DE69827516T2 - Azabenzimidazol-verbindungen zur modulation der serin/threonin protein-kinase funktion - Google Patents

Azabenzimidazol-verbindungen zur modulation der serin/threonin protein-kinase funktion Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die folgende Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung wird gegeben, damit die Erfindung besser verstanden wird, aber sie gilt nicht als Stand der Technik der Erfindung.
  • Die zelluläre Signaltransduktion ist ein fundamentaler Mechanismus, durch den externe Stimuli, die verschiedene Zellprozesse steuern, in das Zellinnere weitergegeben werden. Einer der biochemischen Schlüsselmechanismen der Signaltransduktion beinhaltet die reversible Phosphorylierung der Proteine, die die Regulation der Aktivität der reifen Proteine ermöglicht, indem ihre Struktur und Funktion verändert werden.
  • Die am besten charakterisierten Proteinkinasen in Eukaryoten phosphorylieren Proteine an der Alkoholeinheit von Serin-, Threonin- und Tyrosin-Resten. Diese Kinasen werden zum großen Teil in zwei Gruppen unterteilt, und zwar solche, die spezifisch für die Phosphorylierung von Serin und Threonin sind, und solche, die spezifisch für die Phosphorylierung von Tyrosin sind. Einige Kinasen, die als Kinasen "mit doppelter Spezifität" bezeichnet werden, können sowohl an Tyrosin-, als auch an Serin-/Threonin-Resten phosphorylieren.
  • Proteinkinasen können ebenfalls durch ihre Lokalisierung in der Zelle charakterisiert werden. Einige Kinasen sind Transmembran-Rezeptorproteine, die Liganden außerhalb der Zellmembran binden können. Die Bindung der Liganden verändert die katalytische Aktivität der Rezeptorproteinkinase. Andere sind Nicht-Rezeptor-Proteine, denen einen Transmembrandomäne fehlt. Nicht-Rezeptorproteinkinasen können in einer Vielzahl von zellulären Kompartimenten von der inneren Oberfläche der Zellmembran zum Kern gefunden werden.
  • Viele Kinasen sind an den regulatorischen Kaskaden beteiligt, wo ihre Substrate andere Kinasen umfassen, deren Aktivitäten durch ihren Phosphorylierungszustand reguliert werden. Schließlich wird die Aktivität eines stromabwärts gelegenen Effektors durch eine Phosphorylierung moduliert, die auf einer Aktivierung eines solchen Wegs beruht.
  • Die Serin/Threonin-Kinasefamilie beinhaltet Elemente, die viele Schritte von Signalkaskaden regulieren, einschließlich Kaskaden, die das Zellwachstum, die Wanderung, Differenzierung, Genexpression, Muskelkontraktion, den Glucosemetabolismus, die zelluläre Proteinsynthese, und die Regulation des Zellzyklus steuern.
  • Ein Beispiel für eine Nicht-Rezeptorproteinkinase, die die Proteinziele an Serin und Threoninresten phosphoryliert, ist RAF (Rapidly accelerated fibrosarcoma, rasch beschleunigtes Fibrosarkom). RAF moduliert die katalytische Aktivität anderer Proteinkinasen, wie die Proteinkinase, die die mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) phosphoryliert und somit aktiviert. RAF selbst wird durch das in der Membran verankerte Protein RAS aktiviert, das wiederum in Reaktion auf ligandenaktivierte Tyrosinrezeptorproteinkinasen aktiviert wird, wie den Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR) und den Rezeptor für den von Plättchen hergeleiteten Wachstumsfaktor (PDGFR). Die biologische Bedeutung von RAF bei der Steuerung von zellulären Ereignissen wird von dem Befund unterstrichen, dass veränderte Formen von RAF in Organismen Krebs verursachen können. Ein Beweis für die Bedeutung von RAF in Malignitäten wird in Monia et al., 1996, Nature Medicine 2: 668 gegeben, das hiermit gesamtinhaltlich einschließlich aller Figuren und Tabellen durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • In einem versuch, neue Behandlungen für Krebs und andere Erkrankungen zu entdecken, haben Forscher auf dem Gebiet der Biomedizin und Chemiker Moleküle, die die Funktion der Proteinkinasen hemmen, entworfen, synthetisiert und getestet. Einige kleine organische Moleküle bilden eine Klasse von Verbindungen, die die Funktion von Proteinkinasen modulieren. Beispiele für Moleküle, von denen beschrieben wurde, dass sie die Funktion der Proteinkinasen hemmen, sind bismonocyclische, bicyclische oder heterocyclische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642), Vinylen-Azaindol-Derivate (PCT WO 94/14808), 1-Cyclopropyl-4-pyridylchinolone (US-Patent Nr. 5 330 992), Styrylverbindungen (US-Patent Nr. 5 217 999), styrylsubstituierte Pyridylverbindungen (US-Patent Nr. 5 302 606), bestimmte Chinazolin-Derivate (EP-Anmeldung Nr. 0 566 266 A1), Seleoindole und Selenide (PCT WO 94/03427), trizyklische Polyhydroxylverbindungen (PCT WO 92/21660), und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT WO 91/15495).
  • Die Verbindungen, die die Zellmembranen durchqueren können und gegenüber saurer Hydrolyse beständig sind, sind potentiell vorteilhafte Therapeutika, da sie sehr stark biologisch verfügbar werden, nachdem sie Patienten oral verabreicht werden. Viele dieser Proteinkinase-Inhibitoren hemmen jedoch die Funktion von Proteinkinasen nur schwach. Zudem hemmen viele eine Anzahl von Proteinkinasen und verursachen daher vielfache Nebenwirkungen als Therapeutika für Krankheiten.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft teilweise die Verwendung von Verbindungen auf Azabenzimidazol-Basis zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Zuständen, die mit der Modulation der Funktion einer Serin/Threonin-Proteinkinase, wie RAF, einhergehen sowie mit einer Aberration im Signaltransduktionsweg RAF/MEK einhergehen. Die Erfindung betrifft darüber hinaus Arzneimittel, die Verbindungen umfassen, die zur Behandlung der vorstehend genannten Zustände verwendet werden.
  • I. Verfahren zum Durchmustern von Verbindungen, die die Serin/Threonin-Proteinkinase-Funktion modulieren
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren liefern Maßnahmen zur Modulation der Funktion von Rezeptor- und cytosolischen Serin/Threonin-Proteinkinasen. Diese Verfahren bieten Maßnahmen zur Modulation der Enzyme in vitro und in vivo. Für In-vivo-Anwendungen betreffen die erfindungsgemäßen verfahren teilweise Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion von Serin/Threonin-Proteinkinasen modulieren.
  • Die Erfindung betrifft somit in einem Aspekt ein Verfahren zur Modulation der Funktion einer Serin/Threonin-Proteinkinase mit einer Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis. Die Azabenzimidazol-Verbindung ist gegebenenfalls mit organischen Gruppen substituiert. Das Verfahren umfasst das Zusammenbringen der Zellen, die die Serin/Threonin-Proteinkinase mit der Verbindung exprimieren.
  • Der Begriff "Funktion" betrifft die zelluläre Rolle einer Serin/Threonin-Proteinkinase. Die Serin/Threonin-Proteinkinasefamilie beinhaltet Mitglieder, die viele Schritte in Signalkaskaden regulieren, einschließlich Kaskaden, die das Zellwachstum, die Wanderung, Differenzierung, Genexpression, Muskelkontraktion, den Glucosemetabolismus, die zelluläre Proteinsynthese und Regulation des Zellzyklus steuern.
  • Der Begriff "moduliert" betrifft die Fähigkeit einer Verbindung zur Veränderung der Funktion einer Proteinkinase. Ein Modulator aktiviert vorzugsweise die katalytische Aktivität einer Proteinkinase, insbesondere aktiviert oder inhibiert er die katalytische Aktivität einer Proteinkinase, die von der Konzentration der Verbindung abhängt, die der Proteinkinase ausgesetzt wird, oder am stärksten bevorzugt hemmt er die katalytische Aktivität einer Proteinkinase.
  • Der Begriff "katalytische Aktivität" im Zusammenhang mit der Erfindung definiert die Rate, mit der eine Proteinkinase ein Substrat phosphoryliert. Die katalytische Aktivität kann gemessen werden, bspw. durch Bestimmen der Menge eines Substrats, das in ein Produkt umgewandelt wird, als Funktion der Zeit. Die Phosphorylierung eines Substrats erfolgt am aktiven Zentrum einer Proteinkinase. Das aktive Zentrum ist gewöhnlich ein Hohlraum, in dem das Substrat an die Proteinkinase bindet und es phosphoryliert wird.
  • Der Begriff "Substrat", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Molekül, das durch eine Serin/Threonin-Proteinkinase phosphoryliert wird. Das Substrat ist vorzugsweise ein Peptid und stärker bevorzugt ein Protein. In Bezug auf die Proteinkinase RAF sind bevorzugte Substrate MEK (Mitogen and extracellular regulated Kinase, Mitogen- und extrazelluläre regulierte Kinase).
  • Der Begriff "aktiviert" betrifft die Steigerung der zellulären Funktion einer Proteinkinase. Die Proteinkinasefunktion ist vorzugsweise die Wechselwirkung mit einem natürlichen Bindungspartner und am stärksten bevorzugt die katalytische Aktivität.
  • Der Begriff "hemmt" betrifft die Herabsetzung der zellulären Funktion einer Proteinkinase. Die Proteinkinasefunktion ist vorzugsweise die Wechselwirkung mit einem natürlichen Bindungspartner und am stärksten bevorzugt katalytische Aktivität.
  • Der Begriff "moduliert" betrifft auch die Veränderung der Funktion einer Proteinkinase durch Steigern oder Senken der Wahrscheinlichkeit, dass sich ein Komplex zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner bildet. Ein Modulator steigert vorzugsweise die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein solcher Komplex zwischen der Proteinkinase und dem natürlichen Bindungspartner bildet, stärker bevorzugt steigert oder senkt er die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein Komplex zwischen der Proteinkinase und dem natürlichen Bindungspartner, je nach der Konzentration der Verbindung, die der Proteinkinase ausgesetzt ist, bildet und am stärksten bevorzugt senkt er die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein Komplex zwischen der Proteinkinase und dem natürlichen Bindungspartner bildet.
  • Der Begriff "Komplex" betrifft eine Gefüge von mindestens zwei aneinander gebundenen Molekülen. Signaltransduktionskomplexe enthalten oft mindestens zwei Proteinmoleküle, die aneinander gebunden sind. Eine Protein-Tyrosin-Rezeptorproteinkinase, GRB2, SOS, RAF und RAS bilden bspw. zusammengebaut einen Signaltransduktionskomplex in Reaktion auf einen mitogenen Liganden.
  • Der Begriff "natürlicher Bindungspartner" betrifft Polypeptide, die an eine Proteinkinase in Zellen binden. Natürliche Bindungspartner können bei der Weiterverbreitung eines Signals in einem Proteinkinase-Signaltransduktions-Prozess eine Rolle spielen. Ein Wechsel bei der Wechselwirkung zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner kann sich selbst als erhöhte oder gesenkte Wahrscheinlichkeit, dass die Wechselwirkung zustande kommt, oder als gesteigerte oder gesenkte Konzentration des Komplexes aus Proteinkinase und natürlichem Bindungspartner manifestieren.
  • Ein natürlicher Bindungspartner einer Proteinkinase kann an einen intrazellulären Bereich einer Proteinkinase mit hoher Affinität binden. Eine hohe Affinität stellt eine Gleichgewichts-Bindungskonstante in der Größenordnung von 10–6 M oder weniger dar. Zudem kann ein natürlicher Bindungspartner ebenfalls transient mit dem intrazellulären Bereich einer Proteinkinase wechselwirken und ihn chemisch modifizieren. Die natürlichen Bindungspartner einer Proteinkinase werden ausgewählt aus einer Gruppe, die SRC-Homologie 2 (SH2)- oder -3-(SH3)-Domänen, andere Phosphoryl-Tyrosin-Bindungsdomänen (PTB), Guanin- Nukleotid-Austauschfaktoren, Proteinphosphatasen, und andere Proteinkinasen umfasst, aber nicht darauf eingeschränkt ist. Verfahren zur Bestimmung von Änderungen der Wechselwirkungen zwischen Proteinkinasen und ihren natürlichen Bindungspartnern sind im Stand der Technik leicht verfügbar.
  • Der Begriff "Serin/Threonin-Proteinkinase" betrifft ein Enzym mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 10% Aminosäureidentität zu anderen Enzymen, die Proteine an Serin- und Threonin-Resten phosphorylieren. Eine Serin/Threonin-Proteinkinase katalysiert die Zugabe von Phosphat zu Proteinen an Serin- und Threoninresten. Serin/Threonin-Proteinkinasen können als membrangebundene Proteine oder cytosolische Proteine vorliegen.
  • Der Begriff "zusammenbringen", wie er hier verwendet wird, betrifft das Mischen einer Lösung, die eine erfindungsgemäße Azabenzimidazol-Verbindung umfasst, mit einem flüssigen Medium, worin die Zellen der Verfahren gebadet werden. Die Lösung, die die Verbindung umfasst, kann ebenfalls eine andere Komponente, wie Dimethylsulfoxid (DMSO) umfassen, die die Aufnahme der Azabenzimidazol-Verbindung oder -Verbindungen in die Zellen der Verfahren aufnimmt. Die Lösung, die die Azabenzimidazol-Verbindung umfasst, kann zu dem Medium dazugegeben werden, wobei die Zellen durch Verwendung einer Zufuhrvorrichtung, wie einer Vorrichtung auf Pipettenbasis oder auf Spritzenbasis, gebadet werden.
  • Der Begriff "Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis" betrifft eine organische Azabenzimidazol-Verbindung, die mit chemischen Substituenten substituiert ist. Azabenzimidazol-Verbindungen haben die allgemeine Struktur:
  • Figure 00070001
  • Der Begriff "substituiert" betrifft erfindungsgemäß eine Azabenzimidazol-Verbindung, die mit einer beliebigen Zahl chemischer Substituenten derivatisiert ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Verfahren zur Modulation der Funktion einer Serin/Threonin-Proteinkinase, wobei die Proteinkinase RAF ist.
