CN1167420C - 用于调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的氮杂苯并咪唑类化合物 - Google Patents

用于调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的氮杂苯并咪唑类化合物 Download PDF

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Abstract

本发明部分涉及用氮杂苯并咪唑类化合物调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的方法。该方法引入了表达一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、例如RAF的细胞。另外，本发明描述了用由本发明鉴定的化合物预防和治疗生物体与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶有关的异常状态的方法。而且，本发明涉及氮杂苯并咪唑化合物和包含这些化合物的药物组合物。

Description

用于调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 功能的氮杂苯并咪唑类化合物
发明背景
提供下列对发明背景的说明有助于理解本发明，但不承认其是发明的现有技术。
细胞信号转导是一种把调节不同细胞过程的外部刺激传递到细胞内部的基本机理。信号转导关键的生物化学机理之一涉及蛋白质的可逆性磷酸化作用，该作用通过改变成熟蛋白质的结构和功能，能够调节其活性。
真核生物中得到最佳表征的蛋白激酶在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的醇部分上磷酸化蛋白质。这些激酶主要分为两组：一组特异性地磷酸化丝氨酸和苏氨酸，另一组特异性地磷酸化酪氨酸。有些激酶能够磷酸化酪氨酸以及丝氨酸/苏氨酸残基，被称为“双特异性”激酶。
蛋白激酶也可以以它们在细胞内的位置为特征。有些激酶是跨膜受体蛋白质，能够结合细胞膜外部的配体。与配体结合，改变了受体蛋白激酶的催化活性。另一些是缺少跨膜结构域的非受体蛋白质。在各种细胞腔中，从细胞膜内表面到细胞核，都可以找到非受体蛋白激酶。
很多激酶都涉及调节性级联，其中它们的底物可以包括活性受其磷酸化作用状态调节的其他激酶。最终，下游效应物的活性受由这样一种途径的活化作用所引起的磷酸化作用的调制。
丝氨酸/苏氨酸激酶家族包括调节信号发送级联的许多步骤的激酶，信号发送级联包括控制细胞生长、迁移、分化、基因表达、肌肉收缩、糖代谢、细胞的蛋白质合成和细胞周期的调节的级联。
一个在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化蛋白质靶的非受体蛋白激酶的实例是RAF。RAF调制其他蛋白激酶的催化活性，其他蛋白激酶例如磷酸化并由此活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的蛋白激酶。RAF本身被膜锚定蛋白质RAS所活化，后者的活化又是响应于配体活化酪氨酸受体蛋白激酶，例如表皮生长因子受体(EGFR)和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)。变形的RAF可导致生物体的癌症，这一发现强调了RAF在控制细胞活动中的生物学重要性。Monia等《天然药物》2：668，1996提供了RAF在恶性肿瘤中重要性的证据，其包括图表在内的全文引用在此作为参考文献。
在为了发现针对癌症和其他疾病的新治疗方法所作的努力中，生物医学研究人员和化学家已对抑制蛋白激酶功能的分子进行了设计、合成和试验。一些小的有机分子构成了一类调制蛋白激酶功能的化合物。据报道抑制蛋白激酶功能的分子实例有双单环、二环或杂环芳基化合物(PCT WO 92/20642)、亚乙烯基-吖吲哚衍生物(PCTWO 94/14808)、1-环丙基-4-吡啶基喹诺酮(美国专利No.5,330,992)、苯乙烯基化合物(美国专利No.5,217,999)、苯乙烯基取代的吡啶基化合物(美国专利No.5,302,606)、某些喹唑啉衍生物(EP申请No.0 566 266 A1)、硒代吲哚和硒化物(PCT WO94/03427)、三环多羟基化合物(PCT WO 92/21660)和苄基膦酸化合物(PCT WO 91/15495)。
能够横跨细胞膜并且抗酸解的化合物可能是有利的治疗剂，因为它们在对患者口服给药后有较高的生物利用度。不过，很多这些蛋白激酶抑制剂仅仅微弱地抑制蛋白激酶的功能。另外，很多抑制剂抑制了各种蛋白激酶，因此在作为疾病治疗剂时导致多种副作用。
发明概述
本发明部分涉及用氮杂苯并咪唑类化合物调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的方法。该方法引入了表达丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、如RAF的细胞。另外，本发明描述了用本发明鉴定的化合物预防和治疗生物体与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶有关的异常状态的方法。而且，本发明涉及包含用本发明方法鉴定的化合物的药物组合物。
I.筛选调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法
本发明方法提供了调制受体与胞质丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶二者的功能的手段。这些方法提供了体外与体内调制酶的手段。对体外应用来说，本发明方法部分涉及鉴定调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法。
因此在第一方面，本发明的特征在于用一种氮杂苯并咪唑类化合物调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的方法。该氮杂苯并咪唑化合物可选地被有机基团取代。该方法包括使表达丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的细胞与该化合物接触。
术语“功能”指的是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的细胞作用。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族包括调节信号发送级联中许多步骤的激酶，信号发送级联包括控制细胞生长、迁移、分化、基因表达、肌肉收缩、糖代谢、细胞的蛋白质合成和细胞周期的调节的级联。
术语“调制”指的是化合物改变蛋白激酶功能的能力。调制剂优选地活化蛋白激酶的催化活性，更优选地活化或抑制蛋白激酶的催化活性，活化或抑制取决于与蛋白激酶接触的化合物浓度，或者最优选地抑制蛋白激酶的催化活性。
本发明上下文中的术语“催化活性”定义了蛋白激酶磷酸化底物的速率。催化活性是能够测量的，例如测定底物转化为产物的量随时间变化的函数。底物的磷酸化作用发生在蛋白激酶的活性部位上。活性部位在正常情况下是一种腔，在该腔中底物与蛋白激酶结合并被磷酸化。
这里所用的术语“底物”指的是被丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化的分子。底物优选是一种肽，更优选是一种蛋白质。关于蛋白激酶RAF，优选的底物是MEK和MEK底物MAPK。
术语“活化”指的是提高蛋白激酶的细胞功能。蛋白激酶的功能优选是与天然结合配偶体的相互作用，最优选是催化活性。
术语“抑制”指的是降低蛋白激酶的细胞功能。蛋白激酶的功能优选是与天然结合配偶体的相互作用，最优选是催化活性。
术语“调制”也指的是通过增加或减少在蛋白激酶与天然结合配偶体之间形成复合体的概率，从而改变蛋白激酶的功能。调制剂优选地增加在蛋白激酶与天然结合配偶体之间形成复合体的概率，更优选地增加或减少在蛋白激酶与天然结合配偶体之间形成复合体的概率，增加或减少取决于与蛋白激酶接触的化合物浓度，最优选地减少在蛋白激酶与天然结合配偶体之间形成复合体的概率。
术语“复合体”指的是至少两个彼此结合的分子组合。信号转导复合体通常含有至少两个彼此结合的蛋白质分子。例如，蛋白质酪氨酸受体蛋白激酶、GRB2、SOS、RAF和RAS装配形成响应于促分裂配体的信号转导复合体。
术语“天然结合配偶体”指的是细胞中与蛋白激酶结合的多肽。天然结合配偶体在蛋白激酶信号转导过程中能够起到传播信号的作用。蛋白激酶与天然结合配偶体之间的相互作用的改变本身，能够表明相互作用的发生概率的增加或减少，或者能够表明蛋白激酶/天然结合配偶体复合体浓度的增加或减少。
蛋白激酶天然结合配偶体能够与蛋白激酶的细胞内区高亲和性地结合。高亲和性表示，平衡结合常数为10-6M或以下的数量级。此外，天然结合配偶体也能瞬间与蛋白激酶细胞内区发生相互作用，从化学上修饰它。蛋白激酶天然结合配偶体选自但不限于SRC同源性2(SH2)或3(SH3)结构域、其他磷酰酪氨酸结合(PTB)域、鸟嘌呤核苷酸交换因子、蛋白磷酸酶和其他蛋白激酶。测定蛋白激酶与其天然结合配偶体之间相互作用的改变的方法是本领域容易获得的。
术语“丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶”指的是这样一种酶，它的氨基酸序列的至少10％氨基酸等于其他在丝氨酸与苏氨酸残基上磷酸化蛋白质的酶。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化了磷酸在丝氨酸与苏氨酸残基上加成到蛋白质上。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶能够以膜结合蛋白或胞质蛋白形式存在。
这里所用的术语“接触”指的是将包含本发明氮杂苯并咪唑化合物的溶液与浸泡有本方法细胞的液体介质混合。包含该化合物的溶液也可以包含另一种组分，例如二甲基亚砜(DMSO)，它促进本方法细胞对氮杂苯并咪唑化合物的摄取。可以利用一种分液仪器将包含氮杂苯并咪唑化合物的溶液加入到浸泡有细胞的介质中，例如吸移管类装置或注射器类装置。
术语“氮杂苯并咪唑类化合物”指的是被化学取代基取代的氮杂苯并咪唑有机化合物。氮杂苯并咪唑化合物的一般结构为：
Figure C9881075300101
根据本发明，术语“取代的”指的是用任意数量的化学取代基衍生的氮杂苯并咪唑化合物。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的方法，其中该蛋白激酶是RAF。
RAF蛋白激酶在丝氨酸或苏氨酸残基上磷酸化蛋白靶。一种靶蛋白是磷酸化并由此活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的蛋白激酶(MEK)。RAF本身是被膜结合鸟嘌呤三磷酸酯水解酶RAS所活化的，后者响应于促分裂原刺激的受体蛋白酪氨酸激酶，例如表皮生长因子受体(EGFR)和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)。
本发明方法能够检测调制细胞中RAF蛋白激酶功能的化合物。RAF磷酸化一种蛋白激酶(MEK)，后者又磷酸化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)。仅用RAF监测MEK的磷酸化作用的测定法是不敏感的，因为MEK的磷酸化作用水平是不明显的。为了克服这种敏感性的窘境，MEK和MAPK二者的磷酸化作用都在本发明的测定法中进行跟踪。MAPK的磷酸化作用信号放大了MEK的磷酸化作用信号，使RAF依赖性磷酸化作用在测定法(例如酶联免疫吸附测定法)中得以跟踪。另外，本发明测定法以高通过量的形式进行，因此能够在短时间内快速监测多种化合物。
另一方面，本发明描述了鉴定调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，该方法包括使表达丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的细胞与该化合物接触以及监测对细胞的效应的步骤。
术语“监测”指的是观察向本方法细胞中加入化合物的效应。该效应可以表示为细胞表型、细胞增殖、蛋白激酶的催化活性或蛋白激酶与天然结合配偶体之间的相互作用方面的改变。
术语“效应”描述细胞表型或细胞增殖的改变或没有改变。“效应”也可描述蛋白激酶的催化活性的改变或没有改变。“效应”也可描述蛋白激酶与天然结合配偶体之间的相互作用的改变或没有改变。
本发明的一个优选实施方案涉及鉴定调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，其中的效应是细胞表型的改变或没有改变。
术语“细胞表型”指的是细胞或组织的外观，或者细胞或组织的功能。细胞表型的实例有细胞尺寸(减小或增大)、细胞增殖(细胞数量的增加或减少)、细胞分化(细胞形状的改变或没有改变)、细胞存活、细胞程序死亡(细胞死亡)或代谢营养物的利用(例如糖的摄取)。细胞表型的改变或没有改变用本领域的已知技术是容易测量的。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及鉴定调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，其中的效应是细胞增殖的改变或没有改变。
术语“细胞增殖”指的是一组细胞分裂的速率。本领域技术人员能够对在容器中生长的细胞数进行定量，方法是用普通的光学显微镜观察预定体积中的细胞数。或者，用实验室仪器定量细胞增殖的速率，该仪器通过光学法或电导法测量在适当介质中的细胞密度。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及鉴定调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，其中的效应是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶与天然结合配偶体之间的相互作用的改变或没有改变。
本发明上下文中的术语“相互作用”描述在蛋白激酶的细胞内区与天然结合配偶体或化合物之间所形成的复合体。术语“相互作用”也可以延及在本发明化合物与所研究蛋白激酶的细胞内区及细胞外区之间所形成的复合体。尽管胞质蛋白激酶不具有细胞外区，而受体蛋白激酶细胞携带着细胞外区和细胞内区。
这里所用的术语“细胞内区”指的是存在于细胞内部的蛋白激酶部分。这里所用的术语“细胞外区”指的是存在于细胞外部的蛋白激酶部分。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及鉴定调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，该方法进一步包括下列步骤：(a)溶解细胞，使溶胞产物包含丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；(b)把丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶吸附到抗体上；(c)用一种或几种底物培养所吸附的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；和(d)把一种或几种底物吸附到固体载体或抗体上。监测对细胞的效应的步骤包括测量一种或几种底物的磷酸盐浓度。
