PL191618B1 - Związki azabenzimidazolowe, środki farmaceutyczne zawierające te związki, sposób wytwarzania i zastosowania tych związków - Google Patents

Abstract

PL 191618 1. Zwiazek azabenzimidazolowy, wybrany z grupy obejmujacej a) 2-okso-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydyne; b) 2-okso-6-fenylomerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pirydyne; c) 2-etoksykarbonyloamino-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydyne; d) 2-etoksykarbonyloamino-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydyne; e) 2-metoksykarbonyloamino-6-fenylomerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pirydyne. 3. Sposób wytwarzania zwiazku azabenzimidazolowego, okreslonego w zastrz. 1, znamienny tym, ze 2-amino-6-chloro-3-nitropirydyna reaguje sie z drugim reagentem, wybranym sposród fenolanu sodu lub tiofeno- lanu sodu, w rozpuszczalniku, z wytworzeniem pierwszego produktu posredniego, nastepnie pierwszy produkt posredni redukuje sie w obecnosci katalizatora i srodka redukujacego, z wytworzeniem drugiego produktu posredniego, po czym drugi produkt posredni reaguje z trzecim reagentem, wybranym z grupy obejmujacej O-metyloizomocznik oraz produkt reakcji siarczanu S-metyloizotiouroniowego z chloromrówczanem alkilu, po czym otrzymany zwiazek, okreslony w zastrz. 1, oczyszcza sie. 8. Zastosowanie zwiazku azabenzimidazolowego, okreslonego w zastrz. 1 do wytwarzania leków do le- czenia stanów zwiazanych z modulacja funkcji serynowo/treoninowej kinazy bialkowej. 10. Zastosowanie wedlug zastrz. 9, znamienne tym, ze lek jest przeznaczony do leczenia raka nalezace- go do grupy obejmujacej raka pluc, raka jajników, raka sutka, raka mózgu, wewnatrzosiowego raka mózgu, raka okreznicy, raka gruczolu krokowego, miesaka, miesaka Kaposiego, czerniaka i glejaka. 11. Zastosowanie zwiazku azabenzimidazolowego, okreslonego w zastrz. 1 do wytwarzania leków do le- czenia stanów zwiazanych z zaburzeniami na drodze przekazywania sygnalu, okreslonej jako droga RAF/MEK, charakteryzujacych sie wystepowaniem oddzialywania serynowo-treoninowej kinazy bialkowej RAF z natural- nie wiazana do niej czasteczka. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są związki azabenzimidazolowe, środki farmaceutyczne zawierające te związki, sposób wytwarzania i zastosowanie tych związków.

Przekazywanie sygnału w komórce jest podstawowym mechanizmem wiążącym zewnętrzne bodźce regulujące różne procesy komórkowe z wnętrzem komórki. Jednym z kluczowych biochemicznych mechanizmów przekazywania sygnału jest odwracalna fosforylacja białek umożliwiająca regulację aktywności dojrzałych białek przez zmianę ich struktury i działania.

Najlepiej scharakteryzowane eukariotyczne kinazy białkowe fosforylują grupy alkoholowe seryny, treoniny i tyrozyny białek. Kinazy te przeważnie dzieli się na dwie grupy, z których kinazy należące do pierwszej grupy specyficznie fosforylują serynę i treoninę, a należące do drugiej specyficznie fosforylują tyrozynę. Niektóre kinazy, określane mianem kinaz „o podwójnej aktywności”, fosforylują tyrozynę oraz serynę/treoninę.

Kinazy białkowe można także scharakteryzować przez ich umiejscowienie w komórce. Niektóre kinazy są transbłonowymi białkami receptorowymi wiążącymi ligandy na zewnątrz błony komórkowej. Związanie ligandu zmienia aktywność katalityczną receptorowej kinazy białkowej. Inne kinazy są białkami niereceptorowymi nie posiadającymi domeny transbłonowej. Niereceptorowe kinazy białkowe można znaleźć w różnych przedziałach komórkowych od wewnętrznej strony błony komórkowej do jądra.

Wiele kinaz uczestniczy w kaskadach regulacyjnych, gdzie ich substratami mogą być inne kinazy, których aktywność jest regulowana przez ich stan ufosforylowania. Ostatecznie aktywność docelowego efektora jest modulowana przez fosforylację wynikającą z aktywacji takiej ścieżki.

Rodzina kinaz serynowo/treoninowych obejmuje białka regulujące wiele etapów kaskad sygnałowych, włącznie z kaskadami regulującymi wzrost komórki, migrację, różnicowanie, ekspresję genów, skurcz mięśnia, metabolizm glukozy, syntezę białek komórkowych oraz regulację cyklu komórkowego.

Przykładem niereceptorowej kinazy białkowej docelowo fosforylującej serynę i treoninę białek jest RAF. RAF moduluje aktywność katalityczną innych kinaz białkowych, takich jak kinaza białkowa fosforylująca i tym samym aktywująca kinazę aktywowaną mitogenem (MAPK). Sama RAF jest aktywowana przez zakotwiczone w błonie białko RAS, które z kolei jest aktywowane w odpowiedzi na aktywowane ligandem receptorowe tyrozynowe kinazy białkowe, takie jak receptor nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) oraz receptor pochodzącego z płytek czynnika wzrostu (PDGFR). Biologiczne znaczenie RAF w regulowaniu działania komórki podkreśla odkrycie, że zmienione formy RAF mogą powodować raka. Dowody na znaczenie RAF w złośliwości przedstawiono w artykule Monia i inni, 1996, Nature Medicine 2: 668, przytoczonym tutaj w całości jako pozycja literaturowa włącznie ze wszystkimi zawartymi tam rysunkami i tabelami.

W celu wynalezienia nowych metod leczenia raka i innych chorób, wynalazcy biomedyczni i chemicy zaprojektowali, zsyntetyzowali i przebadali cząsteczki hamujące działanie kinaz białkowych. Niektóre małe cząsteczki organiczne tworzą klasę związków modulujących działanie kinaz białkowych. Przykładami cząsteczek co do których stwierdzono, że hamują działanie kinaz białkowych są bis monocykliczne, bicykliczne lub heterocykliczne związki arylowe (PCT WO 92/20642), pochodne winylenoazaindolu (PCT WO 94/14808), 1-cyklopropylo-4-pirydylochinolony (Patent USA nr 5330992), związki styrylowe (Patent USA nr 5217999), styrylopodstawione związki pirydylowe (Patent USA nr 5302606), pewne pochodne chinazoliny (Zgłoszenie EP nr 0566266 A1), selenoindole i selenidy (PCT WO 94/03427), tricykliczne związki polihydroksylowe (PCT WO 92/21660) oraz pochodne kwasu benzylofosforylowego (PCT WO 91/15495).

Potencjalnie korzystnymi lekami są związki, które mogą przechodzić przez błony komórkowe i są odporne na hydrolizę kwasową, ze względu na to, że mogą się one stać szeroko biodostępne po doustnym podaniu pacjentom. Jednakże, wiele z tych inhibitorów kinaz białkowych tylko w niewielkim stopniu hamuje działanie kinaz białkowych. Ponadto, wiele z nich hamuje różne kinazy białkowe, a zatem może wywołać w leczeniu chorób wiele różnych skutków ubocznych.

Wynalazek dotyczy związku azabenzimidazolowego, wybranego z grupy obejmującej:

a) 2-okso-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-bjpirydynę;

b) 2-okso-6-fenylomerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę;

c) 2-etoksykarbonyloamino-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę;

d) 2-etoksykarbonyloamino-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę;

e) 2-metoksykarbonyloamino-6-fenylomerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę.

PL 191 618 B1

W innym aspekcie, wynalazek dotyczy środka farmaceutycznego zawierającego związek azabenzimidazolowy, według wynalazku, i fizjologicznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.

W kolejnym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania związku, według wynalazku 1, w którym 2-amino-6-chloro-3-nitropirydynę reaguje się z drugim reagentem, wybranym spośród fenolanu sodu lub tiofenolanu sodu, w rozpuszczalniku, z wytworzeniem pierwszego produktu pośredniego, następnie pierwszy produkt pośredni redukuje się w obecności katalizatora i środka redukującego, z wytworzeniem drugiego produktu pośredniego, po czym drugi produkt pośredni reaguje z trzecim reagentem, wybranym z grupy obejmującej O-metyloizomocznik oraz produkt reakcji siarczanu S-metyloizotiouroniowego z chloromrówczanem alkilu, po czym otrzymany związek, według wynalazku, oczyszcza się.

Korzystnie, jako rozpuszczalnik stosuje się n-propanol.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się wodór.

Korzystnie, jako katalizator stosuje się nikiel Raney'a.

Korzystnie, alkil stanowi metyl lub etyl.

W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dotyczy zastosowania związku, według wynalazku, do wytwarzania leków do leczenia stanów związanych z modulacją funkcji serynowo/treoninowej kinazy białkowej.

W kolejnym aspekcie, przedmiotem jest zastosowanie związku, według wynalazku, do wytwarzania leków do leczenia raka, zaburzeń zwłóknieniowych oraz innych zaburzeń proliferacyjnych.

Korzystnie, lek jest przeznaczony do leczenia raka należącego do grupy obejmującej raka płuc, raka jajników, raka sutka, raka mózgu, wewnątrzosiowego raka mózgu, raka okrężnicy, raka gruczołu krokowego, mięsaka, mięsaka Kaposiego, czerniaka i glejaka.

W innym w aspekcie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku azabenzimidazolowego, według wynalazku do wytwarzania leków do leczenia stanów związanych z zaburzeniami na drodze przekazywania sygnału, określonej jako droga RAF/MEK, charakteryzujących się występowaniem oddziaływania serynowo-treoninowej kinazy białkowej RAF z naturalnie wiązaną do niej cząsteczką.

I. Właściwości związku azabenzimidazolowego, według wynalazku.

Związek azabenzimidazolowy, według wynalazku, moduluje działanie serynowo/treoninowych kinaz białkowych. Działanie tego związku dotyczy komórek eksprymujących kinazy serynowo/treoninowe, takie jak RAF. Ponadto, związek, według wynalazku, służy do zapobiegania i leczenia występujących u organizmów nienormalnych stanów związanych z serynowo/treoninowymi kinazami białkowymi.