  • Die RAF-Proteinkinase phosphoryliert Proteinziele auf Serin- oder Threonin-Resten. Ein solches Proteinziel ist die Proteinkinase (MEK), die die mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) phosphoryliert und somit aktiviert. RAF selbst wird durch das membrangebundene guanintriphosphathydrolysierende Enzym RAS in Reaktion auf die mitogenstimulierten Rezeptorprotein-Tyrosinkinasen, wie den Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGRF) und den Rezeptor für den von Plättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGFR) aktiviert.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können Verbindungen erfassen, die die Funktion der RAF-Proteinkinase in Zellen modulieren. RAF phosphoryliert eine Proteinkinase (MEK), die wiederum die mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) phosphoryliert. Tests, die nur die Phosphorylierung von MEK durch RAF überwachen, sind nicht empfindlich, weil MEK nicht signifikant genug phosphoryliert wird. Zur Bewältigung dieses Empfindlichkeits-Dilemmas, wird die Phosphorylierung von MEK und MAPK in den erfindungsgemäßen Tests verfolgt. Das MAPK-Phosphorylierungssignal amplifiziert das MEK-Phosphorylierungssignal und ermöglicht, dass eine RAF-abhängige Phosphorylierung in den Tests, wie Enzymimmuntests, verfolgt wird. Zudem erfolgt der erfindungsgemäße Test in einem Hochdurchsatzformat, so dass viele Verbindungen in einem kurzen Zeitraum rasch überwacht werden können.
  • In einem anderen Aspekt beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, umfassend die Schritte Zusammenbringen der Zellen, die die Serin/Threonin-Proteinkinase exprimieren, mit der Verbindung, und Überwachen der Wirkung auf die Zellen.
  • Der Begriff "Überwachen" betrifft die Beobachtung der Wirkung der Zugabe der Verbindungen zu den Zellen des Verfahrens. Die Wirkung kann in einer Änderung des Zellphänotyps, der Zellproliferation, der katalytischen Proteinkinase-Aktivität oder der Wechselwirkung zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner manifestiert werden.
  • Der Begriff "Wirkung" betrifft eine Änderung oder ein Fehlen einer Änderung in einem Zell-Phänotyp oder einer Zellproliferation. "Wirkung" kann ebenfalls eine Änderung oder ein Fehlen einer Änderung der katalytischen Aktivität der Proteinkinase beschreiben. "Wirkung" kann ebenfalls eine Änderung oder ein Fehlen einer Änderung der Wechselwirkung zwischen der Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner beschreiben.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft das Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Funktion von Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, wobei die Wirkung eine Änderung oder ein Fehlen einer Änderung des Zellphänotyps ist.
  • Der Begriff "Zellphänotyp" betrifft die äußerliche Erscheinung einer Zelle oder eines Gewebes oder die Funktion der Zelle oder des Gewebes. Beispiele für den Zellphänotyp sind die Zellgröße (Reduktion oder Vergrößerung), Zellproliferation (erhöhte oder verringerte Anzahl der Zellen), Zelldifferenzierung (eine Änderung oder ein Fehlen der Änderung der Zellform), zellüberleben, Apoptose (Zelltod) oder die Verwendung eines metabolischen Nährstoffs (bspw. Glucoseaufnahme). Änderungen oder das Fehlen von Änderungen im Zellphänotyp werden leicht durch Techniken des Standes der Technik gemessen.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, wobei die Wirkung eine Änderung oder das Fehlen einer Änderung der Zellproliferation ist.
  • Der Begriff "Zellproliferation" betrifft die Rate, mit der sich eine Gruppe von Zellen teilt. Die Anzahl von Zellen, die in einem Gefäß wachsen, kann durch einen Fachmann quantifiziert werden, wenn dieser die Anzahl der Zellen in einem definierten Volumen mit einem üblichen Lichtmikroskop optisch zählt. Alternativ können die Zellproliferationsraten durch Laborvorrichtungen quantifiziert werden, die die Dichte der Zellen in einem geeigneten Medium optisch oder konduktiv messen.
  • Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, wobei die Wirkung eine Änderung oder ein Fehlen einer Änderung der Wechselwirkung zwischen der Serin/Threonin-Proteinkinase mit einem natürlichen Bindungspartner ist.
  • Der Begriff "Wechselwirkung" beschreibt im Zusammenhang mit der Erfindung einen Komplex, der sich zwischen einem intrazellulären Bereich einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner oder einer Verbindung bildet. Der Begriff "Wechselwirkung" kann sich ebenfalls auf einen Komplex ausdehnen, der sich zwischen einer erfindungsgemäßen Verbindung mit intrazellulären Bereichen und extrazellulären Bereichen der untersuchten Proteinkinasen bildet. Eine cytosolische Proteinkinase hat zwar keinen extrazellulären Bereich, jedoch birgt eine Rezeptor-Proteinkinase einen extrazellulären und einen intrazellulären Bereich.
  • Der Begriff "intrazellulärer Bereich", wie er hier verwendet wird, betrifft den Teil einer Proteinkinase, der im Inneren einer Zelle vorliegt. Der Begriff "extrazellulärer Bereich", wie er hier verwendet wird, betrifft einen Teil einer Proteinkinase, der außerhalb der Zelle vorliegt.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, welches weiterhin die folgenden Schritte umfasst: (a) Lysieren der Zellen, so dass ein Lysat erhalten wird, das Serin/Threonin-Proteinkinase enthält; (b) Adsorption der Serin/Threonin-Proteinkinase an einen Antikörper; (c) Inkubation der adsorbierten Serin/Threonin-Proteinkinase mit einem oder mehreren Substraten; und (d) Adsorption des oder der Substrate an einen festen Träger oder einen Antikörper. Der Schritt Überwachen der Wirkung der Zellen, umfasst das Messen der Phosphatkonzentration von dem oder den Substraten.
  • Der Begriff "Lysieren", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Verfahren zum Unterbrechen der Integrität einer Zelle, so dass dessen Inhalt freigesetzt wird. Die Zelllyse wird durch viele Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, bewerkstelligt. Das Verfahren erfolgt vorzugsweise durch Ultraschallbehandlung oder Zellschertechniken und stärker bevorzugt durch Detergenztechniken.
  • Der Begriff "Antikörper", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Proteinmolekül, das spezifisch an eine Proteinkinase bindet. Ein Antikörper bindet vorzugsweise an eine Proteinkinase-Klasse, und stärker bevorzugt an die RAF-Proteinkinase.
  • Der Begriff "bindet spezifisch", wie er hier verwendet wird, betrifft einen Antikörper, der eine Proteinkinase mit höherer Affinität bindet als eine andere Proteinkinase oder ein zelluläres Protein. Ein Antikörper, der speziell an eine Proteinkinase bindet, bindet eine höhere Konzentration der spezifischen Proteinkinase als eine andere Proteinkinase oder ein zelluläres Protein.
  • Der Begriff "Adsorbieren", wie er hier verwendet wird, betrifft die Bindung eines Moleküls an die Oberfläche eines Antikörpers oder festen Trägers. Beispiele für feste Träger sind chemisch modifizierte Cellulose, wie Phosphocellulose, und Nylon. Antikörper können an feste Träger gebunden sein, wobei Techniken verwendet werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Siehe bspw. Harlo & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories.
  • Der Begriff "Messen der Phosphatkonzentration", wie er hier verwendet wird, betrifft Techniken, die dem Fachmann gemeinhin bekannt sind. Diese Techniken können die Quantifizierung der Konzentration der Phosphatkonzentrationen innerhalb eines Substrats oder die Bestimmung der relativen Mengen an Phosphat innerhalb eines Substrats beinhalten. Diese Techniken können die Adsorption des Substrates an eine Membran und das Erfassen der Menge Phosphat in dem Substrat durch Messung der Radioaktivität beinhalten.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion von Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, weiterhin umfassend die folgenden Schritte: (a) Lysieren der Zellen, so dass ein Lysat erhalten wird, das RAF enthält; (b) Adsorbieren von RAF an einen Antikörper; (c) Inkubieren des adsorbierten RAF mit MEK und MAPK; und (d) Adsorbieren von MEK und MAPK an einen festen Träger oder einen oder mehrere Antikörper. Der Schritt Messen der Wirkung auf die Zellen umfasst das Überwachen der Phosphatkonzentration von MEK und MAPK.
  • Die Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform das Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, wobei die Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis die Struktur der Formel I, II oder III, wie sie hier definiert ist, aufweist oder von einer der Subgruppen, wie sie hier definiert ist.
  • Der Begriff "Verbindung" betrifft die Verbindung oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz, Ester, Amid, Prodrug, Isomer oder Metabolit davon.
  • Der Begriff "pharmazeutisch verträgliches Salz" betrifft eine Formulierung einer Verbindung, die die biologische Aktivität und die Eigenschaften der Verbindung nicht aufhebt. Pharmazeutisch verträgliche Salze können erhalten werden durch Umsetzen einer erfindungsgemäßen Verbindung mit anorganischen oder organischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und dergleichen.
  • Der Begriff "Prodrug" betrifft ein Mittel, das in vivo in das Stamm-Medikament umgewandelt wird. Prodrugs können in einigen Situationen leichter als das Stamm-Medikament verabreicht werden. Das Prodrug kann bspw. durch orale Verabreichung biologisch verfügbar gemacht werden, das Stamm-Medikament jedoch nicht, oder das Prodrug kann die Löslichkeit verbessern, damit eine intravenöse Verabreichung ermöglicht wird.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Kinase modulieren, wobei die Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis die Struktur der Formel I, II, oder III hat, wobei die Azabenzimidazol-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe der SABI-Verbindungen.
  • Der Begriff "SABI-Verbindungen" betrifft die Gruppe der Verbindungen auf Azabenzimidazol-Basis mit der Struktur der Formel A oder B, die in der nachstehenden Tabelle von A-1 bis A-198 durchnummeriert sind.
  • Figure 00140001
  • Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Figure 00170001
  • Figure 00180001
  • Figure 00190001
  • II. Mitogen und extrazellulär regulierte Kinase die anomale Zustände verhindert oder behandelt
  • Bei einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der identifizierten Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis zur Herstellung eines Medikamentes, das sich zur Verhinderung oder Behandlung eines anomalen Zustands in einem Organismus durch Verabreichen einer erfindungsgemäßen Verbindung, wie sie vorstehend durch Formel I, II, oder III spezifiziert ist, mit jeglichen der hier angegebenen Einschränkungen, an einen Organismus, eignet.
  • Der Begriff "Organismus" betrifft ein Lebewesen, das mindestens eine Zelle umfasst. Ein Organismus kann einfach, wie eine eukaryotische Zelle, oder komplex, wie ein Säugetier sein. In bevorzugten Ausführungsformen betrifft ein Organismus Menschen oder Säugetiere.
  • Der Begriff "Verhindern" betrifft das erfindungsgemäße Verfahren, mit dem die Möglichkeit gesenkt wird, oder die Wahrscheinlichkeit eliminiert wird, dass ein Organismus den anomalen Zustand übernimmt oder entwickelt.
  • Der Begriff "Behandeln" betrifft die Erfindung, die eine therapeutische Wirkung hat, und die den anomalen Zustand in dem Organismus zumindest teilweise abschwächt oder aufhebt.
  • Der Begriff "therapeutische Wirkung" betrifft die Hemmung des Zellwachstums, das einen anomalen Zustand verursacht oder dazu beiträgt. Der Begriff "therapeutische Wirkung" betrifft ebenfalls die Hemmung des Wachstumsfaktors, die den anomalen Zustand (bspw. Krebs) verursacht oder dazu beiträgt. Eine therapeutische Wirkung lindert in gewissem Maße ein oder mehrere Symptome des anomalen Zustands. In Bezug auf die Behandlung einer Krebserkrankung bedeutet eine therapeutische Wirkung einen oder mehrere der folgenden Punkte: (a) eine Reduktion der Tumorgröße; (b) Hemmung (d. h. Verlangsamung oder Abstoppen) der Tumor-Metastase; (c) Hemmung des Tumorwachstums; und (d) Lindern, in gewissem Maße, eines oder mehrerer Symptome, die mit dem anomalen Zustand einhergehen. Verbindungen, die Wirkung gegen Leukämien zeigen, können wie hier beschrieben identifiziert werden, außer dass die Verbindungen die Zellproliferation oder das Zellwachstum verlangsamen oder senken, statt die Metastase zu hemmen.
  • Der Begriff "anomaler Zustand" betrifft eine Funktion in den Zellen oder Geweben eines Organismus, die von ihren normalen Funktionen in diesem Organismus abweicht. Ein anomaler Zustand kann die Zellproliferation, Zelldifferenzierung oder das Zellüberleben betreffen.
  • Aberrante Zellproliferationszustände umfassen Krebserkrankungen, wie fibrotische und mesangiale Störungen, anomale Angiogenese und Vasculogenese, Wundheilung, Psoriasis, Diabetes mellitus und Entzündung.
  • Aberrante Differenzierungszustände umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf neurodegenerative Störungen, langsame Wundheilungsraten und Gewebe-Transplantationstechniken.
  • Aberrante Zellüberlebenszustände sind Zustände, in denen die Wege für den programmierten Zelltod (Apoptose) aktiviert oder aufgehoben sind. Eine Anzahl von Proteinkinasen sind mit den Apoptose-Wegen assoziiert. Aberrationen in der Funktion von einer der Proteinkinasen könnten zur Zellimmortalität oder zu vorzeitigem Zelltod führen.
  • Zellproliferation, Differenzierung und Überleben sind Phänomene, die sich einfach durch Verfahren des Standes der Technik messen lassen. Diese Verfahren können das Beobachten der Anzahl von Zellen oder der Erscheinung der Zellen unter einem Mikroskop über die Zeit (bspw. Tage) beinhalten.
