/20 g/ml aprotininu/5 mM EDTA, pH 8,0, 10 g/ml leupeptinu], čímž se snížila konečná koncentrace guanidinu na 0,5 M před centrifugaci při 16000 x g po 20 minut za teploty 4 °C. Vzorky byly dále zředěny,

0« 0000 0 0 000· • · 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 000 0000 optimálního rozmezí ELISA pufru s přidáním 0,5 M β-amyloidové standardy byly připraveny tak, že M guanidin v přítomnosti (BSA).

je-li to nutné, pro dosažení testu, přidáním kaseinového hydrochloridu guanidinu.

(aminokyseliny 1-40 nebo 1-42) konečné složení zahrnovalo 0,5 0,1% hovězího sérového albuminu

Úplný sendvičový test ELISA na β-amyloid, určující βamyloid (aminokyseliny 1-40) i β-amyloid (aminokyseliny 142) sestává ze dvou monoklonálních protilátek (mAb) na βamyloid. Záchytná protilátka 266 [P. Seubert, Nátuře (1992) 359: 325-327] je specifická na aminokyseliny 13-28 βamyloidu. Protilátka 3D6 [Johnson-Wood a kol., PNAS USA (1997) 94: 1550-1555], která je specifická na aminokyseliny 1-5 β-amyloidu, se biotinyluje a slouží jako reportérové protilátka testu. 3D6 biotinylační procedura používá protokol výrobce (Pierce, Rockford, IL, USA) pro NHSbiotinové označování imunoglobulinů s výjimkou, že byl použit 100 mM hydrogenuhličitan sodný, pH 8,5, jako pufr. Protilátka 3D6 nerozpoznává vylučovaný amyloidový prekursorový protein (APP) nebo APP s plnou délkou, ale detekuje pouze typy β-amyloidu s amino-termináiní kyselinou aspartovou. Test má nižší limit citlivosti přibližně 50 pg/ml (11 pM) a nemá křížovou reaktivitu s endogenním myším β-amyloidovým peptidem při koncentracích až do 1 ng/ml.

Konfigurace sendvičového ELISA určující množství β-amyloidu (aminokyseliny 1-42) používá mAb 21F12 [Johnson-Wood a kol., PNAS USA (1997) 94: 1550-1555] (která rozpoznává ·« ··· * · · · • » · * · · · · 19 19 11 119 1 aminokyseliny 33-42 β-amyloidu) jako záchytnou protilátku. Biotinylovaná 3D6 je také reportérovou protilátkou tohoto testu, který má nižší limit citlivosti přibližné 125 pg/ml (28 pM).

Záchytné monoklonální protilátky 266 a 21F12 se nanesou v množství 10 μg/ml do 96-jamkových imunotestovacích destiček (Costar, Cambidge, MA, USA) přes noc za teploty okolí. Destičky se potom odsají a blokují 0,25% lidským sérovým albuminem v PBS pufru po alespoň 1 hodinu za teploty okolí, potom se uchovávají desikované za teploty 4 °C do použití. Destičky se rehydratují promývacím pufrem (Tris-pufrovaný solný roztok, 0,05% Tween 20) před použitím. Vzorky a standardy se přidají na destičky a inkubují přes noc za teploty 4 °C. Destičky se promývají třikrát promývacím pufrem mezi každým krokem pokusu. Biotinylované 3D6, zředěné na 0,5 μg/ml v kaseinovém inkubačním pufru (0,25% kasein, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) se inkubují v jamce po 1 hodinu za teploty okolí. Do jamek se přidá Avidin-HRP (Vector, Burlingame, CA, USA) zředěný na 1:4000 v kaseinovém inkubačním pufru na 1 hodinu za teploty okolí. Přidá se kolorimetrický substrát, Slow TMB-ELISA (Pierce, Cambridge, MA, USA) a ponechá se reagovat po 15 minut, potom se enzymatická reakce zastaví přidáním 2N H2SO4. Reakčni produkt se kvantifikuje použitím přístroje Molecular Devices Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA) měřící rozdíl absorbce na vlnových délkách 450 nm a 650 nm.

9999 ·· 9999 ·· ···· • 9 9 9 9 »99 ·

9 999 999

9« 9 9 9 9 99* 9 *99 9999 «99 9 99 9 99 99

2. Krevní test

EDTA plasma se zředí 1: 1 ve vzorkovém ředidle (0,2 gm/1 fosforečnan sodný * H₂O (monobázický) , 2,16 gm/1 fosforečnan sodný * 7H₂O (dibázický) , 0,5 gm/1 thimerosal, 8,5 gm/1 chlorid sodný, 0,5 ml Triton X-405, 6,0 g/1 hovězí sérvý sérum albumin prostý globulinu; a voda). Vzorky a standardy ve vzorkovém ředidle se testují použitím úplného β-amyloidového testu (266 záchytná/ 3D6 reportérové) popsaného výše pro mozkový tst s výjimkou, že vzorkové ředidlo bylo použito namísto kaseinových ředidel popsaných výše.

Z výše uvedeného popisu jsou odborníkovi v oboru zřejmé různé modifikace a změny popisovaných složení a způsobů. Všechny takové modifikace spadající do rozsahu přiložených patentových nároků spadají do rozsahu předloženého vynálezu.

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina (N)-((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(Lalaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-on.
2. 2. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje (N)-((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on a farmaceuticky přijatelné ředidlo.
3. 3. Způsob inhibice uvolňování a/nebo syntézy β-amyloidového peptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi, který má jeho potřebu, účinného množství (N)— ((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-on.
4. 4. Způsob léčení Alzheimerovy nemoci, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi, který má jeho potřebu, účinného množství (N)-((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6, 7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu.
5. 5. Způsob prevence Alzheimerovy nemoci, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi, který má jeho potřebu, účinného množství (N)-((S)-2-hydroxy-3-methyl-butyryl)-1(L-alaninyl)-(S)-l-amino-3-methyl-4,5,6,7-tetrahydro-2H-3benzazepin-2-onu.

   • ·<*· • 9 «V·· 9» • 9 9 9 • 9 9 C • 9 9 9 « • 9 • 9 9 9 9 9 9 • 9 9 • 9 9 9 9 « • 99 · • 9 9 9 9 9 9
6. 6. Způsob inhibice postupu Alzheimerovy nemoci, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi, který má jeho potřebu, účinného množství (N)-((S)-2-hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-4,5,6,7tetrahydro-2H-3-benzazepin-2-onu.
7. 7. Sloučenina podle nároku 1 pro použití jako léčivo.

   8. Sloučenina podle Alzheimerovy nemoci. nároku 1 pro použití pro léčení 9. Sloučenina podle Alzheimerovy nemoci. nároku 1 pro použití pro prevenci 10. Sloučenina podle nároku 1 pro použití při uvolňování a/nebo syntézy β-amyloidového peptidu. inhibici 11. Sloučenina podle nároku 1 pro použití při inhibici

   postupu Alzheimerovy nemoci.
8. 12. Použití sloučeniny podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro inhibici uvolňování a/nebo syntézy β-amyloidového peptidu, včetně léčby Alzheimerovy nemoci.
9. 13. Použití sloučeniny podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro prevenci Alzheimerovy nemoci a/nebo inhibici postupu Alzheimerovy nemoci.