DE60126132T2

DE60126132T2 - Lactamverbindung zur hemmung der freisetzung oder der synthese von beta-amyloidpeptid

Info

Publication number: DE60126132T2
Application number: DE60126132T
Authority: DE
Inventors: Edmund James Zionsville AUDIA; Varghese South San Francisco JOHN; H. Lee Oakland LATIMER; Leigh Stacey Martinsville MCDANIEL; Scott Jeffrey Indianapolis NISSEN; D. Eugene Moss Beach THORSETT; S. Jay Belmont TUNG
Original assignee: Elan Pharmaceuticals LLC; Eli Lilly and Co
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC; Eli Lilly and Co
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2001-11-05
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2021-11-06
Also published as: CZ20031351A3; EA200300580A1; CY1106366T1; MXPA03004292A; NO20032236L; PE20020802A1; IL155960A; SK5592003A3; WO2002047671A2; HRP20030383B1; HU228117B1; ES2278804T3; TWI305204B; HK1059731A1; NO324324B1; PL212199B1; EP1341531B1; DE60126132D1; NZ525854A; SI1341531T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der pharmazeutischen und organischen Chemie und beschäftigt sich mit einer Verbindung, die die β-Amyloidpeptidfreisetzung und/oder dessen Synthese hemmt.
Hintergrund der Erfindung
Bestimmte Lactame, die die β-Amyloidpeptidfreisetzung und/oder dessen Synthese hemmen und somit zur Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung brauchbar sind, sind in der PCT Anmeldung US97/22986 beschrieben.
Die erfindungsgemäße Verbindung (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on ist zur Hemmung der β-Amyloidpeptidfreisetzung und/oder dessen Synthese brauchbar und demnach zur Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung brauchbar und hat vorteilhafte Wirksamkeits- und Sicherheitseigenschaften.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung liefert die Verbindung (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on.
In einer ihrer Aspekte betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der β-Amyloidpeptidfreisetzung und/oder dessen Synthese, das die Verabreichung einer wirksamen Menge an (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on an einen Patienten umfasst, der dessen bedarf. In einer bestimmten Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung, das die Verabreichung einer wirksamen Menge an (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on an einen Patienten umfasst, der dessen bedarf. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zur Prävention oder Hemmung der Progression der Alzheimerschen Erkrankung, das die Verabreichung einer wirksamen Menge an (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on an einen Patienten umfasst, der dessen bedarf.
In einer anderen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel umfasst. Solche Zusammensetzungen sind zur Hemmung der β-Amyloidpeptidfreisetzung und/oder dessen Synthese brauchbar, einschließlich der Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie hierin verwendet, haben die folgenden Ausdrücke die angegebenen Bedeutungen:
Der Ausdruck "ee" oder "Enantiomerenüberschuss" bezieht sich auf den Prozentsatz, durch den ein Enantiomer, nämlich E₁, im Überschuss in einem Gemisch beider Enantiomere (E₁ + E₂) vorliegt, wie dies durch die Gleichung ((E₁ – E₂) + (E₁ + E₂)) × 100% = ee berechnet wird. Wie dies in der Technik bekannt ist, kann der Enantiomerenüberschuss durch Kapillarelektrophorese und durch chirale HPLC der Verbindungen oder Derivate hiervon bestimmt werden.
Hierin werden die Cahn-Prelog-Ingold Bezeichnungen von (R)- und (S)- und die Bezeichnungen von L- und D- für die Stereochemie in Bezug auf die Isomere von Glycerinaldehyd verwendet, um auf spezifische Isomere Bezug zu nehmen.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann wie im folgenden hergestellt werden. In den folgenden Schemata sind alle Substituenten, falls nichts anderes angegeben ist, wie vorher definiert und alle Reagenzien sind gut bekannt und in der Technik etabliert.
Schema 1
In Schema 1, Schritt 1 wird N-Methylphenethylamin der Formel (1) mit einem geeigneten Bisalkoxycarbonylacetattransferreagenz unter Bildung einer Verbindung der Formel (2) acyliert. N-Methylphenethylamin ist im Handel erhältlich und wird leicht durch die Umsetzung eines 2-Brom- oder 2-Chlorethylbenzols unter Bedingungen, die in der Technik gut bekannt und etabliert sind, mit einem Methylamin umgesetzt. Ein geeignetes Bisalkoxycarbonylacetattransferreagenz ist eines, worin R₄ für C₁-C₄ Alkyl steht und eine Bisalkoxycarbonylacetylgruppe zu den Verbindungen der Formel (1) überführt, wie den Bisalkoxycarbonylessigsäuren und Bisalkoxycarbonylacetylchloriden (siehe Ben-Ishai, Tetrahedron, 43, 439–450 (1987)).
Beispielsweise wird die Verbindung der Formel (1) mit einer geeigneten Bisalkoxycarbonylessigsäure unter Bildung einer Verbindung der Formel (2) zusammengebracht. Solche Kupplungsreagenzien sind in der Peptidsynthese herkömmlich und es können die hierin verwendeten Syntheseverfahren verwendet werden. Beispielsweise können gut bekannte Kupplungsreagenzien, wie Carbodiimide mit oder ohne der Verwendung von gut bekannten Additiven, wie N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxybenzotriazol etc. verwendet werden, um die Acylierung zu vereinfachen. Solche Kupplungsreaktionen verwenden oft eine geeignete Base, um die während der Reaktion gebildete Säure zu fangen. Geeignete Basen umfassen beispielsweise Triethylamin, N,N-Diisopropylethylamin, N-Methylmorpholin und dergleichen. Die Um setzung wird gewöhnlich in einem inerten aprotischen polaren Lösemittel ausgeführt, wie Dimethylformamid, Methylenchlorid, Chloroform, Acetonitril, Tetrahydrofuran und dergleichen. Typischerweise wird die Umsetzung bei Temperaturen von etwa 0°C bis etwa 60°C ausgeführt und erfordert typischerweise etwa 1 bis etwa 24 Stunden. Nachdem die Umsetzung vollständig ist, wird das Produkt der Formel (2) durch herkömmliche Verfahren gewonnen, einschließlich Extraktion, Fällung, Chromatographie, Filtration, Verteilung, Kristallisation und dergleichen.
Alternativ dazu wird beispielsweise die Verbindung der Formel (1) mit einem geeigneten Bisalkoxycarbonylacetylchlorid unter Bildung einer Verbindung der Formel (2) zusammengebracht. Solche Säurechloride werden leicht aus den entsprechenden Säuren durch Verfahren hergestellt, die in der Technik gut bekannt sind, wie durch die Wirkung von Phosphortrichlorid, Phosphoroxychlorid, Phosphorpentachlorid, Thionylchlorid oder Oxalylchlorid mit oder ohne einer kleinen Menge an Dimethylformamid in einem inerten Lösemittel, wie Toluol Methylenchlorid oder Chloroform bei Temperaturen von etwa 0 bis 80°C. Die Umsetzung wird typischerweise für einen Zeitraum ausgeführt, der von 1 Stunde bis 24 Stunden reicht. Das Säurechlorid kann isoliert und gereinigt werden oder kann oft direkt verwendet werden, das heißt ohne Isolierung und/oder Reinigung. Solche Acylierungsreaktionen verwenden gewöhnlich eine geeignete Base, um die während der Reaktion gebildete Säure zu fangen. Geeignete Basen umfassen beispielsweise Pyridin, Triethylamin, N,N-Diisopropylethylamin, N-Methylmorpholin und dergleichen. Die Umsetzung wird im allgemeinen in einem inerten aprotischen polaren Verdünnungsmittel ausgeführt, wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrahydrofuran und dergleichen. Typischerweise wird die Umsetzung bei Temperaturen von etwa –20°C bis etwa 80°C ausgeführt und erfordert typischerweise etwa 1 bis etwa 24 Stunden. Nach der vollständigen Umsetzung wird das Produkt der Formel (2) durch herkömmliche Verfahren gewonnen, einschließlich Extraktion, Fällung, Chromatographie, Filtration, Verteilung, Kristallisation und dergleichen.
In Schema 1, Schritt 2 wird eine Verbindung der Formel (2) unter Bildung einer Verbindung der Formel (3) cyclisiert.
Beispielsweise wird eine Verbindung der Formel (2) mit einer Säure, wie Methansulfonsäure oder Schwefelsäure zusammengebracht. Die Umsetzung wird typischerweise mittels der ausgewählten Säure als Lösemittel ausgeführt. Typischerweise werden die Reaktanden anfänglich bei Temperaturen von etwa –20°C bis etwa 0°C gemischt und können sich dann auf Temperaturen von etwa Umgebungstemperatur bis etwa 60°C erwärmen. Die Cyclisierungsreaktion erfordert typischerweise etwa 12 bis etwa 72 Stunden. Nach der vollständigen Umsetzung wird das Produkt der Formel (2) durch herkömmliche Verfahren gewonnen, einschließlich Extraktion, Fällung, Chromatographie, Filtration, Verteilung, Kristallisation und dergleichen.
In Schema 1, Schritt 3 wird eine Verbindung der Formel (3) unter Bildung einer Verbindung der Formel (4) von den Schutzgruppen befreit.
Die Entfernung solcher Alkoxycarbonylaminschutzgruppen ist gut bekannt und in der Technik anerkannt. Siehe beispielsweise Protecting Groups in Organic Synthesis, Theodara Greene (Erste und zweite Ausgabe, Wiley-Interscience) und Ben-Ishai, Tetrahedron, 43, 439–450 (1987).
Schema 2