这里所用的术语“溶解”指的是破坏细胞完整性、使其内容物释放出来的方法。细胞溶解是用本领域技术人员已知的多种技术来完成的。该方法优选是用超声处理或细胞剪切技术来完成的，更优选是用洗涤剂技术来完成的。
这里所用的术语“抗体”指的是特异性地与蛋白激酶结合的蛋白质分子。抗体优选地与一类蛋白激酶结合，更优选地，特异性地与RAF蛋白激酶结合。
这里所用的术语“特异性地结合”指的是抗体与一种蛋白激酶结合的亲和性高于与另一种蛋白激酶或细胞蛋白质的亲和性。特异性地与一种蛋白激酶结合的抗体将结合高浓度的特异性蛋白激酶，其浓度高于任何其他蛋白激酶或细胞蛋白质。
这里所用的术语“吸附”指的是分子与抗体或固体载体表面的结合。固体载体的实例有化学修饰的纤维素、例如磷酸纤维素，和尼龙。利用本领域普通技术人员熟知的技术，可将抗体与固体载体连接。例如参见Harlo & Lane，An tibodies，A Laboratory Manual，1989，Cold Spring Harbor Laboratories。
这里所用的术语“测量磷酸盐的浓度”指的是本领域普通技术人员公知的技术。这些技术可涉及定量底物中的磷酸盐浓度或者测定底物中磷酸盐的相对含量。这些技术可包括把底物吸附到一种膜上，用放射性测量方法检测底物中的磷酸盐含量。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及鉴定调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，该方法进一步包括下列步骤：(a)溶解细胞，使溶胞产物包含RAF；(b)把RAF吸附到抗体上；(c)用MEK和MAPK培养所吸附的RAF；和(d)把MEK和MAPK吸附到固体载体或一种或几种抗体上。测量对细胞的效应的步骤包括监测所述MEK和MAPK的磷酸盐浓度。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及鉴定调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，其中该氮杂苯并咪唑类化合物具有如这里所定义的式I、II或III结构或者是这里所述的其任意小类。
术语“化合物”指的是该化合物或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、前体药物、异构体或代谢产物。
术语“药学上可接受的盐”指的是不会取消该化合物的生物活性和性质的化合物制剂。使本发明化合物与无机或有机酸反应，可以得到药物盐，酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
术语“前体药物”指的是在体内转化为母体药物的药剂。在某些情况下，前体药物可能比母体药物更易于给药。例如，前体药物通过口服给药，可能是生物可利用的，而母体药物不是，或者前体药物可以提高溶解度，有利于静脉内给药。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及鉴定调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法，其中该氮杂苯并咪唑类化合物具有如式I、II或III所述结构，其中该氮杂苯并咪唑化合物选自由SABI化合物组成的组。
术语“SABI化合物”指的是一组具有式A或B所述、下表中第A-1至A-198偏号结构的氮杂苯并咪唑类化合物：
   化合物编号 R      X    R    Z
  A-1 苯基     O   -   -
  A-2 苯基     S   -   -
  A-3 苯基     O   甲基   O
  A-4 苯基     O   乙基   O
  A-5 2-硝基苯基     O   -   -
  A-6 3-硝基苯基     O   -   -
  A-7 4-硝基苯基     O   -   -
  A-8 2-氯苯基     O   -   -
  A-9 3-氯苯基     O   -   -
  A-10 4-氯苯基     O   -   -
  A-11 2-甲基苯基     O   -   -
  A-12 3-甲基苯基     O   -   -
  A-13 4-甲基苯基     O   -   -
  A-14 2-氟苯基     O   -   -
  A-15 3-氟苯基     O   -   -
  A-16 4-氟苯基     O   -   -
  A-17 2-(三氟甲基)苯基     O   -   -
  A-18 3-(三氟甲基)苯基     O   -   -
  A-19 4-(三氟甲基)苯基     O   -   -
  A-20 2-甲氧基苯基     O   -   -
   化合物编号 R      X      R      Z
  A-21 3-甲氧基苯基     O     -     -
  A-22 4-甲氧基苯基     O     -     -
  A-23 2-羧基苯基     O     -     -
  A-24 3-羧基苯基     O     -     -
  A-25 4-羧基苯基     O     -     -
  A-26 2-硝基苯基     S     -     -
  A-27 3-硝基苯基     S     -     -
  A-28 4-硝基苯基     S     -     -
  A-29 2-氯苯基     S     -     -
  A-30 3-氯苯基     S     -     -
  A-31 4-氯苯基     S     -     -
  A-32 2-甲基苯基     S     -     -
  A-33 3-甲基苯基     S     -     -
  A-34 4-甲基苯基     S     -     -
  A-35 2-氟苯基     S     -     -
  A-36 3-氟苯基     S     -     -
  A-37 4-氟苯基     S     -     -
  A-38 2-(三氟甲基)苯基     S     -     -
  A-39 3-(三氟甲基)苯基     S     -     -
  A-40 4-(三氟甲基)苯基     S     -     -
  A-41 2-甲氧基苯基     S     -     -
  A-42 3-甲氧基苯基     S     -     -
  A-43 4-甲氧基苯基     S     -     -
  A-44 2-羧基苯基     S     -     -
  A-45 3-羧基苯基     S     -     -
  A-46 4-羧基苯基     S     -     -
   化合物编号 R      X      R      Z
  A-47 苯基     NH     -     -
  A-48 2-硝基苯基     NH     -     -
  A-49 3-硝基苯基     NH     -     -
  A-50 4-硝基苯基     NH     -     -
  A-51 2-氯苯基     NH     -     -
  A-52 3-氯苯基     NH     -     -
  A-53 4-氯苯基     NH     -     -
  A-54 2-甲基苯基     NH     -     -
  A-55 3-甲基苯基     NH     -     -
  A-56 4-甲基苯基     NH     -     -
  A-57 2-氟苯基     NH     -     -
  A-58 3-氟苯基     NH     -     -
  A-59 4-氟苯基     NH     -     -
  A-60 2-(三氟甲基)苯基     NH     -     -
  A-61 3-(三氟甲基)苯基     NH     -     -
  A-62 4-(三氟甲基)苯基     NH     -     -
  A-63 2-甲氧基苯基     NH     -     -
  A-64 3-甲氧基苯基     NH     -     -
  A-65 4-甲氧基苯基     NH     -     -
  A-66 2-羧基苯基     NH     -     -
  A-67  3-羧基苯基     NH     -     -
  A-68 4-羧基苯基     NH     -     -
  A-69 2-硝基苯基     O     甲基     O
  A-70 3-硝基苯基     O     甲基     O
  A-71 4-硝基苯基     O     甲基     O
  A-72 2-氯苯基     O     甲基     O
   化合物编号 R      X    R      Z
  A-73 3-氯苯基     O   甲基     O
  A-74 4-氯苯基     O   甲基     O
  A-75 2-甲基苯基     O   甲基     O
  A-76 3-甲基苯基     O   甲基     O
  A-77 4-甲基苯基     O   甲基     O
  A-78 2-氟苯基     O   甲基     O
  A-79 3-氟苯基     O   甲基     O
  A-80 4-氟苯基     O   甲基     O
  A-81 2-(三氟甲基)苯基     O   甲基     O
  A-82 3-(三氟甲基)苯基     O   甲基     O
  A-83 4-(三氟甲基)苯基     O   甲基     O
  A-84 2-甲氧基苯基     O   甲基     O
  A-85 3-甲氧基苯基     O   甲基     O
  A-86 4-甲氧基苯基     O   甲基     O
  A-87 2-羧基苯基     O   甲基     O
  A-88 3-羧基苯基     O   甲基     O
  A-89 4-羧基苯基     O   甲基     O
  A-90 苯基     S   甲基     O
  A-91 2-硝基苯基     S   甲基     O
  A-92 3-硝基苯基     S   甲基     O
  A-93 4-硝基苯基     S   甲基     O
  A-94 2-氯苯基     S   甲基     O
  A-95 3-氯苯基     S   甲基     O
  A-96 4-氯苯基     S   甲基     O
  A-97 2-甲基苯基     S   甲基     O
  A-98 3-甲基苯基     S   甲基     O
     化合物编号 R      X    R      Z
    A-99 4-甲基苯基     S   甲基     O
    A-100 2-氟苯基     S   甲基     O
    A-101 3-氟苯基     S   甲基     O
    A-102 4-氟苯基     S   甲基     O
    A-103 2-(三氟甲基)苯基     S   甲基     O
    A-104 3-(三氟甲基)苯基     S   甲基     O
    A-105 4-(三氟甲基)苯基     S   甲基     O
    A-106 2-甲氧基苯基     S   甲基     O
    A-107 3-甲氧基苯基     S   甲基     O
    A-108 4-甲氧基苯基     S   甲基     O
    A-109 2-羧基苯基     S   甲基     O
    A-110 3-羧基苯基     S   甲基     O
    A-111 4-羧基苯基     S   甲基     O
    A-112 苯基     NH   甲基     O
    A-113 2-硝基苯基     NH   甲基     O
    A-114 3-硝基苯基     NH   甲基     O
    A-115 4-硝基苯基     NH   甲基     O
    A-116 2-氯苯基     NH   甲基     O
    A-117 3-氯苯基     NH   甲基     O
    A-118 4-氯苯基     NH   甲基     O
    A-119 2-甲基苯基     NH   甲基     O
    A-120 3-甲基苯基     NH   甲基     O
    A-121 4-甲基苯基     NH   甲基     O
    A-122 2-氟苯基     NH   甲基     O
    A-123 3-氟苯基     NH   甲基     O
    A-124 4-氟苯基     NH   甲基     O
   化合物编号 R      X    R      Z
  A-125 2-(三氟甲基)苯基     NH   甲基     O
  A-126 3-(三氟甲基)苯基     NH   甲基     O
  A-127 4-(三氟甲基)苯基     NH   甲基     O
  A-128 2-甲氧基苯基     NH   甲基     O
  A-129 3-甲氧基苯基     NH   甲基     O
  A-130 4-甲氧基苯基     NH   甲基     O
  A-131 2-羧基苯基     NH   甲基     O
  A-132 3-羧基苯基     NH   甲基     O
  A-133 4-羧基苯基     NH   甲基     O
  A-134 2-硝基苯基     O   乙基     O
  A-135 3-硝基苯基     O   乙基     O
  A-136 4-硝基苯基     O   乙基     O
  A-137 2-氯苯基     O   乙基     O
  A-138 3-氯苯基     O   乙基     O
  A-139 4-氯苯基     O   乙基     O
  A-140 2-甲基苯基     O   乙基     O
  A-141 3-甲基苯基     O   乙基     O
  A-142 4-甲基苯基     O   乙基     O
  A-143 2-氟苯基     O   乙基     O
  A-144 3-氟苯基     O   乙基     O
  A-145 4-氟苯基     O   乙基     O
  A-146 2-(三氟甲基)苯基     O   乙基     O
  A-147 3-(三氟甲基)苯基     O   乙基     O
  A-148 4-(三氟甲基)苯基     O   乙基     O
  A-149 2-甲氧基苯基     O   乙基     O
  A-150 3-甲氧基苯基     O   乙基     O
   化合物编号 R      X    R      Z
  A-151 4-甲氧基苯基     O   乙基     O
  A-152 2-羧基苯基     O   乙基     O
  A-153 3-羧基苯基     O   乙基     O
  A-154 4-羧基苯基     O   乙基     O
  A-155 苯基     S   乙基     O
  A-156 2-硝基苯基     S   乙基     O
  A-157 3-硝基苯基     S   乙基     O
  A-158 4-硝基苯基     S   乙基     O