Związek, według wynalazku, służy do modulowania działania zarówno receptorowych jak i cytozolowych serynowo/treoninowych kinaz białkowych. Związek, według wynalazku moduluje enzymy zarówno in vivo, jak i in vitro.

W użytym znaczeniu określenie „działanie” oznacza komórkową rolę serynowo/treoninowej kinazy białkowej. Rodzina serynowo/treoninowych kinaz białkowych obejmuje enzymy regulujące wiele etapów kaskad sygnałowych, włącznie z kaskadami regulującymi wzrost komórki, migrację, różnicowanie, ekspresję genów, skurcz mięśnia, metabolizm glukozy, syntezę białek komórkowych oraz regulację cyklu komórkowego.

W użytym znaczeniu określenie „moduluje” oznacza zdolność związku do zmieniania działania kinazy białkowej. Modulator korzystnie aktywuje aktywność katalityczną kinazy białkowej, korzystniej aktywuje lub hamuje aktywność katalityczną kinazy białkowej w zależności od stężenia związku na którego działanie wystawiono kinazę białkową lub najkorzystniej hamuje aktywność katalityczną kinazy białkowej.

W użytym znaczeniu określenie „aktywność katalityczna”, określa stopień w jakim kinaza białkowa fosforyluje substrat. Aktywność katalityczną można zmierzyć, na przykład, oznaczając ilość substratu przetworzonego w produkt w funkcji czasu. Fosforylacja substratu zachodzi w miejscu aktywnym kinazy białkowej. Miejscem aktywnym jest zazwyczaj kieszeń w której substrat wiąże się z kinazą białkową i jest fosforylowany.

W użytym znaczeniu określenie „substrat” oznacza cząsteczkę fosforylowaną przez serynowo/treoninową kinazę białkową. Substrat jest korzystnie peptydem lub korzystniej białkiem. W odniesieniu do kinazy białkowej RAF, korzystnymi substratami są MEK i MEK substrat MAPK.

W użytym znaczeniu określenie „aktywuje” oznacza zwiększenie komórkowego działania kinazy białkowej. Działaniem kinazy białkowej jest korzystnie oddziaływanie z naturalnie wiązaną do niej cząsteczką oraz korzystniej aktywność katalityczna.

PL 191 618 B1

W tym znaczeniu określenie „hamuje” oznacza zmniejszenie komórkowego działania kinazy białkowej. Działaniem kinazy białkowej jest korzystnie oddziaływanie z naturalnie wiązaną do niej cząsteczką oraz korzystniej aktywność katalityczna.

W użytym znaczeniu określenie „moduluje” oznacza także zmianę działania kinazy białkowej przez zwiększenie lub obniżenie możliwości, że utworzy się kompleks pomiędzy kinazą białkową, a naturalnie wiązaną do niej cząsteczką. Modulator korzystnie zwiększa prawdopodobieństwo, że taki kompleks utworzy się pomiędzy kinazą białkową i naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką, korzystniej zwiększa lub zmniejsza prawdopodobieństwo, że utworzy się kompleks pomiędzy kinazą białkową i naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką zależnie od stężenia związku na którego działanie wystawiono kinazę białkową, a najkorzystniej obniża prawdopodobieństwo, że utworzy się kompleks pomiędzy kinazą białkową i naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką.

W użytym znaczeniu określenie „kompleks” oznacza złożenie przynajmniej dwóch cząsteczek związanych ze sobą nawzajem. Kompleksy przekazywania sygnału często obejmują przynajmniej dwie cząsteczki białek powiązane ze sobą. Na przykład białko receptora tyrozynowej kinazy białkowej, GRB2, SOS, RAF i RAS składają się tworząc kompleks przekazywania sygnału w odpowiedzi na ligand mitogenny.

W użytym znaczeniu określenie „naturalnie wiązana cząsteczka” oznacza polipeptydy wiążące się w komórkach do kinazy białkowej. Naturalnie wiązane cząsteczki mogą odgrywać rolę w rozprzestrzenianiu się sygnału w procesach przekazywania sygnału przez kinazy białkowe. Zmiana oddziaływania pomiędzy kinazą białkową a naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką może ujawnić się samo w sobie przez zwiększenie lub zmniejszenie prawdopodobieństwa, że wytworzy się to oddziaływanie lub zwiększenie, lub zmniejszenie stężenia kompleksu kinaza białkowa/naturalnie wiązana cząsteczka.

Cząsteczka naturalnie wiązana przez kinazę białkową może związać się z wewnątrzkomórkowym regionem kinazy białkowej o wysokim powinowactwie. Wysokie powinowactwo odpowiada stałej równowadze wiązania rzędu 10^-6 M lub mniejszej. Ponadto naturalnie wiązana cząsteczka może także przejściowo oddziaływać z wewnątrzkomórkowym regionem kinazy białkowej i modyfikować go chemicznie. Naturalnie wiązane cząsteczki przez kinazę białkową można wybrać z grupy obejmującej, ale nie tylko, domeny homologii SRC 2 (SH2) lub 3 (SH3), inne domeny wiążące ufosforylowaną tyrozynę (PTB), czynniki wymieniające nukleotydy guaninowe, fosfatazy białkowe oraz inne kinazy białkowe. Sposoby oznaczania zmian w oddziaływaniach pomiędzy kinazami białkowymi, a cząsteczkami naturalnie przez nie wiązanymi są łatwo dostępne.

W użytym znaczeniu określenie „serynowo/treoninowa kinaza białkowa” oznacza enzym o sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 10% identycznej z innymi enzymami fosforylującymi serynę i treoninę białek. Serynowo/treoninowa kinaza białkowa katalizuje dodanie fosforanu do seryny lub treoniny białka. Serynowo/treoninowe kinazy białkowe mogą występować jako białka związane z błoną lub cytozolowe.

W użytym znaczeniu określenie „wystawienie na działanie” oznacza zmieszanie roztworu zawierającego związek azabezimidazolowy, według wynalazku, z płynną pożywką zawierającą komórki stosowane w badaniach. Roztwór zawierający związek może także zawierać inne składniki, takie jak dimetylosulfotlenek (DMSO), służące do wychwytu związku lub związków azabenzimidazolowych w komórkach stosowanych w badaniach. Roztwór zawierający związek benzimidazolowy można dodać do pożywki z komórkami przy użyciu aparatu dostarczającego, takiego jak urządzenie typu pipety lub urządzenie typu strzykawki.

W użytym znaczeniu określenie „związek azabenzimidazolowy” oznacza azabenzimidazolowy związek organiczny podstawiony podstawnikami chemicznymi. Azabenzimidazole mają następującą strukturę ogólną:

W użytym znaczeniu określenie „podstawiony”, w odniesieniu do wynalazku, oznacza związek azabenzimidazolowy podstawiony dowolną liczbą podstawników chemicznych.

PL 191 618 B1

Kinaza białkowa RAF fosforyluje serynę lub treoninę docelowych białek. Jednym z takich białek docelowych jest kinaza białkowa (MEK) fosforylująca i w konsekwencji aktywująca kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK). RAF sama w sobie jest aktywowana przez związany z błoną enzym RAS hydrolizujący trifosforan guaniny w odpowiedzi na stymulowane mitogenem białka receptorowe kinaz tyrozynowych, takie jak receptor nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) oraz receptor pochodzącego z płytek czynnika wzrostu (PDGFR).

Modulujące działanie kinazy białkowej RAF w komórkach można wykryć w następujący sposób. RAF fosforyluje kinazę białkową (MEK), która z kolei fosforyluje aktywowaną mitogenem kinazę białkową (MAPK). Testy monitorujące tylko fosforylację MEK przez RAF nie są czułe, ponieważ poziom fosforylacji MEK nie jest znaczący. Aby ominąć problem związany z czułością w wynalazku śledzi się poziom fosforylacji zarówno MEK, jak i MAPK. Sygnał fosforylacji MAPK wzmacnia sygnał fosforylacji MEK i pozwala śledzić fosforylację zależną od RAF w testach typu enzymatycznego testu immunoadsorbcyjnego. Ponadto test ten przeprowadza się w sposób wysokosprawny, tak że wiele związków może być natychmiastowo monitorowanych w krótkim okresie czasu.

II. Sposoby wyszukiwania związków modulujących działanie serynowo/proteinowych kinaz białkowych.

Identyfikację związków modulujących działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej można przeprowadzić przy użyciu sposobu, obejmującego etapy wystawienia komórek eksprymujących serynowo/treoninową kinazę białkową na działanie związku oraz monitorowania skutków wywołanych w komórkach.

W użytym znaczeniu określenie „monitorowanie” oznacza obserwację skutków dodania związku do komórek, przy wykorzystaniu opisanych powyżej sposobów. Skutek może ujawnić się w zmianie fenotypu komórki, proliferacji komórki, aktywności katalitycznej kinazy białkowej lub oddziaływania pomiędzy kinazą białkową a naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką.

W użytym znaczeniu określenie „skutek” opisuje zmianę lub brak zmiany w fenotypie lub proliferacji komórki. „Skutek”może także opisywać zmianę lub brak zmiany w katalitycznej aktywności kinazy białkowej. „Skutek” może także opisywać zmianę lub brak zmiany oddziaływania pomiędzy kinazą białkową a naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką.

W przypadku identyfikacji związków modulujących działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej, skutkiem jest zmiana lub brak zmiany w fenotypie komórki.

W użytym znaczeniu określenie „fenotyp komórki” dotyczy zewnętrznego wyglądu komórki lub tkanki lub działania komórki lub tkanki. Przykładami fenotypu komórki są rozmiar komórki (zmniejszenie lub zwiększenie), proliferacja komórki (zwiększona lub zmniejszona liczba komórek), różnicowanie komórki (zmiana lub brak zmiany w kształcie komórki), przeżycie komórki, apoptoza (śmierć komórki) lub użytkowanie metabolicznego środka odżywczego (np. wychwytu glukozy). Zmiany lub brak zmian w fenotypie komórki można łatwo zmierzyć znanymi technikami.

Ponadto, w przypadku identyfikacji związków modulujących działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej, skutkiem jest zmiana lub brak zmiany w proliferacji komórki.

