CN1176651C - N-(3-苯并呋喃基)脲衍生物 - Google Patents

Abstract

公开含有通式(I)的N-(3-苯并呋喃基)脲衍生物以及可药用的稀释剂的组合物的制备方法，其特征在于将N-(3-苯并呋喃基)脲衍生物与常规辅剂一起配成合适的施用剂型，式(I)为右式：其中A、D、R¹、R²、R³、R⁴和L如说明书中所定义。

Description

N-(3-苯并呋喃基)脲衍生物

本申请为1996年3月6日提交的发明名称为“N-(3-苯并呋喃基)脲衍生物”、申请号为96103073.9的分案申请。

本发明涉及N-(3-苯并呋喃基)脲衍生物，其制备方法和其医药用途。

已知吞噬细胞的NADPH氧化酶是过氧化物游离基阴离子和由其衍生的活性氧类的生理来源，而这两者对于抵御病原体是重要的。而且，致炎性(如TNFα、IL-1或IL-6)和抗炎性的细胞因子(如IL-10)在宿主发挥防御机制过程中起了关键的作用。不能控制发炎性调节因子的产生可以引起急性和慢性炎症、自身免疫性疾病、组织损害、多器官病变以致于死亡。我们还知道吞噬细胞中环状AMP的增加可抑制氧游离基的产生，并且这种细胞功能比其它功能如聚集反应和酶释放更敏感。

具有脂肪氧合酶抑制作用的苯并呋喃-和苯并噻吩衍生物在EP146243中公开。

本发明涉及通式(I)的N-(3-苯并呋喃基)脲衍生物及其盐

其中

A和D相同或不同，表示氢、各具有至多6个碳原子的直链或支链酰基或烷氧羰基，或表示具有至多6个碳原子的直链或支链烷基，它可被羧基或具有至多6个碳原子的烷氧羰基、苯氧基或苯甲酰基任意取代，

或表示卤素、羧基、氰基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、或式

-OR⁵、-S(O)aR⁶、-(O-CH₂-CO)b-NR⁷R⁸、

-CO-NR⁹R¹⁰、-SO₂-NR¹¹R¹²或-NH-SO₂R¹³基团，

其中

R⁵、R⁶、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹和R¹²相同或不同，表示氢、具有3-6个碳原子的环烷基、苄基或含有至多三个选自N、S和O杂原子的5-7元饱和或不饱和的杂环、所述的杂环可与苯环稠合并且可被选自下述的相同或不同的取代基任意地取代：卤素、氰基、硝基或具有至多6个碳原子的直链或支链烷基或

表示各具有至多8个碳原子的直链或支链烷基、链烯基或酰基，或

表示被选自下述基团的相同或不同的取代基任意单取代或双取代的苯基：硝基、卤素、羧基或具有至多6个碳原子的直链或支链烷氧羰基，

或

R⁵表示羟基保护基或具有至多6个碳原子的直链或支链烷氧羰基，或

表示具有至多8个碳原子的直链或支链烷基，该烷基可被羧基、羟基、各具有至多6个碳原子的直链或支链的酰基或烷氧羰基、苯氧基、苯甲酰基取代，或被含有至多三个选自N、S和/或O的杂原子的5-7元不饱和杂环取代，所述的杂环可被卤素、氰基、硝基或具有至多6个碳原子的直链或支链烷基任意取代，

或

R⁵表示式SO₂R¹⁴基团，其中

R¹⁴表示苯基、三氟甲基或具有至多4个碳原子的直链或支链烷基，

a表示0、1或2，

b表示0或1，

R⁷表示氢或具有至多4个碳原子的直链或支链烷基，

R¹³表示具有6-10个碳原子芳基、三氟甲基或具有至多6个

碳原子的直链或支链烷基。

R¹表示氢、具有至多6个碳原子的直链或支链烷基、氨基保护基或基团-CO-R¹⁵，

其中

R¹⁵表示羟基、具有至多6个碳原子的直链或支链烷氧羰基、具有3-6个碳原子的环烷基、吡啶基、吡咯烷基、或具有至多8个碳原子的直链或支链烷基，它可被卤素、羧基或具有至多6个碳原子的直链或支链烷氧羰基任意取代；或表示苯基，它可被羟基、羧基或各具有至多6个碳原子的直链或支链烷氧基或烷氧羰基任意取代，