  A-159 2-氯苯基     S   乙基     O
  A-160 3-氯苯基     S   乙基     O
  A-161 4-氯苯基     S   乙基     O
  A-162 2-甲基苯基     S   乙基     O
  A-163 3-甲基苯基     S   乙基     O
  A-164 4-甲基苯基     S   乙基     O
  A-165 2-氟苯基     S   乙基     O
  A-166 3-氟苯基     S   乙基     O
  A-167 4-氟苯基     S   乙基     O
  A-168 2-(三氟甲基)苯基     S   乙基     O
  A-169 3-(三氟甲基)苯基     S   乙基     O
  A-170 4-(三氟甲基)苯基     S   乙基     O
  A-171 2-甲氧基苯基     S   乙基     O
  A-172 3-甲氧基苯基     S   乙基     O
  A-173 4-甲氧基苯基     S   乙基     O
  A-174 2-羧基苯基     S   乙基     O
  A-175 3-羧基苯基     S   乙基     O
  A-176 4-羧基苯基     S   乙基     O
   化合物编号 R      X      R      Z
  A-177 苯基     NH     乙基     O
  A-178 2-硝基苯基     NH     乙基     O
  A-179 3-硝基苯基     NH     乙基     O
  A-180 4-硝基苯基     NH     乙基     O
  A-181 2-氯苯基     NH     乙基     O
  A-182 3-氯苯基     NH     乙基     O
  A-183 4-氯苯基     NH     乙基     O
  A-184 2-甲基苯基     NH     乙基     O
  A-185 3-甲基苯基     NH     乙基     O
  A-186 4-甲基苯基     NH     乙基     O
  A-187 2-氟苯基     NH     乙基     O
  A-188 3-氟苯基     NH     乙基     O
  A-189 4-氟苯基     NH     乙基     O
  A-190 2-(三氟甲基)苯基     NH     乙基     O
  A-191 3-(三氟甲基)苯基     NH     乙基     O
  A-192 4-(三氟甲基)苯基     NH     乙基     O
  A-193 2-甲氧基苯基     NH     乙基     O
  A-194 3-甲氧基苯基     NH     乙基     O
  A-195 4-甲氧基苯基     NH     乙基     O
  A-196 2-羧基苯基     NH     乙基     O
  A-197 3-羧基苯基     NH     乙基     O
  A-198 4-羧基苯基     NH     乙基     O
II.预防或治疗异常状态的方法
另一方面，本发明的特征在于预防或治疗生物体异常状态的方法，通过将本发明化合物对生物体给药，该化合物是如具有这里所提供的任意约束条件的式I、II或III所确定的。
术语“生物体”指的是任意活着的实体，包含至少一个细胞。生物体可以简单如一个真核细胞，也可以复杂如哺乳动物。在优选的实施方案中，生物体指的是人或哺乳动物。
术语“预防”指的是本发明的减少概率或排除概率的方法，概率指生物体感染或发展异常状态的概率。
术语“治疗”指的是本发明的具有治疗效果和至少在部分程度上减轻或消除生物体异常状态的方法。
术语“治疗效果”指的是抑制导致或归因于异常状态的细胞生长。术语“治疗效果”也指抑制导致或归因于异常状态(例如癌症)的生长因子。治疗效果在一定程度上缓解异常状态的一种或几种症状。关于癌症的治疗，治疗效果指的是下列之一或若干：(a)肿瘤尺寸的减小；(b)肿瘤转移的抑制(即延缓或停止)；(c)肿瘤生长的抑制；和(d)在一定程度上缓解一种或几种与异常状态有关的症状。证实对白血病有效的化合物可如本文所述进行鉴定，不过这些化合物并不抑制转移，而是延缓或减少细胞增殖或细胞生长。
术语“异常状态”指的是生物体细胞或组织的功能偏离其正常功能。异常状态可涉及细胞增殖、细胞分化或细胞存活。
异常的细胞增殖状态包括癌症、如纤维变性和肾小球系膜病症，还包括异常的血管生成和血管发生、伤口愈合、牛皮癣、糖尿病和炎症。
异常的分化状态包括但不限于神经变性疾病、伤口愈合缓慢和组织移植技术。
异常的细胞存活状态涉及编程性细胞死亡(细胞程序死亡)途径被活化或被取消的情况。一些蛋白激酶与细胞程序死亡途径有关。任何一种蛋白激酶的功能异常都可能导致细胞的无限增殖化或未成熟细胞的死亡。
细胞增殖、分化和存活是用本领域的简单方法即可测量的现象。这些方法可涉及在显微镜下观察细胞数量或细胞外观随时间(例如，天)的变化。
术语“给药”广义上涉及对生物体给以化合物，更确切地涉及向生物体细胞或组织中引入化合物的方法。当生物体细胞或组织存在于生物体内或生物体外时，异常状态得以预防或治疗。存在于生物体外的细胞得以维持或在细胞培养皿中生长。对生存在生物体内的细胞来说，本领域有很多用于将化合物给药的方法，包括(但不限于)口服、胃肠外、皮肤、注射和气雾剂应用。对生物体外的细胞来说，本领域有很多用于将化合物给药的方法，包括(但不限于)细胞微注射技术、转化技术和载体技术。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及预防或治疗生物体异常状态的方法，其中该氮杂苯并咪唑类化合物具有如这里所定义的式I、II或III所示的结构或者是这里所述的其任意小类。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及预防或治疗生物体异常状态的方法，其中该氮杂苯并咪唑化合物选自由SABI化合物组成的组。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及预防或治疗生物体异常状态的方法，其中该生物体是一种哺乳动物。
术语“哺乳动物”优选指的是小鼠、大鼠、兔、豚鼠和山羊等生物，更优选为猴和猿，最优选为人。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及预防或治疗生物体异常状态的方法，其中该异常状态是癌症或纤维变性病症。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及预防或治疗生物体异常状态的方法，其中癌症选自由肺癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、轴内脑癌(intra-axial brain cancer)、结肠癌、前列腺癌、肉瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤和神经胶质瘤组成的组。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及预防或治疗生物体异常状态的方法，其中该方法应用于与信号转导途径异常有关的异常状态，该信号转导途径以丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶与天然结合配偶体之间的相互作用为特征。
术语“信号转导途径”指的是信号的传播。一般来说，细胞外信号穿过细胞膜传送，成为细胞内信号。然后该信号能够刺激细胞应答。该术语也涵盖完全在细胞内传播的信号。参与信号转导过程的多肽分子通常是受体与非受体蛋白激酶、受体与非受体蛋白磷酸酶、核苷酸交换因子和转录因子。
术语“异常”连同信号转导过程指的是这样的蛋白激酶，它在生物体中过度表达或表达不足，发生变异使其催化活性低于或高于野生型蛋白激酶活性，发生变异使其不再能够与天然结合配偶体产生相互作用，不再被另一种蛋白激酶或蛋白磷酸酶所修饰或者不再与天然结合配偶体产生相互作用。
术语“促进或破坏异常的相互作用”指的是能够通过将本发明化合物对生物体细胞或组织给药而完成的方法。通过在复合体界面与多个原子形成有利的相互作用，化合物能够促进蛋白激酶与天然结合配偶体之间的相互作用。或者，通过危及在复合体界面原子之间形成的有利相互作用，化合物能够抑制蛋白激酶与天然结合配偶体之间的相互作用。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及预防或治疗生物体异常状态的方法，其中该丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是RAF。
III.本发明的化合物和药物组合物
另一方面，本发明的特征在于具有式I、II或III所述结构的氮杂苯并咪唑化合物：
Figure C9881075300241
其中
(a)R1、R2、R3和R4独立地选自下组：
(i)氢；
(ii)饱和或不饱和烷基；
(iii)NX2X3，其中X2和X3独立地选自由氢、饱和或不饱和烷基和同素环或杂环部分组成的组；
(iv)卤素或三卤甲基；
(v)式-CO-X4的酮，其中X4选自由氢、烷基和同素环或杂环部分组成的组；
(vi)式-(X5)n-COOH的羧酸或式-(X6)n-COO-X7的酯，其中X5、X6和X7独立地选自由烷基和同素环或杂环部分组成的组，其中n是0或1；
(vii)式(X8)n-OH的醇或式-(X8)n-O-X9的烷氧基部分，其中X8和X9独立地选自由氢、饱和或不饱和烷基和同素环或杂环部分组成的组，其中该环可选地被一个或多个取代基取代，取代基独立地选自由烷基、烷氧基、卤素、三卤甲基、羧酸根、硝基和酯组成的组，其中n是0或1；
(viii)式-NHCOX10的酰胺，其中X10选自由烷基、羟基和同素环或杂环部分组成的组，其中该环可选地被一个或多个取代基取代，取代基独立地选自由烷基、烷氧基、卤素、三卤甲基、羧酸根、硝基和酯组成的组；
(ix)-SO2NX11X12，其中X11和X12选自由氢、烷基和同素环或杂环部分组成的组；
(x)同素环或杂环部分，可选地被一个、两个或三个取代基取代，取代基独立地选自由烷基、烷氧基、卤素、三卤甲基、羧酸根、硝基和酯部分组成的组；
(xi)式-CO-H的醛；和
(xii)式-SO2-X13的砜，其中X13选自由饱和或不饱和烷基和同素环或杂环部分组成的组；
(b)Z1和Z2独立地选自由氮、硫、氧、NH和NR4组成的组，其条件是如果Z1和Z2之一是氮、NH或NR4，那么Z1和Z2中的另一个是氮、硫、氧、NH或NR4；且
(c)Z3和X1独立地选自由氮、硫和氧组成的组。
术语“饱和烷基”指的是烷基部分不含有任何烯或炔部分。烷基部分可以是支链的或非支链的。
术语“不饱和烷基”指的是烷基部分含有至少一个烯或炔部分。烷基部分可以是支链的或非支链的。
术语“胺”指的是式NR1R2的化学部分，其中R1和R2独立地选自由氢、饱和或不饱和烷基和同素环或杂环部分组成的组，其中该环可选地被一个或多个取代基取代，取代基独立地选自由烷基、卤素、三卤甲基、羧酸根、硝基和酯部分组成的组。
术语“芳基”指的是具有至少一个环的芳族基团，既包括碳环芳基(例如苯基)，又包括杂环芳基(例如吡啶)，该环具有共轭的π电子系统。术语“碳环”指的是含有一个或多个共价闭合环结构的化合物，并且构成环主干的原子都是碳原子。该术语因此将碳环和杂环区分开来，后者的环主干含有至少一个不是碳的原子。术语“杂芳基”指的是含有至少一个杂环的芳基。
术语“卤素”指的是选自氟、氯、溴和碘的原子。
术语“酮”指的是式-(R)n-CO-R′的化学部分，其中R和R′选自由饱和或不饱和烷基和同素环或杂环部分组成的组，n是0或1。
术语“羧酸”指的是式-(R)n-COOH的化学部分，其中R选自由饱和或不饱和烷基和同素环或杂环部分组成的组，n是0或1。
术语“酯”指的是式-(R)n-COO-R′的化学部分，其中R和R′选自由饱和或不饱和烷基和同素环或杂环部分组成的组，n是0或1。
术语“醇”指的是式-ROH的化学取代基，其中R选自由氢、饱和或不饱和烷基和同素环或杂环部分组成的组，其中该环可选地被一个或多个取代基取代，取代基独立地选自由烷基、卤素、三卤甲基、羧酸根、硝基和酯部分组成的组。
术语“酰胺”指的是式-NHCOR的化学取代基，其中R选自由氢、烷基、羟基和同素环或杂环部分组成的组，其中该环可选地被一个或多个取代基取代，取代基独立地选自由烷基、卤素、三卤甲基、羧酸根、硝基或酯组成的组。
术语“烷氧基部分”指的是式-OR的化学取代基，其中R是氢或饱和或不饱和烷基部分。
术语“醛”指的是式-(R)n-CHO的化学部分，其中R选自由饱和或不饱和烷基和同素环或杂环部分组成的组，n是0或1。
术语“砜”指的是式-SO2-R的化学部分，其中R选自由饱和或不饱和烷基和同素环或杂环部分组成的组。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及具有式I、II或III所述结构的氮杂苯并咪唑类化合物，其中Z1和Z2独立地选自由氮和NH组成的组。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及具有式I、II或III所述结构的氮杂苯并咪唑类化合物，其中R1、R2、R3和R4独立地选自下组：氢；饱和或不饱和烷基，可选地被同素环或杂环部分取代，其中该环部分可选地被一个、两个或三个取代基取代，取代基独立地选自由烷基、烷氧基、卤素、三卤甲基、羟基、烷氧基、羧酸根、硝基和酯部分组成的组；和同素环或杂环部分，可选地被一个、两个或三个取代基取代，取代基独立地选自由烷基、烷氧基、卤素、三卤甲基、羟基、烷氧基、羧酸根、硝基和酯部分组成的组。
在其他优选的实施方案中，本发明涉及具有式I、II或III所述结构的氮杂苯并咪唑类化合物，其中R2和R3是氢。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及具有式I、II或III所述结构的氮杂苯并咪唑类化合物，其中R1是苯基，可选地被一个、两个或三个取代基取代，取代基独立地选自由烷基、烷氧基、卤素、三卤甲基、羧酸根、硝基或酯部分组成的组。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及具有式I、II或III所述结构的氮杂苯并咪唑类化合物，其中R1选自由SABI取代基组成的组。
术语“SABI取代基”指的是下组取代基：苯基、2-硝基苯基、3-硝基苯基、4-硝基苯基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、2-氟苯基、3-氟苯基、4-氟苯基、2-(三氟甲基)苯基、3-(三氟甲基)苯基、4-(三氟甲基)苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2-羧基苯基、3-羧基苯基和4-羧基苯基。
在其他优选的实施方案中，本发明涉及具有式I、II或III所述结构的氮杂苯并咪唑类化合物，其中X1是硫。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及具有式I、II或III所述结构的氮杂苯并咪唑类化合物，其中X1是氧。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及具有式I、II或III所述结构的氮杂苯并咪唑类化合物，其中Z3是氧。