  • Der Begriff "Verabreichen" betrifft allgemein das Bereitstellen an einen Organismus und spezifisch ein Verfahren zum Aufnehmen einer Verbindung in die Zellen oder Gewebe eines Organismus. Der anomale Zustand kann verhindert oder behandelt werden, wenn die Zellen oder Gewebe des Organismus innerhalb oder außerhalb des Organismus existieren. Zellen, die außerhalb des Organismus existieren, lassen sich in Zellkulturschalen halten oder züchten. Für Zellen, die sich innerhalb des Organismus befinden, gibt es viele Techniken im Stand der Technik zur Verabreichung der Verbindungen, einschließlich (aber nicht eingeschränkt auf) orale, parenterale, dermale, Injektions- und Aerosol-Anwendungen. Für Zellen außerhalb des Organismus gibt es viele Techniken im Stand der Technik zur Verabreichung der Verbindungen, einschließlich (aber nicht eingeschränkt auf) Zellmikroinjektionstechniken, Transformationstechniken und Träger-Techniken.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung mitogen und extrazellulär regulierte Kinase zur Verhinderung oder Behandlung eines anomalen Zustands in einem Organismus, wobei die Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis die Struktur der Formel I, II oder III, wie sie hier definiert ist, hat oder jegliche Subgruppen davon, die hier definiert sind.
  • Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der identifizierten Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis zur Herstellung eines Medikamentes, das sich zur Verhinderung oder Behandlung eines anomalen Zustandes in einem Organismus eignet, wobei die Azabenzimidazol-Verbindung aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus SABI-Verbindungen besteht.
  • Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der identifizierten Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis zur Herstellung eines Medikamentes, das sich zur Verhinderung oder Behandlung eines anomalen Zustands in einem Organismus eignet, wobei der Organismus ein Säugetier ist.
  • Der Begriff "Säugetier" betrifft vorzugsweise solche Organismen, wie Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen und Ziegen, stärker bevorzugt Affen und Menschenaffen, und am stärksten bevorzugt Menschen.
  • Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der identifizierten Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis zur Herstellung eines Medikamentes, das sich zur Verhinderung oder Behandlung eines anomalen Zustands in einem Organismus eignet, wobei der anomale Zustand Krebs oder eine fibrotische Störung ist.
  • Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der identifizierten Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis zur Herstellung eines Medikamentes, das sich zur Verhinderung oder Behandlung eines anomalen Zustands in einem Organismus eignet, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lungenkrebs, Ovarialkrebs, Brustkrebs, Gehirntumor, intraaxialer Gehirntumor, Kolonkrebs, Prostatakrebs, Sarlom, Kapsi-Sarkom, Melanom und Gliom.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der identifizierten Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis zur Herstellung eines Medikamentes, das sich zur Verhinderung oder Behandlung eines anomalen Zustands in einem Organismus eignet, wobei die Verwendung bei einem anomalen Zustand angewendet wird, der mit einer Aberration in einem Signaltransduktionsweg einhergeht, gekennzeichnet durch eine Wechselwirkung zwischen einer Serin/Threonin-Kinase und einem natürlichen Bindungspartner.
  • Der Begriff "Signaltransduktionsweg" betrifft die Weiterverbreitung eines Signals. Gewöhnlich wird ein extrazelluläres Signal durch die Zellmembran übertragen, so dass es zu einem intrazellulären Signal wird. Dieses Signal kann dann eine Zellreaktion stimulieren. Der Begriff umfasst auch Signale, die sich vollständig in einer Zelle verbreiten. Die an den Signaltransduktionsprozessen beteiligten Prozesse sind gewöhnlich Rezeptor- und Nicht-Rezeptor-Proteinkinasen, Rezeptor- und Nicht-Rezeptor-Proteinphosphatasen, Nucleotidaustauschfaktoren, und Transkriptionsfaktoren.
  • Der Begriff "Aberration", im Zusammenhang mit einem Signaltransduktionsprozess, betrifft eine Proteinkinase, die in einem Organismus über- oder unterexprimiert wird, derart mutiert wird, dass ihre katalytische Aktivität niedriger oder höher als die Proteinkinase-Aktivität des Wildtyps ist, derart mutiert ist, dass sie nicht länger mit einem natürlichen Bindungspartner wechselwirken kann, nicht länger durch eine andere Proteinkinase oder Proteinphosphatase modifiziert ist, oder nicht länger mit einem natürlichen Bindungspartner wechselwirkt.
  • Der Begriff "fördert oder unterbricht die anomale Wechselwirkung" betrifft ein Verfahren, das durch Verabreichen einer erfindungsgemäßen Verbindung an Zellen oder Geweben in einem Organismus erfolgt. Eine Verbindung kann eine Wechselwirkung zwischen einer Proteinkinase und natürlichen Bindungspartnern fördern, indem günstige Wechselwirkungen mit mehreren Atomen an der Komplex-Grenzfläche eingegangen werden. Alternativ kann eine Verbindung die Wechselwirkung zwischen einer Proteinkinase und natürlichen Bindungspartnern hemmen, indem günstige Wechselwirkungen, die zwischen Atomen an der Komplexgrenzfläche gebildet werden, beeinträchtigt werden. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der identifizierten Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis zur Herstellung eines Medikamentes, das sich zur Verhinderung oder Behandlung eines anomalen Zustands in einem Organismus eignet, wobei die Serin/Threonin-Proteinkinase RAF ist.
  • III. Verbindungen und Arzneimittel der Erfindung
  • Bei einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung Azabenzimidazol-Verbindungen mit den Strukturen der Formeln I, II oder III:
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    wobei:
    • (a) R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
    • (i) Wasserstoff;
    • (ii) gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl;
    • (iii) NX2X3, wobei X2 und X3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten;
    • (iv) Halogen oder Trihalogenmethyl;
    • (v) einem Keton der Formel -CO-X4, wobei X4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten;
    • (vi) einer Carbonsäure der Formel -(X5)n-COOH oder einem Ester der Formel -(X6)n-COO-X7, wobei X5, X6 und X7 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten und wobei n gleich 0 oder 1 ist;
    • (vii) einem Alkohol der Formel (X8)n-OH oder einer Alkoxy-Einheit der Formel -(X8)n-O-X9, wobei X8 und X9 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten, wobei der Ring gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkoxy, Halogen, Trihalogenmethyl, Carboxylat, Nitro und Ester, und wobei n gleich 0 oder 1 ist;
    • (viii) einem Amid der Formel -NHCOX10, wobei X10 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Hydroxyl, und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten, wobei der Ring gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkoxy, Halogen, Trihalogenmethyl, Carboxylat, Nitro und Ester;
    • (ix) -SO2NX11X12, wobei X11 und X12 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten;
    • (x) einer homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheit, die gegebenenfalls substituiert ist mit einer, zwei oder drei Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Alkoxy-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Ester-Einheiten;
    • (xi) einem Aldehyd der Formel -CO-H; und
    • (xii) einem Sulfon der Formel -SO2-X13, wobei X13 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten;
    • (b) Z1 und Z2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, NH oder NR4, mit der Maßgabe, dass, wenn einer der Reste Z1 und Z2 Stickstoff, NH oder NR4 ist, dann der jeweils andere von Z1 und Z2 Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, NH oder NR4 ist; und
    • (c) Z3 und X1 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff.
  • Der Begriff "gesättigtes Alkyl" betrifft eine Alkyleinheit, die keine Alken- oder Alkineinheiten enthält. Die Alkyleinheit kann verzweigt oder nicht-verzweigt sein.
  • Der Begriff "ungesättigtes Alkyl" betrifft eine Alkyleinheit, die mindestens eine Alken- oder Alkineinheit enthält. Die Alkyleinheit kann verzweigt oder nicht-verzweigt sein.
  • Der Begriff "Amin" betrifft eine chemische Einheit der Formel NR1R2, wobei R1 und R2 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten, wobei der Ring gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert ist, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Ester-Einheiten.
  • Der Begriff "Aryl" betrifft einen aromatischen Rest, der mindestens einen Ring mit einem konjugierten pi-Elektronensystem aufweist, und carbocyclische Aryl- (bspw. Phenyl) und heterocyclische Arylgruppen (bspw. Pyridin) beinhaltet. Der Begriff "carbocyclisch" betrifft eine Verbindung, die eine oder mehrere kovalent geschlossene Ringstrukturen aufweisen, und dies beinhaltet, dass die Atome, die das Gerüst des Rings bilden, sämtlich Kohlenstoffatome sind. Der Begriff unterscheidet somit carbocyclische von heterocyclischen Ringe, in denen das Ringgerüst, mindestens ein Atom enthält, das sich von Kohlenstoff unterscheidet. Der Begriff "Heteroaryl" betrifft eine Arylgruppe, die mindestens einen heterocyclischen Ring enthält.
  • Der Begriff "Halogen" betrifft ein Atom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluor, Chlor, Brom und Iod.
  • Der Begriff "Keton" betrifft eine chemische Einheit mit der Formel -(R)n-CO-R', wobei R und R' ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten, und wobei n gleich 0 oder 1 ist.
  • Der Begriff "Carbonsäure" betrifft eine chemische Einheit der Formel -(R)n-COOH, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten, und wobei n gleich 0 oder 1 ist.
  • Der Begriff "Ester" betrifft eine chemische Einheit der Formel -(R)n-COOR', wobei R und R' unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten, und wobei n gleich 0 oder 1 ist.
  • Der Begriff "Alkohol" betrifft einen chemischen Substituenten der Formel -ROH, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten, wobei die Ringeinheit gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estereinheiten.
  • Der Begriff "Amid" betrifft einen chemischen Substituenten der Formel -NHCOR, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten, wobei der Ring gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Halogen, Trihalogen, Carboxylat, Nitro oder Ester.
  • Der Begriff "Alkoxyeinheit" betrifft einen chemischen Substituenten der Formel -OR, wobei R Wasserstoff oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkyleinheit ist.
  • Der Begriff "Aldehyd" betrifft eine chemische Einheit der Formel -(R)n-CHO, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gesättigten Alkyl- und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten und wobei n gleich 0 oder 1 ist.
  • Der Begriff "Sulfon" betrifft eine chemische Einheit der Formel -SO2-R, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten.
  • Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis mit einer Struktur der Formel I, II oder III, wobei Z1 und Z2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff und NH.
  • Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis mit einer Struktur der Formel I, II oder III, wobei R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl, das gegebenenfalls mit homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten substituiert ist, wobei die Ringeinheit gegebenenfalls mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Alkoxy-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Carboxylat-, Nitro- und Estereinheiten und einer homocyclischen oder heterocylischen Ringeinheit, die gegebenenfalls substituiert ist mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Alkoxy-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Carboxylat-, Nitro- und Estereinheiten.
  • Die Erfindung betrifft in anderen bevorzugten Ausführungsformen eine Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis mit einer Struktur der Formel I, II oder III, wobei R2 und R3 Wasserstoff sind.
  • Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis mit einer Struktur der Formel I, II oder III, wobei R1 Phenyl ist, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem, zwei oder drei Substituenten, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Alkoxy-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- oder Estereinheiten.
  • Die Erfindung betrifft bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis mit einer Struktur der Formel I, II oder III, wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SABI-Substituenten.
  • Der Begriff "SABI-Substituenten" betrifft die Gruppe, der Substituenten bestehend aus Phenyl, 2-Nitrophenyl, 3-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl, 2-Chlorphenyl, 3-Chlorphenyl, 4-Chlorphenyl, 2-Methylphenyl, 3-Methylphenyl, 4-Methylphenyl, 2-Fluorphenyl, 3-Fluorphenyl, 4-Fluorphenyl, 2-(Trifluormethyl)phenyl, 3-(Trifluormethyl)phenyl, 4-(Trifluormethyl)phenyl, 2-Methoxyphenyl, 3-Methoxyphenyl, 4-Methoxyphenyl, 2-Carboxyphenyl, 3-Carboxyphenyl, und 4-Carboxyphenyl.
  • Die Erfindung betrifft in anderen bevorzugten Ausführungsformen eine Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis mit einer Struktur der Formel I, II, oder III, wobei X1 Schwefel ist.
  • Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis mit einer Struktur der Formel I, II oder III, wobei X1 Sauerstoff ist.
  • Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis mit einer Struktur der Formel I, II oder III, wobei Z3 Sauerstoff ist.
  • Die Erfindung betrifft in anderen Ausführungsformen eine Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis mit einer Struktur der Formel I, II oder III, wobei R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methyl und Ethyl.
  • Die Erfindung betrifft in einer anderen Ausführungsform eine Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis mit einer Struktur der Formel I, II oder III, wobei die Azabenzimidazol-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SABI-Verbindungen.
  • Die Erfindung liefert in einem anderen Aspekt ein Arzneimittel umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung, wie sie hier näher erläutert ist, oder ihr Salz, und einen physiologisch verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel.
  • Die Erfindung betrifft in einem anderen Aspekt ein Arzneimittel umfassend eine Verbindung mit einer Struktur der Formel I, II oder III, wie sie hier definiert ist, oder eine von deren Subgruppen, wie sie hier offenbart sind.
  • Die Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform ein Arzneimittel, wobei die Azabenzimidazol-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SABI-Verbindungen.
  • Der Begriff "Arzneimittel" betrifft ein Gemisch aus einer erfindungsgemäßen Azabenzimidazol-Verbindung mit anderen chemischen Komponenten, wie Verdünnungsmitteln oder Trägern. Das Arzneimittel erleichtert die Verabreichung der Verbindung an einen Organismus. Mehrere Techniken zur Verabreichung einer Verbindung gibt es im Stand der Technik, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf orale, Injektions-, Aerosol-, parenterale und topische Verabreichung. Arzneimittel lassen sich auch erhalten durch Umsetzen von Verbindungen mit anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure. Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und dergleichen.
  • Der Begriff "physiologisch verträglich" definiert einen Träger oder ein Verdünnungsmittel, das die biologische Aktivität und die Eigenschaften der Verbindung nicht aufhebt.
  • Der Begriff "Träger" definiert eine chemische Verbindung, die die Aufnahme einer Verbindung in Zellen oder Geweben erleichtert. Bspw. ist Dimethylsulfoxid (DMSO) ein gemeinhin verwendeter Träger, da er die Aufnahme vieler organischer Verbindungen in die Zellen oder Gewebe eines Organismus erleichtert.