W użytym znaczeniu określenie „proliferacja komórki” oznacza tempo w jakim grupa komórek ulega podziałom. Liczbę komórek rosnących w naczyniu może oznaczyć fachowiec licząc komórki w określonej objętości pod mikroskopem świetlnym. Ponadto tempo proliferacji komórek można oznaczyć przy pomocy urządzeń laboratoryjnych mierzących gęstość komórek w odpowiedniej pożywce optycznie lub przez pomiar przewodnictwa.

Innym sposobem identyfikacji związków modulujących działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej, jest stwierdzenie zmiany lub braku zmiany oddziaływania pomiędzy serynowo/treoninową kinazą białkową a naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką.

W użytym znaczeniu określenie „oddziaływanie” oznacza kompleks tworzony pomiędzy wewnątrzkomórkowym regionem kinazy białkowej a naturalnie wiązaną przez niego cząsteczką lub związkiem. Termin „oddziaływanie” można także rozszerzyć do kompleksu tworzonego pomiędzy związkiem według wynalazku a wewnątrzkomórkowymi lub zewnątrzkomórkowymi regionami badanej kinazy białkowej. Chociaż cytozolowa kinaza białkowa nie będzie posiadać regionu zewnątrzkomórkowego, to receptorowa kinaza białkowa będzie posiadać zarówno region zewnątrzkomórkowy jak i wewnątrzkomórkowy.

W użytym znaczeniu określenie „region wewnątrzkomórkowy” odnosi się do części kinazy białkowej występującej wewnątrz komórki. W użytym znaczeniu określenie „region zewnątrzkomórkowy” oznacza część kinazy białkowej występujący na zewnątrz komórki.

Ponadto identyfikację związków modulujących działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej można przeprowadzić przy użyciu sposobu obejmującego następujące etapy: (a) zlizowanie komórek

PL 191 618 B1 w celu uzyskania lizatu zawierającego serynowo/treoninową kinazę białkową; (b) adsorbcję serynowo/treoninowej kinazy białkowej do przeciwciała; (c) inkubację zaadsorbowanej serynowo/treoninowej kinazy białkowej z substratem lub substratami; oraz (d) adsorbcję substratu lub substratów do stałego złoża lub przeciwciała. Etap monitorowania skutków wywartych na komórkach obejmuje pomiar stężenia fosforanów substratu lub substratów.

W użytym znaczeniu określenie „zlizowanie” oznacza metodę rozbicia całości komórki, tak że zostaje uwolnione jej wnętrze. Lizę komórki można przeprowadzić różnymi metodami znanymi fachowcom. Korzystnie można to przeprowadzić technikami rozbijania komórek ultradźwiękami lub pod wpływem sił ścinających oraz, korzystniej, przy pomocy detergentów.

W użytym znaczeniu określenie „przeciwciało” oznacza cząsteczkę białka specyficznie wiążącą kinazę białkową. Przeciwciało korzystnie wiąże jedną klasę kinaz białkowych oraz korzystniej specyficznie wiąże kinazę białkową RAF.

W użytym znaczeniu określenie „specyficznie wiąże” odnosi się do przeciwciała wiążącego kinazę białkową z powinowactwem wyższym niż inna kinaza białkowa lub białko komórkowe. Przeciwciało specyficznie wiążące kinazę białkową wiąże stężenie specyficznej kinazy białkowej wyższe niż innej kinazy białkowej lub białka komórkowego.

W użytym znaczeniu określenie „adsorpcja” oznacza związanie cząsteczki na powierzchni przeciwciała lub stałego podłoża. Przykładami stałych podłóż są modyfikowana chemicznie celuloza, taka jak fosfoceluloza oraz nylon. Przeciwciała mogą być przyłączone do stałych podłóż technikami dobrze znanymi fachowcom. Patrz, np. Harlo & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories.

W użytym znaczeniu określenie „pomiar stężenia fosforanów” oznacza techniki powszechnie znane fachowcom. Pomiary te mogą obejmować ilościowe oznaczenie stężeń fosforanów w substracie lub wyznaczenie względnego stosunku ilości fosforanów w substracie. Techniki te mogą obejmować adsorbcję substratu do błon i wyznaczenie ilości fosforanów w substracie przez pomiary radioaktywności.

Identyfikację związków modulujących działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej można przeprowadzić także sposobem obejmującym następujące etapy: (a) zlizowanie komórek w celu uzyskania lizatu zawierającego RAF; (b) adsorbcję RAF do przeciwciała; (c) inkubację zaadsorbowanego RAF z MEK i MAPK; oraz (d) adsorbcję MEK i MAPK do stałego podłoża lub przeciwciała, lub przeciwciał. Etap pomiaru skutków wywartych na komórkach obejmuje monitorowanie stężeń fosforanów wymienionych MEK i MAPK.

Przy użyciu opisanego powyżej sposobu zidentyfikowano związek, według wynalazku lub związki stanowiące dowolną z jego podgrup, o budowie określonej wzorami A lub B, które zostały wymienione w poniższej tabeli:

PL 191 618 B1

Związek nr	R1	X1	R4	Z3
1	2	3	4	5
A-1	fenyl	O	-	-
A-2	fenyl	S	-	-
A-3	fenyl	O	metyl	O
A-4	fenyl	O	etyl	O
A-5	2-nitrofenyl	O	-	-
A-6	3-nitrofenyl	O	-	-
A-7	4-nitrofenyl	O	-	-
A-8	2-chlorofenyl	O	-	-
A-9	3-chlorofenyl	O	-	-
A-10	4-chlorofenyl	O	-	-
A-11	2-metylofenyl	O	-	-
A-12	3-metylofenyl	O	-	-
A-13	4-metylofenyl	O	-	-
A-14	2-fluorofenyl	O	-
A-15	3-fluorofenyl	O	-	-
A-16	4-fluorofenyl	O	-	-
A-17	2-(trifluorometylo)fenyl	O	-	-
A-18	3-(trifluorometylo)fenyl	O	-	-
A-19	4-(trifluorometylo)fenyl	O	-	-
A-20	2-metoksyfenyl	O	-	-
A-21	3-metoksyfenyl	O	-	-
A-22	4-metoksyfenyl	O	-	-
A-23	2-karboksyfenyl	O	-	-
A-24	3-karboksyfenyl	O	-	-
A-25	4-karboksyfenyl	O	-	-
A-26	2-nitrofenyl	S	-	-
A-27	3-nitrofenyl	S	-	-
A-28	4-nitrofenyl	S	-	-
A-29	2-chlorofenyl	S	-	-
A-30	3-chlorofenyl	S	-	-
A-31	4-chlorofenyl	S	-	-
A-32	2-metylofenyl	S	-	-
A-33	3-metylofenyl	S	-	-
A-34	4-metylofenyl	S	-	-
A-35	2-fluorofenyl	S	-	-

PL 191 618 B1 ciąg dalszy tabeli

1	2	3	4	5
A-36	3-fluorofenyl	S	-	-
A-37	4-fluorofenyl	S	-	-
A-38	2-(trifluorometylo)fenyl	S		-
A-39	3-(trifluorometylo)fenyl	S	-	-
A-40	4-(trifluorometylo)fenyl	S	-	-
A-41	2-metoksyfenyl	S	-	-
A-42	3-metoksyfenyl	S	-	-
A-43	4-metoksyfenyl	S	-	-
A-44	2-karboksyfenyl	S	-	-
A-45	3-karboksyfenyl	S	-	-
A-46	4-karboksyfenyl	S	-	-
A-47	fenyl	NH	-	-
A-48	2-nitrofenyl	NH	-	-
A-49	3-nitrofenyl	NH	-	-
A-50	4-nitrofenyl	NH	-	-
A-51	2-chlorofenyl	NH	-	-
A-52	3-chlorofenyl	NH	-	-
A-53	4-chlorofenyl	NH	-	-
A-54	2-metylofenyl	NH	-	-
A-55	3-metylofenyl	NH	-	-
A-56	4-metylofenyl	NH	-	-
A-57	2-fluorofenyl	NH	-	-
A-58	3-fluorofenyl	NH	-	-
A-59	4-fluorofenyl	NH	-	-
A-60	2-(trifluorometylo)fenyl	NH	-	-
A-61	3-(trifluorometylo)fenyl	NH	-	-
A-62	4-(trifluorometylo)fenyl	NH	-	-
A-63	2-metoksyfenyl	NH	-	-
A-64	3-metoksyfenyl	NH	-	-
A-65	4-metoksyfenyl	NH	-	-
A-66	2-karboksyfenyl	NH	-	-
A-67	3-karboksyfenyl	NH	-	-
A-68	4-karboksyfenyl	NH	-	-
A-69	2-nitrofenyl	O	metyl	O
A-70	3-nitrofenyl	O	metyl	O
A-71	4-nitrofenyl	O	metyl	O

PL 191 618 B1

cią	Ig dalszy tabeli
1	2	3	4	5
A-72	2-chlorofenył	O	mety		O
A-73	3-chlorofenyl	O	mety		O
A-74	4-chlorofenyl	O	mety		O
A-75	2-metylofenyl	O	mety		O
A-76	3-metylofenyl	O	mety		O
A-77	4-metylofenyl	O	mety		O
A-78	2-fluorofenyl	O	mety		O
A-79	3-fluorofenyl	O	mety		O
A-80	4-fluorofenyl	O	mety		O
A-81	2-(trifluorometylo)fenyl	O	mety		O
A-82	3-(trifluorometylo)fenyl	O	mety		O
A-83	4-(trifluorometylo)fenyl	O	mety		O
A-84	2-metoksyfenyl	O	mety		O
A-85	3-metoksyfenyl	O	mety		O
A-86	4-metoksyfenyl	O	mety		O
A-87	2-karboksyfenyl	O	mety		O
A-88	3-karboksyfenyl	O	mety		O
A-89	4-karboksyfenyl	O	mety		O
A-90	fenyl	S	mety		O
A-91	2-nitrofenyl	S	mety		O
A-92	3-nitrofenyl	S	mety		O
A-93	4-nitrofenyl	S	mety		O
A-94	2-chlorofenyl	S	mety		O
A-95	3-chlorofenyl	S	mety		O
A-96	4-chlorofenyl	S	mety		O
A-97	2-metylofenyl	S	mety		O
A-98	3-metylofenyl	S	mety		O
A-99	4-metylofenyl	S	mety		O
A-100	2-fluorofenyl	S	mety		O
A-101	3-fluorofenyl	S	mety		O
A-102	4-fluorofenyl	S	mety		O
A-103	2-(trifluorometylo)fenyl	S	mety		O
A-104	3-(trifluorometylo)fenyl	S	mety		O
A-105	4-(trifluorometylo)fenyl	S	mety		O
A-106	2-metoksyfenyl	S	mety		O
A-107	3-metoksyfenyl	S	mety		O