在其他优选的实施方案中，本发明涉及具有式I、II或III所述结构的氮杂苯并咪唑类化合物，其中R4选自由甲基和乙基组成的组。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及具有式I、II或III所述结构的氮杂苯并咪唑类化合物，其中该氮杂苯并咪唑化合物选自由SABI化合物组成的组。
另一方面，本发明的特征在于药物组合物，该组合物包含如这里所指定的化合物或其盐和一种生理学上可接受的载体或稀释剂。
另一方面，本发明涉及药物组合物，该组合物包含具有如这里所定义的式I、II或III结构的化合物或者是这里所述的任意小类化合物。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及药物组合物，其中该氮杂苯并咪唑化合物选自由SABI化合物组成的组。
术语“药物组合物”指的是本发明的氮杂苯并咪唑化合物与其他化学组分(例如稀释剂或载体)的混合物。药物组合物有利于化合物对生物体的给药。本领域有多种化合物给药方法，包括但不限于口服、注射、气雾剂、胃肠外和局部给药。也可以使化合物与无机酸反应而得到药物组合物，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
术语“生理学上可接受的”定义了不会取消化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。
术语“载体”定义了有利于向细胞或组织中引入化合物的化合物。例如，二甲基亚砜(DMSO)是一种常用载体，它促进生物体细胞或组织对很多有机化合物的摄取。
术语“稀释剂”定义了稀释在水中的化合物，它将溶解本发明化合物以及稳定该化合物的生物活性形式。溶解在缓冲溶液中的盐在本领域中用作稀释剂。一种常用的缓冲溶液是磷酸盐缓冲的盐水，因为它模拟了人血液的盐条件。由于低浓度的缓冲盐即可控制溶液的pH，被缓冲的稀释剂很少改变化合物的生物活性。
IV.本发明的合成方法
另一方面，本发明涉及用于合成式I、II或III的氮杂苯并咪唑化合物的方法，包括下列步骤：(a)使2-氨基-6-氯-3-硝基吡啶与第二反应剂在溶剂中反应，得到第一中间体，其中该第二反应剂是取代的芳基环；(b)在催化剂和还原剂的存在下，还原第一中间体，得到第二中间体；(c)使第二中间体与第三反应剂反应；和(d)纯化本发明的化合物。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及合成本发明化合物的方法，其中该取代的芳基环是取代的苯酚、取代的苯硫酚和取代的苯胺。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及合成本发明化合物的方法，其中该取代的苯酚、取代的苯硫酚和取代的苯胺选自由SABI反应剂组成的组。
术语“SABI反应剂”指的是下组反应剂的钠盐：苯酚、2-硝基苯酚、3-硝基苯酚、4-硝基苯酚、2-氯苯酚、3-氯苯酚、4-氯苯酚、2-甲酚、3-甲酚、4-甲酚、2-氟苯酚、3-氟苯酚、4-氟苯酚、2-(三氟甲基)苯酚、3-(三氟甲基)苯酚、4-(三氟甲基)苯酚、2-甲氧基苯酚、3-甲氧基苯酚、4-甲氧基苯酚、2-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、苯硫酚、2-硝基苯硫酚、3-硝基苯硫酚、4-硝基苯硫酚、2-氯苯硫酚、3-氯苯硫酚、4-氯苯硫酚、2-甲苯硫酚、3-甲苯硫酚、4-甲苯硫酚、2-氟苯硫酚、3-氟苯硫酚、4-氟苯硫酚、2-(三氟甲基)苯硫酚、3-(三氟甲基)苯硫酚、4-(三氟甲基)苯硫酚、2-甲氧基苯硫酚、3-甲氧基苯硫酚、4-甲氧基苯硫酚、2-巯基苯甲酸、3-巯基苯甲酸、4-巯基苯甲酸、苯胺、2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-硝基苯胺、2-氯苯胺、3-氯苯胺、4-氯苯胺、2-甲苯胺、3-甲苯胺、4-甲苯胺、2-氟苯胺、3-氟苯胺、4-氟苯胺、2-(三氟甲基)苯胺、3-(三氟甲基)苯胺、4-(三氟甲基)苯胺、2-茴香胺、3-茴香胺、4-茴香胺、2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸和4-氨基苯甲酸。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及合成本发明化合物的方法，其中该溶剂是正丙醇。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及合成本发明化合物的方法，其中该还原剂是氢。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及合成本发明化合物的方法，其中该催化剂是阮内镍。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及合成本发明化合物的方法，其中该第三反应剂是O-甲基异脲。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及合成本发明化合物的方法，其中该第三反应剂是S-甲基异硫脲鎓硫酸盐与氯甲酸烷基酯的反应产物。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及合成本发明化合物的方法，其中该氯甲酸烷基酯是氯甲酸甲酯。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及合成本发明化合物的方法，其中该氯甲酸烷基酯是氯甲酸乙酯。
上述本发明概述是非限制性的，通过下列对优选实施方案和权利要求书的说明，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。
优选实施方案的说明
本发明部分涉及用氮杂苯并咪唑类化合物调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的方法。另外，本发明部分涉及鉴定调制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的化合物的方法。该方法引入了表达丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、例如RAF的细胞。
RAF是一种非受体蛋白激酶，当它与活化RAS结合时，被募集到细胞膜，RAS是鸟嘌呤三磷酸酯水解酶。当活化受体蛋白酪氨酸激酶、例如EGFR或PDGFR与衔接蛋白GRB2和鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS结合时，RAS被活化。SOS从RAS除去鸟嘌呤二磷酸酯，代之以鸟嘌呤三磷酸酯，由此活化RAS。然后，RAS结合RAF，因此活化RAF。然后，RAF可以在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化其他蛋白靶，例如磷酸化并因此活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激酶(MEK)。因此，RAF在促分裂原活化信号转导中充当中介控制因子。
由于RAF在细胞中的重要调节作用，修饰RAF的氨基酸序列能够改变其功能，并因此修饰细胞行为。RAF氨基酸序列的突变与肿瘤和癌症有关，这一观察结果强调了RAF在细胞增殖中的作用。因为引起细胞癌症的RAF突变会产生显示未调催化活性的RAF分子，所以RAF抑制剂可以减轻或者甚至消除引起这些细胞癌症的细胞增殖。
本发明方法能够检测调制细胞中蛋白激酶RAF功能的化合物。RAF磷酸化一种蛋白激酶(MEK)，后者又磷酸化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)。仅用RAF监测MEK的磷酸化作用的测定法是不敏感的，因为MEK的磷酸化作用水平是不明显的。为了克服这种敏感性的窘境，MEK和MAPK二者的磷酸化作用都在本发明的测定法中进行跟踪。MAPK的磷酸化作用信号放大了MEK的磷酸化作用信号，使RAF依赖性磷酸化作用在酶联免疫吸附测定法中得以被跟踪。另外，本发明测定法的样本流量高，因此能够在短时间内快速监测多种化合物。
本发明方法鉴定了抑制RAF蛋白激酶功能的化合物。这些化合物是氮杂苯并咪唑类衍生物。尽管已经试验了氮杂苯并咪唑类衍生物对参与细菌核苷酸合成的酶的抑制能力，不过很多这些化合物尚未对其蛋白激酶抑制作用进行有价值的研究。
因为RAF表现出明显的与其他丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的氨基酸同源性，本发明的氮杂苯并咪唑类化合物因此可能抑制除RAF以外的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。因此，本发明方法也涉及除RAF以外的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括受体与非受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。
本发明方法也涉及其他调制细胞中RAF功能的化合物，该方法的高产使短时间试验一大系列分子成为可行。因此，本发明方法能够鉴定本发明中没有公开的调制STK(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)功能的现有分子。
I.氮杂苯并咪唑类化合物的生物活性
对本发明的氮杂苯并咪唑类化合物的抑制RAF蛋白激酶功能的能力进行了试验。这里报告了对这些抑制作用研究的生物测定和结果。用于测量氮杂苯并咪唑类化合物对蛋白激酶功能的调制作用的方法类似于Tang等人的于1996年8月23日提交的美国申请08/702,232号中描述的那些，发明名称为“二氢吲哚酮(Indolinone)组合文库和用于疾病治疗的相关产物与方法”(Lyon & Lyon Docket No.221/187)，涉及该方法的高产方面。包括所有附图在内的08/702,232申请全文引用在此作为参考文献。
II.用氮杂苯并咪唑类化合物治疗的靶疾病
这里所述的方法、化合物和药物组合物被设计为通过调制RAF蛋白激酶功能来抑制细胞增殖病症。增殖病症导致多细胞生物中一个或几个细胞子集发生不希望有的细胞增殖，这对生物体有害。这里所述的方法、化合物和药物组合物也可以用于治疗和预防生物体的其他病症，例如与早熟细胞死亡有关的病症(即神经病学上的疾病)或炎症。这些疾病可以是RAF分子功能不适宜的结果，或者是RAF相关蛋白激酶分子功能不适宜的结果。
RAF蛋白激酶或与RAF有关的蛋白激酶的功能改变在某些疾病中能导致明显的细胞增殖状态增强或减弱。异常的细胞增殖状态包括癌症、纤维变性病症、肾小球系膜病症、异常的血管生成和血管发生、伤口愈合、牛皮癣、再狭窄和炎症。
纤维变性病症涉及细胞的细胞外基质的异常形成。纤维变性病症的一个实例是肝硬化。肝硬化的特征在于细胞外基质组分的浓度增加，导致肝脏瘢痕的形成。肝硬化可导致肝脏硬化等疾病。
肾小球系膜细胞增殖性病症的发生原因是肾小球系膜细胞的异常增殖。肾小球系膜增殖性病症包括多种人肾疾病，例如肾小球性肾炎、糖尿病性肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病综合征、移植排斥和肾小球病。
优选可以用本发明方法和化合物治疗的癌症类型是肺癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、轴内脑癌、结肠癌、前列腺癌、肉瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤和神经胶质瘤。这里所提供的证据表明，本发明化合物和方法能够有效地用来阻止和逆转癌细胞的增殖，供参考。
血管生成和血管发生病症是由血管的过度增殖引起的。血管增殖在各种正常的生理过程中都是必要的，例如胚胎发育、黄体形成、伤口愈合和器官再生。不过，血管增殖也是癌肿发育所必需的。其他血管增殖性病症的实例包括关节炎，其中新生毛细血管侵入关节并破坏软骨。另外，血管增殖性病症还包括眼疾病，例如糖尿病性视网膜病，其中视网膜中的新生毛细血管侵入玻璃体，导致出血和失明。相反，与血管皱缩、收缩或闭合有关的病症、例如再狭窄，也涉及蛋白激酶的不利调节功能。
而且，血管生成和血管发生与恶性固体肿瘤的生长和转移有关。迅速生长的癌肿需要富含养分和氧的血液供应以继续生长。其结果是，异常大量的毛细血管经常与肿瘤同步生长，充当肿瘤的补给线。除了向肿瘤供应养分以外，嵌入肿瘤的新生血管还为肿瘤细胞提供了进入生物体循环和转移至远端部位的通路。Folkman，1990，《国立癌症研究所杂志》(J.Natl.Cancer Inst.)82：4-6。
不适宜的RAF活性可刺激产生细胞增殖性病症。特别设计成调制RAF蛋白激酶功能的分子已显示可抑制细胞增殖。具体来说，将反义核酸分子设计成既与编码RAF蛋白激酶的信使RNA结合又阻滞该信使的翻译，它们体外可有效逆转A549细胞的转化。Monia等1996《天然药物》(Nature Medicine)2：688，包括所有图表在内的全文引用在此作为参考文献。A549细胞是人恶性细胞。
这些以RAF为目标的反义研究所提供的证据表明，调制RAF蛋白激酶功能的本发明氮杂苯并咪唑分子能够阻止、同样可能逆转生物体中恶性细胞的增殖。这些氮杂苯并咪唑化合物可以用本文实施例所提供的体外方法进行试验。而且，也用本文实施例所提供的异种移植方法，还可以试验氮杂苯并咪唑化合物体内对肿瘤细胞的效应。
不适宜的RAF活性刺激特定类型细胞产生不希望有的细胞增殖的方式至少有两种：(1)直接刺激特定细胞的生长；或(2)增加特定区域、例如肿瘤组织的血管形成，从而促进组织的生长。
首先鉴定细胞增殖性病症是否由RAF驱动，这有助于本发明的使用。一旦鉴定为这样的病症，即可利用本领域普通医师或兽医熟知的程序分析他们的症状，确诊患有该病症的患者。然后可以用这里所述的方法对患者进行治疗。
要确定细胞增殖性病症是否由RAF驱动，首先测定患者体内细胞或特定位置的RAF活性水平。例如在癌细胞的情况下，可以比较非RAF驱动的癌症与RAF驱动的癌症之间的一种或几种RAF活性水平。如果癌细胞的RAF活性水平高于RAF驱动的癌症，优选为等于或大于RAF驱动的癌症，那么它们是利用本发明所述的调制RAF的方法和化合物进行治疗的候选对象。
在细胞增殖性病症是由非癌细胞的不希望有的增殖引起的情况下，将其RAF活性水平与普通群体比较(例如，不包括患有细胞增殖性病症的人或动物的普通人或动物群体的平均水平)。如果不希望有的细胞增殖病症的特征在于其RAF水平高于普通群体，那么该病症是利用本发明所述的调制RAF的方法和化合物进行治疗的候选对象。
III.氮杂苯并咪唑类化合物的药物组合物和给药
制备该化合物的药物组合物的方法、测定对患者给药的化合物量的方法和化合物对生物体给药的方式公开在Tang等人的于1996年8月23日提交的美国申请08/702,232号，发明名称为“二氢吲哚酮组合文库和用于疾病治疗的相关产物与方法”(Lyon & Lyon DocketNo.221/187)，和Buzzetti等人的于1996年8月1日公开的国际专利申请WO 96/22976号，发明名称为“作为酪氨酸激酶抑制剂的水溶性3-亚芳基-2-氧化吲哚衍生物”，包括所有附图在内的二者全文引用在此作为参考文献。本领域的技术人员将领会到，这些说明适用于本发明，并且能够容易地适应本发明。
实施例
下列实施例是非限制性的，仅是本发明不同方面和特征的代表。实施例描述了合成本发明化合物的方法和测量化合物对RAF蛋白激酶功能的效应的方法。
这些方法中所用的细胞是商业上可得到的。由细胞所携带的核酸载体也是商业上可得到的，不同蛋白激酶的基因序列是易于在序列数据库中查到的。因此，本领域的普通技术人员利用容易获得的技术，通过结合商业上可得到的细胞、商业上可得到的核酸载体和蛋白激酶基因，能够容易地适时再创造细胞系。