In Schema 2, Schritt 1 wird eine geeignete Phenylessigsäure der Formel (5) mit einem geeigneten Acetal der Formel (6) unter Bildung einer Verbindung der Formel (7) gekuppelt. Eine geeignete Phenylessigsäure der Formel (5) ist eine, worin A₂ für eine aktivierte Gruppe steht, beispielsweise -OH, -Cl oder -Br. Ein geeignetes Acetal der Formel (6) ist eines, worin R₅ für ein C₁-C₄ Alkyl steht. Solche Kupplungsreaktionen sind in der Peptidsynthese herkömmlich und die hierin verwendeten Syntheseverfahren können verwendet werden, wie dies in Schema 1, Schritt 1 beschrieben ist.
Die in Schema 2, Schritt 2 gezeigte Kupplung kann auch unter Schotten-Baumann Bedingungen mittels eines Säurehalogenids der Verbindung der Formel (5) und eines geeigneten Acetals der Formel (6) in einem gemischten Lösemittel, wie Methyl, t-Butylether, Ethylacetat, Tetrahydrofuran, Aceton oder Diethylether und Wasser ausgewählt weden. Eine solche Umsetzung wird mittels einer geeigneten Base, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumbicarbonat oder Kaliumbicarbonat ausgeführt. Typischerweise wird die Umsetzung gerührt oder stark geschüttelt und bei Temperaturen von etwa –20°C bis etwa 80°C ausgeführt und erfordert typischerweise etwa 1 bis etwa 24 Stunden. Nach der Vervollständigung der Reaktion wird das Produkt der Formel (7) durch herkömmliche Verfahren gewonnen, einschließlich Extraktion, Fällung, Chromatographie, Filtration, Verteilung, Kristallisation und dergleichen.
In Schema 2, Schritt 2 wird eine Verbindung der Formel (7) unter Bildung einer Verbindung der Formel (8) cyclisiert. Solche Cyclisierungsreaktionen werden in einem Säure, wie Schwefelsäure ausgeführt. Typischerweise wird die Säure als Lösemittel verwendet. Im allgemeinen wird die Umsetzung bei Temperaturen von etwa –20°C bis etwa 150°C ausgeführt und erfordert typischerweise etwa 1 bis etwa 24 Stunden. Nachdem die Umsetzung vollständig ist, wie das Produkt der Formel (8) durch herkömmliche Verfahren gewonnen, einschließlich Extraktion, Fällung, Chromatographie, Filtration, Verteilung, Cyclisierung und dergleichen.
In Schema 2, Schritt 3 wird eine Verbindung der Formel (8) einer Amintransferreaktion unter Bildung einer Verbindung der Formel (9) unterzogen. In Schema 2 ist eine Oximierung gezeigt. Eine solche Oximierung wird durch Zusammenbringen des Enolats einer Verbindung der Formel (8) mit Oximtransferreagenzien erreicht, wie einem Alkylnitritester. Das Enolat einer Verbindung der Formel (8) kann durch Umsetzung der Verbindung (8) mit einer geeigneten Base hergestellt werden, wie Kalium-t-butoxid, Lithiumdiisopropylamid, Lithiumhexamethylsilazid, Natriumhexamethylsilazid, Kaliumhexamethylsilazid und dergleichen. Solche Oximinierungen werden beispielhaft dargestellt von Wheeler et al., Organic Syntheses, Coll. Vol. VI, Seite 840, die die Umsetzung von Isoamylnitrit mit einem Keton unter Bildung des gewünschten Oxims beschreibt. Die Umsetzung wird typischerweise in einem Lösemittel ausgeführt, wie Tetrahydrofuran. Im allgemeinen wird die Umsetzung bei Temperaturen von etwa –20°C bis etwa 50°C ausgeführt und erfordert typischerweise etwa 1 bis etwa 24 Stunden. Nach der vollständigen Umsetzung wird das Produkt der Formel (8) durch herkömmliche Verfahren gewonnen, einschließlich Extraktion, Fällung, Chromatographie, Filtration, Verteilung, Kristallisation und dergleichen.
Alternativ dazu kann eine solche Amintransferreaktion durch das Azid erreicht werden. Ein Azid kann durch die Umsetzung des Enolats einer Verbindung der Formel (8) mit einem Azidtansferreagenz gebildet werden, wie Toluolsulfonylazid und Triisopropylbenzolsulfonylazid. Eine solche Umsetzung ist beispielhaft dargestellt in Evans et al., J. Am. Chem. Soc., 112: 4011–4030 (1990), 41. Die Umsetzung wird typischerweise in einem Lösemittel ausgeführt, wie Tetrahydrofuran. Im allgemeinen wird die Umsetzung bei Temperaturen von etwa –20°C bis etwa 50°C ausgeführt und erfordert typischerweise etwa 1 bis etwa 24 Stunden. Nach der vollständigen Umsetzung wird das Produkt der Formel (8) mit einem Azid anstelle eines Oxims durch herkömmliche Verfahren gewonnen, einschließlich Extraktion, Fällung, Chromatographie, Filtration, Verteilung, Kristallisation und dergleichen.
Wie in Schema 2, Schritt 4 gezeigt, wird ein Oxim zur Verbindung der Formel (4) reduziert. Solche Reduktionen werden durch die Behandlung mit Wasserstoff und einem geeigneten Katalysator erreicht, wie Raney Nickel oder Palladiumkatalysatoren, wie Palladium-auf-Kohle. Die Umsetzung wird typischerweise in einem Lösemittel ausgeführt, wie Tetrahydrofuran, Ethylacetat oder Niederalkoholen, wie Methanol, Ethanol und Isopropanol in Essigsäure, Wasser, wässrigem Ammoniak und dergleichen und Gemischen hiervon. Die Umsetzung wird im allgemeinen bei Wasserstoffdrücken ausgeführt, die von atmosphärischem Druck bis etwa 600 psi (4137 kPa) reichen. Im allgemeinen wird die Umsetzung bei Temperaturen von etwa 20°C bis etwa 100°C ausgeführt und erfordert typischerweise etwa 1 bis etwa 24 Stunden. Nach der vollständigen Umsetzung wird das Produkt der Formel (4) durch herkömmliche Ver fahren gewonnen, einschließlich Extraktion, Fällung, Chromatographie, Filtration, Verteilung, Kristallisation und dergleichen.
Alternativ dazu wird die Azidogruppe reduziert, wenn das Amin über ein Azid transferiert wird. Solche Reduktionen werden durch Hydrierung ausgeführt, wie dies oben beschrieben ist.
Verfahren zur Herstellung von (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on sind in Schema A beschrieben.
Schema A
Das Schema A, Schritt 1 zeigt die stereochemische Auftrennung eines geeigneten Lactams der Formel (4) unter Bildung eines Lactams der Formel (10), das ein im wesentlichen reines (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "im wesentlichen rein" auf die Enantiomerenreinheit von (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann im wesentlichen reines (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on hergestellt werden, das das (S)-Enantiomer umfasst, das zu mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 90%, vor allem mehr als 95%, vor allem größer als 97% vorhanden ist.
Beispielweise kann das (S)-Isomer der Verbindung der Formel (4) durch fraktionierte Kristallisation von Dibenzoyltartrat-, (R)-(–)-d-Camphersulfonsäure- und (D)-(–)-Mandelsäuresalzen aufgetrennt werden. Es wird erwartet, dass eine große Vielzahl an Dibenzoyltartraten für diesen Zweck geeignet ist. Insbesondere sind die Dibenzoylester mit einem para-Substituenten bevorzugt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Wasserstoff, Halogen, C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₄ Alkoxy und Di-p-toluoyltartrat, wobei Di-p-toluoyltartrat bevorzugt ist. Di-p-toluoyl-L-tartrat wird verwendet, um das (S)-Isomer zu erhalten.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren wird die Verbindung der Formel (4) mit der ausgewählten Säure zusammengebracht. Im allgemeinen können etwa 0,4 Moläquivalente bis zu einem großen Überschuss der ausgewählten Säure mit bevorzugterweise etwa 0,4 bis 1,5 Moläquivalenten verwendet werden, wobei etwa 0,5 bis 1,1 Moläquivalente bevorzugter sind.
Das Verfahren wird typischerweise durch die Kristallisation des Säureadditionssalzes aus einer Lösung ausgeführt. Insbesondere sind Niederalkohole, einschließlich Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, Butanol, sek-Butanol, Isobutanol, t-Butanol, Amylalkohol, Isoamylalkohol, t-Amylalkohol, Hexanol, Cyclopentanol und Cyclohexanol geeignet, wobei Methanol, Ethanol und Isopropanol bevorzugt sind. Die Verwendung eines Antilösemittels kann vorteilhaft sein. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Antilösemittel" auf ein Lösemittel, worin das Salz signifikant weniger löslich ist im Vergleich zum Lösemittel. Wenn ein Antilösemittel verwendet wird, ist es vorzugsweise mit dem ausgewählten Lösemittel mischbar. Geeignete Antilösemittel umfassen Ether, wie Diethylether, Methyl-t-butylether und dergleichen und Niederalkylacetate, wie Methylacetat, Ethylacetat, Isopropylacetat, Propylacetat, Isobutylacetat, sek-Butylacetat, Butylacetat, Amylacetat, Isoamylacetat und dergleichen und Alkane, wie Pentan, Hexan, Heptan, Cyclohexan und dergleichen. Wenn das vorliegende Verfahren durch die Kristallisation des aus dem razemischen Gemisch gebildeten Säureadditionssalzes ausgeführt wird, muss bei der Verwendung eines Antilösemittels, darauf geachtet werden, dass eine Kristallisation des unerwünschten diastereomeren Salzes vermieden wird.
Typischerweise wird die Kristallisation bei anfänglichen Temperaturen von etwa 40°C bis zur Rückflusstemperatur der ausgewählten Lösemittel und bei anfänglichen Konzentrationen von etwa 0,05 mol/l bis etwa 0,25 mol/l ausgeführt. Das Gemisch wird dann unter Bildung des Salzes abgekühlt. Das Animpfen kann vorteilhaft sein. Das Rühren des anfänglichen Niederschlags für 4 bis 48 Stunden kann vorteilhaft sein. Vorzugsweise wird die Kristallisationslösung langsam abgekühlt. Die Kristallisation wird am bequemsten auf Temperaturen von Umgebungstemperatur bis etwa –20°C gekühlt. Das Salz kann mittels Techniken gewonnen werden, die in der Technik gut bekannt sind, einschließlich Filtration, Dekantieren, Zentrifugation, Verdampfung, Trocknung und dergleichen. Die Verbindung der Formel (10) kann direkt als Säureadditionssalz der ausgewählten Säure verwendet werden. Alternativ dazu kann die Verbindung der Formel (10) vor der Verwendung als weiteres Säureadditionssalz nach einem Säureaustausch verwendet werden oder kann als Base durch Extraktion unter basischen Bedingungen isoliert werden, wie dies in der Technik gut bekannt ist.