PL 191 618 B1 ciąg dalszy tabeli

1	2	3	4	5
A-108	4-metoksyfenyl	S	metyl	O
A-109	2-karboksyfenyl	S	metyl	O
A-110	3-karboksyfenyl	S	metyl	O
A-111	4-karboksyfenyl	S	metyl	O
A-112	fenyl	NH	metyl	O
A-113	2-nitrofenyl	NH	metyl	O
A-114	3-nitrofenyl	NH	metyl	O
A-115	4-nitrofenyl	NH	metyl	O
A-116	2-chlorofenyl	NH	metyl	O
A-117	3-chlorofenyl	NH	metyl	O
A-118	4-chlorofenyl	NH	metyl	O
A-119	2-metylofenyl	NH	metyl	O
A-120	3-metylofenyl	NH	metyl	O
A-121	4-metylofenyl	NH	metyl	O
A-122	2-fluorofenyl	NH	metyl	O
A-123	3-fluorofenyl	NH	metyl	O
A-124	4-fluorofenyl	NH	metyl	O
A-125	2-(trifluorometylo)fenyl	NH	metyl	O
A-126	3-(trifluorometylo)fenyl	NH	metyl	O
A-127	4-(trifluorometylo)fenyl	NH	metyl	O
A-128	2-metoksyfenyl	NH	metyl	O
A-129	3-metoksyfenyl	NH	metyl	O
A-130	4-metoksyfenyl	NH	metyl	O
A-131	2-karboksyfenyl	NH	metyl	O
A-132	3-karboksyfenyl	NH	metyl	O
A-133	4-karboksyfenyl	NH	metyl	O
A-134	2-nitrofenyl	O	etyl	O
A-135	3-nitrofenyl	O	etyl	O
A-136	4-nitrofenyl	O	etyl	O
A-137	2-chlorofenyl	O	etyl	O
A-138	3-chlorofenyl	O	etyl	O
A-139	4-chlorofenyl	O	etyl	O
A-140	2-metylofenyl	O	etyl	O
A-141	3-metylofenyl	O	etyl	O
A-142	4-metylofenyl	O	etyl	O
A-143	2-fluorofenyl	O	etyl	O

PL 191 618 B1

cią	Ig dalszy tabeli
1	2	3	4	5
A-144	3-fluorofenyl	O	ety		O
A-145	4-fluorofenyl	O	ety		O
A-146	2-(trifluorometylo)fenyl	O	ety		O
A-147	3-(trifluorometylo)fenyl	O	ety		O
A-148	4-(trifluorometylo)fenyl	O	ety		O
A-149	2-metoksyfenyl	O	ety		O
A-150	3-metoksyfenyl	O	ety		O
A-151	4-metoksyfenyl	O	ety		O
A-152	2-karboksyfenyl	O	ety		O
A-153	3-karboksyfenyl	O	ety		O
A-154	4-karboksyfenyl	O	ety		O
A-155	fenyl	S	ety		O
A-156	2-nitrofenyl	S	ety		O
A-157	3-nitrofenyl	S	ety		O
A-158	4-nitrofenyl	S	ety		O
A-159	2-chlorofenyl	S	ety		O
A-160	3-chlorofenyl	S	ety		O
A-161	4-chlorofenyl	S	ety		O
A-162	2-metylofenyl	S	ety		O
A-163	3-metylofenyl	S	ety		O
A-164	4-metylofenyl	S	ety		O
A-165	2-fluorofenyl	S	ety		O
A-166	3-fluorofenyl	S	ety		O
A-167	4-fluorofenyl	S	ety		O
A-168	2-(trifluorometylo)fenyl	S	ety		O
A-169	3-(trifluorometylo)fenyl	S	ety		O
A-170	4-(trifluorometylo)fenyl	S	ety		O
A-171	2-metoksyfenyl	S	ety		O
A-172	3-metoksyfenyl	S	ety		O
A-173	4-metoksyfenyl	S	ety		O
A-174	2-karboksyfenyl	S	ety		O
A-175	3-karboksyfenyl	S	ety		O
A-176	4-karboksyfenyl	S	ety		O
A-177	fenyl	NH	ety		O
A-178	2-nitrofenyl	NH	ety		O
A-179	3-nitrofenyl	NH	ety		O

PL 191 618 B1 ciąg dalszy tabeli

1	2	3	4	5
A-180	4-nitrofenyl	NH	etyl	O
A-181	2-chlorofenyl	NH	etyl	O
A-182	3-chlorofenyl	NH	etyl	O
A-183	4-chlorofenyl	NH	etyl	O
A-184	2-metylofenyl	NH	etyl	O
A-185	3-metylofenyl	NH	etyl	O
A-186	4-metylofenyl	NH	etyl	O
A-187	2-fluorofenyl	NH	etyl	O
A-188	3-fluorofenyl	NH	etyl	O
A-189	4-fluorofenyl	NH	etyl	O
A-190	2-(trifluorometylo)fenyl	NH	etyl	O
A-191	3-(trifluorometylo)fenyl	NH	etyl	O
A-192	4-(trifluorometylo)fenyl	NH	etyl	O
A-193	2-metoksyfenyl	NH	etyl	O
A-194	3-metoksyfenyl	NH	etyl	O
A-195	4-metoksyfenyl	NH	etyl	O
A-196	2-karboksyfenyl	NH	etyl	O
A-197	3-karboksyfenyl	NH	etyl	O
A-198	4-karboksyfenyl	NH	etyl	O

Określenie „związek” dotyczy związku lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, estru, amidu, proleku, izomeru lub metabolitu.

Określenie „farmaceutycznie dopuszczalne sole” dotyczy postaci związku, która nie wpływa niekorzystnie na działanie biologiczne lub właściwości związku. Sole farmaceutyczne można otrzymać przez poddanie związku według wynalazku reakcji z kwasami nieorganicznymi lub organicznymi, takimi jak kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas azotowy, kwas fosforowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas p-toluenosulfonowy, kwas salicylowy itp.

Określenie „prolek” odnosi się do środka, który przekształca się in vivo w lek macierzysty. W pewnych sytuacjach proleki mogą być łatwiejsze do podawania niż lek macierzysty. Tak np. w przeciwieństwie do związku macierzystego prolek może być biodostępny po podaniu doustnym, albo też prolek może wykazywać lepszą rozpuszczalność, umożliwiającą podawanie dożylne.

II. Sposoby zapobiegania lub leczenia nienormalnych stanów

Związek, według wynalazku, wykorzystuje się do zapobiegania lub leczenia nienormalnego stanu w organizmie.

W użytym znaczeniu określenie „nienormalny stan” oznacza takie działanie komórek lub tkanek organizmu, które różni się od ich normalnego działania w organizmie. Nienormalny stan może dotyczyć proliferacji komórek, różnicowania komórek lub przeżycia komórek.

W użytym znaczeniu określenie „organizm” oznacza jakąkolwiek żyjącą istotę zawierającą przynajmniej jedną komórkę. Organizm ten może być tak prosty jak pojedyncza komórka eukariotyczna lub tak złożony jak ssak. W korzystnych rozwiązaniach, organizm oznacza ludzi lub ssaki.

W użytym znaczeniu określenie „ssak” oznacza korzystnie taki organizm jak mysz, szczur, królik, świnka morska oraz koza, korzystniej małpa oraz małpa człekokształtna, a najkorzystniej człowiek.

W użytym znaczeniu określenie „zapobieganie oznacza metodę obniżania prawdopodobieństwa lub eliminację możliwości, że organizm nabawi się nienormalnego stanu lub rozwinie się w nim nienormalny stan.

PL 191 618 B1

W użytym znaczeniu określenie „leczenie” oznacza sposób o leczniczym skutku oraz przynajmniej częściowo łagodzący lub znoszący nienormalny stan organizmu.

W użytym znaczeniu określenie „skutek leczniczy” oznacza zahamowanie wzrostu komórki powodującego lub prowadzącego do nienormalnego stanu. W użytym znaczeniu określenie „skutek leczniczy” także oznacza zahamowanie czynników wzrostowych powodujących lub, których działanie prowadzi do nienormalnego stanu (np. raka). Skutek leczniczy łagodzi w pewnym stopniu jeden lub więcej symptomów nienormalnego stanu. W odniesieniu do leczenia nowotworów skutek leczniczy oznacza jedno lub więcej z następujących: (a) zmniejszenie rozmiaru nowotworu; (b) zahamowanie (tj. spowolnienie lub zatrzymanie) przerzutów nowotworowych; (c) zahamowanie wzrostu nowotworu oraz (d) złagodzenie w pewnym stopniu jednego lub więcej z symptomów związanych z nienormalnym stanem. Związki wykazujące skuteczność wobec białaczek można zidentyfikować w sposób tutaj opisany, z tym wyjątkiem, że zamiast hamowania przerzutów będą one spowalniać lub zmniejszać proliferację lub wzrost komórek.

Stany zaburzonej proliferacji komórek obejmują raki, zaburzenia zwłóknienia i mezangialne, nienormalną angiogenezę i rozwój naczyń, gojenie się ran, łuszczycę, cukrzycę oraz zapalenia. Przy czym rak jest wybrany z grupy obejmującej rak płuca, rak jajnika, rak sutka, rak mózgu, wewnątrzosiowy rak mózgu, rak okrężnicy, rak gruczołu krokowego, mięsak, mięsak Kaposiego, czerniak oraz glejak.

Stany zaburzonego różnicowania komórek dotyczą, ale nie tylko, zaburzeń neurozwyrodnieniowych, spowolnionego gojenia się ran oraz technik przeszczepów tkanek.