L表示氧原子或硫原子，

R²和R³相同或不同，表示氢、具有至多6个碳原子的环烷基、各具有至多8个碳原子的直链或支链烷基、烷氧羰基或链烯基，或表示苯甲酰基、具有6-10个碳原子的芳基，它们可被选自下述基团的相同或不同的取代基任意单取代至三取代；卤素、氰基、硝基、羧基或各具有至多6个碳原子的直链或支链烷基、烷氧基、烷氧羰基或酰基，

或

R²和R³与氮原子一起形成任选含有氧原子的5-至7-元饱和杂环，和

R⁴表示被选自下述基团的相同或不同的取代基任意单取代至三取代的苯基：羟基、苯硫基、具有3-6个碳原子的环烷基、卤素、硝基、四唑基、噻唑基、呋喃基、吡啶基、三氟甲基、二氟甲基、氰基、羧基或各具有至多8个碳原子的直链或支链烷基、烷氧基、烷氧羰基或酰基，或

表示可被苯基任意取代苯基，前者又可被卤素任意单取代或双取代，或者被基团-NR¹⁶R¹⁷，-SR¹⁸，-SO₂R¹⁹或-O-SO₂-R²⁰任意取代，

其中

R¹⁶和R¹⁷的定义如上述R⁷和R⁸的定义，并且与后者相同或不同，或

R¹⁶表示氢，和

R¹⁷表示具有至多6个碳原子的直链或支链酰基，

R¹⁸表示氢或具有至多6个碳原子的直链或支链烷基，

R¹⁹和R²⁰相同或不同，并且表示具有至多6个碳原子的直链或支链烷基、苄基或苯基。

本发明还涉及含有至少一种通式(I)的化合物及其盐以及可药用的稀释剂的组合物的制备方法，其特征在于将所述化合物及其盐与常规辅剂一起配成合适的施用剂型，

其中

A和D相同或不同，表示氢、各具有至多6个碳原子的直链或支链酰基或烷氧羰基，或表示具有至多6个碳原子的直链或支链烷基，或表示式-OR⁵，

其中

R⁵表示氢、苄基、具有至多6个碳原子的直链或支链烷氧羰基、具有至多8个碳原子的直链或支链烷基，

R¹表示氢，

L表示氧原子或硫原子，

R²和R³相同或不同，表示氢、具有至多6个碳原子的环烷基、各具有至多8个碳原子的直链或支链烷基、烷氧羰基或链烯基，和

R⁴表示任选被选自下述基团的相同或不同的取代基所单取代至三取代的苯基：羟基、卤素、硝基、三氟甲基或各具有至多8个碳原子的直链或支链烷基、烷氧基。

本发明的N-(3-苯并呋喃基)脲衍生物也可以其盐的形式存在。一般来说，这里是指与有机或无机碱或酸形成的盐。

本发明中生理上可接受的盐是优选的。N-(3-苯并呋喃基)脲衍生物的生理上可接受的盐为含有游离羧基的本发明物质的金属盐和铵盐。特别优选的盐是，例如钠盐、钾盐、镁盐或钙盐，以及由氨衍生的，或由有机碱如乙胺、二或三乙胺、二或三乙醇胺、二环己基胺、二甲基氨基乙醇、天冬氨酸、亮氨酸或乙二胺衍生的铵盐。

本发明化合物的生理上可接受的盐也指与无机酸或有机酸生成的盐。这里优选的盐是指与无机酸形成的盐，无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸或硫酸，或与有机羧酸或磺酸形成的盐，有机羧酸和磺酸如乙酸、马来酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、乙磺酸、苯磺酸、甲基苯磺酸或萘二磺酸。

本发明化合物以立体异构体的形式存在，它们以象或镜象(对映异构体)或不以象或镜象(非对映异构体)的形式存在。本发明涉及对映体和外消旋物形式，也涉及菲对映异构体混合物。类似于非对映异构体，采用已知的方法可将外消旋物拆分为单一组分的立体异构体。