  • Der Begriff "Verdünnungsmittel" definiert chemische Verbindungen, die in Wasser verdünnt sind, das die interessierende Verbindung löst und die biologisch stabile Form der Verbindung stabilisiert. Salze, die in gepufferten Lösungen gelöst sind, werden im Stand der Technik als Verdünnungsmittel verwendet. Eine gemeinhin verwendete Pufferlösung ist eine phosphatgepufferte Salzlösung, da sie die Salzbedingungen von menschlichem Blut nachahmt. Da Puffersalze den pH-Wert einer Lösung bei niedrigen Konzentrationen steuern können, modifiziert ein gepuffertes Verdünnungsmittel kaum die biologische Aktivität einer Verbindung.
  • IV. Syntheseverfahren der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft in einem anderen Aspekt ein Verfahren zur Synthese einer Azabenzimidazol-Verbindung der Formel I, II oder III, umfassend die Schritte: (a) Umsetzen von 2-Amino-6-chlor-3-nitropyridin mit einem zweiten Reaktanten in einem Lösungsmittel, so dass das erste Zwischenprodukt erhalten wurde, wobei der zweite Reaktant ein substituierter Arylring ist; (b) Reduzieren des ersten Zwischenproduktes in Gegenwart eines Katalysators und eines Reduktionsmittels, so dass das zweite Zwischenprodukt erhalten wird; (c) Umsetzen des zweiten Zwischenproduktes mit einem dritten Reaktanten; und (d) Reinigen der erfindungsgemäßen Verbindung.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Verfahren zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei der substituierte Arylring ein substituiertes Phenol, substituiertes Thiophenol und ein substituiertes Anilin ist.
  • Die Erfindung betrifft in einer anderen bevorzugten Ausführungsform das Verfahren zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei das substituierte Phenol, substituierte Thiophenol und das substituierte Anilin ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SABI-Reaktanten.
  • Der Begriff "SABI-Reaktanten" betrifft die Gruppe der Reaktanten, bestehend aus dem Natriumsalz von Phenol, 2-Nitrophenol, 3-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, 2-Chlorphenol, 3-Chlorphenol, 4-Chlorphenol, 2-Kresol, 3-Kresol, 4-Kresol, 2-Fluorphenol, 3-Fluorphenol, 4-Fluorphenol, 2-(Trifluormethyl)phenol, 3-(Trifluormethyl)phenol, 4-(Trifluormethyl)phenol, 2-Methoxyphenol, 3-Methoxyphenol, 4-Methoxyphenol, 2-Hydroxybenzoesäure, 3-Hydroxybenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Thiophenol, 2-Nitrothiophenol, 3-Nitrothiophenol, 4-Nitrothiophenol, 2-Chlorthiophenol, 3-Chlorthiophenol, 4-Chlorthiophenol, 2-Thiokresol, 3-Thiokresol, 4-Thiokresol, 2-Fluorthiophenol, 3-Fluorthiophenol, 4-Fluorthiophenol, 2-(Trifluormethyl)thiophenol, 3-(Trifluormethyl)thiophenol, 4-(Trifluormethyl)thiophenol, 2-Methoxybenzolthiol, 3-Methoxybenzolthiol, 4-Methoxybenzolthiol, 2-Mercaptobenzoesäure, 3-Mercaptobenzoesäure, 4-Mercaptobenzoesäure, Anilin, 2-Nitroanilin, 3-Nitroanilin, 4-Nitroanilin, 2-Chloranilin, 3-Chloranilin, 4-Chloranilin, 2-Toluidin, 3-Toluidin, 4-Toluidin, 2-Fluoranilin, 3-Fluoranilin, 4-Fluoranilin, 2-(Trifluormethyl)anilin, 3-(Trifluormethyl)anilin, 4-(Trifluormethyl)anilin, 2-Anisidin, 3-Anisidin, 4-Anisidin, 2-Aminobenzoesäure, 3-Aminobenzoesäure, und 4-Aminobenzoesäure.
  • Die Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform das Verfahren zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei das Lösungsmittel n-Propanol ist.
  • Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform das Verfahren zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei das Reduktionsmittel Wasserstoff ist.
  • Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform das Verfahren zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei der Katalysator Raney-Nickel ist.
  • Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform das Verfahren zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei der dritte Reaktant O-Methylisoharnstoff ist.
  • Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform das Verfahren zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei der dritte Reaktant das Produkt der Umsetzung von S-Methylisothiouroniumsulfat und Alkylchlorformiat ist.
  • Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform das Verfahren zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei das Alkylchlorformiat Methylchlorformiat ist.
  • Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei das Alkylchlorformiat Ethylchlorformiat ist.
  • Die Erfindung wird nachstehend aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform und aus den Ansprüchen ersichtlich.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zum Teil Verfahren zur Modulation der Funktion von Serin/Threonin-Proteinkinasen mit Verbindungen auf Azabenzimidazol-Basis. Die Erfindung betrifft zudem zum Teil Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinasen modulieren. Die Verfahren beinhalten Zellen, die eine Serin/Threoninkinase exprimieren, wie RAF.
  • RAF ist eine Nicht-Rezeptorproteinkinase, die zur Zellmembran rekrutiert wird, wenn sie an aktiviertes RAS, ein Guanintriphosphat hydrolysierendes Enzym, bindet. RAS wird aktiviert, wenn eine aktivierte Rezeptorprotein-Tyrosinkinase, wie EGFR oder PDGFR, an ein Adaptorprotein, GRB2, und einen Guaninnukleotid-Austauschfaktor, SOS, bindet. SOS entfernt Guanindiphosphat aus RAS, ersetzt es gegen Guanintriphosphat und aktiviert dadurch RAS. RAS bindet dann an RAF und aktiviert es somit. RAF kann dann andere Proteinziele auf Serin- und Threoninresten phosphorylieren, wie die Kinase (MEK), die die mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) phosphoryliert und somit aktiviert. Somit dient RAF als intermediärer Regulationsfaktor der mitogenaktivierten Signaltransduktion.
  • Aufgrund der wichtigen regulatorischen Rolle von RAF in Zellen können Modifikationen der Aminosäuresequenz von RAF dessen Funktion verändern und somit das Zellverhalten verändern. Die Rolle von RAF bei der Zellproliferation wird durch die Beobachtung unterstrichen, dass Mutationen der Aminosäuresequenz von RAF mit Tumoren und Krebserkrankungen einhergehen. Da die krebserzeugenden Mutationen von RAF zu RAF-Molekülen führen, die eine ungeregelte katalytische Aktivität aufweisen, können Inhibitoren von RAF die Zellproliferation, die in diesen Zellen zu Krebs führt, abschwächen oder sogar ganz aufheben.
  • Erfindungsgemäße Verfahren können Verbindungen erfassen, die die Funktion der Proteinkinase RAF in den Zellen moduliert. RAF phosphoryliert eine Proteinkinase (MEK), die wiederum mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) phosphoryliert. Tests, die nur die Phosphorylierung von MEK durch RAF überwachen, sind nicht empfindlich, da MEK nicht signifikant genug phosphoryliert wird. Zur Bewältigung dieses Empfindlichkeits-Dilemmas wird die Phosphorylierung von MEK und MAPK in den erfindungsgemäßen Tests untersucht. Das MAPK-Phosphorylierungssignal amplifiziert das MEK-Phosphorylierungssignal und ermöglicht, dass die RAF-abhängige Phosphorylierung im Enzymimmuntest verfolgt wird. Daneben wird der erfindungsgemäße Test vorzugsweise in einem Hochdurchsatzformat durchgeführt, so dass viele Verbindungen rasch in einem kurzen Zeitraum überwacht werden können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren haben Verbindungen identifiziert, die die Funktion der RAF-Proteinkinase hemmen. Diese Verbindungen sind Derivate auf Azabenzimidazol-Basis. Es wurden zwar Derivate auf Azabenzimidazol-Basis auf ihre Fähigkeit zur Hemmung von Enzymen untersucht, die an der Nucleotidsynthese in Bakterien beteiligt sind, jedoch wurden viele dieser Verbindungen hinsichtlich der Proteinkinasehemmung noch nicht signifikant untersucht.
  • Da RAF die signifikante Aminosäurehomologie gegenüber anderen Serin/Threonin-Proteinkinasen hemmt, können die erfindungsgemäßen Verbindungen auf Azabenzimidazol-Basis wahrscheinlich andere Serin/Threonin-Proteinkinasen als RAF hemmen. Somit betreffen die erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls andere Serin/Threonin-Proteinkinasen als RAF, einschließlich Rezeptor- und Nicht-Rezeptor-Serin/Threonin-Proteinkinasen.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren betreffen ebenfalls andere Verbindungen, die die RAF-Funktion in Zellen modulieren, da der Hochdurchsatzaspekt der Verfahren ermöglicht, dass eine breite Anordnung von Molekülen in einem kurzen Zeitraum getestet werden kann. Daher können die erfindungsgemäßen Verfahren bestehende Moleküle identifizieren, die nicht in der vorliegenden Erfindung offenbart sind, die die STK-Funktion modulieren.
  • I. Biologische Aktivität der Verbindungen auf Azabenzimidazol-Basis
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen auf Azabenzimidazol-Basis wurden auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der RAF-Proteinkinase-Funktion untersucht. Die biologischen Tests und die Ergebnisse dieser Hemmstudien sind hier beschrieben. Die zur Messung der Modulation der Proteinkinasefunktion durch die Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis verwendeten Verfahren ähneln denjenigen, die in der US-Patentanmeldung mit der laufenden Nr. 08/702 232 von Tang et al., mit dem Titel "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease", (Lyon & Lyon Akten-Nr. 221/187), eingereicht am 23. August 1996, hinsichtlich des Hochdurchsatz-Aspektes der Erfindung beschrieben sind. Die Anmeldung mit der Nr. 08/702 232 ist hiermit vollinhaltlich, einschließlich sämtlicher Zeichnungen, durch Bezugnahme aufgenommen.
  • II. Ziel-Erkrankungen, die sich zur Behandlung durch Verbindungen auf Azabenzimidazol-Basis eignen
  • Die hier beschriebenen Verfahren, Verbindungen und Arzneimittel sind so ausgelegt, dass sie proliferative Zellstörungen hemmen, indem die Funktion der RAF-Proteinkinase moduliert wird. Proliferative Störungen führen zu einer ungewünschten Zellproliferation von einer oder mehreren Zellpopulationen in einem mehrzelligen Organismus, was den Organismus schädigt. Die hier beschriebenen Verfahren, Verbindungen und Arzneimittel können sich ebenfalls zur Behandlung und Verhinderung anderer Störungen in Organismen eignen, wie Störungen, die mit dem vorzeitigen Zelltod einhergehen (d. h. neurologische Erkrankungen) oder Entzündung. Diese Störungen können eine Folge von RAF-Molekülen sein, die nicht korrekt funktionieren oder eine Folge der RAF-verwandten Proteinkinasemoleküle, die nicht korrekt funktionieren.
  • Veränderungen der Funktion der RAF-Proteinkinase oder Proteinkinasen, die RAF betreffen, können zu verstärkten oder herabgesetzten Zellproliferationsereignissen führen, die in bestimmten Erkrankungen offensichtlich sind. Aberrante Zellproliferations-Zustände beinhalten Krebserkrankungen, fibrotische Störungen, mesangiale Störungen, anomale Angiogenese und Vaskulogenese, Wundheilung, Psoriasis, Restenose und Entzündung.
  • Fibrotische Störungen betreffen die anomale Bildung der zellulären extrazellulären Matrix. Ein Beispiel für eine fibrotische Störung ist eine hepatische Zirrhose. Die hepatische Zirrhose ist durch eine erhöhte Konzentration von extrazellulären Matrixbestandteilen charakterisiert, was zur Bildung einer hepatischen Vernarbung führt. Die hepatische Zirrhose kann Erkrankungen wie die Leberzirrhose verursachen.
  • Mesangiale Zellproliferationsstörungen erfolgen aufgrund einer anomalen Proliferation mesangialer Zellen. Mesangiale Proliferationsstörungen beinhalten verschiedene menschliche Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropathie, maligne Nephrosklerose, thrombotische Mikroangiopathiesyndrome, Transplantat-Abstoßung und Glomerulopathien.
  • Bevorzugte Typen von Krebserkrankungen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren und Verbindungen behandelt werden können, sind Lungenkrebs, Ovarialkrebs, Brustkrebs, Gehirntumor, intraaxialer Gehirntumor, Kolonkrebs, Prostatakrebs, Kaposi-Sarkom, Melanom und Gliom. Der Beweis, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen und Verfahren sich effizient verwenden lassen, um die Proliferation von Krebszellen zu bekämpfen und umzukehren, wird hiermit durch Bezugnahme bereitgestellt.
  • Angiogene und vaskulogene Störungen beruhen auf einer übermäßigen Proliferation der Blutgefäße. Die Proliferation der Blutgefäße ist notwendig bei einer Vielzahl von normalen physiologischen Prozessen, wie bei der Embryonalentwicklung, Bildung von Corpus Luteum, Wundheilung und Organ-Erneuerung. Die Proliferation von Blutgefäßen ist jedoch ebenfalls essentiell bei der Krebstumorentwicklung. Andere Beispiele für Blutgefäß-Proliferationsstörungen beinhalten Arthritis, wobei neue kapillare Blutgefäße in das Gelenk einwandern und den Knorpel zerstören. Zudem beinhalten Blutgefäß-Proliferationserkrankungen Augenerkrankungen, wie diabetische Retinopathie, wobei neue Kapillaren in der Retina in den Glaskörper einwandern, bluten und Blindheit verursachen. Umgekehrt werden Krankheiten, die mit dem Schrumpfen, Zusammenziehen oder dem Verschließen von Blutgefäßen einhergehen, wie eine Restenose, ebenfalls mit der entgegengesetzten Regulation von Proteinkinasen in Zusammenhang gebracht.