Stany zaburzonego przeżycia komórek dotyczą stanów, w których szlaki programowanej śmierci komórek (apoptozy) są zaktywowane lub wyłączone. Wiele kinaz białkowych jest związanych ze szlakami apoptozy. Zaburzenia działania którejkolwiek z kinaz białkowych mogą prowadzić do nieśmiertelności komórki lub przedwczesnej śmierci komórki.

Proliferacja, różnicowanie i przeżycie komórek są łatwe do zmierzenia sposobami znanymi fachowcom. Sposoby te mogą obejmować obserwację liczby lub wyglądu komórek pod mikroskopem w odniesieniu do czasu (np. dni).

W użytym znaczeniu określenie „podawanie” szeroko odnosi się do dostarczania organizmowi lub bardziej szczegółowo sposobu włączania związku do komórek lub tkanek organizmu. Nienormalnemu stanowi można zapobiegać lub leczyć go, kiedy komórki lub tkanki organizmu występują w organizmie lub poza jego obrębem. Komórki poza obrębem organizmu można utrzymywać lub hodować w naczyniach hodowlanych. Dla komórek występujących w organizmie istnieje w dziedzinie wynalazku wiele technik podawania związków, włącznie z (ale nie tylko) podawaniem doustnym, pozajelitowym, skórnym, przez zastrzyki lub w aerozolu. Dla komórek występujących poza organizmem istnieje wiele technik podawania związku, według wynalazku, włącznie z (ale nie tylko) technikami mikroiniekcji, transformacji lub nośnikowymi.

Ponadto związek, według wynalazku, stosuje się do zapobiegania lub leczenia nienormalnych stanów w organizmie związanych z zaburzeniami szlaku przekazywania sygnału, charakteryzującymi się oddziaływaniami serynowo/treoninowej kinazy białkowej z naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką.

W użytym znaczeniu określenie „szlak przekazywania sygnału” oznacza rozprzestrzenianie się sygnału. Ogólnie zewnątrzkomórkowy sygnał jest przekazywany przez błonę komórkową i staje się sygnałem wewnątrzkomórkowym. Następnie sygnał ten może stymulować odpowiedź komórkową. Termin ten także obejmuje sygnały w całości przekazywane w obrębie komórki. Cząsteczki polipeptydów związane z procesami przekazywania sygnału są to zazwyczaj receptorowe i niereceptorowe kinazy białkowe, receptorowe i niereceptorowe fosfatazy białkowe, czynniki wymiany nukleotydów oraz czynniki transkrypcyjne.

W użytym znaczeniu określenie „zaburzenie” dotyczący procesów przekazywania sygnałów dotyczy kinazy białkowej, która jest nad lub niedoeksprymowana w organizmie, zmutowana, tak że jej aktywność katalityczna jest mniejsza lub większa niż aktywność katalityczna kinazy białkowej typu dzikiego, zmutowana, tak, że nie może oddziaływać z naturalnie wiązaną przez siebie cząsteczką, nie jest modyfikowana przez inną kinazę białkową lub fosfatazę białkową lub nie oddziaływuje z naturalnie wiązaną przez siebie cząsteczką.

W użytym znaczeniu określenie „pobudzający lub przerywający nienormalne oddziaływania” oznacza sposób, który można osiągnąć podając związek, według wynalazku, komórkom lub tkankom organizmu. Związek może pobudzać oddziaływanie pomiędzy kinazą białkową, a naturalnie wiązanymi przez nią cząsteczkami przez utworzenie korzystnych oddziaływań z wieloma atomami na powierzchni rozdzielającej kompleksu. Ponadto, związek może hamować oddziaływania pomiędzy kinazą

PL 191 618 B1 białkową, a naturalnie wiązanymi przez nią cząsteczkami przez przeciwdziałanie korzystnym oddziaływaniom utworzonym pomiędzy atomami na powierzchni rozdzielającej kompleksu. W innym korzystnym rozwiązaniu wynalazek dotyczy sposobu zapobiegania lub leczenia nienormalnych stanów w organizmie, gdzie serynowo/treoninową kinazą białkową jest RAF.

Wskazana powyżej istota wynalazku nie stanowi ograniczenia, a inne cechy i zalety wynalazku staną się oczywiste po zapoznaniu się z poniższym opisem korzystnych rozwiązań.

RAF jest niereceptorową kinazą białkową rekrutowaną do błony komórkowej przez wiązanie z aktywowanym RAS, enzymem hydrolizującym trifosforan guaniny. RAS jest aktywowany pod wpływem zaktywowanej receptorowej tyrozynowej kinazy białkowej, takiej jak EGFR lub PDGFR, związanej z białkiem adaptorowym, GRB2 oraz czynnikiem wymiany nukleotydów guaninowych, SOS. SOS usuwa difosforan guaniny z RAS i zastępuje go trifosforanem guaniny w ten sposób aktywując RAS. Następnie RAS wiąże i w konsekwencji aktywuje RAF. Następnie RAF może ufosforylować serynę lub treoninę innych białek docelowych, takich jak kinaza (MEK) fosforylująca i w konsekwencji aktywująca kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK). Zatem, RAF służy za pośredniczący czynnik regulujący w aktywowanym mitogenem przekazywaniu sygnału.

Ze względu na istotną rolę regulatorową RAF w komórkach modyfikacje sekwencji aminokwasowej RAF mogą zmienić jej działanie i w konsekwencji zmodyfikować zachowanie komórki. Rolę RAF w proliferacji komórki podkreśliły obserwacje, że mutacje sekwencji aminokwasowej RAF związane są z nowotworami i rakami. Ze względu na to, że mutacje RAF powodujące raka w komórkach powodują powstanie cząsteczek RAF wykazujących nieregulowaną aktywność katalityczną, inhibitory RAF mogą łagodzić lub nawet znosić proliferację prowadzącą do raka w tych komórkach.

Opisane powyżej metody pozwalają wykryć związki modulujące działanie kinazy białkowej RAF w komórkach. RAF fosforyluje kinazę białkową (MEK), która z kolei fosforyluje kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK). Testy monitorujące tylko fosforylację MEK przez RAF nie są czułe, ponieważ poziom fosforylacji MEK nie jest znaczący. Aby ominąć problem związany z czułością, w opisanych powyżej metodach, śledzi się poziom fosforylacji zarówno MEK, jak i MAPK. Sygnał fosforylacji MAPK wzmacnia sygnał fosforylacji MEK i pozwala śledzić fosforylację zależną od RAF w testach typu enzymatycznego testu immunoadsorbcyjnego. Ponadto test przeprowadza się w sposób wysokosprawny, tak że wiele związków może być natychmiastowo monitorowanych w krótkim okresie czasu.

W wyniku zastosowania wskazanych powyżej metod wykrywania związków modulujących działanie kinazy białkowej RAF w komórkach zidentyfikowano związki hamujące działanie kinazy białkowej RAF. Związki te to pochodne, oparte na azabenzimidazolu. Pomimo, że pochodne oparte na azabenzimidazolu były badane pod względem ich zdolności do hamowania enzymów uczestniczących w syntezie nukleotydów u bakterii, wiele z tych związków nie przebadano jeszcze w znaczący sposób pod względem ich zdolności do hamowania kinaz białkowych.

Ze względu na to, że RAF wykazuje znaczącą homologię sekwencji aminokwasowej z innymi serynowo/treoninowymi kinazami białkowymi istnieje duże prawdopodobieństwo, że związki azabenzimidazolowe będą także hamować serynowo/treoninowe kinazy białkowe inne niż RAF. Zatem, związki, według wynalazku, oddziaływują także na serynowo/treoninowe kinazy białkowe inne niż RAF, włącznie z receptorowymi i niereceptorowymi kinazami białkowymi.

Przy użyciu wskazanych powyżej sposobów można zidentyfikować także inne związki modulujące działanie RAF w komórkach, ze względu na to, że wysokosprawność tych sposobów pozwala przetestować duży szereg cząsteczek w krótkim okresie czasu. Zatem sposoby pozwalają zidentyfikować istniejące cząsteczki nie ujawnione w wynalazku modulujące działanie STK.

I. Biologiczna aktywność związków azabenzimidazolowych.

Związki azabenzimidazolowe, według wynalazku, przebadano pod względem ich zdolności do hamowania działania kinazy białkowej RAF. Testy biologiczne oraz wyniki tych badań hamowania zamieszczono poniżej. Sposoby, zastosowane do zmierzenia modulowania działania kinazy białkowej przez związki azabenzimidazolowe, były podobne, do ujawnionych w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 08/702232 Tanga i innych zatytułowanym „Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for Treatment of Disease” (Lyon & Lyon, nr rejestracyjny 221/187) z 23 czerwca 1996, w odniesieniu do wysokosprawności sposobów. Zgłoszenie 08/702232 jest przytoczone tutaj jako pozycja literaturowa w całości, włącznie z rysunkami.

II. Choroby docelowe dla leczenia związkami azabenzimidazolowymi

Sposoby, związki oraz środki farmaceutyczne opisane tutaj zaprojektowano tak, by hamowały zaburzenia proliferacyjne komórki przez modulację działania kinazy białkowej RAF. Zaburzenia proliferacyjne

PL 191 618 B1 wywołują niepożądaną proliferację komórki w jednym lub więcej podzbiorach komórek organizmu wielokomórkowego powodując szkodę dla organizmu. Sposoby, związki oraz środki farmaceutyczne tutaj opisane mogą być także użyteczne do leczenia oraz zapobiegania innym zaburzeniom w organizmach, takim jak zaburzenia związane z przedwczesną śmiercią komórek (tj. zaburzenia neurologiczne) oraz zapalenia. Zaburzenia te mogą wynikać z nieprawidłowego działania cząsteczek RAF lub nieprawidłowego działania cząsteczek kinazy białkowej pokrewnej RAF.

Zmiany działania kinazy białkowej RAF lub kinazy białkowej pokrewnej RAF mogą prowadzić do stanów wzmożonej lub obniżonej proliferacji widocznych w pewnych chorobach. Stany niewłaściwej proliferacji komórek obejmują raki, zaburzenia zwłóknienia, zaburzenia mezangialne, nienormalną angiogenezę i rozwój naczyń, gojenie się ran, łuszczyca, nawrót zwężenia naczynia oraz zapalenia.