实施例1：合成本发明的氮杂苯并咪唑化合物的操作
现在将以下列非限制性实施例对本发明进行阐述，其中，除非另有说明：
(i)蒸发是在真空下用旋转蒸发法进行的；
(ii)操作是在惰性气体气氛下进行的，例如氮；
(iii)高效液相色谱法(HPLC)是在Merck LiChrosorb RP-18反相二氧化硅上进行的，得自E.Merck，Darmstadt，Germany；
(iv)产率仅供举例说明之用，不必是可达到的最大值；
(v)熔点是未校正的，用HWS Mainz SG 2000数字熔点仪测定；
(vi)所有本发明式I、II和III化合物的结构是用质子磁共振谱、元素微量分析和某些情况下的质谱确定的，质子磁共振谱使用Bruker AMX500-NMR分光光度计；
(vii)结构的纯度用薄层色谱法(TLC)或HPLC测定，TLC使用硅胶(Merck Silica Gel 60 F254)；和
(vii)中间体一般没有进行完整的特征鉴定，其纯度用薄层色谱法(TLC)或HPLC测定。
合成操作
化合物A-90：2-甲氧羰基氨基-6-(苯巯基-3H-咪唑并[4，5-b] 吡啶
2-氨基-3-硝基-6-(苯巯基)吡啶的制备方法是将2-氨基-6-氯-3-硝基吡啶(84.0g，0.484mol)和苯硫酚钠(Fluka)(72.0g，0.545mol)在2-丙醇(1500ml)中加热回流2小时。冷却至室温后，混悬液用水(100ml)稀释，真空过滤收集固体，用水和2-丙醇洗涤，在50℃真空下干燥，得到109.1g(95％产率)2-氨基-3-硝基-6-(苯巯基)吡啶，熔点148-152℃。
2，3-二氨基-6-(苯巯基)吡啶的制备方法是在70℃1200ml 2-丙醇中，在30g阮内镍的存在下，在5atm H2下氢化2-氨基-3-硝基-6-(苯巯基)吡啶(107.1g，0.433mol)。4小时(29.1L氢)后，把反应混合物冷却至4℃，继续搅拌。真空过滤收集沉淀，用2-丙醇洗涤，在50℃真空下干燥。合并了的滤液在减压下浓缩，用2-丙醇重结晶。用1000ml THF洗涤氢化设备两次，在减压下蒸发，用2-丙醇重结晶后，收集沉淀，在50℃真空下干燥，得到80.4g(87.1％产率)2，3-二氨基-6-(苯巯基)吡啶，熔点119-122℃。
2-甲氧羰基氨基-6-苯巯基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的制备方法是向S-甲基异硫脲鎓硫酸盐(53g，0.19mol)(Aldrich)在68ml水中的冷溶液(5-15℃)中滴加氯甲酸甲酯(34ml，0.44mol)，同时保持温度低于20℃。然后，小心地加入氢氧化钠水溶液(116g，25％NaOH)，有白色沉淀生成。20分钟后，加入水(210ml)，用乙酸(冰乙酸，34ml)调pH为4.0。向该混合物中滴加2，3-二氨基-6-(苯巯基)吡啶(37.8g，0.174mol)在210ml乙醇中的溶液，加热至85-90℃保持2小时。冷却反应混合物过夜后，过滤分离沉淀，用温水(1000ml)洗涤，干燥，在4℃下用乙酸和乙醇重结晶。过滤收集沉淀，用甲醇洗涤，在50℃真空下干燥，得到30g(57.4％产率)2-甲氧羰基氨基-6-苯巯基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶，熔点269-274℃(分解)。
化合物A-3：2-甲氧羰基氨基-(6-苯氧基-3H-咪唑并[4，5-b]吡 啶
用苯酚钠代替实施例A-90中的苯硫酚钠，进行相同的过程，得到2-甲氧羰基氨基-(6-苯氧基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶，熔点＞280℃(分解)。
化合物A-4：2-乙氧羰基氨基-(6-苯氧基-3H-咪唑并[4，5-b]吡 啶
用氯甲酸乙酯代替实施例A-3中的氯甲酸甲酯，进行相同的过程，得到2-乙氧羰基氨基-(6-苯氧基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶，熔点＞280℃(分解)。
化合物A-1：2-氧代-6-苯氧基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
使O-甲基异脲直接与2，3-二氨基-6-(苯巯基)吡啶反应，代替实施例A-3中S-甲基异硫脲鎓硫酸盐与氯甲酸甲酯的反应产物，进行相同的过程，得到2-氧代-(6-苯氧基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶，熔点277-278℃。
化合物A-2：2-氧代-6-苯巯基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶用苯硫酚钠代替实施例A-1中的苯酚钠，进行相同的过程，得到2-氧代-(6-苯巯基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶，熔点253-254℃。
化合物A-5至A-25：
用适当的苯酚盐代替实施例A-1中的苯酚钠，进行相同的过程，得到下列实施例。对实施例A-23、A-24和A-25来说，羧基被甲基、乙基、苄基、叔丁基或其他适当的酯保护起来，然后在最后一步中去保护，得到相应化合物。
A-5    2-氧代-6-(2-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-6    2-氧代-6-(3-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-7    2-氧代-6-(4-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-8    2-氧代-6-(2-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-9    2-氧代-6-(3-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-10   2-氧代-6-(4-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-11   2-氧代-6-(2-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-12   2-氧代-6-(3-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-13   2-氧代-6-(4-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-14   2-氧代-6-(2-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-15   2-氧代-6-(3-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-16   2-氧代-6-(4-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-17   2-氧代-6-[2-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-18   2-氧代-6-[3-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-19   2-氧代-6-[4-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-20   2-氧代-6-(2-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-21   2-氧代-6-(3-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-22   2-氧代-6-(4-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-23   2-氧代-6-(2-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-24  2-氧代-6-(3-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-25  2-氧代-6-(4-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
化合物A-26至A-46
用适当的苯硫酚盐代替实施例A-2中的苯硫酚钠，进行相同的过程，得到下列实施例。对实施例A-44、A-45和A-46来说，羧基被甲基、乙基、苄基、叔丁基或其他适当的酯保护起来，然后在最后一步中去保护，得到相应化合物。
A-26  2-氧代-6-(2-硝基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-27  2-氧代-6-(3-硝基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-28  2-氧代-6-(4-硝基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-29  2-氧代-6-(2-氯苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-30  2-氧代-6-(3-氯苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-31  2-氧代-6-(4-氯苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-32  2-氧代-6-(2-甲基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-33  2-氧代-6-(3-甲基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-34  2-氧代-6-(4-甲基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-35  2-氧代-6-(2-氟苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-36  2-氧代-6-(3-氟苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-37  2-氧代-6-(4-氟苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-38  2-氧代-6-[2-(三氟甲基)苯巯基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-39  2-氧代-6-[3-(三氟甲基)苯巯基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-40  2-氧代-6-[4-(三氟甲基)苯巯基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-41  2-氧代-6-(2-甲氧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-42  2-氧代-6-(3-甲氧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-43  2-氧代-6-(4-甲氧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-44  2-氧代-6-(2-羧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-45  2-氧代-6-(3-羧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-46  2-氧代-6-(4-羧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
化合物A-47至A-68：
用适当的苯胺盐代替实施例A-1中的苯酚钠，进行相同的过程，得到下列实施例。对实施例A-66、A-67和A-68来说，羧基被甲基、乙基、苄基、叔丁基或其他适当的酯保护起来，然后在最后一步中去保护，得到相应化合物。
A-47  2-氧代-6-苯氨基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-48  2-氧代-6-(2-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-49  2-氧代-6-(3-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-50  2-氧代-6-(4-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-51  2-氧代-6-(2-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-52  2-氧代-6-(3-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-53  2-氧代-6-(4-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-54  2-氧代-6-(2-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-55  2-氧代-6-(3-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-56  2-氧代-6-(4-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-57  2-氧代-6-(2-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-58  2-氧代-6-(3-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-59  2-氧代-6-(4-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-60  2-氧代-6-[2-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-61  2-氧代-6-[3-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-62  2-氧代-6-[4-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-63  2-氧代-6-(2-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-64  2-氧代-6-(3-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-65  2-氧代-6-(4-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-66  2-氧代-6-(2-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-67  2-氧代-6-(3-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-68  2-氧代-6-(4-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