一般来说，杂环表示含有至多3个选自氧、硫和/或氮的杂原子的5-至7-元饱和或不饱和的，优选5-至6-元饱和或不饱和的杂环，所述的杂环可与芳环进一步稠合。

下述杂环基是优选的：噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹噁唑基、cinnolyl、噻唑基、二氢噻唑基、苯并噻唑基、异噻唑基、苯并异噻唑基、噁唑基、苯并噁唑基、异噁唑、咪唑基、吲哚基、吗啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑基、噁唑啉基或三唑基。

一般来说，上述定义中提及的氨基保护基包括下述一系列保护基：苄氧基羰基、3，4-二甲氧基苄氧羰基、3，5-二甲氧基苄氧羰基、2，4-二甲氧基苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、4-硝基苄氧羰基、2-硝基苄氧羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基苄氧羰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、丁氧基羰基、异丁氧基羰基、叔丁氧基羰基、烯丙氧基羰基、乙烯氧基羰基、2-硝基苄氧羰基、3，4，5-三甲氧基苄氧羰基、环己氧基羰基、1，1-二甲基乙氧基羰基、金刚烷基羰基、邻苯二甲酰基、2，2，2-三氯代乙氧基羰基、2，2，2-三氯代-叔丁氧基羰基、氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴-9-基甲氧基羰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、2，2，2-三氟乙酰基、2，2，2-三氯乙酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基、邻苯二甲酰亚基、异戊酰基或苄氧基亚甲基、4-硝基苄基、2，4-二硝基苄基或4-硝基苯基。

优选的通式(I)化合物及其盐是下述化合物：

其中

A和D相同或不同，并且表示氢、各具有至多5个碳原子的直链或支链酰基或烷氧羰基、或表示具有至多4个碳原子的直链或支链烷基，它们可被羧基、羟基、具有至多5个碳原子的烷氧羰基、苯氧基或苄氧基任意取代，或

表示氟，氯，溴，硝基，三氟甲基或下式基团：-OR⁵、-S(O)a-R⁶、-(O-CH₂-CO)b-NR⁷R⁸、-CO-NR⁹R¹⁰、-SO-NR¹¹R¹²或-NH-SO₂-R¹³，

其中

R⁵、R⁶、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹和R¹²相同或不同，表示氢，环丙基，环戊基，环己基，醌醇基(chinolyl)，吡啶基，咪唑基，1，3-噻唑基或噻吩基，它们由相同或不同选自下述的取代基选择取代的：氟、氯、溴、碘、氰基、硝基或最多有5个碳原子的直链或支链烷基，

表示各自最多有6个碳原子的直链或支链的烷基、链烯基或酰基，或

表示被相同或不同的选自下列基团的取代基单取代或二取代的苯基：硝基、氟、氯、溴、碘、羧基或最多有5个碳原子的直链支链的烷氧羰基，

或者

R⁵表示苄基，乙酰基或四氧吡喃基或最多有4个碳原子的直链或支链烷氧羰基，

表示最多具有6个碳原子的直链或支链烷基，该烷基被羧基、羟基、最多有4个碳原子的直链或支链酰基或烷氧羰基、苯氧基、苯甲酰基取代，或被由氟、氯、溴、氰基、硝基或最多有4个碳原子的直链或支链烷基选择取代的吡啶基，咪唑基，噻吩基或呋喃基所取代，

或者

R⁵表示式-SO₂-R¹⁴基团，其中

R¹⁴表示苯基、三氟甲基或最多有3个碳原子的直链或支链烷基，

a表示数0、1或2，

b表示数0或1，

R⁷表示氢或最多有3个碳原子的直链或支链烷基，

R¹³表示苯基、三氟甲基或最多有3个碳原子的直链或支链烷基，

R¹表示氢、最多有4个碳原子的直链或支链烷基，叔丁氧羰基或式-COR¹⁵基团，

其中

R¹⁵表示羟基，最多有4个碳原子的直链或支链烷氧羰基，环戊基，环己基，吡略烷基或最多有5个碳原子、且被下述基团选择取代的直链或支链烷基：氟、氯、溴、羧基或最多有4个碳原子的直链或支链烷氧羰基，或