Zaburzenia zwłóknienia dotyczą nienormalnego tworzenia komórkowej macierzy zewnątrzkomórkowej. Przykładem zaburzenia zwłóknienia jest marskość wątrobowa. Marskość wątrobowa charakteryzuje się zwiększonym stężeniem składników macierzy zewnątrzkomórkowej powodującym powstanie blizny wątrobowej. Marskość wątrobowa może spowodować powstanie takich chorób jak marskość wątroby.

Zaburzenia proliferacyjne komórek mezangialnych pojawiają się wskutek nienormalnej proliferacji komórek mezangialnych. Proliferacyjne zaburzenia mezangialne obejmują różne choroby nerek u ludzi, takie jak zapalenie kłębuszków nerkowych, cukrzycowa choroba nerek, złośliwa marskość nerki, zespoły zakrzepowej choroby włośniczek, odrzucenie przeszczepu oraz choroby kłębuszków nerkowych.

Korzystnymi rodzajami raków, które można leczyć związkami, według wynalazku, są rak płuca, rak jajnika, rak sutka, rak mózgu, wewnątrzosiowego rak mózgu, rak okrężnicy, rak gruczołu krokowego, mięsak, mięsak Kaposiego, czerniak oraz glejak. Dowody na to, że związki, według wynalazku, mogą skutecznie być użyte do powstrzymania lub odwrócenia proliferacji komórek rakowych zacytowano tutaj jako pozycje literaturowe.

Zaburzenia angiogenezy i rozwoju naczyń wywołują nadmierną proliferację naczyń krwionośnych. Proliferacja naczyń krwionośnych jest niezbędna w różnych normalnych procesach fizjologicznych, takich jak rozwój embrionalny, tworzenie ciałka żółtego, gojenie się ran oraz regeneracja organów. Jednakże proliferacja naczyń krwionośnych jest także podstawowym procesem w rozwoju guzów nowotworowych. Inne przykłady zaburzeń proliferacyjnych naczyń krwionośnych obejmują zapalenie stawów, gdzie nowe włosowate naczynia krwionośne dokonują inwazji na staw i niszczą chrząstkę. Ponadto, choroby proliferacyjne naczyń krwionośnych obejmują choroby oczu, takie jak retynopatia cukrzycowa, gdzie nowe włośniczki w siatkówce dokonują inwazji na ciało szkliste, wywołują krwawienia i ślepotę. Na odwrót, zaburzenia związane z kurczeniem się, skurczem lub zamknięciem naczyń krwionośnych, takie jak nawrót zwężenia, są także związane z nieprawidłową regulacją kinaz białkowych.

Ponadto tworzenie naczyń i angiogeneza są związane ze wzrostem złośliwych guzów litych oraz przerzutów. Szybko rosnący guz raka wymaga dostarczenia krwi bogatej w składniki odżywcze oraz tlen, aby mógł on kontynuować wzrost. W konsekwencji wspólnie z guzem rośnie nienormalnie duża liczba włosowatych naczyń krwionośnych zaopatrująca guz w składniki niezbędne do jego wzrostu. Nowe naczynia krwionośne umieszczone w guzie dodatkowo, oprócz dostarczania guzowi składników odżywczych, zapewniają drogę wyjścia dla komórek nowotworowych, które w ten sposób wchodzą do krążenia i tworzą przerzuty w odległych miejscach organizmu. Folkman, 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 4-6.

Nieprawidłowe działanie RAF może stymulować komórki do zaburzeń proliferacyjnych. Wykazano, że cząsteczki specyficznie zaprojektowane do modulowania działania kinazy białkowej RAF hamują proliferację komórek. Specyficznie, antysensowne cząsteczki kwasów nukleinowych, zaprojektowane tak, aby zarówno wiązały się do RNA matrycowego kodującego kinazę białkową RAF jak i blokowały translację tej matrycy, skutecznie odwróciły transformację komórek A549 in vitro. Monia i inni, 1996 Nature Medicine 2: 688, zacytowane tutaj jako pozycja literaturowa w całości łącznie ze wszystkimi tabelkami i rysunkami. A549 są to ludzkie komórki złośliwe.

Badania z antysensownym kwasem nukleinowym skierowanym do RAF dostarczają dowodów, że związki oparte na azabenzimidazolu, według wynalazku, modulujące działanie kinazy białkowej RAF mogą powstrzymać, a także prawdopodobnie odwrócić, proliferacje złośliwych komórek w organizmie. Związki, według wynalazku, można przebadać metodami in vitro przytoczonymi tutaj jako przykład. Ponadto, związki, według wynalazku, można przebadać pod względem ich działania na komórki nowotworowe in vivo metodami heteroprzeszczepów, także przytoczonymi tutaj jako przykład.

PL 191 618 B1

Istnieją przynajmniej dwa sposoby, na których drodze nieodpowiednia aktywność RAF może stymulować niepożądaną proliferację komórki konkretnego typu komórek: (1) bezpośrednia stymulacja wzrostu konkretnej komórki, lub (2) wzrost unaczynienia konkretnego regionu, takiego jak tkanka nowotworowa, który będzie służyć wzrostowi tej tkanki.

W pierwszym rzędzie należy zidentyfikować, czy zaburzenie proliferacji komórki jest napędzane przez RAF. Kiedy zidentyfikuje się takie zaburzenia, można zidentyfikować pacjenta cierpiącego na takie zaburzenie przy pomocy analizy objawów procedurami dobrze znanymi lekarzom lub weterynarzom. Pacjentów takich można leczyć w sposób tutaj opisany.

To czy zaburzenie proliferacji komórki jest napędzane przez RAF można oznaczyć w pierwszym rzędzie wyznaczając poziom aktywności RAF występującej w komórce lub w konkretnym miejscu ciała pacjenta. Na przykład, w przypadku komórek rakowych poziom jednej lub więcej aktywności RAF można porównać z rakami nienapędzanymi przez RAF oraz rakami napędzanymi przez RAF. Jeżeli komórki rakowe mają wyższy poziom aktywności RAF niż raki napędzane przez RAF, korzystnie równy lub większy niż raki napędzane przez RAF, są one kandydatami do leczenia przy pomocy opisanych sposobów oraz związków, według wynalazku, modulujących RAF.

W przypadku zaburzeń proliferacyjnych komórki wynikających z niepożądanej proliferacji komórek nienowotworowych poziom aktywności RAF porównuje się z poziomem występującym ogólnie w populacji (np. średnim poziomem występującym ogólnie w populacji ludzi lub zwierząt, z wyjątkiem ludzi lub zwierząt cierpiących na zaburzenia proliferacyjne komórek). Jeżeli niepożądana proliferacja komórki charakteryzuje się wyższym poziomem RAF niż występujący ogólnie w populacji, wtedy zaburzenie jest kandydatem do leczenia przy pomocy opisanych sposobów i związków według wynalazku modulujących RAF.

III. Środki farmaceutyczne i podawanie związków azabenzimidazolowych

Sposoby przygotowywania środków farmaceutycznych zawierających związki, sposoby oznaczania ilości związków podawanych pacjentowi oraz sposoby podawania związków organizmowi ujawniono w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 08/702232 Tanga i innych, zatytułowanym „Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease” (Lyon & Lyon, nr rejestracyjny 221/187) z 23 czerwca 1996, oraz międzynarodowej publikacji patentowej nr WO 96/22976 Buzzettiego i innych, zatytułowanej „Hydrosoluble 3-Arylidene-2-Oxindole Derivatives as Tyrosine Kinase Inhibitors” z 1 czerwca 1996, z których oba są zacytowane tutaj jako pozycje literaturowe w całości, łącznie z rysunkami. Fachowcy potrafią ocenić, że takie opisy dadzą się łatwo zastosować w wynalazku i mogą być do niego łatwo zaadoptowane.

Poniższe przykłady nie ograniczają zakresu wynalazku i jedynie przedstawiają różne jego aspekty i cechy. Przykłady opisują sposoby syntezy związków, według wynalazku, i sposoby pomiaru wpływu związku na działanie kinazy białkowej RAF.

Komórki stosowane w tych sposobach są dostępne w handlu. Wektory kwasów nukleinowych zakotwiczone przez komórki są również dostępne w handlu, a sekwencje genów dla różnych kinaz białkowych są łatwo dostępne z banków danych dotyczących sekwencji. W związku z tym specjalista może łatwo odtworzyć linie komórek w określony sposób, przez połączenie dostępnych w handlu komórek, dostępnych w handlu wektorów kwasów nukleinowych i genów kinaz białkowych, z użyciem technik łatwo dostępnych specjalistom.

P r zyk ł a d 1. Procedury w syntezie związków azabenzimidazolowych według wynalazku

Wynalazek zostanie poniżej zilustrowany następującymi przykładami nie ograniczającymi jego zakresu, w których, oile nie zaznaczono tego inaczej:

(i) odparowanie prowadzono w wyparce rotacyjnej pod próżnią;

(ii) czynności wykonywano w atmosferze gazu obojętnego, takiego jak azot;

(iii) wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) przeprowadzano na krzemionce Merck LiChrosorb RP-18 do analizy z odwróceniem faz, otrzymanej z E. Merck, Darmstadt, Niemcy;

(iv) wydajności podano jedynie przykładowo, tak że nie muszą to być wydajności maksymalne;

(v) temperatury topnienia nie zostały skorygowane; mierzono je w cyfrowym aparacie do pomiaru temperatury topnienia HWS Mainz SG 2000;

(vi) struktury wszystkich związków według wynalazku, o wzorach I, II i III, potwierdzono w oparciu o spektroskopię protonowego rezonansu magnetycznego z użyciem spektrofotometru Bruker AMX500-NMR, w oparciu o mikroanalizę elementarną oraz, w pewnych przypadkach, na podstawie spektroskopii masowej;

PL 191 618 B1 (vii) czystość oceniano metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na żelu krzemionkowym (Merck Silica Gel 60 F254) lub metodą HPLC; oraz (viii) związków pośrednich nie charakteryzowano dokładnie, a ich czystość oceniano metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na żelu krzemionkowym (Merck Silica Gel 60 F254) lub metodą HPLC.