化合物A-69至A-89
用适当的苯酚盐代替实施例A-3中的苯酚钠，进行相同的过程，得到下列实施例。对实施例A-87、A-88和A-89来说，羧基被甲基、乙基、苄基、叔丁基或其他适当的酯保护起来，然后在最后一步中去保护，得到相应化合物。
A-69  2-甲氧羰基氨基-6-(2-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-70  2-甲氧羰基氨基-6-(3-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-71  2-甲氧羰基氨基-6-(4-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-72  2-甲氧羰基氨基-6-(2-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-73  2-甲氧羰基氨基-6-(3-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-74  2-甲氧羰基氨基-6-(4-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-75  2-甲氧羰基氨基-6-(2-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-76  2-甲氧羰基氨基-6-(3-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-77  2-甲氧羰基氨基-6-(4-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-78  2-甲氧羰基氨基-6-(2-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-79  2-甲氧羰基氨基-6-(3-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-80  2-甲氧羰基氨基-6-(4-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-81  2-甲氧羰基氨基-6-[2-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-82  2-甲氧羰基氨基-6-[3-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-83  2-甲氧羰基氨基-6-[4-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-84  2-甲氧羰基氨基-6-(2-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-85  2-甲氧羰基氨基-6-(3-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-86  2-甲氧羰基氨基-6-(4-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-87  2-甲氧羰基氨基-6-(2-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-88  2-甲氧羰基氨基-6-(3-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-89  2-甲氧羰基氨基-6-(4-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
化合物A-91至A-111
用适当的苯硫酚盐代替实施例A-90中的苯硫酚钠，进行相同的过程，得到下列实施例。对实施例A-109、A-110和A-111来说，羧基被甲基、乙基、苄基、叔丁基或其他适当的酯保护起来，然后在最后一步中去保护，得到相应化合物。
A-91  2-甲氧羰基氨基-6-(2-硝基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-92  2-甲氧羰基氨基-6-(3-硝基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-93  2-甲氧羰基氨基-6-(4-硝基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-94  2-甲氧羰基氨基-6-(2-氯苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-95  2-甲氧羰基氨基-6-(3-氯苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-96  2-甲氧羰基氨基-6-(4-氯苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-97  2-甲氧羰基氨基-6-(2-甲基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-98  2-甲氧羰基氨基-6-(3-甲基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-99  2-甲氧羰基氨基-6-(4-甲基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-100  2-甲氧羰基氨基-6-(2-氟苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-101  2-甲氧羰基氨基-6-(3-氟苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-102  2-甲氧羰基氨基-6-(4-氟苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-103  2-甲氧羰基氨基-6-[2-(三氟甲基)苯巯基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-104  2-甲氧羰基氨基-6-[3-(三氟甲基)苯巯基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-105  2-甲氧羰基氨基-6-[4-(三氟甲基)苯巯基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-106  2-甲氧羰基氨基-6-(2-甲氧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-107  2-甲氧羰基氨基-6-(3-甲氧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-108  2-甲氧羰基氨基-6-(4-甲氧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-109  2-甲氧羰基氨基-6-(2-羧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-110  2-甲氧羰基氨基-6-(3-羧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-111  2-甲氧羰基氨基-6-(4-羧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
化合物A-112至A-133
用适当的苯胺盐代替实施例A-3中的苯酚钠，进行相同的过程，得到下列实施例。对实施例A-131、A-132和A-133来说，羧基被甲基、乙基、苄基、叔丁基或其他适当的酯保护起来，然后在最后一步中去保护，得到相应化合物。
A-112  2-甲氧羰基氨基-6-苯氨基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-113  2-甲氧羰基氨基-6-(2-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-114  2-甲氧羰基氨基-6-(3-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-115  2-甲氧羰基氨基-6-(4-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-116  2-甲氧羰基氨基-6-(2-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-117  2-甲氧羰基氨基-6-(3-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-118  2-甲氧羰基氨基-6-(4-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-119  2-甲氧羰基氨基-6-(2-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-120  2-甲氧羰基氨基-6-(3-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-121  2-甲氧羰基氨基-6-(4-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-122  2-甲氧羰基氨基-6-(2-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-123  2-甲氧羰基氨基-6-(3-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-124  2-甲氧羰基氨基-6-(4-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-125  2-甲氧羰基氨基-6-[2-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-126  2-甲氧羰基氨基-6-[3-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-127  2-甲氧羰基氨基-6-[4-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-128  2-甲氧羰基氨基-6-(2-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-129  2-甲氧羰基氨基-6-(3-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-130  2-甲氧羰基氨基-6-(4-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-131  2-甲氧羰基氨基-6-(2-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-132  2-甲氧羰基氨基-6-(3-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-1 33  2-甲氧羰基氨基-6-(4-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
化合物A-134至A-154
用适当的苯酚盐代替实施例A-4中的苯酚钠，进行相同的过程，得到下列实施例。对实施例A-152、A-153和A-154来说，羧基被甲基、乙基、苄基、叔丁基酯或其他适当的酯保护起来，然后在最后一步中去保护，得到相应化合物。
A-134  2-乙氧羰基氨基-6-(2-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-135  2-乙氧羰基氨基-6-(3-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-136  2-乙氧羰基氨基-6-(4-硝基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-137  2-乙氧羰基氨基-6-(2-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-138  2-乙氧羰基氨基-6-(3-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-139  2-乙氧羰基氨基-6-(4-氯苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-140  2-乙氧羰基氨基-6-(2-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-141  2-乙氧羰基氨基-6-(3-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-142  2-乙氧羰基氨基-6-(4-甲基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-143  2-乙氧羰基氨基-6-(2-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-144  2-乙氧羰基氨基-6-(3-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-145  2-乙氧羰基氨基-6-(4-氟苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-146  2-乙氧羰基氨基-6-[2-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-147  2-乙氧羰基氨基-6-[3-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-148  2-乙氧羰基氨基-6-[4-(三氟甲基)苯氧基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-149  2-乙氧羰基氨基-6-(2-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-150  2-乙氧羰基氨基-6-(3-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-151  2-乙氧羰基氨基-6-(4-甲氧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-152  2-乙氧羰基氨基-6-(2-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-153  2-乙氧羰基氨基-6-(3-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-154  2-乙氧羰基氨基-6-(4-羧基苯氧基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