表示苯基，该苯基被羟基、羧基或各自最多有4个碳原子的烷氧基或烷氧羰基取代。

L表示氧或硫原子，

R²和R³相同或不同，表示氢，环丁基，环戊基，环己基或各自最多有6个碳原子的直链或支链烷基、烷氧羰基或链烯基，或

表示被相同或不同的包括下面一系列取代基单取代至三取代的苯甲酰基或苯基：氟、氯、溴、碘、羧基、氰基、硝基、或最多各自有5个碳原子的支链或直链烷基、烷氧基或烷氧羰基，

或者

R²和R³与氮原子一起形成吡咯烷基、哌啶基或吗啉基，

以及

R⁴表示由相同或不同的包括下面一系列取代基单取代至三取代的苯基：羟基、硫代苯基、环戊基、环己基、氟、氯、溴、碘、硝基、四唑基、噻唑基、呋喃基、吡啶基、三氟甲基、二氟甲基、氰基、羧基，最多各自有6个碳原子的直链或支链烷基、烷氧基、烷氧羰基或酰基，或

由苯基选择取代的苯基，前者被氟、氯或溴选择的单取代或二取代。

最优选的通式(I)化合物和其盐是下述化合物：

其中

A和D相同或不同，表示氢，最多各自有4个碳原子的直链或支链酰基或烷氧羰基、或最多有3个碳原子的直链或支链烷基，该基团被最多有4个碳原子的羧基或烷氧羰基选择取代；苯氧基，苯甲酰基，或

表示氟，氯，溴，硝基，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基，或下式基团：-OR⁵，-S(O)aR⁶，-(O-CH₂-CO)b-NR⁷R⁸，-CONR⁹R¹⁰，-SO₂NR¹¹R¹²或-NH-SO₂R¹³，

其中

R⁵、R⁶、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹和R¹²同，表示氢，环丙基，环戊基，环己基，醌醇基，吡啶基，咪唑基，1，3-噻唑基或噻吩基，这些基团被相同或不同的下述一系列取代基所取代：氟、氯、溴、碘、氰基、硝基或最多有3个碳原子的直链或支链烷基，

表示各自最多有3个碳原子的直链或支链烷基、链烯基或酰基，或

表示苯基，该苯基被相同或不同的下述一系列取代基选择的单取代或二取代：氟、氯、溴、碘、羧基或最多有3个碳原子的直链或支链烷氧羰基，

或者

R⁵表示苄基，乙酰基或四氧吡喃基或最多有3个碳原子的直链或支链烷氧羰基，

表示最多有4个碳原子的直链或支链烷基，该烷基被羧基、羟基、各自最多有3个碳原子的酰基或烷氧羰基、苯氧基、苯甲酰基或被吡啶基，咪唑基或噻吩基取代，

或者

R⁵表示式-SO₂R¹⁴基团，

其中

R¹⁴表示苯基、三氟甲基或甲基，

a表示数0、1或2，

b表示数0或1，

R⁷表示氢，甲基或乙基，

R¹³表示苯基，三氟甲基或甲基，R¹表示氢或最多有3个碳原子的烷基，或式-COR¹⁵基团，

其中

R¹⁵表示羟基、最多有3个碳原子的直链或支链烷氧羰基，环戊基，环己基，吡啶基，吡咯烷基，或最多有4个碳原子的直链或支链烷基，该烷基由氟、氯、溴、羧基或最多有3个碳原子的直链或支链烷氧羰基选择取代，或

表示苯基，该苯基被羟基、羧基或各自最多有3个碳原子的直链或支链烷氧基或烷氧羰基选择取代，

L表示氧或硫原子，

R²和R³相同或不同，表示氢，环丁基，环戊基，环己基或各自最多有5个碳原子的直链或支链烷基、烷氧羰基或链烯基，或

表示苯甲酰基或苯基，它们是被相同或不同的下述一系列取代基选择的单取代至三取代：氟、氯、溴、碘、羧基、氰基、硝基或各自最多有3个碳原子烷基、烷氧基或烷氧羰基，

或者

R²和R³与氮原子一起形成吡咯烷基环，

以及

R⁴表示苯基，该苯基被相同或不同的下述一系列取代基选择的一取代至三取代：羟基、硫代苯基、环戊基、环己基、氟、氯、溴、硝基、四唑基、噻唑基、呋喃基、吡啶基、三氟甲基、二氟甲基、氰基、羧基或最多各自有5个碳原子的直链或支链的烷基、烷氧基、烷氧羰基或酰基，或