Ein bevorzugtes Verfahren ergibt (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on mit einer im wesentlichen enantiomeren Reinheit durch die Kristallisation von 1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on als Säureadditionssalz einer Säure, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus Di-p-tolyl-L-weinsäure, (R)-(–)-d-Camphersulfonsäure und (D)-(–)-Mandelsäure als dynamischer Prozess in Anwesenheit eines aromatischen Aldehyds. Das dynamische Verfahren hat den Vorteil, dass das 1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on einer Umwandlung zu einem einzelnen Isomer während der Kristallisation unterzogen wird, wobei die Ausbeute verbessert wird und ein Abfallstrom vermieden wird, der ein ungewünschtes Isomer enthält.
Es wird erwartet, dass eine große Vielzahl an aromatischen Aldehyden für den dynamischen Prozess geeignet ist, wobei festgestellt wurde, dass mehrere Aldehyde in der Praxis besonders geeignet sind. Genauer gesagt wurde festgestellt, dass Salicylsäuren bevorzugt sind und Salicylaldehyd, 5-Nitrosalicylaldehyd und 3,5-Dichlorsalicylaldehyd sind im vorliegenden dynamischen Auftrennverfahren bevorzugter.
Demnach wird, wenn das vorliegende Verfahren als dynamische Auftrennung ausgeführt wird, das 1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on mit der ausgewählten Säure in Gegenwart eines aromatischen Aldehyds zusammengebracht. Im allgemeinen werden für die dynamische Auftrennung etwa 0,9 bis 1,2 Moläquivalente an Säure verwendet, wobei 1 Moläquivalent bevorzugt ist. Das aromatische Aldehyd wird im allgemeinen in einer katalytischen Menge verwendet. Typischerweise werden etwa 0,5 bis 0,001 mol/l Äquivalente eines aromatischen Aldehyds verwendet, wobei etwa 0,1 bis etwa 0,01 Moläquivalente bevorzugt sind.
Der dynamische Prozess wird typischerweise in einem Lösemittel ohne einem oben beschriebenen Antilösemittel ausgeführt. Das Gemisch aus 1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on, der ausgewählten Säure und dem aromatischen Aldehyd wird gerührt, um die Umwandlung zum gewünschten Isomer zu erlauben. Im allgemeinen wird diese Umwandlung bei Temperaturen von Umgebungstemperatur bis zur Rückflusstemperatur des Lösemittels ausgeführt. Im allgemeinen erfordert die Umwandlung 6 bis 48 Stunden.
Wie es dem Fachmann bekannt ist, wenn das vorliegende Verfahren als dynamische Auftrennung verwendet wird, kann die Verwendung des Säureadditionssalzes von (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on durch die Anwesenheit einer kleinen Menge eines aromatischen Aldehyds im isolierten Produkt verkompliziert werden. Daher ist es nach der dynamischen Auftrennung bevorzugt, dass das (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on durch Salzaustausch, vorzugsweise als Hydrochloridsalz vor der Verwendung oder der Bildung der Base isoliert wird.
Das Schema A, Schritt 2 zeigt die Kupplungsreaktion eines geeignet aminogeschützten Alanins der Formel PgNH-CHCH₃-C(O)-A und eines geeigneten Lactams der Formel (10). Geeignetes aminogeschütztes Alanin ist eines, worin Pg für eine Aminoschutzgruppe steht, die L-Konfiguration aufweist und A für eine Aktivierungsgruppe steht, beispielsweise -OH oder -Cl, die zur Kupplung mit der Aminogruppe der Verbindung der Formel (10) fähig ist. Solche aminogeschützten Alanine sind für den Fachmann leicht verfügbar.
Die in Reaktionsschema A, Schritt 2 gezeigte Kupplungsreaktion umfasst eine Umsetzung, die herkömmlich für eine Peptidsynthese ausgeführt wird und es können auch die hierin verwendeten Syntheseverfahren verwendet werden. Solche Verfahren sind im Detail in Schema 1, Schritt 1 beschrieben. Das Reaktionsschema A, Schritt 3 zeigt die Schutzgruppenabspaltung an einer Verbindung der Formel (11) unter Bildung einer Verbindung der Formel (12). Solche Schutzgruppenabspaltungen an Aminosäuregruppen sind in der Technik gut bekannt und geschätzt.
Das Reaktionsschema A, Schritt 4 zeigt die Kupplungsreaktion einer geeigneten Verbindung der Formel (13), nämlich (CH₃)₂CH-CHOH-C(O)A₁ und einer Verbindung der Formel (12) unter Bildung einer Verbindung der Formel I. Das S-Isomer der Verbindung der Formel (13) ist im Handel erhältlich und ist in der Technik gut bekannt, einschließlich PCT/US97/22986 vom 22. Dezember 1997. Die in Schritt 3 gezeigte Kupplungsreaktion wird mittels der Säure der Formel (13) (Verbindungen, worin A₁ für -OH steht) oder des hiervon stammenden Säurehalogenids (Verbindungen, worin A₁ für -Cl oder -Br steht) auf eine Weise ausgeführt, wie dies in Schema 1, Schritt 1 beschrieben ist.
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I ist in Schema A, Schritt 5 dargestellt, das die Kupplungsreaktion einer geeigneten Verbindung der Formel (10) und einer geeigneten Verbindung der Formel (14), nämlich (CH₃)₂CH-CHOH-C(O)-NH-CHCH₃-C(O)A₂ unter Bildung einer Verbindung der Formel I zeigt. Eine geeignete Verbindung der Formel (10) ist in Schritt 2 beschrieben. Eine geeignete Verbindung der Formel (14) ist eine, die die Stereochemie aufweist, die im Endprodukt der Formel I gewünscht wird.
Die Verbindungen der Formel (14) werden leicht durch die Kupplung von Carboxy-geschützten Aminosäuren, nämlich H₂N-CHCH₃-C(O)OPg₁ mit Verbindungen der Formel (13) hergestellt, wie dies oben beschrieben ist. Erneut sind solche Kupplungsreaktionen in der Technik gut bekannt und ergeben nach der Schutzgruppenabspaltung eine Verbindung der Formel (14).
Die Verbindung der Formel I kann durch mehrere Techniken isoliert und gereinigt werden, einschließlich Kristallisation. Es können Kristallisations- oder Aufschlämmungstechniken verwendet werden. Insbesondere kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung durch die Kristallisation aus einer Vielzahl an wasserfreien und wässrigen Lösemitteln hergestellt werden. Geeignete Lösemittel sind Aceton, Niederalkohole (wie Methanol, Ethanol und Isopropanol), Essigsäure und Acetonitril mit und ohne Wasser und Ethylacetat, Diethylether und Methyl-t-butylether. In der Praxis wurde festgestellt, dass wässriges Aceton bevorzugt ist. Für ein gegebenes wässriges Lösemittel hängt die Menge an Wasser von der relativen Löslichkeit von (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on in dem Lösemittel im Vergleich zu Wasser ab und ob eine Kristallisations- oder Aufschlämmtechnik verwendet wird.
Es wird im allgemeinen eine Kristallisation durch Lösen von (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on in einem wässrigen Lösemittel und einer anschließenden Abkühlung ohne oder mit Zugabe von mehr Wasser unter Bildung eines Feststoffs ausgeführt. Typischerweise wird die Kristallisation bei Anfangstemperaturen von etwa 40°C bis zur Rückflusstemperatur des ausgewählten wässrigen Lösemittels ausgeführt. Das Gemisch wird dann unter Bildung des kristallinen Dihydrats abgekühlt. Animpfen kann vorteilhaft sein. Vorzugsweise wird die Kristallisationslösung langsam abgekühlt. Die Kristallisation wird am bequemsten auf Temperaturen von Umgebungstemperatur bis etwa –20°C abgekühlt.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele und Präparationen erläutert. Diese Beispiele und Präparationen sind nur erläuternd und sollen die Erfindung auf keine Weise beschränken.
Die in den Beispielen und Präparationen verwendeten Ausdrücke haben ihre normalen Bedeutungen, falls nichts anderes angegeben ist. Beispielsweise bezieht sich "°C" auf Grad Celsius, "mmol" bezieht sich auf Millimol, "g" bezieht sich auf Gramm, "ml" bezieht sich auf Milliliter, "Kochsalzlösung" bezieht sich auf eine gesättigte wässrige Natriumchloridlösung, "THF" bezieht sich auf Tetrahydrofuran, "HPLC" bezieht sich auf Hochdruckflüssigchromatographie etc.
Beispiel 1
Synthese von 1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on
Zu einer Aufschlämmung aus Natriumhydrid (1,1 Äquivalente) in 15 ml trockenem DMF wird 2,3,4,5-Tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (0,0042 mol) als eine Lösung in 10 ml DMF gegeben Methyliodid (etwa 2 Äquivalente) wird dann zugegeben. Nach der Vollständigkeit gemäß TLC wird das Reaktionsgemisch über Eis gegossen und in Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser gefolgt von Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird dann über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird durch HPLC (LC 2000) unter Elution mit einem Ethylacetat/Hexansystem unter Bildung von 3-Methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on gereinigt.
3-Methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (1 Äquivalent) wird in TNF gelöst und Isoamylnitrit (1,2 Äquivalente) wird zugegeben, Das Gemisch wird auf 0°C in einem Eisbad gekühlt. NaHMDS (1,1 Äquivalente, 1 M in THF) wird tropfenweise zugegeben. Nach dem Rühren für 1 Stunde oder bis die Reaktion vollständig ist, wird das Gemisch konzentriert, dann mit 1 N wässriger Chlorwasserstoffsäure angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Portion wird getrocknet und unter Bildung eines rohen Produkts konzentriert, das durch Silicagelchromatographie unter Bildung von 1-Hydroxyimino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on gereinigt wird. Massenspektroskopie (M+H)⁺ 205,1.