  • Vaskulogenese und Angiogenese gehen ebenfalls mit dem Wachstum maligner fester Tumore und Metastasen einher. Ein stark wachsender Krebstumor erfordert für ein fortgesetztes Wachsen eine nährstoff- und sauerstoffreiche Blutversorgung. Folglich wächst eine anormal große Zahl von kapillaren Blutgefäßen oft zusammen mit dem Tumor, die dem Tumor als Versorgungsleitungen dienen. Neben der Zufuhr von Nährstoffen zu dem Tumor liefern die in einen Tumor eingebetteten Blutgefäße einen Zugang für Tumorzellen, in den Blutkreislauf einzutreten, und bilden in dem Organismus an entfernten Stellen Metastasen. Folkman, 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 4–6.
  • Eine unzureichende RAF-Aktivität kann Zellproliferationsstörungen stimulieren. Moleküle, die speziell zur Modulation der Funktion der RAF-Proteinkinase ausgelegt sind, hemmen die Zellproliferation. Insbesondere Antisense-Nukleinsäuremoleküle, die so ausgelegt sind, dass sie die Messenger-RNA binden, die die RAF-Proteinkinase codiert, und die Translation dieser Botschaft blockieren, kehrten die Transformation von A549-Zellen effizient in vitro um. Monia et al., 1996, Nature Medicine 2: 688, das hiermit vollinhaltlich einschließlich sämtlicher Figuren und Tabellen aufgenommen ist. A549-Zellen sind menschliche maligne Zellen.
  • Diese RAF-gezielten Antisense-Untersuchungen liefern den Beweis, dass die erfindungsgemäßen Azabenzimidazol-Moleküle die die Funktion der RAF- Proteinkinase modulieren, die Proliferation maligner Zellen in einem Organismus einschränken und wahrscheinlich umkehren können. Diese Azabenzimidazol-Verbindungen können bspw. in den hier bereitgestellten In-vitro-Verfahren untersucht werden. Die Azabenzimidazol-Verbindungen können darüber hinaus auf ihre Wirkung auf Tumorzellen in vivo durch Fremdtransplantat-Verfahren, die hier ebenfalls bspw. bereitgestellt werden, untersucht werden.
  • Es existieren mindestens zwei Wege, in denen eine unzureichende RAF-Aktivität eine ungewünschte Zellproliferation eines bestimmten Zelltyps stimulieren kann: (1) die direkte Stimulation des Wachstums der jeweiligen Zelle, oder (2) das Erhöhen der Vaskularisierung eines bestimmten Bereichs, wie eines Tumorgewebes, wodurch das Wachstum des Gewebes erleichtert wird.
  • Die Verwendung der vorliegenden Erfindung wird erleichtert, indem zuerst identifiziert wird, ob die Zellproliferationsstörung von RAF gesteuert wird. Sobald solche Störungen identifiziert sind, lassen sich Patienten, die an einer solchen Störung leiden, durch Analyse ihrer Symptome analysieren, indem dem Arzt oder dem veterinärmedizinischen Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden.
  • Die Bestimmung, ob die Zellproliferationsstörung von RAF gesteuert wird, kann erfolgen, indem zuerst das Ausmaß der RAF-Aktivität bestimmt wird, die in der Zelle oder in einem bestimmten Ort des Körpers des Patienten auftritt. Im Falle von Krebszellen kann das Ausmaß von einer oder mehreren RAF-Aktivitäten mit nicht durch RAF gesteuerten Krebserkrankungen und durch RAF gesteuerten Krebserkrankungen verglichen werden. Haben die Krebszellen ein höheres Ausmaß an RAF-Aktivität als die durch RAF gesteuerten Krebserkrankungen, vorzugsweise gleich oder größer als durch RAF gesteuerte Krebserkrankungen, dann sind sie Kandidaten für die Behandlung mit den beschriebenen RAF-modulierenden verfahren und Verbindungen der Erfindung.
  • Im Fall von Zellproliferationsstörungen, die aufgrund einer ungewünschten Proliferation von Nicht-Krebszellen entstehen, wird das Ausmaß der RAF-Aktivität mit dem Ausmaß verglichen, das bei der allgemeinen Bevölkerung auftritt (bspw. das durchschnittliche Ausmaß, das bei der allgemeinen Bevölkerung von Menschen und Tieren auftritt, ausschließlich solcher Menschen oder Tiere, die an einer Zellproliferationsstörung leiden). Ist die ungewünschte Zellproliferationsstörung durch ein höheres RAF-Ausmaß charakterisiert als es bei der allgemeinen Bevölkerung auftritt, dann ist die Störung ein Kandidat zur Behandlung, wobei die beschriebenen RAF-modulierenden Verfahren und Verbindungen der Erfindung verwendet werden.
  • III. Arzneimittel und Verabreichung von Verbindungen auf Azabenzimidazol-Basis
  • Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen der Verbindungen, Verfahren zur Bestimmung der Mengen der an einen Patienten zu verabreichenden Verbindungen, und die Modi zur Verabreichung der Verbindungen an einen Organismus sind in der US-Patentanmeldung mit der laufenden Nr. 08/702 232 von Tang et al. mit dem Titel "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease" (Lyon & Lyon Akten-Nr. 221/187), eingereicht am 23. August 1996, und in der Internationalen Patentveröffentlichung mit der Nummer WO 96/22976, von Buzzetti et al., mit dem Titel "Hydrosoluble 3-Aryliden-2-Oxindole Derivatives as Tyrosin Kinase Inhibitors", veröffentlicht am 1. August 1996, offenbart, die jeweils vollinhaltlich einschließlich ihrer Zeichnungen durch Bezugnahme aufgenommen sind. Der Fachmann erkennt, dass sich diese Beschreibungen auf die vorliegende Erfindung anwenden lassen und leicht daran angepasst werden können.
  • Beispiele
  • Die Beispiele beschreiben Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen und Verfahren zum Messen einer Wirkung einer Verbindung auf die Funktion der RAF-Proteinkinase.
  • Die in den Verfahren verwendeten Zellen sind kommerziell erhältlich. Die in den Zellen enthaltenen Nukleinsäurevektoren sind ebenfalls kommerziell erhältlich, und die Sequenzen der Gene für verschiedene Proteinkinasen sind leicht in Sequenz-Datenbanken zugänglich. Somit kann ein Fachmann die Zelllinie leicht rechtzeitig wieder erzeugen, indem die kommerziell erhältlichen Zellen, die kommerziell erhältlichen Nukleinsäurevektoren und die Proteinkinase-Gene mit Techniken, die dem Durchschnittsfachmann leicht zugänglich sind, kombiniert werden.
  • Beispiel 1: Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen Azabenzimidazol-Verbindungen
  • Die Erfindung wird nachstehend anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht:
    • (i) Verdampfungen erfolgten durch Rotationsverdampfung unter Vakuum:
    • (ii) die Betriebsverfahren erfolgten unter einer Atmosphäre eines Inertgases wie Stickstoff;
    • (iii) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) erfolgte auf Merck LiChrosorb RP-18-Umkehrphasen-Silica, das von E. Merck, Darmstadt, Deutschland erhalten wurde;
    • (iv) die Ausbeuten sind lediglich zu Veranschaulichungszwecken angegeben und sind nicht notwendigerweise das erzielbare Maximum;
    • (v) Schmelzpunkte sind nicht korrigiert und wurden mit einem HWS Mainz SG 2000 Digital-Schmelzpunkt-Gerät bestimmt;
    • (vi) die Strukturen sämtlicher Verbindungen der Formel I, II und III dieser Erfindung wurden durch Kernresonanzspektroskopie auf einem Bruker AMX500-NMR Spektralphotometer, durch Elementar-Mikroanalyse und, in bestimmten Fällen, durch Massenspektrokopie bestätigt;
    • (vii) die Reinheit der Strukturen erfolgten durch Dünnschichtchromatographie (DC) mittels Silicagel (Merck Silicagel 60 F254) oder durch HPLC; und
    • (viii) Zwischenprodukte wurden gewöhnlich nicht vollständig gekennzeichnet, und die Reinheit wurde durch Dünnschichtchromatographie (DC) oder durch HPLC bestimmt.
  • Syntheseverfahren
  • Verbindung A-90: 2-Methoxycarbonylamino-(6-phenylmercapto-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • 2-Amino-3-nitro-6-(phenylmercapto)pyridin wurde hergestellt durch Erhitzen von 2-Amino-6-chlor-3-nitropyridin (84,0 g, 0,484 mol) und Natriumthiophenolat (Fluka) (72,0 g, 0,545 Mol) in 2-Propanol (1500 ml) unter Rückfluss für 2 Std. Nach dem Kühlen auf Raumtemperatur wurde die Suspension mit Wasser (100 ml) verdünnt, der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Wasser und 2-Propanol gewaschen und bei 50°C unter Vakuum getrocknet, so dass 109,1 g (95% Ausbeute) von 2-Amino-3-nitro-6-(phenylmercapto)pyridin, Schmp. 148–152°C erhalten wurde.
  • 2,3-Diamino-6-(phenylmercapto)pyridin wurde hergestellt durch Hydrieren von 2-Amino-3-nitro-6-(phenylmercapto)pyridin (107,1 g, 0,433 Mol) unter 5 Atm. H2 in der Gegenwart von 30 g Raney-Ni in 1200 ml 2-Propanol bei 70°C. Nach 4 Std. (29,1 l Wasserstoff) wurde das Reaktionsgemisch unter kontinuierlichem Rühren auf 4°C gekühlt. Der Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit 2-Propanol gewaschen und bei 50°C unter Vakuum getrocknet. Die vereinigten Filtrate wurden unter reduziertem Druck eingeengt und aus 2-Propanol umkristallisiert. Nach dem zweimaligen Waschen der Hydrierungsvorrichtung mit 1000 ml THF, Verdampfen unter reduziertem Druck und Umkristallisation aus 2-Propanol wurde der Niederschlag gesammelt und bei 50°C unter Vakuum getrocknet, so dass 80,4 g (87,1% Ausbeute) 2,3-Diamino-6-(phenylmercapto)pyridin, Schmp. 119–122°C, erhalten wurde.
  • 2-Methoxycarbonylamino-6-phenylmercapto-3H-imidazo[4,5-b]pyridin wurde hergestellt durch Zugabe von Methylchlorformiat (34 ml, 0,44 Mol) tropfenweise zu einer kalten (5–15°C) Lösung von S-Methylisothiouroniumsulfat (53 g, 0,19 mol) (Aldrich) in 68 ml Wasser, während die Temperatur unter 20°C gehalten wurde. Anschließend wurde wässriges Natriumhydroxid (116 g, 25% NaOH) vorsichtig dazu gegeben, und es trat ein weißer Niederschlag auf. Nach 20 min wurde Wasser (210 ml) zugegeben, und der pH-Wert auf 4,0 mit Essigsäure (Eisessig, 34 ml) eingestellt. Zu diesem Gemisch wurde eine Lösung von 2,3-Diamino-6-(phenylmercapto)pyridin (37,8 g, 0,174 mol) in 210 ml Ethanol tropfenweise dazu gegeben, und 2 Std. auf 85 bis 90°C erhitzt. Nach dem Kühlen des Reaktionsgemischs über Nacht wurde der Niederschlag durch Filtration isoliert, mit warmem Wasser (1000 ml) gewaschen, getrocknet und aus Essigsäure und Ethanol bei 4°C umkristallisiert. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Methanol gewaschen und bei 50°C unter Vakuum getrocknet, so dass 30 g (57,4% Ausbeute) 2-Methoxycarbonylamino-6-phenylmercapto-3H-imidazo[4,5-b]pyridin, Schmp. 269–274°C (Zers.) erhalten wurde.
  • Verbindung A-3: 2-Methoxycarbonylamino-(6-phenoxy-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Durch Auswechseln von Natriumthiophenolat gegen Natriumphenolat in Beispiel A-90 ergab das identische Verfahren 2-Methoxycarbonylamino-(6-phenoxy-3H-imidazo[4,5-b]pyridin, Schmp. > 280°C (Zers.).
  • Verbindung A-4: 2-Ethoxycarbonylamino-6-phenoxy-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Durch Auswechseln von Methylchlorformiat gegen Ethylchlorformiat in Beispiel A-3 ergab das identische Verfahren 2-Ethoxycarbonylamino-(6-phenoxy-3H-imidazo[4,5-b]pyridin, Schmp. > 280°C (Zers.).
  • Verbindung A-1: 2-Oxo-6-phenoxy-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Durch direktes Umsetzen von O-Methylisoharnstoff mit 2,3-Diamino-6-(phenylmercapto)pyridin anstelle des Produkts der Umsetzung von S-Methylisothiouroniumsulfat und Methylchlorformiat in Beispiel A-3 ergab das identische Verfahren 2-Oxo-(6-phenoxy-3H-imidazo[4,5-b]pyridin, Schmp. 277–278°C.
  • Verbindung A-2: 2-Oxo-6-phenylmercapto-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Durch Auswechseln von Natriumphenolat gegen Natriumthiophenolat in Beispiel A-1 ergab das identische Verfahren 2-Oxo(6-phenylmercapto-3H-imidazo[4,5-b]pyridin, Schmp. 253–254°C.
  • Verbindung A-5–A-25
  • Durch Auswechseln von Natriumphenolat gegen das geeignete Phenolat in Beispiel A-1 ergibt das identische Verfahren die folgenden Beispiele. Für die Beispiele A-23, A-24, und A-25 werden die Carboxygruppen durch einen Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, tert.-Butyl- oder anderen geeigneten Ester geschützt, und dann im letzten Schritt die Schutzgruppen entfernt, so dass die Verbindungen erhalten werden.