苯基，该苯基可被任选由氯一取代或二取代的苯基任意取代。

另外本发明还发现了制备通式(I)化合物的方法，其特征在于：将其中A、D、R¹和R⁴具有上文定义的通式(II)化合物

和其中L和R²具有上文定义的通式III化合物

            R²-N＝C＝L  (III)

在惰性溶剂中进行反应，必要时在有碱和/或有辅助剂存在下进行；

    在R²/R³＝H和L＝O的情况下，

    使通式(II)化合物和通式(IIIa)化合物反应

            E-SO₂-N-C-O    (IIIa)

其中E表示卤素，优选氯；

在R²/R³＝H和L＝S的情况下，

使通式(II)化合物和NH₄SCN反应；

以及在R¹、R²和/或R³≠H情况下，可选择性地用常规方法衍生得到氨基基团。

本发明的方法可用例如下述方程式的方法说明：

适当的溶剂是常用的在反应条件下不发生变化的有机溶剂。包括醚如乙醚、二噁烷或四氢呋喃，丙酮，二甲亚砜，二甲基甲酰胺或醇类，如甲醇、乙醇、丙醇或卤代烃，如二氯甲烷、三氯甲烷或四氯甲烷，优选二氯甲烷。

适当的碱通常是有机或元机碱。优选包括碱金属氢氧化物如氢氧化钠、碳酸氢钠或氢氧化钾，碱土金属氢氧化物如氢氧化钡，碱金属碳酸盐如碳酸钠或碳酸钾，碱土金属碳酸盐如碳酸钙，或碱金属，或有机胺(三烷基(C₁-C₅)胺)如三乙胺，或杂环化合物如1，4-二氨杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)，或氨化物(amide)如氨化钠、丁基氨化锂或丁基锂、吡啶或甲基哌啶。也可使用碱金属，如钠或它的氢化物如氢化钠作为碱使用。优选碳酸钾、三乙胺、碳酸氢钠和氢氧化钠。

该方法通常在-30℃至+100℃温度范围内，优选在-10℃至+50℃范围内进行。

该方法通常在常压下进行，但是也可以在提高的压力下或在减压条件下(如在0.5至5.0巴范围内)进行。

相对于1摩尔通式(III)或(IIIa)化合物碱的用量为1至10摩尔，优选1.0至4摩尔。

作为原料使用的通式(II)化合物是新的，可用下述方法制备：

首先使其中A和D如上文定义的通式(IV)化合物

与通式(V)化合物反应

         R⁴-CO-CH₂-T    (V)

其中R⁴如上文定义，和

T表示典型的离去基团，例如氯、溴、碘、甲苯磺酸基或甲磺酸基，优选溴，

可以制备通式(VI)化合物

其中A、D和R⁴如上文定义，

反应在一种上述溶剂或碱中，优选在三乙胺和二甲基甲酰胺中进行；

接着在最后步骤中与NaOC₂H₅/C₂H₅OH进行反应。

该方法通常在+10℃至+150℃温度范围内，优选在+30℃至+80℃范围内进行。

该方法通常在常压下进行，但是也可以在升高的压力或减压下(例如在0.5至5巴范围内)进行。

通式(III)、(IIIa)、(IV)、(V)和(VI)化合物是已知的，在某些情况下是新化合物，并可用常规方法制备。

出人意料的是，通式(I)化合物抑制氧游离基的形成和TNFα(肿瘤坏死因子)的生成，但趋向于释放IL-10。这些化合物能通过抑制吞噬细胞磷酸二酯酶活性而增加细胞环腺苷酸(环AMP)。

特别是本发明化合物能通过多形核细胞(PMN)抑制过氧化物的生成。还有，在多种刺激，包括细菌脂多糖(LPS)、全调理酵母聚糖(ZymC3b)和IL-1β的刺激的响应中，这些化合物抑制人体单核细胞中TNFα的释放和增强IL-10的产生。