Procedury syntezy

Związek A-90: 2-Metoksykarbonyloamino-(6-fenylomerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pirydyna

2-Amino-3-nitro-6-(fenylomerkapto)pirydynę otrzymano przez ogrzewanie 2-amino-6-chloro-3-nitropirydyny (84,0 g, 0,484 mola) i tiofenolanu sodu (Fluka) (72,0 g, 0,545 mola) w 2-propanolu (1500 ml) w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej zawiesinę rozcieńczono wodą (100 ml), substancję stałą odsączono próżniowo, przemyto wodą i 2-propanolem oraz wysuszono w 50°C pod próżnią otrzymując 109,1 g (95% wydajności) 2-amino-3-nitro-6-(fenylomerkapto)pirydyny, t.t. 148-152°C.

2,3-Diamino-6-(fenylomerkapto)pirydynę otrzymano przez uwodornienie 2-amino-3-nitro-6-(fenylomerkapto)pirydyny (107,1 g, 0,433 mola) pod ciśnieniem wodoru 5 atm w obecności 30 g niklu Raney'a w 1200 ml 2-propanolu w 70°C. Po 4 godzinach (pochłonięte 29,1 litra wodoru) mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 4°C z ciągłym mieszaniem. Wytrącony osad odsączono próżniowo, przemyto 2-propanolem i wysuszono w 50°C pod próżnią. Połączone przesączę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i rekrystalizowano w 2-propanolu. Po dwukrotnym przemyciu aparatu do uwodornienia 1000 ml THF, odparowaniu pod zmniejszonym ciśnieniem i rekrystalizacji z 2-propanolu, wytrącony osad odsączono i wysuszono w 50°C pod próżnią, otrzymując 80,4 g (87,1% wydajności) 2,3-diamino-6-(fenylomerkapto)pirydyny, t.t. 119-122°C.

2-Metoksykarbonyloamino-6-fenylomerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę otrzymano przez wkroplenie chloromrówczanu metylu (34 ml, 0,44 mola) do zimnego (5-15°C) roztworu siarczanu S-metyloizotiouroniowego (53 g, 0,19 mola) (Aldrich) w 68 ml wody z utrzymaniem temperatury poniżej 20°C. Następnie dodano ostrożnie wodnego roztworu wodorotlenku sodu (116 g, 25% NaOH) i wytrącił się biały osad. Po 20 minutach dodano wody (210 ml) i pH doprowadzono do 4,0 kwasem octowym (lodowatym, 34 ml). Do mieszaniny tej wkroplono roztwór 2,3-diamino-6-(fenylomerkapto)pirydyny (37,8 g, 0,174 mola) w 210 ml etanolu i mieszaninę ogrzewano w 85-90°C przez 2 godziny. Po ochłodzeniu mieszaniny reakcyjnej przez noc wytrącony osad odsączono, przemyto ciepłą wodą (1000 ml), wysuszono i poddano rekrystalizacji z kwasu octowego i etanolu w 4°C. Osad odsączono, przemyto metanolem i wysuszono w 50°C pod próżnią, otrzymując 30 g (57,4% wydajności) 2-metoksykarbonyloamino-6-fenylomerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pirydyny, t.t. 269-274°C (rozkład).

Związek A-3: 2-Metoksykarbonyloamino-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydyna

Przez zastosowanie fenolanu sodu zamiast tiofenolanu sodu w przykładzie A-90, w identyczny sposób otrzymano 2-metoksykarbonyloamino-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę, t.t. >280°C (rozkład).

Związek A-4: 2-Etoksykarbonyloamino-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydyna

Stosując chloromrówczan etylu zamiast chloromrówczanu metylu w przykładzie A-3, w identyczny sposób otrzymano 2-etoksykarbonyloamino-(6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-bjpirydynę, t.t. >280°C (rozkład).

Związek A-1: 2-Okso-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydyna

Poddając reakcji bezpośrednio 2,3-diamino-6-(fenylomerkapto)pirydynę z O-metyloizomocznikiem zamiast z siarczanem S-metyloizotiouroniowym i chloromrówczanem metylu w przykładzie A-3, w identyczny sposób otrzymano 2-okso-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę, t.t. 277-278°C.

Związek A-2: 2-Okso-6-fenylomerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pirydyna

Stosując tiofenolan sodu zamiast fenolami sodu w przykładzie A-1, w identyczny sposób otrzymano 2-okso-6-fenylomerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę, t.t. 253-254°C.

P r z y k ł a d 2: Test mierzący fosforylujące działanie RAF.

Niniejszy test pozwala wykryć poziom fosforylacji katalizowanej przez RAF docelowego białka MEK, a także fosforylacji MAPK przez MEK. Sekwencję genu RAF opisano w Bonner i inni, 1985, Molec. Cell. Biol 5: 1400-1407 i można ją łatwo uzyskać z banków danych sekwencji genów. Konstrukcję wektorowego kwasu nukleinowego oraz linii komórkowych użytych w tej części wynalazku w pełni opisał Morrison i inni., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8855-8859.

Materiały i odczynniki

1. Komórki Sf9 (Spodoptera frugiperda); GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

PL 191 618 B1

2. bufor RIPA: 20 mM Tris/HCl pH 7,4, 137 mM NaCl, 10% gliceryna, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aproteniny, 0,5% Triton X-100;

3. Białko fuzyjne Tioredoksyna-MEK (T-MEK): ekspresję i oczyszczanie T-MEK przy pomocy chromatografii powinowactwa przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta. Numer katalogowy K 350-01 i R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.

4. His-MAPK (ERK 2): MAPK ze znacznikiem His eksprymowano w komórkach XL1 Blue transformowanych wektorem pUC18 kodującym His-MAPK. His-MAPK oczyszczono przy pomocy chromatografii powinowactwa Ni. Nr katalogowy 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, w sposób tutaj opisany.

5. Surowica owcza przeciwko mysim IgG: Jackson laboratories, West Grove, PA.Nr katalogowy 515-006-008, Nr Lot 28563

6. Specyficzne przeciwciała przeciwko kinazie białkowej RAF-1: URP2653 z UBI.

7. Bufor do opłaszczania: PBS; sól buforowana fosforanem, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD

8. Bufor do przemywania: TBST -50 mM Tris/HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1%Triton X-100

9. Bufor blokujący: TBST, 0,1% etanolamina pH 7,4

10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO

11. Bufor do kinazy (KB): 20 mM Hepes/HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Tryton X-100, 1 mM

PMSF, 5 mg/l Aproteniny, 75 mM ortowanadan sodu, 0,5 MM DTT oraz 10mM MgCl2.

12. Mieszanina ATP: 100 mM MgCfe, 300 mM ATP, 10 mCiY-³³P ATP (Dupont-NEN)/ml.

13. Roztwór do zatrzymywania reakcji: 1% kwas fosforowy; Fisher, Pittsburgh, PA.

14. Maty Wallac Cellulose Phosphate Filter; Wallac, Turku, Finlandia.

15. Roztwór do przemywania filtrów: 1% kwas fosforowy, Fisher, Pittsburgh, PA.

16. Harvester Tomtec do płytek, Wallac, Turku, Finlandia.

17. Licznik Wallac beta do płytek Nr 1205, Wallac, Turku, Finlandia.

18. 96-studzienkowe płytki NUNC polipropylenowe o dnie V-kształtnym do związków Applied Scientific Nr katalogowy AS-72092.

Procedura

Wszystkie z następujących etapów przeprowadzono w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem przypadków, w których w tekście zaznaczono co innego.

1. Powlekanie płytek ELISA: Płytki ELISA powlekano 100 ml owczej surowicy przeciw-mysiej oczyszczonej przez powinowactwo (1 mg/100 ml buforu do powlekania)przez noc w 4°C. Płytki ELISA przechowywane w 4°C można używać przez dwa tygodnie.

2. Odwrócono płytki i usunięto płyn. Dodano 100 ml roztworu blokującego na 30minut.

3. Usunięto roztwór blokujący i czterokrotnie przemyto buforem do przemywania. Otrzepano płytkę na ręczniku papierowym celem usunięcia nadmiaru płynu.

4. Do każdej studzienki dodano 1 mg specyficznego przeciwciała przeciwko RAF-1 i inkubowano przez 1 godzinę. Przemyto w sposób opisany w punkcie 3.

5. Rozmrożono lizaty komórek Sf9 zakażonych RAS/RAF i rozcieńczono je TBSTdo 10 mg/100ml. Dodano 10 mg rozcieńczonego lizatu do studzienki i inkubowano przez 1 godzinę. Płytki wytrząsano podczas inkubacji. Do kontroli negatywnych nie dodano lizatów. Lizaty z owadzich komórek Sf9 zakażonych RAS/RAF przygotowano po zakażeniu komórek zrekombinowanymi bakulowirusami przy MOI 5 dla każdego z wirusów i zbierano 48 godzin później. Komórki przemyto jeden raz w PBS i zlizowano w buforze RIPA. Nierozpuszczalny materiał usunięto przez odwirowanie (5 minut przy 10000 x g). Równe części lizatów zamrożono w suchym lodzie/etanolu i przechowywano do czasuużycia w -80°C.

6. Usunięto niezwiązany materiał i przemyto w sposób opisany powyżej (punkt 3).

7. Dodano 2 mg T-MEK i 2 mg His-MAEPK na studzienkę i ustawiono objętość na 40 ml przy pomocy buforu do kinazy. Sposoby oczyszczania T-MEK i MAPK z ekstraktów komórkowych przytoczono tutaj jako przykłady.

8. Wstępnie rozcieńczono związki (roztwór bazowy 10 mg/ml DMSO) lub ekstrakty 20 razy wTBST plus 1% DMSO. Do studzienek z punktu 6 dodano 5 ml wstępnie rozcieńczonych związków/ekstraktów. Inkubowano przez 20 min. Do kontroli nie dodano leków.

9. Rozpoczęto reakcję kinazowania dodając 5 ml mieszaniny ATP. Podczas inkubacji płytki wytrząsano na wytrząsarce do płytek ELISA.

10. Zatrzymano reakcję kinazowania po 60 minutach dodając do każdej studzienki 30 ml roztworu do zatrzymywania reakcji.

11. Na płytkach ELISA umieszczono maty fosfocelulozowe w harwesterze Tomtecdo płytek. Zebrano materiał ze studzienek i przepłukano filtr roztworem do przemywania filtrów zgodnie z zaleceniami

PL 191 618 B1 producenta. Maty wysuszono. Oznakowano maty i umieszczono je w urządzeniu trzymającym. Umieszczono urządzenie trzymające w aparacie służącym do detekcji radioaktywności i oznaczono na filtrach fosfor radioaktywny.