化合物A-155至A-176
用适当的苯硫酚盐代替实施例A-4中的苯酚钠，进行相同的过程，得到下列实施例。对实施例A-174、A-175和A-176来说，羧基被甲基、乙基、苄基、叔丁基或其他适当的酯保护起来，然后在最后一步中去保护，得到相应化合物。
A-155  2-乙氧羰基氨基-6-苯巯基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-156  2-乙氧羰基氨基-6-(2-硝基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-157  2-乙氧羰基氨基-6-(3-硝基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-158  2-乙氧羰基氨基-6-(4-硝基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-159  2-乙氧羰基氨基-6-(2-氯苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-160  2-乙氧羰基氨基-6-(3-氯苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-161  2-乙氧羰基氨基-6-(4-氯苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-162  2-乙氧羰基氨基-6-(2-甲基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-163  2-乙氧羰基氨基-6-(3-甲基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-164  2-乙氧羰基氨基-6-(4-甲基苯氧基(4-methylphMenoxy))-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-165  2-乙氧羰基氨基-6-(2-氟苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-166  2-乙氧羰基氨基-6-(3-氟苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-167  2-乙氧羰基氨基-6-(4-氟苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-168  2-乙氧羰基氨基-6-[2-(三氟甲基)苯巯基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-169  2-乙氧羰基氨基-6-[3-(三氟甲基)苯巯基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-170  2-乙氧羰基氨基-6-[4-(三氟甲基)苯巯基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-171  2-乙氧羰基氨基-6-(2-甲氧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-172  2-乙氧羰基氨基-6-(3-甲氧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-173  2-乙氧羰基氨基-6-(4-甲氧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-174  2-乙氧羰基氨基-6-(2-羧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-175  2-乙氧羰基氨基-6-(3-羧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-176  2-乙氧羰基氨基-6-(4-羧基苯巯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
化合物A-177至A-198
用适当的苯胺盐代替实施例A-4中的苯酚钠，进行相同的过程，得到下列实施例。对实施例A-196、A-197和A-198来说，羧基被甲基、乙基、苄基、叔丁基或其他适当的酯保护起来，然后在最后一步中去保护，得到相应化合物。
A-177  2-乙氧羰基氨基-6-苯氨基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-178  2-乙氧羰基氨基-6-(2-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-179  2-乙氧羰基氨基-6-(3-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-180  2-乙氧羰基氨基-6-(4-硝基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-181  2-乙氧羰基氨基-6-(2-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-182  2-乙氧羰基氨基-6-(3-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-183  2-乙氧羰基氨基-6-(4-氯苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-184 2-乙氧羰基氨基-6-(2-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-185  2-乙氧羰基氨基-6-(3-甲基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-186  2-乙氧羰基氨基-6-(4-甲基苯氧基(4-methylphMenoxy))-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-187  2-乙氧羰基氨基-6-(2-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-188  2-乙氧羰基氨基-6-(3-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-189  2-乙氧羰基氨基-6-(4-氟苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-190  2-乙氧羰基氨基-6-[2-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-191  2-乙氧羰基氨基-6-[3-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-192  2-乙氧羰基氨基-6-[4-(三氟甲基)苯氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-193  2-乙氧羰基氨基-6-(2-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-194  2-乙氧羰基氨基-6-(3-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-195  2-乙氧羰基氨基-6-(4-甲氧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-196  2-乙氧羰基氨基-6-(2-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-197  2-乙氧羰基氨基-6-(3-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
A-198  2-乙氧羰基氨基-6-(4-羧基苯氨基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶
实施例2：测定RAF磷酸化功能的测定法
下列测定法报告了RAF催化的其靶蛋白MEK以及MEK的靶蛋白MAPK的磷酸化作用的量。RAF的基因序列描述在Bonner等1985《分子细胞生物学》5：1400-1407中，在多基因序列数据库中是易于查到的。用在本发明这部分中的核酸载体和细胞系的构建完整地描述在Morrison等1988《美国国家科学院院报》85：8855-8859中。
材料和试剂
1.Sf9(草地贪夜蛾)细胞；GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD；
2.RIPA缓冲液：20mM Tris/HCl pH 7.4，137mM NaCl，10％甘油，1mM PMSF，5mg/L Aprotenin，0.5％Triton X-100；
3.硫氧还蛋白-MEK融合蛋白(T-MEK)：按照厂商提供的操作，用亲和色谱法进行T-MEK的表达和纯化。目录#K 350-01和R350-40，Invitrogen Corp.，San Diego，CA；
4.His-MAPK(ERK 2)：用编码His-MAPK的pUC18载体转化XL1Blue细胞，在该细胞中表达His-标记的MAPK。His-MAPK用Ni-亲和色谱法纯化。目录#27-4949-01，Pharmacia，Alameda，CA，如本文所述；
5.绵羊抗小鼠IgG：Jackson实验室，West Grove，PA，目录#515-006-008，Lot# 28563；
6.RAF-1蛋白激酶特异性抗体：来自UBI的URP2653；
7.包被缓冲液：PBS；磷酸盐缓冲盐水，GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD；
8.洗涤缓冲液：TBST-50mM Tris/HCl pH 7.2，150mM NaCl，0.1％Triton X-100；
9.封闭缓冲液：TBST，0.1％乙醇胺pH 7.4；
10.DMSO，Sigma，St.Louis，MO；
11.激酶缓冲液(KB)：20mM Hepes/HCl pH 7.2，150mM NaCl，0.1％Triton X-100，1mM PMSF，5mg/L Aprotenin，75mM原钒酸钠，0.5MMDTT和10mM MgCl2；
12.ATP混合物：100mM MgCl2，300mM ATP，10mCi g-33P ATP(Dupont-NEN)/mL；
13.终止缓冲液：1％磷酸，Fisher，Pittsburgh，PA；
14.Wallac磷酸纤维素滤垫：Wallac，Turku，Finnland；
15.滤器洗涤溶液：1％磷酸，Fisher，Pittsburgh，PA；
16.Tomtec平板收获器：Wallac，Turku，Finnland；
17.Wallac β平板读数器：#1205，Wallac，Turku，Finnland；
18.化合物用NUNC 96孔V底聚丙烯平板，应用科学目录#AS-72092。
操作
除非特别说明，下列步骤均在室温下进行。
1.ELISA平板包被：在4℃下，ELISA孔用100μl绵羊抗小鼠亲和性纯化的抗血清(1μg/100μl包被缓冲液)包被过夜。ELISA平板在4℃下贮藏时可使用两周。
2.倒置平板，除去液体。加入100μl封闭溶液，培养30分钟。
3.除去封闭溶液，用洗涤缓冲液洗涤四次。在纸巾上轻拍平板，以除去过量液体。
4.向每孔中加入1mg RAF-1的特异性抗体，培养1小时。如步骤3所述洗涤。
5.融化感染有Sf9细胞的RAS/RAF溶胞产物，用TBST稀释至10μg/100μl。向每孔中加入10mg稀释了的溶胞产物，培养1小时。在培养过程中摇动平板。阴性对照不加入溶胞产物。用重组杆状病毒感染细胞，每种病毒的MOI为5，48小时后收获，制得感染有Sf9昆虫细胞的RAS/RAF溶胞产物。细胞用PBS洗涤一次，在RIPA缓冲液中溶解。离心(10000xg，5分钟)除去不溶性物质。将溶胞产物等份在干冰/乙醇中冷冻，在-80℃下贮藏备用。
6.除去没有被结合的物质，如上(步骤3)所述进行洗涤。
7.在每孔中加入2mg T-MEK和2mg His-MAPK，用激酶缓冲液调节体积至40μl。本文实施例提供了从细胞提取物中纯化T-MEK和MAPK的方法。
8.用TBST加1％DMSO预稀释化合物(储备溶液10μg/μl DMSO)或提取物20倍。向步骤6中所述的孔中加入5μl预稀释的化合物/提取物。培养20分钟。对照不加入药物。
9.加入5μl ATP混合物开始激酶反应。在培养过程中，在ELISA平板摇动器上摇动平板。
10.60分钟后，向每孔中加入30μl终止溶液以终止激酶反应。
11.在Tomtec平板收获器中放置磷酸纤维素垫和ELISA平板。按照厂商的建议，收获并用滤器洗涤溶液洗涤滤器。干燥滤垫。密封滤垫，放入容器中。把容器插入放射性检测仪器中，对滤垫上的放射性磷进行定量。
或者，从测定平板各孔取40μl等份，转移至磷酸纤维素滤垫上的相应位置。风干滤器后，把滤器放入托盘中。小心地摇动托盘1小时，每15分钟更换洗涤溶液。风干滤垫。密封滤垫，放入适用于测量样本放射性磷的容器中。把容器插入检测装置中，对滤垫上的放射性磷进行定量。
按照用于下列氮杂苯并咪唑类化合物的方案，测量RAF-1 ELISA测定法中的IC50值：
和
Figure C9881075300551
IC50值是将磷酸化靶蛋白的最大量或细胞生长减少50％所需的氮杂苯并咪唑类抑制剂的浓度。RAF-1磷酸化作用测定法中测量的IC50值描绘在表1中：
           表1
    化合物     IC50(μM)
    A-1     79
    A-2     ＞100
    A-3     6.1
    A-4     6.7
    A-90     0.95
实施例3：MAPK和MEK的纯化
MAPK和MEK蛋白质是易于在细胞内表达的，方法是将编码这些蛋白质的基因亚克隆到商业上可得到的表达带聚组氨酸标记的蛋白质的载体中。编码这些蛋白质的基因是易于从实验室得到的，通常是对这些蛋白质进行操作或者从含有cDNA文库的细胞中克隆这些基因。文库是商业上易于得到的，本领域技术人员从MEK和MAPK的核酸序列，能够容易地设计与编码MEK或MAPK的cDNA分子同源的核酸探针，该核酸序列可从多基因数据库如Genbank得到。利用目前本领域技术人员可以获得的技术，能够在短时间内完成基因的克隆。
利用下列方案能够完成MEK和MAPK蛋白质从细胞提取物中的纯化，该方案修改自Robbins等1993《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)268：5097-5106：