可能是由于IV型磷酸二酯酶对其的降解而使其得到抑制从而由细胞cAMP提高导致了上述作用。

所以本发明化合物可用作治疗急性和慢性感染病变的药物。

本发明化合物优选适于治疗和预防急慢性感染和自身免疫疾病，例如气肿、牙槽炎、休克肺、各种哮喘、COPD、ARDS、支气管炎、动脉硬化、关节病、胃肠道感染、类风湿关节炎、心肌炎、脓毒症和脓毒病休克、关节炎、类风湿脊椎炎和骨关节炎、革兰氏阴性败毒症、再灌注损伤、移植的宿主反应、同种移植排异、疟疾、肌痛、HIV、AIDS、恶病质、Cronh病、溃疡性结肠炎、Pyresis、系统性红斑狼疮、多发性硬化、I型糖尿病、牛皮癣、Bechet病、变态反应性紫癜、肾炎、慢性肾小球肾炎、肠感染疾病和白血病。另外本发明化合物适合于减轻再氧化后坏死组织的损坏，在此情况下同时给药到嘌呤醇以抑制黄嘌呤氧化酶更好，也用于和过氧化物歧化酶结合治疗。

试验说明

1.制备人PMN

用静脉穿刺方法从健康受试者身上取血，用葡聚糖沉淀和在缓冲介质中再悬浮的方法纯化中性细胞。

2.FMLP刺激后过氧化物基阴离子生成的抑制作用

在微滴板的孔中使中性细胞(2.5×10⁵ml^-1)与细胞素C(1.2mg/ml)混合。把本发明化合物加入二甲亚砜(DMSO)，在所有的孔中化合物浓度范围为2.5nM至10μM，DMSO浓度为0.1％v/v。加入细胞松弛素B(5μg×ml^-1)后把板在37℃孵育5分钟。然后加入4×10^-8M的FMLP刺激中性细胞，并通过在Thermomax微滴板分光光度计上监测OD₅₅₀测量作为过氧化物歧化酶的过氧化物的生成，该歧化酶能抑制细胞素C的还原。起始速率用Softmax动力学计算程序计算。各空白孔含有200单位的过氧化歧化酶。

过氧化物生成的抑制作用由下式计算

$\frac{[1-\left((\mathrm{Rx}-\mathrm{Rb})\right)]}{\left((\mathrm{Ro}-\mathrm{Rb})\right)}\·100$

Rx＝含本发明化合物的孔中的速率

Ro＝对照孔的速率

Rb＝含过氧化物歧化酶的空白孔的速率

本发明化合物的IC₅₀值范围为0.07μM-10μM。

3.PMN环AMP浓度的测定

将本发明化合物和3.7×10⁶PMN一起在37℃孵育5分钟，然后加入4×10^-8M的FMLP，6分钟后加入于96％v/v乙醇中的1％v/v的浓盐酸，其中含有0.1mM EDTA，使蛋白质沉淀，离心后使乙醇萃取物在氮气中蒸发至干，再悬浮于含4mM EDTA的50mM Tris/HCl(pH7.4)之中，用Amersham International plc.提供的环AMP结合蛋白质试样测定萃取物中环AMP浓度，用含对照孵育载体中的百分数表示环AMP浓度。

在1μM化合物时化合物使cAMP水平的提高为对照值的0-400％。

4.PMN磷酸二酯酶试验

按Souness和Scott(Biochem.J.，291，389-395，1993)所述由人体PMN基本如组织匀浆进行。按作者所述把组织匀浆用钒酸钠/谷胱甘肽处理，以表示出在磷酸二酯酶上的descrete立体定向位置。本发明化合物的IC₅₀值范围为0.001μM至10μM。

5.人体血小板磷酸二酯酶试验

除了匀浆是如上文所述用钒酸盐谷胱甘肽处理以外，基本上按Schmidt等人(Biochem.Pharmacol.，42，153-162，1991)所述的方法进行。本发明化合物的IC₅₀值大于100μM。

6.对大鼠脑膜的rolipram结合位置的结合试验

本试验基本按Schneider等人(Eur.J.Pharmacol.，127，105-115，1986)所述的方法进行。本发明化合物的IC₅₀值范围0.01-10μM。