1-Hydroxyimino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on wird in EtOH/NH₃ (20:1) gelöst und in einer Bombe mittels Raney Nickel und Wasserstoff (500 psi 3447 kPa) bei 100°C für 10 Stunden hydriert. Das entstehende Gemisch wird filtriert und unter Bildung eines Öls konzentriert, das durch Silicagelchromatographie unter Bildung der Titelverbindung gereinigt wird.
Beispiel 2
Synthese von 1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on
Zu einem 20 l Morton Kolben werden MTBE (5,52 μl, 7 Volumina) und (N-Methylamino)acetaldehyddimethylacetal (614 g, 5 mol) unter Bildung einer Lösung bei Raumtemperatur gegeben. Eine Lösung aus Natriumbicarbonat, die durch Zugabe von Natriumbicarbonat (546 g, 6,5 mol) zu Wasser (6,31 l, 8 Volumina) hergestellt wurde, wird zu dem Mortons Reaktionskolben gegeben. Das Gemisch wird auf weniger als 10°C gekühlt und eine MTBE (789 ml) Lösung aus Phenylacetylchlorid (789 g, 5 mol) wird tropfenweise zu dem gekühlten Reaktionsgemisch über einen Zeitraum von 1 h gegeben. Nach der Zugabe wird das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 1 h gerührt. Zu diesem Zeitpunkt zeigt eine HPLC Analyse an, dass die Reaktion vollständig ist. Eine extraktive Aufarbeitung mit MTBE (4 Volumina), wasserfreiem Magnesiumsulfat gefolgt von einer Konzentration auf einem Rotationsverdampfer ergibt 1,187 kg (98%) an N-Methyl-N-(2,2-dimethoxyethyl)phenylacetamid als Flüssigkeit. (M+H)⁺ = 237,9.
Zu einem 5 l Mortonkolben unter einer starken Stickstoffatmosphäre werden H₂SO₄ (1,42 l) und N-Methyl-N-(2,2-dimethoxyethyl)phenylacetamid (712 g, 3 mol) tropfenweise in den Reaktionskolben gegeben, wobei sich eine Exothermie (22 bis 78°C) entwickelt. Die entstehende Reaktion wird dann für 3 h auf 110°C erhitzt, dann auf Raumtemperatur gekühlt und in einen 20 l Mortonkolben überführt. Bei weniger als 10°C wird das Reaktionsgemisch mit wässrigem Natriumhydroxid (9,18 l, 5 N) gestoppt. Eine extraktive Aufarbeitung mit Ethylacetat (2 × 2,85 l), Trocknen mit Natriumsulfat gefolgt von der Konzentration zu einem Feststoff ergibt 520 g (73,5%) an 3-Methyl-2,3-dihydro-1H-3-benzazepin-2-on als Feststoff. Dieses Material kann aus MTBE für eine zusätzliche Reinheit unter Bildung eines Feststoffs umkristallisiert werden. Smp. = 81–82°C. (M+H)⁺ = 174,2.
Eine THF Lösung (0,5 l) aus 3-Methyl-2,3-dihydro-1H-3-benzazepin-2-on (113,8 g, 0,657 mol) wird auf 0°C gekühlt und Isoamylnitrit (100,75 g, 0,86 mol) wird tropfenweise zugegeben. Zu dem entstehenden Gemisch wird LiHMDS (1 N THF Lösung, 854 ml, 0,854 mol) derartig gegeben, dass die Temperatur unter 10°C bleibt. Nach der Zugabe kann die Reaktion bei Raumtemperatur für 2–3 h stehen, während der Reaktionsfortschritt gemäß HPLC aufgezeichnet wird. Nach der Vollständigkeit der Reaktion wird das Gemisch auf 0°C gekühlt und der pH wird von 12 auf 2–3 mittels wässriger HCl (2 N) eingestellt. Der entstehende Niederschlag wird für 12–16 h gerührt, ehe eine Isolierung durch Filtration und Trocknung 86,3 g (64,9%) an 1-Hydroxyimino-3-methyl-2,3-dihydro-1H-3-benzazepin-2-on ergibt. Smp. = 225–226°C. (M+H)⁺ = 203,0.
Eine Ethanollösung (525 ml) aus 1-Hydroxyimino-3-methyl-2,3-dihydro-1H-3-benzazepin-2-on (35 g, 0,173 mol) wird zu einem Autoklaven zusammen mit Palladium auf Kohle (10%, 3,5 g) als verdünnte HCl Aufschlämmung (konzentriert, wässrig, 17,5 g in 17 ml Wasser) gegeben. Das entstehende Gemisch wird bei 50°C und 250 psi (1723 kPa) hydriert, bis die Reaktion vollständig ist. Das Reaktionsgemisch wird über ein Kissen aus Celite mittels Ethanol als Lösemittel filtriert und das Filtrat wird auf 90 ml konzentriert. Wasser (350 ml) wird zum Konzentrat gegeben und die entstehende Lösung wird weiter auf etwa 200 ml konzentriert. Dichlormethan (350 ml) wird zu der wässrigen Lösung gegeben, ehe der pH auf 11–11,5 mit wässrigem Natriumhydroxid (1 N) eingestellt wird. Die organische Portion wird abgetrennt und die wässrige Portion wird mit Dichlormethan (175 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zu einem Rückstand konzentriert, der während dem Stehen unter Bildung der Titelverbindung kristallisiert. Smp. = 69–81°C. (M+H)⁺ = 191,0.
Beispiel 3
Synthese von 1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on
Zu einem 22 l Morton Kolben werden Dichlormethan (4,73 l, 8 Volumina), N-Methylphenethylamin (591 g, 4,33 mol) und wässriges Natriumbicarbonat (436,7 g, 5,2 mol in 4,73 l Wasser) gegeben. Das Gemisch wird auf weniger als 5°C gekühlt und eine Dichlormethanlösung (887 ml) aus Chloracetylchlorid (513,7 g, 4,55 mol) wird tropfenweise zu dem gekühlten Reaktionsgemisch über einen Zeitraum von 70 min gegeben. Nach der Zugabe zeigt eine HPLC Analyse, dass die Reaktion vollständig ist. Die Phasen werden getrennt und die wässrige Phase wird mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und auf einem Rotationsverdampfer unter Bildung von 915,7 g (99,8%) an N-Methyl-N-(2-phenylethyl)-1-chloracetamid konzentriert. (M+H) = 212,1.
Zu einem 12 l Kolben unter einer Stickstoffatmosphäre werden N-Methyl-N-(2-phenylethyl)-1-chloracetamid (883,3 g, 4,17 mol) und ortho-Dichlorbenzol (6,18 l) gegeben. Aluminiumchlorid (1319 g, 10,13 mol) wird zugegeben, wobei eine Exothermie (22 bis 50°C) entsteht. Die entstehende Reaktion wird dann für 2,5 h auf 165°C erhitzt und dann über etwa 14 Stunden auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wird auf etwa 0°C gekühlt und kaltes Wasser (8,86 l, etwa 5°C) wird in vier Portionen zugegeben, um die Exothermie auf etwa 40°C zu halten. Die Phasen werden getrennt und die wässrige Phase wird mit Dichlormethan (7,07 l) extrahiert und die Phasen werden getrennt. Die organischen Phasen werden vereinigt und mit wässriger Chlorwasserstoffsäure (8,83 l, 1 N) und dann einer gesättigten wässrigen Natriumbicarbonatlösung (7,07 l) extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet, mit Silicagel (883 g) vereinigt und auf eine Säule aus Silicagel (3,53 kg, in einem gesinterten Glastrichter, als Aufschlämmung in Dichlormethan gegeben) aufgetragen. Die Säule wird mit Dichlormethan, bis 25 l gesammelt sind und dann mit Ethylacetat und Bildung des Produkts eluiert. Die das Produkt enthaltende Fraktion wird zu 3-Methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on als hellbrauner Feststoff, 608 g, (83%) eingedampft.
In einen 22 l Kolben unter Stickstoff werden 3-Methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (606 g, 3,46 mol) und Isoamylnitrit (543 g, 4,5 mol) in THF (7,88 l) gegeben. Das Gemisch wird auf etwa 0°C gekühlt, ehe LiHMDS (1 N THF Lösung, 4,5 l, 4,5 mol) so zugegeben wird, dass die Temperatur unter etwa 7°C bleibt. Nach der Zugabe kann die Reaktion bei Raumtemperatur für etwa 2 Stunden stehen, während der Reaktionsfortscxhritt gemäß HPLC aufgezeichnet wird. Nachdem die Reaktion vollständig ist wird das Gemisch auf etwa 0°C gekühlt und der pH wird von 12 auf etwa 2–1 mittels wässriger HCl (2 N) eingestellt: Der entstehende Niederschlag wird für etwa 6 h gerührt, ehe er durch Filtration isoliert und unter Bildung von 1-Hydroxyimino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on, 604 g (85,6%) getrocknet wird.
1-Hydroxyimino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (625 g, 3,06 mol) und 3 A Ethanol (15,6 l), werden gemischt. Das entstehende Gemisch wird bei 50°C und 250 psi (1723 kPa) unter kräftigem Rühren hydriert, bis die Reaktion vollständig ist (etwa 4 Stunden). Das Reaktionsgemisch wird über ein Kissen aus Celite mittels Ethanol als Lösemittel filtriert und das Filtrat wird unter Bildung eines Feststoffs konzentriert. Der Feststoff wird mit Dichlormethan (6 l) behandelt und 1 N wässrige Natriumhydroxidlösung wird zugegeben, bis der pH der wässrigen Phase zwischen 11–11,5 beträgt. Das Gemisch wird gerührt, die Phasen werden getrennt und die wässrige Phase wird mit Dichlormethan (2 l) extrahiert. Die organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und in einem Rotationsverdampfer unter Bildung der Titelverbindung, 477 g (81,9%) eingedampft.
Beispiel 4
Synthese von (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on
1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (1,544 g, 8,12 mmol) wird vorsichtig in 15 ml Methanol unter Bildung einer Lösung erhitzt. In einem anderen Kolben wird Di-p-toluoyl-1-weinsäure (3,12 g, 8,08 mmol) in 15 ml Methanol gelöst und mittels einer Pipette unter Erwärmen eine Aminlösung zugegeben. Das Gemisch wird erhitzt, bis die Feststoffe ausfallen. Zusätzliche 30 ml Methanol werden unter Bildung einer Lösung zugegeben, die für 30–40 Minuten am Rückfluss erhitzt wird und dann langsam auf Umgebungstemperatur unter Bildung eines Feststoffs abgekühlt wird. Nach dem Rüh ren für etwa 18 Stunden wird der Feststoff durch Filtration gesammelt und mit einer kleinen Menge an kaltem Methanol unter Bildung von 2,24 g an (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on-di-p-toluoyl-L-weinsäuresalz (96% Ausbeute, 94,7% ee) gewaschen.