1.用本领域技术人员易于获得的超声处理、渗透压或弗氏压碎器技术溶解细胞。下文提供了适当的超声缓冲液。
2.将与镍或钴共轭的固体载体与下文公开的平衡缓冲液进行平衡。聚组氨酸标记特异性地与固体载体上的镍和钴原子结合。用十倍于固体载体体积的平衡缓冲液洗涤树脂三次，达到平衡。固体载体是本领域普通技术人员易于得到的。
3.向固体载体中加入溶胞产物，在容器中平衡一段时间。或者，可将固体载体装填在蛋白质色谱柱中，可以使溶胞产物流经固体载体。
4.用下文公开的洗涤缓冲液洗涤固体载体。
5.用一定量的洗脱缓冲液(下文提供)从固体载体中洗脱MEK或MAPK蛋白质，该缓冲液可以从固体载体中除去大部分蛋白质。
超声缓冲液
50mM磷酸钠pH 8.0
0.3M氯化钠
10mM β-巯基乙醇
1％ NP40
10mM NaF
0.5mM Pefablock
平衡缓冲液
50mM磷酸钠pH 8.0
0.3M氯化钠
10mM β-巯基乙醇
1％ NP40
10mM NaF
1mM Imidazol
洗涤缓冲液
50mM磷酸钠pH 8.0
0.3M氯化钠
10mM β-巯基乙醇
1％ NP40
10mM NaF
10mM Imidazol
洗脱缓冲液
50mM磷酸钠pH 8.0
0.3M氯化钠
10mM β-巯基乙醇
1％ NP40
10mM NaF
10-500mM Imidazol
实施例4：测定EGF受体磷酸化功能的测定法
全细胞中EGF受体激酶活性(EGFR-NIH3T3测定)的测定方法详细描述在Tang等人的于1996年6月5日提交的PCT公报WO 9640116中，发明名称为“用于疾病治疗的二氢吲哚酮化合物”，包括所有附图在内的全文引用在此作为参考文献。
EGF受体磷酸化作用测定法中测定的IC50值描绘在表2中：
          表2
    化合物     IC50(μM)
    A-1     ＞100
    A-2     ＞100
    A-3     ＞100
    A-4     ＞100
实施例5：测定氮杂苯并咪唑类化合物对表达Ras的细胞生长的 效应的测定法
下列测定法测定了表达RAS的NIH-3T3细胞的生长速率。该测定法的目的是测定化合物对过量表达H-Ras的NIH3T3细胞生长的效应。
材料
96孔平底无菌板
96孔圆底无菌板
无菌25mL或100mL液槽
移液管，多管自动移液器
无菌移液管吸头
无菌15mL和50mL试管
试剂
0.4％SRB的1％乙酸溶液
10mM Tris碱
10％ TCA
1％乙酸
无菌DMSO(Sigma)
化合物的DMSO溶液(100mM或以下的储备溶液)
胰蛋白酶-EDTA(GIBCO BRL)
细胞系
3T3/H-Ras(NIH 3T3克隆7种表达致癌H-Ras的基因组片段的细胞)
可以使用下列方案构建细胞：
1.将编码Ras的基因片段亚克隆到商业上可得到的载体中，后者将稳定地转染NIH-3T3细胞。该片段来自cHa-ras的基因组转化等位基因。
2.利用磷酸钙法，用亚克隆的载体转染NIH-3T3细胞。选择在DMEM中的2％血清中表达Ras构建体的细胞。2周后观察到可见的焦点。收集转化了的细胞，得到稳定转化了的细胞系。
生长培养基
2％小牛血清/DMEM+2mM谷氨酰胺，Pen/Strep
方案
第0天：细胞平板接种
这部分测定在层流通风橱中进行。
1.细胞受胰蛋白酶作用。将200mL细胞混悬液转移至10mLisotone中。用Coulter计数器计数细胞。
2.将细胞在生长培养基中稀释至60,000个细胞/mL。向96孔平底板的每孔中转移100μl细胞，得到6000个细胞/孔。
3.每种化合物使用平板的一半(4行)，每种化合物浓度用四个孔，培养基对照也用一组4个孔。
4.小心地摇动平板，使细胞均匀地附着。
5.平板在37℃、10％ CO2恒温箱中培养。
第1天：化合物的加入
这部分测定在层流通风橱中进行。
1.在96孔圆底平板中，向第1到11栏中加入120μl生长培养基，培养基中含有最高屏蔽浓度(screening concentration)的化合物中的2X最终％DMSO。例如，如果最高浓度是100μl，这是从100mM储备溶液中得到的，那么1X DMSO是0.1％，因此2X DMSO是0.2％。该平板用于滴定化合物，每种化合物4行。
2.在无菌15mL试管中，制备最高屏蔽浓度的化合物在生长培养基加2X DMSO中的2X溶液。每种细胞系需要1mL。化合物的起始浓度通常是100mM，不过该浓度可因化合物的溶解度而异。
3.将240mL的2X起始化合物溶液转移到96孔圆底平板第12栏的四个孔中。从第12栏向第11栏、从第11栏向第10栏，依次类推直到第2栏，从右向左转移12mL，进行1∶2连续稀释。将100μl化合物稀释液和100μl第1栏中的培养基转移到96孔平底平板相应孔中的100μl细胞培养基上。每孔的总体积应当是200μl。
4.把平板放回恒温箱，恒温3天。
第4天：测定的开展
这部分测定在台子上进行。
1.抽去或倒掉培养基。向每孔中加入200μl冷10％TCA，以固定细胞。平板在4℃下培养至少60分钟。
2.弃去TCA，用自来水冲洗孔5次。将平板倒置在纸巾上干燥。
3.用100μl/孔的0.4％SRB染色细胞10分钟。
4.倒掉SRB，用1％乙酸冲洗孔5次。将平板倒置在纸巾上充分干燥。
5.在摇动器上，用100μl/孔的10mM Tris碱溶解染料5-10分钟。
6.在570nm下的Dynatech ELISA平板读数器上读数，参照波长为630nm。
选择抑制过度表达RAS的细胞的生长速率的化合物，如表3所述。
           表3
    化合物     IC50(μM)RAS/NIH3T3
    A-3     40
    A-4     20
实施例6：测定氮杂苯并咪唑类化合物对A549细胞生长的效应的 测定法
下列测定法测定A549细胞的生长速率。本测定的目的在于测定化合物对A549人肺癌细胞生长的效应。A549细胞是易于从商业来源获得的，例如ATCC(CCL185)。
材料
96孔平底无菌板
96孔圆底无菌板
无菌25mL或100mL液槽
移液管，多管自动移液器
无菌移液管吸头
无菌15mL和50mL试管
试剂
0.4％SRB的1％乙酸溶液
10mM Tris碱
10％ TCA
1％乙酸
无菌DMSO(Sigma)
化合物的DMSO溶液(100mM或以下的储备溶液)
胰蛋白酶-EDTA(GIBCO BRL)
细胞系和生长培养基
A549人肺癌细胞(ATCC CCL185)
Ham’s F12-K中的10％胎牛血清
方案
第0天：细胞平板接种
这部分测定在层流通风橱中进行。
1.细胞受胰蛋白酶作用。将200μL细胞混悬液转移至10mLisotone中。用Coulter计数器计数细胞。
2.将细胞在生长培养基中稀释至20,000个细胞/mL。向96孔平底板的每孔中转移100μL细胞，得到2000个细胞/孔。
3.每种化合物使用平板的一半(4行)，每种化合物浓度用四个孔，培养基对照也用一组4个孔。
4.小心地摇动平板，使细胞均匀地附着。
5.平板在37℃、10％CO2恒温箱中培养。
第1天：化合物的加入
这部分测定在层流通风橱中进行。
1.在96孔圆底平板中，向第1到11栏中加入120μL生长培养基，培养基中含有最高屏蔽浓度的化合物中的2X最终％DMSO。例如，如果最高屏蔽浓度是100μM，这是从100mM储备溶液中得到的，那么1X DMSO是0.1％，因此2X DMSO是0.2％。该平板用于滴定化合物，每种化合物4行。
2.在无菌15mL试管中，制备最高屏蔽浓度的化合物在生长培养基加2X DMSO中的2X溶液。每种细胞系需要1mL。化合物的起始浓度通常是100μM，不过该浓度可因化合物的溶解度而异。
3.将240μL的2X起始化合物溶液转移到96孔圆底平板第12栏的四个孔中。从第12栏向第11栏、从第11栏向第10栏，依次类推直到第2栏，从右向左转移120μL，进行1∶2连续稀释。将100μL化合物稀释液和100μL第1栏中的培养基转移到96孔平底平板相应孔中的100μL细胞培养基上。每孔的总体积应当是200μL。
4.把平板放回恒温箱，恒温3天。
第5天：测定的开展
这部分测定在台子上进行。
1.抽去或倒掉培养基。向每孔中加入200μL冷10％TCA，以固定细胞。平板在4℃下培养至少60分钟。
2.弃去TCA，用自来水冲洗孔5次。将平板倒置在纸巾上干燥。
3.用100μL/孔的0.4％SRB染色细胞10分钟。
4.倒掉SRB，用1％乙酸冲洗孔5次。将平板倒置在纸巾上充分干燥。
5.在摇动器上，用100μL/孔的10mM Tris碱溶解染料5-10分钟。
6.在570nm下的Dynatech ELISA平板读数器上读数，参照波长为630nm。
选择抑制A549细胞的生长速率的化合物，如表4所述。
          表4
    化合物     IC50(μM)A549
    A-3     2265(2％FBS)
    A-4     65.7(2％FBS)
实施例7：测定Raf调制剂体内生物活性的方法
异种移植研究可以用来监测本发明化合物对卵巢、黑素瘤、前列腺、肺和乳腺肿瘤细胞的抑制作用。详细的测定方案描述在Tang等人的于1996年6月5日提交的PCT公开WO 9640116中，发明名称为“用于疾病治疗的二氢吲哚酮化合物”，包括所有附图在内的全文引用在此作为参考文献。
在缺少这里没有明确公开的内容或限制的情况下也可以实施这里所阐述的本发明。所用的术语和表达方式用作说明书的术语而非限制，在使用这些术语和表达方式时，不排除所有所显示和所述的等价特征或其部分，相反，应当承认，各种变体也是可能在本发明请求保护的范围内的。因此，应当认为，尽管通过优选的实施方案和可选的特征已经具体公开了本发明，本领域技术人员也可以采取这里所公开的构思变体和差异，而且这些变体和差异被认为是在由所附权利要求书所定义的本发明范围之内的。
易于为本领域技术人员所理解的是，本发明充分适合于实施并达到上述及其固有的目的和优点。这里所述的分子复合体和方法、操作、处理、分子、特定化合物是优选实施方案的代表，是示范性的，不是对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到变体和其他用途，它们在由权利要求书范围所定义的本发明实质内。
对本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明范围和精神的前提下，可以对这里所公开的本发明作出不同的替换和修饰。
说明书中提到的全部专利和申请是对本发明所属领域的技术人员水平的说明。这里引用全部专利和申请作为参考文献，就象各自的公报明确和分别地引用作为参考文献。
在缺少这里没有明确公开的内容或限制的情况下也可以适当地实施这里所阐述的本发明。因此，例如，术语“包含”、“主要由……组成”和“由……组成”在所有情况下任何一个都可以和另外两个替换使用。所用的术语和表达方式用作说明书的术语而非限制，在使用这些术语和表达方式时，不排除所有所显示和所述的等价特征或其部分，相反，应当承认，各种变体也是可能在本发明请求保护的范围内的。因此，应当认为，尽管通过优选的实施方案和可选的特征已经具体公开了本发明，本领域技术人员也可以采取这里所公开的构思变体和差异，而且这些变体和差异被认为是在由所附权利要求书所定义的本发明范围之内的。
另外，本发明的各特征或方面是以马库什类术语描述的，本领域技术人员将承认，本发明也可以用马库什类的任意个别成分或小类成分来描述。例如，如果X被描述为选自由溴、氯和碘组成的组，那么关于X是溴的权利要求和关于X是溴和氯的权利要求也被充分描述了。
前面没有引用的参考文献、包括专利和非专利文献，在所有场合下都特意引用在此作为参考文献。其他实施方案体现在下列权利要求书中。

Claims (16)

1.用氮杂苯并咪唑类化合物体外抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的方法，包括使表达所述丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的细胞与所述化合物接触的步骤，其中所述的氮杂苯并咪唑类化合物具有式I、II或III所示的结构：
Figure C988107530002C1
其中
R1是苯基或被一个取代基取代的苯基，取代基选自由甲基、甲氧基、氯、氟、三氟甲基、羧基和硝基组成的组；
R2和R3都是氢；
R4是甲基或乙基；
X1是硫、氧或NH；
Z1和Z2独立地是N或NH；
Z3是氧。
2.权利要求1的方法，其中所述的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是RAF。
3.权利要求1的方法，其中所述的氮杂苯并咪唑化合物选自由SABI化合物组成的组。
4.式I、II或III的氮杂苯并咪唑类化合物在制备用于抑制生物体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的药物中的应用：
其中
R1是苯基或被一个取代基取代的苯基，取代基选自由甲基、甲氧基、氯、氟、三氟甲基、羧基和硝基组成的组；
R2和R3都是氢；
R4是甲基或乙基；
X1是硫、氧或NH；
Z1和Z2独立地是N或NH；
Z3是氧。
5.权利要求4的应用，其中所述的生物体是哺乳动物。
6.权利要求4的应用，其中所述的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶与天然结合配偶体之间的相互作用。
7.权利要求6的应用，其中所述的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是RAF。
8.氮杂苯并咪唑化合物，具有式I、II或III所示的结构：
Figure C988107530004C1
其中
R1是苯基或被一个取代基取代的苯基，取代基选自由甲基、甲氧基、氯、氟、三氟甲基、羧基和硝基组成的组；
R2和R3都是氢；
R4是甲基或乙基；
X1是硫、氧或NH；
Z1和Z2独立地是N或NH；
Z3是氧。
9.权利要求8的化合物，其中所述的R1选自苯基、2-硝基苯基、3-硝基苯基、4-硝基苯基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、2-氟苯基、3-氟苯基、4-氟苯基、2-(三氟甲基)苯基、3-(三氟甲基)苯基、4-(三氟甲基)苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2-羧基苯基、3-羧基苯基和4-羧基苯基。
10.权利要求8的化合物，其中所述的氮杂苯并咪唑化合物选自由SABI化合物组成的组。
11.药物组合物，包含权利要求8-10任意一项的氮杂苯并咪唑化合物和生理学上可接受的载体或稀释剂。
12.用于合成式(I)化合物的方法，
式(I)中，
R1是苯基或被一个取代基取代的苯基，取代基选自由甲基、甲氧基、氯、氟、三氟甲基、羧基和硝基组成的组；
R2和R3都是氢；
X1是硫、氧或NH；
Z1和Z2独立地是N或NH；
该方法包括下列步骤：
(a)使2-氨基-6-氯-3-硝基吡啶与选自由SABI反应剂组成的组的第二反应剂在溶剂中反应，得到第一中间体；
(b)在催化剂和还原剂的存在下，还原所述第一中间体，得到第二中间体；
(c)使第二中间体与第三反应剂反应，其中该第三反应剂是O-甲基异脲或S-甲基异硫脲鎓硫酸盐与氯甲酸烷基酯的反应产物；和
(d)纯化所述式(I)化合物。
13.权利要求12的方法，其中所述的溶剂是正丙醇。
14.权利要求12的方法，其中所述的还原剂是氢。
15.权利要求12的方法，其中所述的催化剂是阮内镍。
16.权利要求12的方法，其中所述的烷基是甲基或乙基。
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