7.人体单核细胞的制备

由正常供体身上取血，用密度离心从外周血液中分离出单核细胞，接着离心冲洗。

8.内毒素诱导的TNF释放

用LPS(2μg ml^-1)刺激单核细胞(1×10⁶ml^-1)，和不同浓度(10^-4至10μg ml^-1)的化合物一起孵育，把化合物溶于DMSO/介质(2％v/v)。细胞在RPMI-1640培养基谷氨酰胺/FCS补给培养基中于37℃下，在含5％CO₂的加湿空气中孵育，18-24小时后用人体TNF特异ELISA(medgenix)测定上清液中的TNF。对照组是没有刺激的和不含化合物的LPS刺激的单核细胞。实施例2、13和16化合物诱导了人体单核细胞中LPS产生的TNF活性。

9.内毒素诱导的小鼠休克致死率

使B6D2F1小鼠(n＝10)用半乳糖胺(600mg/kg)致敏，用LPS(0.01μg/每只小鼠)触发小鼠休克和死亡。在施用LPS 1小时以前静脉给药本发明化合物，对照组是用LPS作用于小鼠而不用化合物，在用LPS8至24小时后小鼠死亡，实施例2、13和16化合物在剂量为3-30mg/kg时内毒素引起的死亡减少大约70％至100％。

半乳糖胺/LPS引起的死亡减少。

10.人体单核细胞的刺激作用和细胞因子水平的测定

在试验化合物存在下用100ng/ml LPS、0.8mg/ml ZymC3b或10ng/ml IL-1β刺激人体单核细胞，最终DMSO浓度保持在0.1％v/v。37℃下，于含5％CO₂的加湿空气中将细胞孵育过夜，取上清液贮于-70℃。用A6抗-TNF单克隆抗体作为初级抗体由ELISA测定TNFα浓度，二级抗体是多克隆抗-TNFα抗体IP200(Genzyme)，以及测定抗体是多克隆抗-rabbit IgG碱性磷酸酶结合体(Sigma)。IL-10由ELISA(Biosource)测定。实施例2化合物能抑制LPS和IL-1β诱导的TNFα生成，IC₅₀值为1-2μM，而在化合物浓度10μM时，ZymC3b诱导的TNFα生成能抑制大约50％。实施例2还能引起IL-10的释放，本身不刺激IL-10的生成，在10μM IL-10的生成大约增加3-4倍。

新的活性化合物可按常规方法制成常用剂型，例如片剂、包复片剂、丸剂、粒剂、气雾剂、糖浆、乳剂、悬浮剂和溶液，制备中可使用惰性、无毒、药学上可接受的赋形剂或溶剂。与此有关的是，在各种情况下，治疗活性化合物的浓度大约是混合物总重量的0.5至90％，即其含量为要足以达到预定的剂量范围。

制剂可以，例如把活性化合物和溶剂和/或赋形剂掺合，适当地可使用乳化剂和/或分散剂，而当用水作稀释剂的情况下，如需要可以使用例如有机溶剂作辅助剂。

可用常规方式给药，优选口服或肠道外给药，特别是经舌或静脉内用药。

在肠道外给药的情况下，活性化合物溶液可使用适当的液体载体。

通常要达到有效的治疗效果在静脉用药时给药量最好是大约0.001至10mg/kg，优选约0.01至5mg/kg体重，口服用药时剂量是大约为0.01至25mg/kg，优选0.1至10mg/kg体重。

尽管如此，也有必要主要依据下述因素改变上述剂量：体重或施用方法，施药者的个体状态、药剂的形式和给药的时间或间隔，因此在某些情况下可能用比上述最小剂量更少的量就足够了，而在某些情况下必须要超过所述上限的量。在用药量相对较大的情况下，最好在每日用药期内把它们分成数个单个剂量。

溶剂

    I      石油醚∶乙酸乙酯  1∶1

    II     石油醚∶乙酸乙酯  5∶1

    III    石油醚∶乙酸乙酯  5∶2

    IV      酸乙酯

    V       二氯甲烷∶甲醇  5∶1

    VI      二氯甲烷

    VII     环己烷∶乙酸乙酯3∶1

    VIII    二氯甲烷∶甲醇  50∶1

起始化合物

实施例I

2-羟基-4-甲氧基苯  腈

把2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(55g，0.36mol)、盐酸羟胺(30g，O.43mol)和甲酸钠(34g，O.5mol)在甲酸(200ml，O.43mol)中回流1.25小时，然后，在搅拌下30分钟内在冰浴上使得到的溶液快速冷却，得到的沉淀经过滤分离和用水充分洗涤，在真空干燥器中干燥后得到标题化合物(45g，0.3mol，产率84％)，为红砖色固体，mp 169-171℃，Rf(EtOAc)0.43。