    A-5 2-Oxo-6-(2-nitrophenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-6 2-Oxo-6-(3-nitrophenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-7 2-Oxo-6-(4-nitrophenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-8 2-Oxo-6-(2-chlorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-9 2-Oxo-6-(3-chlorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-10 2-Oxo-6-(4-chlorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-11 2-Oxo-6-(2-methylphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-12 2-Oxo-6-(3-methylphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-13 2-Oxo-6-(4-methylphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-14 2-Oxo-6-(2-fluorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-15 2-Oxo-6-(3-fluorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-16 2-Oxo-6-(4-fluorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-17 2-Oxo-6-[2-(trifluormethyl)phenoxy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-18 2-Oxo-6-[3-(trifluormethyl)phenoxy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-19 2-Oxo-6-[4-(trifluormethyl)phenoxy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-20 2-Oxo-6-(2-methoxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-21 2-Oxo-6-(3-methoxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-22 2-Oxo-6-(4-methoxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-23 2-Oxo-6-(2-carboxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-24 2-Oxo-6-(3-carboxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-25 2-Oxo-6-(4-carboxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Verbindungen A-26–A-46
  • Durch Auswechseln von Natriumthiophenolat gegen das geeignete Thiophenolat in Beispiel A-2 ergibt das identische Verfahren die folgenden Beispiele. Für die Beispiele A-44, A-45 und A-46 werden die Carboxygruppen durch einen Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, tert.-Butyl- oder anderen geeigneten Ester geschützt und dann im letzten Schritt die Schutzgruppen entfernt, so dass die Verbindungen erhalten werden.
    A-26 2-Oxo-6-(2-nitrophenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-27 2-Oxo-6-(3-nitrophenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-28 2-Oxo-6-(4-nitrophenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-29 2-Oxo-6-(2-chlorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-30 2-Oxo-6-(3-chlorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-31 2-Oxo-6-(4-chlorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-32 2-Oxo-6-(2-methylphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-33 2-Oxo-6-(3-methylphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-34 2-Oxo-6-(4-methylphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-35 2-Oxo-6-(2-fluorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-36 2-Oxo-6-(3-fluorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-37 2-Oxo-6-(4-fluorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-38 2-Oxo-6-[2-(trifluormethyl)phenylmercapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-39 2-Oxo-6-[3-(trifluormethyl)phenylmercapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-40 2-Oxo-6-[4-(trifluormethyl)phenylmercapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-41 2-Oxo-6-(2-methoxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-42 2-Oxo-6-(3-methoxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-43 2-Oxo-6-(4-methoxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-44 2-Oxo-6-(2-carboxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-45 2-Oxo-6-(3-carboxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-46 2-Oxo-6-(4-carboxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Verbindungen A-47–A-68
  • Durch Substitution von Natriumphenolat gegen das geeignete Anilinsalz in Beispiel A-1 ergibt das identische Verfahren die folgenden Beispiele. Für die Beispiele A-66, A-67 und A-68 werden die Carboxygruppen durch einen Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, tert.-Butyl- oder anderen geeigneten Ester geschützt und dann im letzten Schritt die Schutzgruppen entfernt, so dass die Verbindungen erhalten werden.
    A-47 2-Oxo-6-phenylamino-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-48 2-Oxo-6-(2-nitrophenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-49 2-Oxo-6-(3-nitrophenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-50 2-Oxo-6-(4-nitrophenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-51 2-Oxo-6-(2-chlorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-52 2-Oxo-6-(3-chlorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-53 2-Oxo-6-(4-chlorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-54 2-Oxo-6-(2-methylphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-55 2-Oxo-6-(3-methylphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-56 2-Oxo-6-(4-methylphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-57 2-Oxo-6-(2-fluorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-58 2-Oxo-6-(3-fluorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-59 2-Oxo-6-(4-fluorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-60 2-Oxo-6-[2-(trifluormethyl)phenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-61 2-Oxo-6-[3-(trifluormethyl)phenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-62 2-Oxo-6-[4-(trifluormethyl)phenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-63 2-Oxo-6-(2-methoxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-64 2-Oxo-6-(3-methoxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-65 2-Oxo-6-(4-methoxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-66 2-Oxo-6-(2-carboxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-67 2-Oxo-6-(3-carboxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-68 2-Oxo-6-(4-carboxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Verbindungen A-69–A-89
  • Durch Auswechseln von Natriumphenolat gegen das geeignete Phenolat in Beispiel A-3 ergibt das identische Verfahren die folgenden Beispiele. Für die Beispiele A-87, A-88 und A-89 werden die Carboxygruppen durch einen Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, tert.-Butyl- oder anderen geeigneten Ester geschützt und dann im letzten Schritt die Schutzgruppen entfernt, so dass die Verbindungen erhalten werden.
    A-69 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-nitrophenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-70 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-nitrophenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-71 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-nitrophenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-72 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-chlorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-73 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-chlorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-74 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-chlorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-75 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-methylphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-76 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-methylphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-77 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-methylphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-78 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-fluorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-79 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-fluorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-80 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-fluorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-81 2-Methoxycarbonylamino-6-[2-(trifluormethyl)phenoxy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-82 2-Methoxycarbonylamino-6-[3-(trifluormethyl)phenoxy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-83 2-Methoxycarbonylamino-6-[4-(trifluormethyl)phenoxy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-84 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-methoxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-85 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-methoxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-86 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-methoxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-87 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-carboxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-88 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-carboxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-89 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-carboxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Verbindungen A-91–A-111
  • Durch Auswechseln von Natriumthiophenolat gegen das geeignete Thiophenolat in Beispiel A-90 ergibt das identische Verfahren die folgenden Beispiele. Für die Beispiele A-109, A-110 und A-111 werden die Carboxygruppen durch einen Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, tert.-Butyl- oder anderen geeigneten Ester geschützt und dann im letzten Schritt die Schutzgruppen entfernt, so dass die Verbindungen erhalten werden.
    A-91 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-nitrophenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-92 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-nitrophenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-93 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-nitrophenylmercapto)-3H-imidazo[5-b]pyridin
    A-94 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-chlorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-95 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-chlorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-96 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-chlorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-97 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-methylphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-98 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-methylphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-99 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-methylphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-100 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-fluorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-101 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-fluorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-102 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-fluorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-103 2-Methoxycarbonylamino-6-[2-(trifluormethyl)phenylmercapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-104 2-Methoxycarbonylamino-6-[3-(trifluormethyl)phenylmercapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-105 2-Methoxycarbonylamino-6-[4-(trifluormethyl)phenylmercapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-106 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-methoxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-107 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-methoxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-108 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-methoxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-109 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-carboxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-110 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-carboxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-111 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-carboxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Verbindungen A-112–A-133
  • Durch Auswechseln von Natriumphenolat gegen das geeignete Anilinsalz in Beispiel A-3 ergibt das identische Verfahren die folgenden Beispiele. Für die Beispiele A-131, A-132 und A-133 werden die Carboxygruppen durch einen Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, tert.-Butyl- oder anderen geeigneten Ester geschützt und dann im letzten Schritt die Schutzgruppen entfernt, so dass die Verbindungen erhalten werden.
    A-112 2-Methoxycarbonylamino-6-phenylamino-3H-imidazo[4,5-A-112
    A-113 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-nitrophenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-114 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-nitrophenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-115 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-nitrophenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-116 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-chlorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-117 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-chlorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-118 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-chlorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-119 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-methylphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-120 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-methylphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-121 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-methylphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-122 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-fluorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-123 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-fluorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-124 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-fluorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-125 2-Methoxycarbonylamino-6-[2-(trifluormethyl)phenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-126 2-Methoxycarbonylamino-6-[3-(trifluormethyl)phenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-127 2-Methoxycarbonylamino-6-[4-(trifluormethyl)phenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-128 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-methoxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-129 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-methoxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-130 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-methoxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-131 2-Methoxycarbonylamino-6-(2-carboxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-132 2-Methoxycarbonylamino-6-(3-carboxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-133 2-Methoxycarbonylamino-6-(4-carboxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Verbindungen A-134–A-154
  • Durch Auswechseln von Natriumthiophenolat gegen das geeignete Phenolat in Beispiel A-4 ergibt das identische Verfahren die folgenden Beispiele. Für die Beispiele A-152, A-153 und A-154 werden die Carboxygruppen durch einen Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, tert.-Butyl- oder anderen geeigneten Ester geschützt und dann im letzten Schritt die Schutzgruppen entfernt, so dass die Verbindungen erhalten werden.
    A-134 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-nitrophenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-135 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-nitrophenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-136 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-nitrophenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-137 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-chlorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-138 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-chlorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-139 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-chlorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-140 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-methylphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-141 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-methylphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-142 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-methylphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-143 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-fluorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-144 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-fluorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-145 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-fluorphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-146 2-Ethoxycarbonylamino-6-[2-(trifluormethyl)phenoxy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-147 2-Ethoxycarbonylamino-6-[3-(trilfluormethyl)phenoxy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-148 2-Ethoxycarbonylamino-6-[4-(trifluormethyl)phenoxy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-149 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-methoxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-150 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-methoxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-151 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-methoxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-152 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-carboxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-153 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-carboxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-154 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-carboxyphenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Verbindungen A-155–A-176
  • Durch Auswechseln von Natriumthiophenolat gegen das geeignet Thiophenolat in Beispiel A-4 ergibt das identische verfahren die folgenden Beispiele. Für die Beispiele A-174, A-175 und A-176 werden die Carboxygruppen durch einen Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, tert.-Butyl- oder anderen geeigneten Ester geschützt und dann im letzten Schritt die Schutzgruppen entfernt, so dass die Verbindungen erhalten werden.
    A-155 2-Ethoxycarbonylamino-6-phenylmercapto-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-156 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-nitrophenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-157 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-nitrophenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-158 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-nitrophenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-159 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-chlorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-160 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-chlorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-161 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-chlorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-162 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-methylphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-163 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-methylphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-164 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-methylphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-165 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-fluorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-166 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-fluorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-167 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-fluorphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-168 2-Ethoxycarbonylamino-6-[2-(trifluormethyl)phenylmercapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-169 2-Ethoxycarbonylamino-6-[3-(trifluormethyl)phenylmercapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-170 2-Ethoxycarbonylamino-6-[4-(trifluormethyl)phenylmercapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-171 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-methoxyphenylmercapto)-3H-imidazol[4,5-b]pyridin
    A-172 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-methoxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-173 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-methoxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-174 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-carboxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-175 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-carboxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-176 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-carboxyphenylmercapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Verbindungen A-177–A-198
  • Durch Auswechseln von Natriumphenolat gegen das geeignete Anilinsalz in Beispiel A-4 ergibt das identische Verfahren die folgenden Beispiele. Für die Beispiele A-196, A-197 und A-198 werden die Carboxygruppen durch einen Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, tert.-Butyl- oder anderen geeigneten Ester geschützt, und dann im letzten Schritt die Schutzgruppen entfernt, so dass die Verbindungen erhalten werden.
    A-177 2-Ethoxycarbonylamino-6-phenylamino-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-178 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-nitrophenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-179 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-nitrophenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-180 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-nitrophenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-181 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-chlorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-182 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-chlorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-183 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-chlorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-184 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-methylphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-185 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-methylphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-186 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-methylphMenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-187 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-fluorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-188 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-fluorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-189 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-fluorphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-190 2-Ethoxycarbonylamino-6-[2-(trifluormethyl)phenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-191 2-Ethoxycarbonylamino-6-[3-(trifluormethyl)phenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-192 2-Ethoxycarbonylamino-6-[4-(trifluormethyl)phenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-193 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-methoxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-194 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-methoxyphenylamino)3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-195 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-methoxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-196 2-Ethoxycarbonylamino-6-(2-carboxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-197 2-Ethoxycarbonylamino-6-(3-carboxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
    A-198 2-Ethoxycarbonylamino-6-(4-carboxyphenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
  • Beispiel 2: Test zur Messung der Phosphorylierungsfunktion von RAF
  • Der folgende Test beschreibt die Menge der RAF-katalysierten Phosphorylierung ihres Zielproteins MEK sowie das Ziel von MEK, nämlich MAPK. Die RAF-Gensequenz ist beschrieben in Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol. 5: 1400–1407 und ist leicht zugänglich in mehreren Gensequenz-Datenbanken. Die Konstruktion des Nukleinsäure-Vektors und der für diesen Anteil der Erfindung verwendeten Zelllinien sind vollständig beschrieben in Morrison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8855–8859.
  • Materialien und Reagenzien
    • 1. SF9 (Spodoptera frugiperda)-Zellen; GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.
    • 2. RIPA-Puffer: 20 mM Tris/HCl pH-Wert 7,4, 137 mM NaCl, 10% Glycerin, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aprotenin, 0,5% Triton X-100;
    • 3. Thioredoxin-MEK-Fusionsprotein (T-MEK): T-MEK-Expression und Reinigung durch Affinitäts-Chromatographie erfolgten gemäß den Verfahren des Herstellers. Katalog Nummer K 350-01 und R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.
    • 4. HIS-MAPK (ERK 2); MAPK mit His-Ende wurde in XL1-Blue-Zellen exprimiert, die mit pUC18-Vektor transformiert waren, der His-MAPK codierte. His-MAPK wurde durch Ni-Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Kat. Nummer 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, wie hier beschrieben.
    • 5. Schaf-Anti-Maus-IgG: Jackson Laboratories, West Grove, PA. Katalog Nummer 515-006-008, Lot Nummer 28563
    • 6. RAF-1 Proteinkinase spezifischer Antikörper: URP2653 von UBI.
    • 7. Beschichtungspuffer: PBS; phosphatgepufferte Salzlösung, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.
    • 8. Waschpuffer: TBST – 50 mM Tris/HCl pH-Wert 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100
    • 9. Blockierungs-Puffer: TBST, 0,1% Ethanolamin pH-Wert 7,4.
    • 10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO
    • 11. Kinase-Puffer (KB): 20 mM Hepes/HCl pH-Wert 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aprotenin, 75 mM Natriumorthovanadat, 0,5 MM DTT und 10 mM MgCl2.
    • 12. ATP-Mix: 100 mM MgCl2, 300 mM ATP, 10 mCi g-33P ATP (Dupont-NEN)/ml.
    • 13. Stop-Lösung: 1% Phorphorsäure; Fisher, Pittsburgh, PA.
    • 14. Wallac Cellulose-Phosphat-Filtermatten; Wallac, Turku, Finnland.
    • 15. Filterwaschlösung: 1% Phosphorsäure, Fisher, Pittsburgh, PA.
    • 16. Tomtec-Plattenernter, Wallac, Turku, Finnland.