(S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on-di-p-toluoyl-L-weinsäuresalz (11,83 g, 20,5 mmol) wird in 45 ml an wässriger 1,0 N Natriumhydroxidlösung gelöst und mit Methylenchlorid (3 × 25 ml) extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridphasen werden mit 35 ml wässriger 1,0 N Natriumhydroxidlösung und dann Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Das Entfernen des Lösemittels unter Vakuum ergibt die Titelverbindung (3,38 g) als farbloses Öl (87 Ausbeute, 93,2% ee).
Beispiel 5
Synthese von (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on
1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (6,0 g, 31,5 mmol) wird vorsichtig in 75 ml Methanol unter Bildung einer Lösung erhitzt und mit einer Lösung aus Di-p-toluoyl-L-weinsäure (12,2 g, 31,5 mmol) in 75 ml warmem Methanol erhitzt. Die Lösung wird angeimpft und es bildet sich ein Feststoff. Weitere 100 ml Methanol werden zugegeben und das Gemisch kann rühren. Nach dem Rühren für etwa 18 Stunden wird der Feststoff durch Filtration gesammelt und mit einer kleinen Menge an kaltem Methanol unter Bildung von 6,7 g eines Feststoffs gewaschen. Der Feststoff wird mit Methanol (200 ml) vereinigt und gerührt. Nach 18 Stunden wird der Feststoff unter Bildung von (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on-di-p-toluoyl-L-weinsäuresalz (4,4 g) gesammelt. Eine Isolierung der Base durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren ergibt die Titelverbindung (96% ee).
Beispiel 6
Synthese von (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on
In ein 22 l Gefäß wird 1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (438 g, 2,3 mol) unter Stickstoff (etwa 40°C) unter Bildung einer Lösung in Methanol (4,38 ml) erhitzt. In einem anderen Kolben wird Di-p-toluoyl-l-weinsäure (889,7 g, 2,3 mol) in 4,38 l Methanol erhitzt und auf etwa 40°C erhitzt, ehe die Lösung aus 1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on zugegeben wird. Das Erhitzen wird fortgesetzt und weitere 6,13 l Methanol werden zugegeben, ehe das Gemisch für etwa 45 Minuten am Rückfluss erhitzt wird und dann langsam auf Umgebungstemperatur unter Bildung eines Feststoffs gekühlt wird. Nach dem Rühren für etwa 18 Stunden wird der Feststoff durch Filtration gesammelt und mit einer kleinen Menge der Mutterlaugen gewaschen und nach dem Lufttrocknen mit etwa 2 l Ethylacetat unter Bildung von 561,6 g an (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on-di-p-toluoyl-L-weinsäuresalz gewaschen. (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on-di-p-toluoyl-L-weinsäuresalz, Dichlormethan (6,57 l) und 1 N wässrige Natriumhydroxidlösung (6,57 l) werden vereinigt und gerührt. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase wird zweimal mit 1 N wässriger Natriumhydroxidlösung (3,281) und einmal mit Kochsalzlösung (2,46 l) gewaschen, ehe über Magnesiumsulfat getrocknet wird, filtriert wird und auf einem Rotationsverdampfer unter Bildung der Titelverbindung 250 g (57,4%, 94,1% ee) eingedampft wird.
Beispiel 7
Synthese von (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on-chlorwasserstoffsäure
1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (31,9 g, 168 mmol) wird in etwa 300 ml Isopropylacetat aufgeschlämmt und auf 45°C erhitzt. In einen separaten Kolben wird (R)-(–)-D-Mandelsäure (25,0 g, 164 mmol) in etwa 130 ml Isopropylalkohol erhitzt, bis sich eine Lösung bildet und wird zu der oben erhaltenen 1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on/Isopropylacetataufschlämmung unter Bildung einer Lösung gegeben, aus der sich schnell ein Niederschlag bildet. Das Gemisch wird bei 45°C für etwa 3 Stunden gerührt. 5-Nitrosalicylaldehyd-(2-hydroxy-5-nitrobenzaldehyd) (1,40 g, 8,38 mmol, 5 Molprozent) wird zu der warmen Lösung gegeben und das Gemisch wird bei 45°C gerührt. Nach etwa 14 Stunden wird die Aufschlämmung auf Umgebungstemperatur gekühlt und für 2 Stunden gerührt, ehe die Feststoffe durch Filtration gesammelt und mit 70 ml kaltem Isopropylacetat gewaschen werden und sie werden im Vakuumofen bei 40°C unter Bildung von 46,62 g an (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (R)-mandelsäuresalz (82,9% Ausbeute, 98,4% ee) getrocknet.
(S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (R)-mandelsäuresalz (2,42 g, 7,06 mmol, 98,4% ee) wird in 25 ml Ethylacetat bei Umgebungstemperatur aufgeschlämmt. Konzentrierte wässrige Chlorwasserstoffsäure (1,1 ml, etwa 11,2 mmol) wird zugegeben und das Gemisch wird unter kräftigem Rühren für 3,5 Stunden auf 50°C erhitzt. Die Aufschlämmung wird auf Umgebungstemperatur gekühlt, filtriert und mit Methyl-t-butylether (etwa 10 ml) unter Bildung von 1,48 g der Titelverbindung (92,5% Ausbeute; 97,9% ee) gewaschen.
Beispiel 8
Synthese von (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on
Ein Rundbodenkolben wird mit N-t-Boc-L-alanin (1,0 Äquivalente), Hydroxybenzotriazolhydrat (etwa 1,1 Äquivalente) und (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (1,0 Äquivalente) in THF unter einer Stickstoffatmosphäre beladen. Hunig's Base (N,N-Diisopropylethylamin, 1,1 Äquivalente) wird zu dem gut gerührten Gemisch gefolgt von EDC (1,1 Äquivalente) gegeben. Nach dem Rühren von 4 bis 17 Stunden bei Umgebungstemperatur wird das Lösemittel bei verringertem Druck entfernt und der Rückstand wird in Ethylacetat und Wasser aufgenommen und mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung, 1 N wässrigem HCl und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel wird bei verringertem Druck unter Bildung von 1-(N-t-Boc-L-alaninyl)amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on gereinigt. Massenspektroskopie (M+H)⁺ 362,3.
Ein Strom an wasserfreiem HCl Gas wird durch eine gerührte Lösung aus 1-(N-t-Boc-L-alaninyl)amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on in 1,4-Dioxan (0,03–0,09 M) gegeben und in einem Eisbad auf etwa 10°C unter NZ für 10–15 Minuten abgekühlt. Die Lösung wird verschlossen, dann wird das Kühlbad entfernt und die Lösung kann sich unter Rühren für 2–8 Stunden auf Umgebungstemperatur erwärmen, wobei 1,0 gemäß TLC für den Verbrauch des Ausgangsmaterials beobachtet wird. Die Lösung wird unter Bildung von 1-(L-Alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on konzentriert, das ohne weitere Reinigung verwendet wird.
1-(L-Alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-3-methyl-1H-3-benzazepin-2-on (1,0 Äquivalente), Hydroxybenzotriazolhydrat (1,1 Äquivalente) und (S)-2-Hydroxy-3-methylbuttersäure (1,0 Äquivalente) in THF werden unter Stickstoffatmosphäre gemischt. Hunig's Base (N,N-Diisopropylethylamin, 1,1 Äquivalente) wird zu dem gut gerührten Gemisch gefolgt von EDC (1,1 Äquivalente) gegeben. Nach dem Rühren für 4 bis 17 Stunden bei Umgebungstemperatur wird das Lösemittel bei verringertem Druck entfernt, der Rückstand wird in Ethylacetat (oder einem ähnlichen Lösemittel) und Wasser aufgenommen, mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung, 1 N HCl und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel wird bei verringertem Druck unter Bildung der Titelverbindung entfernt.
Beispiel 9
Synthese von (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on
Ein Rundbodenkolben wird mit N-t-Boc-L-alanin (249,5 g, 1,32 mol), Hydroxybenzotriazolhydrat (232,2 g, 1,52 mol) und (S)-1-Amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (250,8 g, 1,32 mol) in THF (3,76 l) unter Stickstoffatmosphäre behandelt. Das Gemisch wird auf weniger als 5°C gekühlt, ehe Hunig's Base (N,N-Diisopropylethylamin, 188,4 g, 1,45 mol) gefolgt von EDC (283,7 g, 1,45 mol) zugegeben wird. Nach dem Rühren für 6 Stunden wird das Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur erwärmt und für etwa 14 Stunden gerührt. Das Lösemittel wird bei verringertem Druck entfernt und der Rückstand wird in Ethylacetat (3,76 l) und Wasser (1,76 l) aufgenommen, die Phasen werden getrennt, die organische Phase wird mit Wasser (1,76 l) extrahiert, die wässrigen Phasen werden vereinigt und mit Ethylacetat (1,76 l) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung (1,76 l) extrahiert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und auf einem Rotationsverdampfer unter Bildung von 1-(N-t-Boc-L-alaninyl)amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on, 463 g (97,2%) eingedampft.
Eine Ethylacetatlösung aus HCl wird hergestellt, indem man wasserfreies HCl Gas, mittels eines Dispersionsröhrchens unter der Oberfläche durch Ethylacetat (1,76 l), das auf etwa 0°C gekühlt ist, gibt. Die oben aus HCl hergestellte Ethylacetatlösung wird zu einer kräftig gerührten Aufschlämmung aus 1-(N-t-Boc-L-alaninyl)amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (462 g, 1,28 mol) in Ethylacetat (3,7 l) gegeben. Eine weitere Menge an Ethylacetat (1 l) wird zugegeben und das Reaktionsgemisch kann sich auf Raumtemperatur erwärmen und wird für 22 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter Bildung eines Feststoffs filtriert. Der Feststoff wird mit Acetonitril (5 l) aufgeschlämmt, am Rückfluss erhitzt und dann auf etwa 60°C gekühlt, ehe filtriert und unter Bildung von 1-(L-Alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on, 389,8 g (94,7%) getrocknet wird.