实施例II

(3-氨基-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-(3-硝基苯基)甲酮

把等当量的2-羟基-4-甲氧基苯腈(5g，33.5mmol)和ω-溴代-3-硝基乙酰苯(8.2g，33.5mmol)溶于30ml DMF并加入4.6ml三乙胺，混合物于75℃加热90分钟。用水使其骤冷，用二氯甲烷萃取三次，真空蒸发溶剂，残余物干燥过夜。粗产品在150mg钠于50ml乙醇的混合物中加热回流90分钟，冷却至室温后，蒸出溶剂，把残余物溶于水并用乙酸乙酯萃取三次，用Na₂SO₄干燥有机层，真空浓缩，残余物用色谱法(硅胶60)进一步纯化。

产率 9.6g(92％)

Rf   0.18(III)

mp   214℃

按类似于实施例I的方法制备表I-V中的化合物。

表I：

表I：(续)

表I：(续)

表I：(续)

表I：(续)

表I：(续)

表II

表II：(续)

表III：

表III：(续)

表III：(续)

表IV：

表IV：(续)

表IV：(续)

表V：

表V：(续)

表V：(续)

制备实施例

实施例1

N-(3-(6-甲氧基-2-(4′-甲基苯甲酰基)苯并呋喃基)脲

把1g(3.55mmol)实施例II化合物溶于二氯甲烷(20ml)，冷却至0℃，在30分钟内向其中滴加氯代磺酰基异氰酸酯(0.55g，3.99mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液，之后使反应物回至室温并再搅拌4小时。加水(20ml)，反应物搅拌过夜。真空去除二氯甲烷，把残余物溶于乙酸乙酯，用盐水洗涤，分离，用MgSO₄干燥。将蒸发后得到的固体用戊烷研制得到标题化合物(1g，3.1mmol，产率87％)，为黄色固体，mp 258-260℃，Rf(CH₃OH∶CH₂Cl₂，1∶1)0.82。

用类似于实施例1的方法制备表1所列化合物。

表1：

表1：(续)

表1：(续)

实施例21

N-苯甲酰基-N′-(3-(2-(2′，4′-二氯苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃基)硫脲

将1.35g(4mmol)实施例IV化合物和苯甲酰基异硫氰酸酯(720mg，4.4mmol)于丙酮(20ml)中回流2 4小时，在此之后使反应冷却并在搅拌下倾入冰水中。沉淀物经过滤分离和用水洗涤，在干燥器中真空干燥后分离出标题化合物(1.6g，3.3mmol，产率84％)，为黄色固体，mp 100-102℃，Rf 0.67(IV)。

按类似于实施例1的方法制备表2-6所列化合物。

表2：

表3：

表3：(续)

表3：(续)

表4：

表4：(续)

表4：(续)

表5：

表6：

表6：(续)

表6：(续)

表6：(续)

Claims (1)

1.含有至少一种通式(I)的化合物及其盐以及可药用的稀释剂的组合物的制备方法，其特征在于将所述化合物及其盐与常规辅剂一起配成合适的施用剂型，

其中

A和D相同或不同，表示氢、各具有至多6个碳原子的直链或支链酰基或烷氧羰基，或表示具有至多6个碳原子的直链或支链烷基，或表示式-OR⁵，

其中

R⁵表示氢、苄基、具有至多6个碳原子的直链或支链烷氧羰基、具有至多8个碳原子的直链或支链烷基，

R¹表示氢，

L表示氧原子或硫原子，

R²和R³相同或不同，表示氢、具有至多6个碳原子的环烷基、各具有至多8个碳原子的直链或支链烷基、烷氧羰基或链烯基，和

R⁴表示任选被选自下述基团的相同或不同的取代基所单取代至三取代的苯基：羟基、卤素、硝基、三氟甲基或各具有至多8个碳原子的直链或支链烷基、烷氧基。