    • 17. Wallac Beta-Plattenleser Nummer 1205, Wallac, Turku, Finnland.
    • 18. Nunc V-Boden-Polypropylen-Platten mit 96 Vertiefungen für Verbindungen Applied Scientific Katalog Nummer AS-72092.
  • Verfahren
  • Sämtliche nachfolgenden Schritte wurden, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt.
    • 1. ELISA-Platten-Beschichtung: Elisa-Vertiefungen werden mit 100 ml affinitätsgereinigtem Schaf-Anti-Maus-Antiserum (1 mg/100 ml Beschichtungspuffer) über Nacht bei 4°C beschichtet. Elisaplatten können zwei Wochen verwendet werden, wenn sie bei 4°C aufbewahrt werden.
    • 2. Umdrehen der Platte und Entfernen der Flüssigkeit. Zugabe von 100 ml Blockierungs-Lösung und Inkubation für 30 min.
    • 3. Entfernen der Blockierungslösung und viermaliges Waschen mit Waschpuffer. Überführen der Platte auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
    • 4. Zugeben von 1 mg Antikörper, der spezifisch für RAF-1 ist, in jede Vertiefung und Inkubation für 1 Std. Waschen wie in Schritt 3 beschrieben.
    • 5. Auftauen der Lysate aus RAS/RAF-infizierten SF9-Zellen und Verdünnen mit TBST auf 10 mg/100 ml. Zugabe von 10 mg verdünntem Lysat zu den Vertiefungen und Inkubation für 1 Std. Schütteln der Platte während der Inkubation. Negative Kontrollen erhalten kein Lysat. Lysate aus RAS/RAF-infizierten Sf9-Insekten-Zellen werden hergestellt, nachdem die Zellen mit rekombinanten Baculoviren bei einer MOI von 5 für jedes Virus infiziert werden, und 48 Std. später geerntet. Die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen und in RIPA-Puffer lysiert. Unlösliches Material wird durch Zentrifugation entfernt (5 min bei 10000 × g). Aliquote der Lysate werden in Trockeneis/Ethanol gefroren und bei –80°C bis zum Gebrauch aufbewahrt.
    • 6. Entfernen von nicht-gebundenem Material und Waschen, wie oben beschrieben (Schritt 3).
    • 7. Zugeben von 2 mg T-MEK und 2 mg HIS-MAEPK pro Vertiefung und Einstellen des Volumens auf 40 ml mit Kinase-Puffer. Verfahren zum Reinigen von T-MEK und MAPK aus Zellextrakten werden hier durch Bezugnahme aufgenommen.
    • 8. Vorverdünnen der Verbindungen (Stammlösung 10 mg/ml DMSO) oder Extrakte 20fach in TBST plus 1% DMSO. Zugabe von 5 ml der vorverdünnten Verbindungen/Extrakte zu den in Schritt 6 beschriebenen Vertiefungen. 20 minütiges Inkubieren. Kontrollen erhalten kein Medikament.
    • 9. Beginn der Kinasereaktion durch Zugabe von 5 ml ATP-Mix; Schütteln der Platten auf einem ELISA-Plattenschüttler während der Inkubation.
    • 10. Beenden der Kinasereaktion nach 60 min durch Zugabe von 30 ml Stop-Lösung zu jeder Vertiefung.
    • 11. Unterbringung der Phosphozellulosematte und der ELISA-Platte in dem Tomtec-Plattenernter. Ernten und Waschen des Filters mit der Filter-Waschlösung entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Trocknen der Filtermatten. Verschließen der Filtermatten und Unterbringen in der Halterung. Unterbringen der Halterung in der Radioaktivitäts-Nachweis-Vorrichtung und Quantifizieren des radioaktiven Phosphors auf den Filtermatten.
  • Alternativ können 40 ml-Aliquote aus einzelnen Vertiefungen der Testplatte zu den entsprechenden Stellen auf der Phosphocellulose-Matte überführt werden. Nach dem Lufttrocknen der Filter werden die Filter in eine Schale überführt. Die Schale wird vorsichtig gerüttelt, wobei die Waschlösung in 15 min-Intervallen 1 Std. lang gewechselt wird. Die Filtermatten werden luftgetrocknet. Die Filtermatten werden abgedichtet und in einer Halterung untergebracht, die zum Messen des radioaktiven Phosphors in den Proben geeignet ist. Die Halterung wird in einer Nachweisvorrichtung untergebracht und der radioaktive Phosphor auf den Filtermatten quantifiziert.
  • Die IC50-Werte wurden gemäß dem Protokoll für die folgenden Verbindungen auf Azabenzimidazol-Basis in dem RAF-1-ELISA-Test gemessen:
  • Figure 00620001
  • Ein IC50-Wert ist die Konzentration des Inhibitors auf Azabenzimidazol-Basis, der zum Senken der Maximalmenge des phosphorylierten Zielproteins oder des Zellwachstums um 50% erforderlich ist. Die IC50-Werte, die in dem RAF-1-Phsophorylierungs-Test gemessen wurden, sind in der Tabelle 1 dargestellt:
  • TABELLE 1
    Figure 00630001
  • Beispiel 3: Reinigung von MAPK und MEK
  • Die MAPK- und MEK-Proteine werden leicht in Zellen exprimiert, indem ein Gen, das diese Proteine codiert, in einen kommerziell erhältlichen Vektor subkloniert wird, der die Proteine mit einer poly-Histidin-Markierung exprimiert. Gene, die diese Proteine codieren, sind leicht von Laboratorien verfügbar, die gewöhnlich mit diesen Proteinen arbeiten, oder durch Klonieren dieser Gene von Zellen, die cDNA-Banken enthalten. Die Banken sind kommerziell leicht erhältlich und ein Fachmann kann leicht Nukleinsäuresonden entwerfen, die zu cDNA-Molekülen homolog sind, die MEK oder MAPK aus der Nukleinsäure von MEK und MAPK codieren, welche in mehreren Gen-Datenbanken, wie Genbank, erhältlich sind. Die Klonierung eines Gens kann in einem kurzen Zeitraum bewerkstelligt werden, wobei Techniken verwendet werden, die dem Fachmann derzeit geläufig sind.
  • Die Reinigung der MEK- und MAPK-Proteine aus Zellextrakten kann mit dem folgenden Protokoll erfolgen, das von Robbins et al, 1993, J. Biol. Chem. 268: 5097–5106 angepasst wurde:
    • 1. Die Zellen werden durch Ultraschallbehandlung, osmotischen Stress oder French-Press-Techniken, die dem Fachmann geläufig sind, lysiert. Ein geeigneter Ultraschallbehandlungspuffer wird nachstehend bereitgestellt.
    • 2. Ein fester Träger, der mit Nickel oder Kobalt konjugiert ist, wird mit dem nachstehend beschriebenen Äquilibrierungspuffer äquilibriert. Die poly-Histidin-Markierung bindet spezifisch an die Nickel- und Kobalt-Atome auf dem festen Träger. Die Aquilibrierung kann durch dreimaliges Waschen des Harzes mit einem Volumen des Äquilibrierungspuffers erzielt werden, das dem 10fachen Volumen des festen Trägers entspricht. Der feste Träger ist dem Durchschnittsfachmann leicht verfügbar.
    • 3. Das Zelllysat wird zu dem festen Träger gegeben und in einem Gefäß für einen bestimmten Zeitraum äquilibriert. Alternativ kann der feste Träger in eine Proteinchromatographiesäule gepackt werden, und das Lysat kann durch den festen Träger gelassen werden.
    • 4. Der feste Träger wird mit dem nachstehend beschriebenen Waschpuffer gewaschen.
    • 5. Das MEK- oder MAPK-Protein aus dem festen Träger wird mit einer Menge Elutionspuffer (nachstehend bereitgestellt) eluiert, welcher einen signifikanten Anteil des Proteins aus dem festen Träger entfernt.
  • Ultraschallbehandlungspuffer
    • 50 mM Natriumphosphat pH-Wert 8,0
    • 0,3 M Natriumchlorid
    • 10 mM β-Mercaptoethanol
    • 1% NP40
    • 10 mM NaF
    • 0,5 mM Pefablock
  • Äquilibrierungspuffer
    • 50 mM Natriumphosphat pH-Wert 8,0
    • 0,3 M Natriumchlorid
    • 10 mM β-Mercaptoethanol
    • 1% NP40
    • 10 mM NaF
    • 1 mM Imidazol
  • Waschpuffer
    • 50 mM Natriumphosphat pH-Wert 8,0
    • 0,3 M Natriumchlorid
    • 10 mM β-Mercaptoethanol
    • 1% NP40
    • 10 mM NaF
    • 10 mM Imidazol
  • Elutionspuffer
    • 50 mM Natriumphosphat pH-Wert 8,0
    • 0,3 M Natriumchlorid
    • 10 mM β-Mercaptoethanol
    • 1% NP40
    • 10 mM NaF
    • 10–500 mM Imidazol
  • Beispiel 4: Test zum Messen der Phosphorylierungsfunktion des EGF-Rezeptors
  • Die EGF-Rezeptorkinase-Aktivität (EGFR-NIH3T3-Test) in ganzen Zellen wurde gemessen wie eingehend beschrieben in der PCT-Veröffentlichung WO9640116, eingereicht am 5. Juni 1996, von Tang et al., mit dem Titel "Indolinone Compounds for the Treatment of Disease", die hiermit vollinhaltlich einschließlich der Zeichnungen unter Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Die in dem EGF-Rezeptor-Phosphorylierungstest gemessenen IC50-Werte sind in der Tabelle 2 gezeigt:
  • TABELLE 2
    Figure 00660001
  • Beispiel 5: Test zur Messung der Wirkung von Verbindungen auf Azabenzimidazol-Basis auf das Wachstum von Zellen, die RAS exprimieren
  • Der folgende Test misst die Wachstumsraten für NIH-3T3-Zellen, die RAS exprimieren. Der Zweck des Tests ist die Bestimmung der Wirkungen der Verbindungen auf das Wachstum von NIH-3T3-Zellen über die Expression von H-Ras.
  • Materialien
    • sterile Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen
    • sterile Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen
    • sterile Pipetten mit 25 ml- oder 100 ml-Reservoir, Mehrkanal-Pipetman
    • sterile Pipettenspitzen
    • sterile 15 ml- und 50 ml-Röhrchen
  • Reagenzien
    • 0,4% SRB in 1% Essigsäure
    • 10 mM Tris-Base
    • 10% TCA
    • 1% Essigsäure
    • steriles DMSO (Sigma)
    • Verbindung in DMSO (Stammlösung mit 100 mM oder weniger)
    • Trypsin-EDTA (GIBCO BRL)
  • Zelllinie
    • 3T3/H-Ras (NIH 3T3-Klon 7, Zellen, die das genomische Fragment von onkogenem H-Ras exprimieren).
  • Die Zellen können nach dem folgenden Protokoll konstruiert werden:
    • 1. Ein Genfragment, das Ras codiert, wird in einen kommerziell erhältlichen Vektor subkloniert, der NIH-3T3-Zellen stabil transfiziert. Das Fragment stammt von dem genomischen transformierenden Allel von cHa-ras.
    • 2. NIH-3T3-Zellen werden mit dem subklonierten Vektor durch ein Calciumphosphatverfahren transfiziert. Zellen, die das Ras-Konstrukt exprimieren, werden in 2% Serum in DMEM selektiert. Sichtbare Foci werden nach 2 Wochen beobachtet. Die transformierten Zellen werden vereinigt, so dass eine stabil transformierte Zelllinie erzeugt wird.
  • Wachstumsmedium
    • 2% Kalbsserum/DMEM + 2 mM Glutamin, Pen/Strep
  • Protokoll
  • Tag 0: Zellplattierung
  • Dieser Teil des Tests erfolgt in einer Laborbox mit laminarer Strömung.
    • 1. Trypsinisierung der Zellen. 200 ml Zellsuspension werden zu 10 ml Isoton gegeben. Die Zellen werden mit einem Coulter-Zähler gezählt.
    • 2. Die Zellen werden in Wachstumsmedium auf 60 000 Zellen/ml verdünnt. Jeweils 100 ml Zellen werden in die Vertiefungen einer Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen überführt, so dass 6000 Zellen pro Vertiefung erhalten werden.
    • 3. Die Hälfte der Platte (4 Reihen) für jede Verbindung und die 4fache Anzahl Vertiefungen für jede Konzentration der Verbindungskonzentration und ein Satz mit 4 Vertiefungen für die Mediumskontrolle wird verwendet.
    • 4. Die Platten werden vorsichtig geschüttelt, so dass die Zellen gleichmäßig anhaften können.
    • 5. Die Platten werden in einem 10% CO2-Inkubator bei 37°C inkubiert.
  • Tag 1: Zugabe der Verbindung
  • Dieser Teil des Tests erfolgt in einer sterilen Laborbox mit laminarer Strömung.
    • 1. In einer Rundbodenplatte mit 96 Vertiefungen werden 120 ml Wachstumsmedium, das 2 × End% DMSO enthält, und das in der höchsten Screening-Konzentration der Verbindung gefunden wird, in die Spalten 1 bis 11 gegeben. Ist die höchste Konzentration bspw. 100 ml und besteht diese aus einer 100 mM Stammlösung, so ist 1 × DMSO 0,1% und 2 × DMSO ist 0,2%. Diese Platte wird zum Austitrieren der Verbindung verwendet, und zwar 4 Reihen pro Verbindung.
    • 2. In einem sterilen 15 ml-Röhrchen wird eine 2 × Lösung der höchsten Screening-Konzentration der Verbindung in Wachstumsmedium plus 2 × DMSO hergestellt. Es wird 1 ml pro Zelllinie benötigt. Die Ausgangskonzentration der Verbindung ist gewöhnlich 100 mM, jedoch kann diese Konzentration je nach der Löslichkeit der Verbindung variieren.