1-(L-Alaninyl)-(S)-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-3-methyl-1H-3-benzazepin-2-on (369,5 g, 1,18 mol), Hydroxybenzotriazolhydrat (207,6 g, 1,36 mol), Hunig's Base (N,N-Diisopropylethylamin, 352,2 g, 2,71 mol) und (S)-2-Hydroxy-3-methyl-buttersäure (140,6 g, 1,18 mol) in THF (4,8 l) werden unter einer Stickstoffatmosphäre vereinigt und auf weniger als 5°C gekühlt. EDC (253,7 g, 1,3 mol) wird zugegeben und das Reaktionsgemisch kann sich auf Umgebungstemperatur erwärmen und rühren. Nach etwa 25 Stunden wird das Reaktionsgemisch mit Dichlormethan (5,54 l) verdünnt und mit Wasser (2,22 l) extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser (2,22 l) extrahiert, die wässrigen Phasen werden vereinigt und mit Dichlormethan (5,54 l) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, zweimal mit Wasser (2,22 l) und mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung (2,22 l) extrahiert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und auf einem Rotationsverdampfer unter Bildung eines Feststoffs, 428 g (100%) eingedampft. Der Feststoff wird in einem Lösemittelgemisch, das Aceton (3,42 l) und Wasser (0,856 l) enthält unter leichtem Erwärmen (40°C) aufgenommen. Die Lösung wird in ~2 l Portionen aufgeteilt und es wird jeweils Wasser (7,19 l) zugegeben, während die trübe Lösung auf 50°C erwärmt wird. Nach der vollständigen Zugabe von Wasser kann die trübe Lösung sich für etwa 14 Stunden auf Umgebungstemperatur erwärmen, ehe sie filtriert und unter Bildung der Titelverbindung, 310,6 g (66,2%) als deren Dihydrat getrocknet wird.
Wenn sie als Pharmazeutikum verwendet wird, wird die vorliegende Erfindung gewöhnlich in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht. In einer weiteren Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge an (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel enthalten. Solche Zusammensetzungen werden zur Hemmung der β-Amyloidpeptidfreisetzung und/oder dessen Synthese verwendet, einschließlich der Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung. Daher umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung des β-Amyloidpeptidfreisetzung und/oder dessen Synthese und umfasst spezifisch die Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung.
(N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on kann durch eine Vielzahl an Wegen verabreicht werden. Die vorliegende Verbindung kann in jeder Form oder Art verabreicht werden, die die Verbindung in einer wirksamen Menge bioverfügbar macht, einschließlich orale und parenterale Wege. Beispielsweise kann die vorliegende Verbindung oral, durch Inhalation, subkutan, intramuskulär, intravenös, transdermal, intranasal, rektal, okular, topisch, sublingual, bukkal und dergleichen verabreicht werden.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wird der Wirkstoff gewöhnlich mit einem Hilfsstoff gemischt, mit einem Hilfsstoff verdünnt oder in einem solchen Träger eingeschlossen, der in Form einer Kapsel, eines Sachets, Papiers oder anderen Behälters vorliegen kann. Die erfindungsgemäße Verbindung kann alleine oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, das heißt mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln kombiniert werden, wie Trägern oder Hilfsstoffen, wobei der Anteil und die Art hiervon durch die Löslichkeit und die chemischen Eigenschaften der vorliegenden Verbindung, den gewählten Verabreichungsweg und pharmazeutischer Standardpraxis bestimmt werden. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Mack Publishing Co. (1990)).
Die vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzungen werden auf eine in der pharmazeutischen Technik gut bekannte Weise hergestellt. Der Träger oder der Hilfsstoff kann ein festes, halbfestes oder flüssiges Material sein, das als Vehikel oder Medium für den Wirkstoff dient. Geeignete Träger oder Hilfsstoffe sind in der Technik gut bekannt. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur oralen, inhalativen, parenteralen oder topischen Verwendung angepasst werden und kann in Form von Tabletten, Kapseln, Aerosolen, Inhalationsmitteln, Zäpfchen, Lösungen, Suspensionen oder dergleichen an den Patienten verabreicht werden.
Für die Zwecke der oralen therapeutischen Verabreichung können die Verbindung mit den Hilfsstoffen verarbeitet werden und in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Obladen, Kaugummis und dergleichen verwendet werden. Diese Präparationen sollten mindestens 4% der erfindungsgemäßen Verbindung, dem Wirkstoff enthalten, aber dies kann in Abhängigkeit der bestimmten Form variieren und kann zwischen 2% bis etwa 90% des Gewichts der Einheit betragen. Die Menge der in den Zusammensetzungen vorhandenen Verbindung ist so groß, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird. Bevorzugte Zusammensetzungen und Präparationen gemäß der vorliegenden Erfindung können durch den Fachmann bestimmt werden.
Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Dragees und dergleichen können auch einen oder mehrere der folgenden Hilfsstoffe enthalten: Bindemittel, wie mikrokristalline Cellulose, Traganthgummi oder Gelatine, Hilfsstoffe, wie Stärke oder Lactose, Zerfallshilfsstoffe, wie Alginsäure, Primogel, Maisstärke und dergleichen, Schmiermittel, wie Magnesiumstearat, Siliconöl oder Sterotex, Gleitmittel, wie kolloidales Siliziumdioxid und Süßstoffe, wie Saccharose oder Saccharin können zugegeben werden oder ein Geschmacksstoff, wie Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangenaroma. Wenn die Dosierungsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu Materialien des obigen Typs einen flüssigen Träger, wie Polyethylenglycol oder ein fettes Öl enthalten. Andere Dosierungsformen können andere verschiedene Materialien enthalten, die die physikalische Form der Dosierungseinheit modifizieren, wie beispielsweise als Beschichtungen. Daher können Tabletten oder Pillen mit Zucker, Schellack oder anderen Beschichtungsmitteln beschichtet werden. Ein Sirup kann zusätzlich zu den vorliegenden Verbindungen Saccharose als Süßstoff und bestimmte Konservierungsstoffe; Farbstoffe und Färbungen und Geschmacksstoffe enthalten. Materialien, die zur Herstellung dieser verschiedenen Zusammensetzungen verwendet werden, sollten pharmazeutisch rein und in den verwendeten Mengen nicht toxisch sein.
Zum Zweck der parenteralen Verabreichung können die erfindungsgemäßen Verbindungen in eine Lösung oder Suspension eingearbeitet werden. Diese Präparationen enthalten typischerweise zumindest 0,1% einer erfindungsgemäßen Verbindung, können aber zwischen 0,1 und etwa 90% des Gewichts hiervon variiert werden. Die Menge der Verbindung der Formel I, die in solchen Zusammensetzungen vorhanden ist, ist so groß, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird. Die Lösungen oder Suspensionen können auch ein oder mehrere der folgenden Hilfsstoffe enthalten: Sterile Verdünnungsmittel, wie Wasser zur Injektion, Kochsalzlösung, fixierte Öle, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösemittel, antibakterielle Mittel, wie Benzylalkohol oder Methylparaben, Antioxidationsmittel, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit, Chelatmittel, wie Ethylendiamintetraessigsäure, Puffer, wie Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel zur Einstellung der Tonizität, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Die parenterale Präparation kann in Ampullen, Einwegspritzen, oder Mehrfachdosierungsgläschen eingeschlossen werden, die aus Glas oder Plastik sind. Bevorzugte Zusammensetzungen und Präparationen können durch den Fachmann bestimmt werden.
Die Verbindungen der Erfindung können auch topisch verabreicht werden und wenn dies so ausgeführt wird, kann der Träger geeigneterweise eine Lösung, eine Salbe oder eine Gelgrundlage sein. Die Grundlage kann beispielsweise eines oder mehrere aus der folgenden Aufzählung umfassen: Vaseline, Lanolin, Polyethylenglycole, Bienenwachs, Mineralöl, Verdünnungsmittel, wie Wasser und Alkohol und Emulgiermittel und Stabilisationsmittel. Topische Formulierungen können eine Konzentration der Formel I oder des pharmazeutischen Salzes hiervon mit etwa 0,1 bis etwa 10% G/V (Gewicht pro Volumeneinheit) enthalten.
Eine weitere bevorzugte Formulierung der vorliegenden Erfindung verwendet Transdermalverabreichungsvorrichtungen ("Patches"). Solche Transdermalpatches können zur Bereitstellung einer kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Infusion der erfindungsgemäßen Verbindungen in kontrollierten Mengen verwendet werden. Die Konstruktion und die Verwendung von Transdermalpatches zur Verabreichung von pharmazeutischen Mitteln ist in der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise US 5 023 252 A vom 11. Juni 1991. Solche Patches können zur kontinuierlichen, pulsartigen oder bedarfsabhängigen Abgabe von pharmazeutischen Mitteln konstruiert werden.
Um die Ausführung der Erfindung weiter zu erläutern werden typische pharmazeutische Zusammensetzungen im folgenden beschrieben. Die Beispiele sind nur erläuternd und sollen den Schutz der Erfindung auf keine Weise beschränken.
Formulierungsbeispiel 1
Hartgelatinekapseln werden unter Verwendung folgender Inhaltsstoffe hergestellt:

Menge

Inhaltsstoff (mg/Kapsel)

Wirkstoff 30,0

Stärke 305,0

Magnesiumstearat 5,0
Die obigen Inhaltsstoffe werden gemischt und in Hartgelatinekapseln in Mengen von 340 mg gefüllt.
Formulierungsbeispiel 2
Eine Tablette wird unter Verwendung der folgenden Inhaltsstoffe hergestellt:

Menge

Inhaltsstoff (mg/Tablette)

Wirkstoff 25,0

mikrokristalline Cellulose 200,0

kolloidales Siliciumdioxid 10,0

Stearinsäure 5,0
Die Bestandteile werden vermischt und unter Bildung von Tabletten gepresst, wobei jede 240 mg wiegt.
Formulierungsbeispiel 3
Es wird eine Trockenpulverformulierung zur Inhalation hergestellt, die die folgenden Bestandteile enthält:

Inhaltsstoff Gewicht %

Wirkstoff 5

Lactose 95
Der Wirkstoff wird mit der Lactose gemischt und das Gemisch wird in eine Vorrichtung zur Trockenpulverinhalation gegeben.
Formulierungsbeispiel 4

Tabletten, die jeweils 30 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:

	Menge
Inhaltsstoff	(mg/Tablette)
Wirkstoff	30,0 mg
Stärke	45,0 mg
Mikrokristalline Cellulose	35,0 mg
Polyvinylpyrrolidon (als 10% Lösung in sterilem Wasser)	4,0 mg
Natriumcarboxymethylstärke	4,5 mg
Magnesiumstearat	0,5 mg
Talkum	1,0 mg
Gesamt	120 mg

Der Wirkstoff, die Stärke und die Cellulose werden durch ein Nr. 20 Mesh U.S. Sieb gegeben und sorgfältig vermischt. Die Polyvinylpyrrolidonlösung wird mit den entstehenden Pulvern vermischt, die dann durch ein Nr. 16 Mesh U.S. Sieb gegeben werden. Die so hergestellten Granula werden bei 50–60°C getrocknet und durch ein Nr. 16 Mesh U.S. Sieb gegeben. Die Natriumcarboxymethylstärke, das Magnesiumstearat und das Talkum werden, nachdem sie vorher durch ein Nr. 30 Mesh U.S. Sieb gegeben wurden, zu den Granula gegeben und nach dem Mischen in einer Tablettenmaschine unter Bildung von Tabletten gepresst, die jeweils 150 mg wiegen.
Formulierungsbeispiel 5
Kapseln, die jeweils 40 mg Arzneimittel enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:

Menge

Inhaltsstoff (mg/Kapsel)

Wirkstoff 40,0 mg

Stärke 109,0 mg

Magnesiumstearat 1,0 mg

Gesamt 150,0 mg
Der Wirkstoff, die Stärke und das Magnesiumstearat werden gemischt, durch ein Nr. 20 Mesh U.S. Sieb gegeben und in Hartgelatinekapseln in 150 mg Mengen abgefüllt.
Formulierungsbeispiel 6
Zäpfchen, die jeweils 25 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:

Inhaltsstoff Menge

Wirkstoff 25 mg

Gesättigte Fettsäureglyceride auf 2 000 mg
Der Wirkstoff wird durch ein Nr. 60 Mesh U.S. Sieb gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die vorher bei möglichst geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in eine Zäpfchenform mit einer nominalen Kapazität von 2,0 g gegossen und abgekühlt.
Formulierungsbeispiel 7

Suspensionen, die jeweils 50 mg Arzneimittel pro 5,0 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:

Inhaltsstoff	Menge
Wirkstoff	50,0 mg
Xanthangummi	4,0 mg
Natriumcarboxymethylcellulose (11%)
Mikrokristalline Cellulose (89%)	50 mg
Saccharose	1,75 g
Natriumbenzoat	10,0 mg
Geschmacksstoff und Farbstoff	q.v.
Gereinigtes Wasser auf	5,0 ml

Das Arzneimittel, die Saccharose und das Xanthangummi werden vermischt, durch ein Nr. 10 Mesh US Sieb gegeben und dann mit einer vorher hergestellten Lösung der mikrokristallinen Cellulose und der Natriumcarboxymethylcellulose in Wasser gemischt. Das Natriumbenzoat, der Geschmacksstoff und der Farbstoff werden mit etwas Wasser verdünnt und unter Rühren zugegeben. Anschließend wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche Volumen zu erhalten.
Formulierungsbeispiel 8
Kapseln, die jeweils 15 mg Arzneimittel enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:

Menge

Inhaltsstoff (mg/Kapsel)

Wirkstoff 15,0 mg

Stärke 407,0 mg

Magnesiumstearat 3,0 mg

Gesamt 425,0 mg
Der Wirkstoff, die Cellulose, die Stärke und das Magnesiumstearat werden gemischt, durch ein Nr. 20 Mesh U.S. Sieb gegeben und in Hartgelatinekapseln in 560 mg Mengen abgefüllt.
Formulierungsbeispiel 9
Eine subkutane Formulierung kann folgendermaßen hergestellt werden:

Inhaltsstoff Menge

Wirkstoff 1,0 mg

Maisöl 1 ml
In Abhängigkeit der Löslichkeit des Wirkstoffs in Maisöl können bis zu etwa 5,0 mg oder mehr des Wirkstoffs in der Formulierung verwendet werden, falls dies gewünscht ist.
Formulierungsbeispiel 10
Eine topische Formulierung kann folgendermaßen hergestellt werden:

Inhaltsstoff Menge

Wirkstoff 1–10 g

Emulgierwachs 30 g

Flüssiges Paraffin 20 g

Weißes Weichparaffin auf 100 g
Das weiße Weichparaffin wird erhitzt, bis es geschmolzen ist. Das flüssige Paraffin und das Emulgierwachs werden eingearbeitet und gerührt, bis sie gelöst sind. Der Wirkstoff wird zugegeben und das Rühren wird fortgesetzt, bis dieser dispergiert ist. Das Gemisch wird dann gekühlt, bis es fest ist.
In einem ihrer Aspekte beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der β-Amyloidpeptidfreisetzung und/oder dessen Synthese, das die Verabreichung einer wirksamen Menge an (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on an einen Patienten umfasst, der dessen bedarf. In einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung liefert die vorliegende Erfindung eine Verbindung, die zur Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung geeignet ist, wobei eine wirksame Menge der Verbindung, die (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on ist, an einen Patienten umfasst, der dessen bedarf.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung die Verwendung von (N)-((5)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung und/oder der Hemmung der Progression der Alzheimerschen Erkrankung.
Es wird auch erkannt, dass der Fachmann die Alzheimersche Erkrankung durch die Behandlung eines Patienten beeinflussen kann, der von der Erkrankung betroffen ist, oder durch die prophylaktische Behandlung eines Patienten, der einem Risiko ausgesetzt ist, die Erkrankung zu entwickeln. Daher sollen sich die Ausdrücke "Behandlung" oder "behandeln" auf alle Prozesse beziehen, worin eine Verlangsamung, eine Unterbrechung, ein Anhalten, eine Kontrolle oder ein Stoppen der Progression der Alzheimerschen Erkrankung stattfindet, aber zeigen nicht notwendigerweise die vollständige Eliminierung aller Symptome an. Daher umfassen die beschriebenen Verfahren zur Prävention des Einsetzens der Alzheimerschen Erkrankung bei einem Patienten, der einem Risiko zur Entwicklung der Alzheimerschen Erkrankung ausgesetzt ist, die Hemmung der Progression der Alzheimerschen Erkrankung und die Behandlung der fortgeschrittenen Alzheimerschen Erkrankung.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Patient" auf einen Warmblüter, wie einen Säuger, der von einer Störung betroffen ist, die mit einer Zunahme der β-Amyloidpeptidfreisetzung und/oder dessen Synthese assoziiert ist, einschließlich Alzheimerscher Erkrankung. Es ist verständlich, dass Meerschweinchen, Hunde, Katzen, Ratten, Mäuse, Pferde, Rinder, Schafe und Menschen Beispiele für Tiere innerhalb des Umfangs der Bedeutung des Ausdrucks sind. Patienten, die einer solchen Behandlung bedürfen, werden leicht diagnostiziert.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "effektive Menge" einer Verbindung der Formel I auf eine Menge, die zur Hemmung der β-Amyloidpeptidfreisetzung und/oder dessen Synthese wirksam ist und speziell bei der Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung.
Eine wirksame Menge kann leicht durch den behandelnden Arzt durch die Verwendung herkömmlicher Techniken und durch die Beobachtung der unter analogen Bedingungen erhaltenen Ergebnisse bestimmt werden. Bei der Bestimmung einer wirksamen Menge, der Dosis an (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on, werden mehrere Faktoren durch den Arzt in Betracht gezogen, einschließlich unter anderem die Stärke und Eigenschaften von (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on, der Art des Patienten, dessen Größe, Alter und allgemeiner Gesundheitszustand, das Ausmaß oder die Schwere der Krankheit, die Reaktion des einzelnen Patienten, der Verabreichungsweg, die Bioverfügbarkeitseigenschaften der verabreichten Präparation, der ausgewählte Dosisplan, die Verwendung einer anderen begleitenden Medikation und andere relevante Umstände.
Eine wirksame Menge an (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on dürfte von 0,1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag (mg/kg/Tag) bis etwa 100 mg/kg/Tag variieren. Bevorzugte Mengen können vom Fachmann bestimmt werden.
Das (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onanhydrat der vorliegenden Erfindung kann in verschiedenen biologischen Systemen getestet werden, einschließlich der folgenden.
Beispiel A
Zelluläres Screening zur Detektion von Inhibitoren der β-Amyloidproduktion
Es werden mehrere Verbindungen der obigen Formel I auf ihre Fähigkeit getestet, die β-Amyloidbildung in einer Zelllinie zu hemmen, die die Schwedische Mutation aufweist. Dieser Screeningtest verwendet Zellen (K293: humane Nierenzelllinie), die stabil mit dem Gen für das Amyloidvorläuferprotein 751 (APP 751), das die Doppelmutation Lys₆₅₁Met₆₅₂ nach Asn₆₅₁Leu₆₅₂ (APP751 Nummerierung) enthält auf die in WO 94 10 569 A⁸ und Citron¹² beschriebene Weise transfiziert sind. Diese Mutation wird herkömmlich als die Schwedische Mutation bezeichnet und die Zellen, die als "293 751 SWE" bezeichnet werden, werden in Corning Platten mit 96 Vertiefungen mit 2 bis 4 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in Dulbecco's Minimal Essential Medium (Sigma, St. Louis, MO) plus 10% fetalem Rinderserum plattiert. Die Zellzahl ist wichtig, um β-Amyloid ELISA Ergebnisse im linearen Bereich des Tests zu erhalten (–0,2 bis 2,5 ng pro ml).
Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C in einem Inkubator, der mit 10% Kohlendioxid äquilibriert ist, werden die Medien entfernt und mit 200 μl einer Verbindung der Formel I (Arzneimittel) ersetzt, das pro Vertiefung Medium für eine zweistündige Vorbehandlungsperiode enthält, und die Zellen werden wie oben inkubiert. Arzneimittelstammlösungen werden in 100% Dimethylsulfoxid so hergestellt, dass die in der Behandlung verwendete Arzneimittelendkonzentration enthaltene Konzentration an Dimethylsulfoxid 0,5% nicht übersteigt und gewöhnlich 0,1% entspricht.
Am Ende der Vorbehandlungsperiode werden die Medien erneut entfernt und mit frischem, Arzneimittel enthaltendem Medium wie oben ersetzt und die Zellen werden für weitere 2 Stunden inkubiert. Nach der Behandlung werden die Platten in einem Beckman GPR bei 1200 Upm für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um den Zelldebris vom konditionierten Medium zu pelletieren. Aus jeder Vertiefung werden 100 μl an konditioniertem Medium oder geeignete Verdünnungen hiervon in eine ELISA Platte überführt, die vorbeschichtet ist mit Antikörper 266 [P. Seubert, Nature (1992) 359: 325–327] gegen die Aminosäuren 13–28 des β-Amyloidpeptids, wie dies in WO 94 10 569 A⁸ beschrieben ist, und bei 4°C über Nacht gelagert. Ein ELISA Test, der markierten Antikörper 3D6 verwendet [P. Seubert, Nature (1992) 359: 325–327] gegen die Aminosäuren 1 bis 5 des β-Amyloidpeptids wird am nächsten Tag gefahren, um die Menge an gebildetem β-Amyloidpeptid zu messen.
Cytotoxische Effekte der Verbindungen werden durch eine Modifikation des Verfahrens von Hansen et al. gemessen. Zu den Zellen, die in der Gewebekulturplatte verbleiben, werden 25 μl einer Stammlösung (5 mg/ml) an 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma, St. Loius, MO) in einer Endkonzentration von 1 mg/ml gegeben. Die Zellen werden bei 37°C für 1 Stunde inkubiert und die zelluläre Aktivität wird durch die Zugabe eines gleichen Volumens an MTT Lysepuffer (20% G/V Natriumdodecylsulfat in 50% Dimethylformamid, pH 4,7) gestoppt. Die vollständige Extraktion wird durch ein Schütteln über Nacht bei Raumtemperatur erreicht. Der Unterschied in der OD₅₆₂ nm und der OD₅₀ nm, wird in einem Molecular Device UV_max Mikrotiterplattenlesegerät als Indikator der zellulären Lebensfähigkeit gemessen.
Die Ergebnisse des β-Amyloidpeptid ELISA werden an eine Standardkurve angepasst und als ng/ml an β-Amyloidpeptid ausgedrückt. Um die Cytotoxizität zu normalisieren, werden diese Ergebnisse durch die MTT Ergebnisse dividiert und als Prozentsatz der Ergebnisse aus einer Arzneimittel-freien Kontrolle ausgedrückt. Alle Ergebnisse sind der Mittelwert und die Standardabweichung von mindestens 6 identischen Tests.
Beispiel B
In Vivo Suppression der β-Amyloidpeptidfreisetzung und/oder Synthese
Dieses Beispiel erläutert, wie die Verbindungen der Erfindung auf eine in vivo Suppression der β-Amyloidpeptidfreisetzung und/oder Synthese getestet werden können. Für diese Experimente werden 3 bis 4 Monate alte PDAPP Mäuse verwendet [Garnes et al., (1995) Nature 373: 523–527]. In Abhängigkeit davon, welche Verbindung getestet wird, wird die Verbindung gewöhnlich zwischen 1 und 10 mg/ml formuliert. Aufgrund der geringen Löslichkeitsfaktoren der Verbindungen können sie mit verschiedenen Vehikeln formuliert werden, wie Maisöl (Safeway, South San Francisco, CA), 10% Ethanol in Maisöl, 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Research Biochemicals International, Natick MA) und Carboxymethylcellulose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
Die Mäuse erhalten eine subkutane Dosis mit einer 26 Gauge Nadel und 3 Stunden später werden die Tiere über eine CO₂ Narkose getötet und das Blut wird durch eine kardiale Punktion mittels 1 cc 25G 5/8'' Tuberculinspritze/Nadel entnommen, die mit einer Lösung aus 0,5 M EDTA, pH 8,0 beschichtet ist. Das Blut wird in ein Becton Dickinson Vakutainerröhrchen gegeben, worin EDTA enthalten ist, und für 15 Minuten bei 1500 × g bei 5°C zentrifugiert. Die Gehirne der Mäuse werden dann entfernt und der Cortex und der Hippocampus werden ausgeschnitten und auf Eis gestellt.
1. Hirntest
Um die Hippocampus- und Cortexgewebe für die Enzym-gebundenen Immunosorbenttests (ELISAs) herzustellen, wird jede Hirnregion in 10 Volumina an eiskaltem Guanidinpuffer (5,0 M Guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) mittels eines motorgetriebenen Kontes-Stössel (Fisher, Pittsburgh PA) homogensiert. Die Homogenate werden auf eine sanft rotierende Plattform für 3 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur gestellt und bei –20°C vor der Quantifizierung des β-Amyloids gelagert.
Die Hirnhomogenate werden 1:10 mit eiskaltem Caseinpuffer [0,25% Casein, Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,05% Natriumazid, 20 μg/ml Aprotinin, 5 mM EDTA, pH 8,0, 10 μg/ml Leupeptin] verdünnt, wobei die Endkonzentration an Guanidin auf 0,5 M verringert wird, bevor bei 16 000 × g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert wird. Die Proben werden erforderlichenfalls weiter verdünnt, um einen optimalen Bereich für die ELISA Messungen durch die Zugabe von Caseinpuffer mit zugegebenen 0,5 M Guanidinhydrochlorid zu erreichen. Die β-Amyloidstandards (1–40 oder 1–42 Aminosäuren) werden so hergestellt, dass die Endkonzentration 0,5 M Guanidin in Gegenwart von 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) entspricht.
Der gesamte β-Amyloidsandwich ELISA, der sowohl β-Amyloid (AS 1–40) als auch β-Amyloid (As 1 bis 42) quantifiziert, besteht aus zwei monoklonalen Antikörpern (mAb) gegenüber β-Amyloid. Der Fangantikörper 266 [P. Seubert, Nature (1992) 359: 325–327] ist gegenüber den Aminosäuren 13 bis 28 des β-Amyloids spezifisch. Der Antikörper 3D6 [Johnson-Wood et al., PNAS USA (1997) 94: 1550–1555], der gegenüber den Aminosäuren 1 bis 5 des β-Amyloids spezifisch ist, wird biotinyliert und dient als Reporterantikörper im Test. Das 3D6 Biotinylierungsverfahren verwendet das Protokoll des Herstellers (Pierce, Rockford, IL) für die NHS-Biotinmarkierung der Immunglobuline, außer dass 100 mM Natriumbicarbonat, pH 8,5 Puffer verwendet wird. Der 3D6 Antikörper erkennt das sekretierte Amyloidvorläuferprotein (APP) oder das Volllängen APP, aber detektiert nur die β-Amyloidspezies mit einer aminoterminalen Asparaginsäure. Der Test hat einen geringeren Empfindlichkeitsbereich von –50 pg/ml (11 pM) und zeigt keine Kreuzreaktivität gegenüber dem endogenen β-Amyloidpeptid der Maus bei Konzentrationen von bis zu 1 ng/ml.
Die Konfiguration des Sandwich ELISA, das die Menge an β-Amyloid (As 1–42) quantifiziert, verwendet den mAb 21F12 [Johnson-Wood et al., PNAS USA (1997) 94: 1550–1555] (der die Aminosäuren 33–42 des β-Amyloids erkennt) als Fangantikörper. Biotinylierter 3D6 ist auch der Reperorterantikörper in diesem Test, der ein geringeres Maß an Empfindlichkeit von 125 pg/ml (28 pM) aufweist.
Die 266 und 21F12 Fangantikörper werden mit 10 μg/ml in Immuntestplatten mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Die Platten werden dann abgesaugt und mit 0,25% Humanserumalbumin in PBS Puffer für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und dann trocken bei 4°C gelagert, bis sie verwendet werden. Die Platten werden mit Waschpuffer (Tris-gepufferte Kochsalzlösung, 0,05% Tween 20) vor der Verwendung rehydriert. Die Proben und Standards werden zu den Platten gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten werden dreimal mit Waschpuffer zwischen jedem Schritt des Tests gewaschen. Der biotinylierte 3D6, der mit 0,5 μg/ml in Caseininkubationspuffer verdünnt wird (0,25% Casein, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) wird in der Vertiefung für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Avidin-HRP (Vektor, Burlingame, CA), das 1:4000 in Caseininkubationspuffer verdünnt ist, wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur zu den Vertiefungen gege ben. Das colorimetrische Substrat Slow TMB-ELISA (Pierce, Cambridge, MA) wird zugegeben und kann für 15 Minuten reagieren, wonach die enzymatische Reaktion durch die Zugabe von 2 N H₂SO₄ gestoppt wird. Das Reaktionsprodukt wird mittels Molecular Divices Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA) quantifiziert, wobei der Unterschied in der Absorption bei 450 nm und 650 nm gemessen wird.
2. Bluttest
Das EDTA Plasma wird 1:1 in einem Probenverdünnungsmittel verdünnt (0,2 g/ml Natriumphosphat × H₂O (monobasisch), 2,16 g/ml Natriumphosphat × 7 H₂O (dibasisch), 0,5 g/l Thimerosal, 8,5 g/l Natriumchlorid, 0,5 ml Triton X-405, 6,0 g/l Globulin-freies Rinderserumalbumin und Wasser). Die Proben und Standards werden im Probenverdünnungsmittel mittels des gesamten β-Amyloidtests getestet (266 Fangantikörper/3D6 Reporter), wie dies oben für den Hirntest beschrieben ist, außer dass das Probenverdünnungsmittel anstelle der beschriebenen Caseinverdünnungsmittel verwendet wird.

Claims

Verbindung der Formel I (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,-4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on
Pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung der Formel I (N)-((S)-2-Hydroxy-3-methylbutyryl)-1-(L-alaninyl)-(S)-1-amino-3-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on
und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel umfasst.
Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung als Pharmazeutikum.
Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung.
Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Prävention der Alzheimerschen Erkrankung.
Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Hemmung der Freisetzung und/oder der Synthese des β-amyloiden Peptids.
Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Hemmung bei der Progression der Alzheimerschen Erkrankung.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Freisetzung und/oder Synthese des β-amyloiden Peptids, einschließlich der Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention der Alzheimerschen Erkrankung und/oder der Hemmung der Progression der Alzheimerschen Erkrankung.