    • 3. 240 ml der 2 × Ausgangsverbindungslösung werden in die vierfache Anzahl Vertiefungen in Spalte 12 der Rundbodenplatte mit 96 Vertiefungen hinzu gefügt. Von rechts nach links werden 1 : 2 Verdünnungsreihen über die Platte hergestellt, indem 12 ml von Spalte 12 in Spalte 11, von Spalte 11 in Spalte 10 usw. bis zu Spalte 2 überführt werden. 100 ml der Verbindungs-Verdünnungen und 100 ml Medium werden in Spalte 1 auf 100 ml Medium auf Zellen in den entsprechenden Vertiefungen einer Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen überführt. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung sollte 200 ml sein.
    • 4. Die Platte wird zurück in den Inkubator überführt und 3 Tage inkubiert.
  • Tag 4: Entwicklung des Tests
  • Dieser Teil des Tests erfolgt auf der Laborbank.
    • 1. Das Medium wird abgesaugt. In die Vertiefungen werden jeweils 200 ml kalte 10% TCA zur Fixierung der Zellen gegeben. Die Platte wird mindestens 60 min bei 4°C inkubiert.
    • 2. Die TCA wird verworfen und die Vertiefungen 5 mal mit Leitungswasser gespült. Die Platten werden verkehrt herum auf Papiertüchern getrocknet.
    • 3. Die Zellen werden mit 100 ml/Vertiefung 0,4% SRB 10 min lang gefärbt.
    • 4. SRB wird abdekantiert und die Vertiefungen 5 mal mit 1% Essigsäure gespült. Die Platten werden verkehrt herum auf Papiertüchern vollständig getrocknet.
    • 5. Der Farbstoff wird mit 100 ml/Vertiefung 10 mM Tris-Base 5 bis 10 min auf einem Schüttler solubilisiert.
    • 6. Die Platten werden auf einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät bei 570 nm mit Bezug auf 630 nm gelesen.
  • Ausgewählte Verbindungen hemmten die Wachstumsraten der Zellen, die RAS überexprimieren, wie in Tabelle 3 veranschaulicht ist.
  • TABELLE 3
    Figure 00690001
  • Beispiel 6: Test zum Messen der Wirkung der Verbindungen auf Azabenzimidazol-Basis auf das Wachstum von A549-Zellen
  • Der folgende Test misst die Wachstumsraten für A549-Zellen. Der Zweck des Tests ist die Bestimmung der Wirkungen der Verbindungen auf das Wachstum von Lungenkarzinomzellen A549 beim Menschen. A549-Zellen sind leicht von kommerziellen Quellen, wie ATCC (CCL185), erhältlich.
  • Materialien
    • sterile Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen
    • sterile Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen
    • sterile Pipetten mit 25 ml- oder 100 ml-Reservoir, Mehrkanal-Pipetman
    • sterile Pipettenspitzen
    • sterile 15 ml- und 50 ml-Röhrchen
  • Reagenzien
    • 0,4% SRB in 1% Essigsäure
    • 10 mM Tris-Base
    • 10% TCA
    • 1% Essigsäure
    • steriles DMSO (Sigma)
    • Verbindung in DMSO (Stammlösung mit 100 mM oder weniger)
    • Trypsin-EDTA (GIBCO BRL)
  • Zelllinie und Wachstumsmedium
    • Lungenkarzinom-Zellen A549 beim Menschen (ATCC CCL185)
    • 10% fötales Kalbsserum in Ham's F12K
  • Protokoll
  • Tag 0: Zellplattierung
  • Dieser Teil des Tests erfolgt in einer Laborbox mit laminarer Strömung.
    • 1. Trypsinisierung der Zellen. 200 ml Zellsuspension werden zu 10 ml Isoton gegeben. Die Zellen werden mit einem Coulter-Zähler gezählt.
    • 2. Die Zellen werden in Wachstumsmedium auf 20 000 Zellen/ml verdünnt. Jeweils 100 ml Zellen werden in die Vertiefungen einer Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen überführt, so dass 2000 Zellen pro Vertiefung erhalten werden.
    • 3. Die Hälfte der Platte (4 Reihen) für jede Verbindung und die 4fache Anzahl Vertiefungen für jede Konzentration der Verbindungskonzentration und ein Satz für die Mediumskontrolle wird verwendet.
    • 4. Die Platten werden vorsichtig geschüttelt, so dass die Zellen gleichmäßig anhaften können.
    • 5. Die Platten werden in einem 10% CO2-Inkubator bei 37°C inkubiert.
  • Tag 1: Zugabe der Verbindung
  • Dieser Teil des Tests erfolgt in einer sterilen Laborbox mit laminarer Strömung.
    • 1. In einer Rundbodenplatte mit 96 Vertiefungen werden 120 μl Wachstumsmedium, das 2 × End% DMSO enthält, und das in der höchsten Screening-Konzentration der Verbindung gefunden wird, in die Spalten 1 bis 11 gegeben. Ist die höchste Konzentration bspw. 100 μM und besteht diese aus einer 100 mM Stammlösung, so ist 1 × DMSO 0,1% und 2 × DMSO ist 0,2%. Diese Platte wird zum Austitrieren der Verbindung verwendet, und zwar 4 Reihen pro Verbindung.
    • 2. In einem sterilen 15 ml-Röhrchen wird eine 2 × Lösung der höchsten Screening-Konzentration der Verbindung in Wachstumsmedium plus 2 × DMSO hergestellt. Es wird 1 ml pro Zelllinie benötigt. Die Ausgangskonzentration der Verbindung ist gewöhnlich 100 μM, jedoch kann diese Konzentration je nach der Löslichkeit der Verbindung variieren.
    • 3. 240 μl der 2 × Ausgangsverbindungslösung werden in die vierfache Anzahl Vertiefungen in Spalte 12 der Rundbodenplatte mit 96 Vertiefungen hinzu gefügt. Von rechts nach links werden 1 : 2 Verdünnungsreihen über die Platte erzeugt, indem 120 μl von Spalte 12 in Spalte 11, Spalte 11 in Spalte 10 usw. bis zu Spalte 2 überführt werden. 100 μl der Verbindungs-Verdünnungen und 100 μl Medium werden in Spalte 1 auf 100 μl Medium auf Zellen in den entsprechenden Vertiefungen einer Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen überführt. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung sollte 200 μl sein.
    • 4. Die Platte wird zurück in den Inkubator überführt und 3 Tage inkubiert.
  • Tag 5: Entwicklung des Tests
  • Dieser Teil des Tests erfolgt auf der Laborbank.
    • 1. Das Medium wird abgesaugt. In die Vertiefungen werden jeweils 200 μl kalte 10% TCA zur Fixierung der Zellen gegeben. Die Platte wird mindestens 60 min bei 4°C inkubiert.
    • 2. Die TCA wird verworfen und die Vertiefungen 5 mal mit Leitungswasser gespült. Die Platten werden verkehrt herum auf Papiertüchern getrocknet.
    • 3. Die Zellen werden mit 100 μl/Vertiefung 0,4% SRB 10 min lang gefärbt.
    • 4. SRB wird abdekantiert und die Vertiefungen 5 mal mit 1% Essigsäure gespült. Die Platten werden verkehrt herum auf Papiertüchern vollständig getrocknet.
    • 5. Der Farbstoff wird mit 100 μl/Vertiefung 10 mM Tris-Base 5 bis 10 min auf einem Schüttler solubilisiert.
    • 6. Die Platten werden auf einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät bei 570 nm mit Bezug auf 630 nm gelesen.
  • Ausgewählte Verbindungen hemmten die Wachstumsraten von A549-Zellen, wie in Tabelle 4 veranschaulicht ist.
  • TABELLE 3
    Figure 00720001
  • Beispiel 7: Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität der Raf-Modulatoren in vivo
  • Fremd-Transplantat-Untersuchungen lassen sich zur Überwachung der Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Hemmung von Ovar-, Melanom-, Prostata-, Lungen- und Brustdrüsen-Tumorzellen verwenden. Das Protokoll für den Test ist eingehend beschrieben in der PCT-Veröffentlichung WO9640116, eingereicht am 5. Juni 1996, von Tang et al., mit dem Titel "Indolinone Compounds for the Treatment of Disease", die hiermit vollinhaltlich einschließlich der Zeichnungen, unter Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Es ist somit selbstverständlich, dass die Erfindung zwar spezifisch anhand der bevorzugten Ausführungsformen und wahlfreien Eigenschaften beschrieben ist, jedoch können Modifikationen und Abwandlungen von den hier offenbarten Konzepten durch den Fachmann vorgenommen werden, und dass solche Modifikationen und Variationen im Rahmen der Erfindung liegen sollen, die durch die beigefügten Ansprüche definiert werden.
  • Sind zudem Eigenschaften oder Aspekte der Erfindung in Bezug auf Markush-Gruppen beschrieben, erkennt der Fachmann zudem, dass die Erfindung auch dadurch in Bezug auf jedes einzelne Mitglied oder eine Untergruppe von Mitgliedern der Markush-Gruppe beschrieben wird. Wird bspw. beschrieben, dass X aus der Gruppe Brom, Chlor und Iod ausgewählt ist, sind Ansprüche, dass X Brom ist, und Ansprüche, dass X Brom und Chlor ist, vollständig beschrieben.

Claims (21)

  1. Azabenzimidazol-Verbindung mit einer Struktur der Formel I, II oder III:
    Figure 00740001
    wobei: (a) R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus (i) Wasserstoff; (ii) gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl; (iii) NX2X3, wobei X2 und X3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten; (iv) Halogen oder Trihalogenmethyl; (v) einem Keton der Formel -CO-X4, wobei X4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten; (vi) einer Carbonsäure der Formel -(X5)n-COOH oder einem Ester der Formel -(X6)n-COO-X7, wobei X5, X6 und X7 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl und homocyclischen oder hetereocyclischen Ringeinheiten und wobei n gleich 0 oder 1 ist; (vii) einem Alkohol der Formel (X8)n-OH oder einer Alkoxy-Einheit der Formel -(X8)n-O-X9, wobei X8 und X9 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten, wobei der Ring gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkoxy, Halogen, Trihalogenmethyl, Carboxylat, Nitro und Ester, und wobei n gleich 0 oder 1 ist; (viii) einem Amid der Formel -NHCOX10, wobei X10 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Hydroxyl, und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten, wobei der Ring gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkoxy, Halogen, Trihalogenmethyl, Carboxylat, Nitro und Ester; (ix) -SO2NX11X12, wobei X11 und X12 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten; (x) einer homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheit, die gegebenenfalls substituiert ist mit einer, zwei oder drei Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Alkoxy-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Ester-Einheiten; (xi) einem Aldehyd der Formel -CO-H; und (xii) einem Sulfon der Formel -SO2-X13, wobei X13 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheiten; (b) Z1 und Z2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, NH oder NR4, mit der Maßgabe, dass wenn einer der Reste Z1 und Z2 Stickstoff, NH oder NR4 ist, dann der jeweils andere von Z1 und Z2 Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, NH oder NR4 ist; und (c) Z3 und X1 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff.
  2. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei Z1 und Z2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff und NH.
  3. Verbindung nach Anspruch 1 und 2, wobei R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus (i) Wasserstoff; (ii) gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit einer homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheit, oder einer polycyclischen Ringeinheit, wobei die Ringeinheit gegebenenfalls substituiert ist mit einer oder drei Substituenten, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Carboxylat-, Nitro- und Estereinheiten; und (iii) einer homocyclischen oder heterocyclischen Ringeinheit, die gegebenenfalls substituiert ist mit einem, zwei oder drei Substituenten, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Carboxylat-, Nitro- und Estereinheiten.
  4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei die Reste R2 und R3 Wasserstoff sind.
  5. Verbindung nach Anspruch 3, wobei der Rest R1 Phenyl ist, das gegebenenfalls substituiert ist durch ein, zwei oder drei Substituenten, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Alkoxy-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- oder Estereinheiten.
  6. Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Rest X1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Schwefel, Sauerstoff und NH.
  7. Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Rest Z3 Sauerstoff ist.
  8. Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Rest R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methyl und Ethyl.
  9. Arzneimittel, umfassend eine Azabenzimidazol-Verbindung nach einem der Ansprüche 1–8, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
  10. Verfahren zur Synthese einer Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, umfassend die Schritte: (a) Umsetzen von 2-Amino-6-chlor-3-nitropyridin mit einem 2. Reaktanten in einem Lösungsmittel, so dass das erste Zwischenprodukt erhalten wird, wobei der zweite Reaktant ein substituierter Arylring ist; (b) Reduzieren des ersten Zwischenproduktes in Gegenwart eines Katalysators und eines Reduktionsmittels, so dass das zweite Zwischenprodukt erhalten wird; (c) Umsetzen des zweiten Zwischenproduktes mit einem dritten Reaktanten; und (d) Reinigen der Verbindung nach Anspruch 1.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Lösungsmittel n-Propanol ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der substituierte Arylring ein substituiertes Phenol, substituiertes Thiophenol und substituiertes Anilin ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Reduktionsmittel Wasserstoff ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Katalysator Raney-Nickel ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der dritte Reaktant O-Methylisoharnstoff ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der dritte Reaktant das Produkt der Umsetzung von S-Methylisothiouroniumsulfat und Alkylchlorformiat ist.
  17. verfahren nach Anspruch 10 und 16, wobei das Alkyl Methyl oder Ethyl ist.
  18. Verwendung einer Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Zuständen, die mit der Modulation der Funktion einer Serin/Threonin-Proteinkinase einhergehen.
  19. Verwendung einer Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs, einer Fibrose-Störung und anderer antiproliferativer Störungen.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei das Medikament der Behandlung von Krebs dient, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lungenkrebs, Ovarialkrebs, Brustkrebs, Gehirnkrebs, intraaxialer Gehirntumor, Kolonkrebs, Prostatakrebs, Sarkom, Kaposi-Sarkom, Melanom und Gliom.
  21. Verwendung einer Verbindung auf Azabenzimidazol-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Zustands, der mit einer Aberration des Signaltransduktionswegs einhergeht, der als RAF (Rapidly accelerated fibrosarcoma)/MEK (Mitogen and extracellular regulated kinase)-Weg charakterisiert ist, gekennzeichnet durch eine Wechselwirkung zwischen der Serin/Threonin-Proteinkinase RAF und einem natürlichen Bindungspartner.
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