W inny sposób, 40 ml próbki z każdej ze studzienek płytki testowej przeniesiono na odpowiednie pozycje filtrów fosfocelulozowych. Po wysuszeniu na powietrzu umieszczono filtry na tacy. Delikatnie kołysano tacą zmieniając bufor do przepłukiwania co 15 minut przez 1 godzinę. Wysuszono filtry na powietrzu. Oznakowano maty i umieszczono je w urządzeniu trzymającym odpowiednim do pomiarów fosforu radioaktywnego w próbkach. Umieszczono urządzenie trzymające w aparacie służącym do detekcji i oznaczono w próbkach fosfor radioaktywny na filtrach.

Zmierzono wartości lC50 według protokołu dla następujących związków opartych na azobenzimidazolu w teście ELISA dla RAF-1:

PL 191 618 B1

Wartość IC50 jest to stężenie inhibitora opartego na azobenzimidazolu wymaganego do obniżenia maksymalnej ilości docelowo fosforylowanych białek lub wzrostu komórki o 50%. Wartości IC50 zmierzone w teście fosforylacji RAF-1 przedstawiono w tabeli 1:

T ab el a 1

Związek	IC50 (pm)
A-1	79
A-2	> 100
A-3	6,1
A-4	6,7
A-90	0,95

P r zyk ł a d 3: Oczyszczanie MAPK i MEK

Białka MAPK i MEK łatwo jest wyeksprymować w komórkach przeprowadzając podklonowanie genu kodującego te białka do dostępnego w handlu wektora eksprymującego białka ze znacznikiem poli-histydynowym. Geny kodujące te białka łatwo uzyskać z laboratoriów normalnie pracujących z tymi białkami z komórek zawierających biblioteki cDNA. Biblioteki są łatwo dostępne w handlu i fachowiec bez problemu może zaprojektować sondy kwasu nukleinowego homologiczne do cząsteczek cDNA kodujących MEK lub MAPK z sekwencji nukleotydowych MEK i MAPK, dostępnych w bazach danych genetycznych takich jak Genbank. Klonowanie genu można przeprowadzić w krótkim okresie czasu przy pomocy technik obecnie dostępnych fachowcom.

Oczyszczanie białek MEK i MAPK z ekstraktów komórkowych przeprowadzono używając następującego protokołu, który jest zmienioną formą z Robbins i inni 1993, J. Biol. Chem. 268: 5097-5106:

1. Zlizowano komórki przez obróbkę ultradźwiękami, stres osmotyczny lub technikami French Press łatwo dostępnymi dla fachowców. Skład buforu do obróbki ultradźwiękami podano poniżej.

2. Równoważono stałe złoże sprzężone z niklem lub kobaltem przy pomocy buforu do równoważenia, którego skład podano poniżej. Znacznik polihistydynowy jest specyficznie wiązany przez atomy niklu lub kobaltu do stałego złoża. Równoważenie przeprowadzono trzykrotnie płucząc złoże objętością buforu do równoważenia równą dziesięciu objętością złoża. Stałe złoże jest łatwo dostępne dla fachowców.

3. Dodano lizat komórkowy do stałego złoża i równoważono w naczyniu przez pewien czas. Inaczej, stałym złożem można zapakować kolumnę do chromatografii białkowej i lizat można przepuścić przez kolumnę.

4. Przemyto stałe złoże buforem do przemywania, którego skład podano poniżej.

5. Wymyto białko MEK lub MAPK ze stałego złoża taką ilością buforu do wymywania (skład podany poniżej), która usunęła ze złoża stałego znaczną część białka.

Bufor do obróbki ultradźwiękami mM fosforan sodu pH 8,0

0,3 M chlorek sodu mM β-merkaptoetanol

1% NP40 mMNaF

0,5 mM Pefablock

Bufor do równoważenia mM fosforan sodu pH 8,0

0,3 M chlorek sodu mM β-merkaptoetanol

1%NP40 mMNaF

1mM Imidazol

Bufor do przemywania mM fosforan sodu pH 8,0

0,3 M chlorek sodu

PL 191 618 B1 mM β-merkaptoetanol

1% NP40 mMNaF

10mM Imidazol

Bufor do wymywania mM fosforan sodu pH 8,0

0,3 M chlorek sodu mM β-merkaptoetanol

1% NP40 mMNaF

10-500 mM Imidazol

P r z y k ł a d 4: Test mierzący działanie fosforylujące receptora EGF.

Aktywność kinazową receptora EGF (test EGFR-NIH3T3) w całych komórkach zmierzono w sposób opisany szczegółowo w publikacji PCT W09640116 z 5 czerwca 1996, Tanga i innych, zatytułowanej „Indolinone Compounds for the Treatment of Disease” zacytowanej tutaj w całości jako pozycja literaturowa, włącznie z rysunkami.

Wartości IC50 zmierzone w teście fosforylacji przez receptor EGF przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2

Związek	IC50 (μΜ)
A-1	> 100
A-2	> 100
A-3	> 100
A-4	> 100

P r z y k ł a d 5: Test mierzący działanie związków opartych na azobenzimidazolu na wzrost komórek eksprymujących Ras.

Poniższy test służy do zmierzenia stopnia wzrostu komórek NIH-3T3 eksprymujących RAS. Celem testu jest oznaczenie działania związków na wzrost komórek NIH 3T3 nadeksprymujących H-Ras.

Materiały

96-studzienkowe jałowe płytki o płaskim dnie

96-studzienkowe jałowe płytki o okrągłym dnie jałowy 25 ml lub 100 ml zbiornik pipety, pipety wielokanałowe jałowe końcówki do pipet jałowe 15 ml i 50 ml probówki

Odczynniki

0,4% SRB w 1% kwasie octowym mM zasadowy Tris

10% TCA

1% kwas octowy jałowy DMSO (Sigma) związek w DMSO (100 mM lub mniej stężony roztwór bazowy)

Trypsin-EDTA (GIBCO BRL)

Linia komórkowa:

3T3/H-Ras (komórki NIH 3T3 klon 7 eksprymujące genomowy fragment onkogenu H-Ras).

Komórki otrzymano w następujący sposób:

1. Podklonowano fragment genu kodujący Ras do dostępnego w handlu wektora stabilnie transfekującego komórki NIH-3T3. Fragment pochodził z genomowego allelu transformującego cHa-ras.

2. Stransfekowano komórki NIH-3T3 podklonowanym wektorem z użyciem fosforanu wapnia. Wyselekcjonowano komórki eksprymujące konstrukt Ras w 2% surowicy w DMEM. Widoczne ogniska obserwowano po dwóch tygodniach. Zebrano transformowane komórki i utworzono stabilnie stransformowaną linię komórkową.

PL 191 618 B1

Pożywka wzrostowa

2% surowica cielęca/DMEM + 2 mM glutamina, Pen/Strep

Protokół:

Dzień 0: Wysiewanie komórek:

Tą część testu przeprowadzono w komorze z przepływem laminarnym.

1. Trypsynizacja komórek. Przeniesiono 200 ml zawiesiny komórek do 10 ml izotonu. Policzono komórki Coulter Counter.

2. Rozcieńczono komórki w pożywce wzrostowej do 60000 komórek/ml. Przeniesiono po 100 ml komórek do każdej ze studzienek 96-studzienkowej płytki z płaskim dnem dodając po 6000 komórek/studzienkę.

3. Połowę płytki (4 rzędy) użyto dla każdego ze związków w czterech powtórzeniach dla każdego stężenia związku oraz zestawu 4 studzienek do kontroli z pożywką.

4. Delikatnie wytrząsano płytki aby pozwolić na równomierne przyczepienie się komórek.

5. Inkubowano płytki w inkubatorze w 37°C w 10% CO2.

Dzień 1: Dodanie związku:

Tą część testu przeprowadzono w komorze z przepływem laminarnym.

1. Do 96-studzienkowych płytek z okrągłym dnem do kolumn 1 do 11 dodano 120 ml pożywki wzrostowej zawierającej 2X końcowego % DMSO wyznaczonego z poszukiwania najwyższego stężenia związku. Na przykład, jeżeli najwyższe stężenie wynosiło 100ml roztworu przygotowanego z 100 mM roztworu bazowego, 1X DMSO wynosiło 0,1%, a więc 2X DMSO wynosiło 0,2%. Płytkę tę użyto do oznaczenia miana związku, 4 rzędy nazwiązek.

2. W jałowej 15 ml probówce przygotowano 2X roztwór najwyższego stężenia znalezionego dla związku w pożywce wzrostowej plus 2X DMSO. Potrzebny był 1 ml na linię komórkową. Stężenie początkowe związku zazwyczaj wynosiło 100 mM, ale mogło się ono różnić w zależności od rozpuszczalności związku.

3. Przeniesiono 240 ml 2X początkowego roztworu związku w czterech powtórzeniach do 12 kolumn 96-studzienkowych płytek o okrągłym dnie. Wykonano kolejne rozcieńczenia 1:2 wzdłuż płytki od prawej do lewej przenosząc 12 ml z kolumny 12 do kolumny 11, z kolumny 11 do 10 itd. aż do kolumny 2. Przeniesiono 100 ml rozcieńczonych związków i 100 ml pożywki do kolumny 1, na 100 ml pożywki w odpowiadających im studzienkach 96-studzienkowej płytki z płaskim dnem. Całkowita objętość na studzienkę powinna wynosić 200 ml.

4. Płytkę ponownie umieszczono w inkubatorze i inkubowano przez 3 dni.

Dzień 4: Wywołanie testu:

Ten etap testu przeprowadzono na stole.

1. Odessano lub odlano pożywkę. Dodano 200 ml zimnego 10% TCA do każdej ze studzienek, aby utrwalić komórki. Inkubowano płytki przez 60 minut w 4°C.

2. Odrzucono TCA i 5-krotnie przepłukano studzienki wodąz kranu. Wysuszonopłytki odwracając je do góry dnem na ręczniki papierowe.

3. Barwiono komórki 100 ml/studzienkę 0,4% SRB przez 10 minut.

4. Odlano SRB i przepłukano studzienki 5-krotnie kwasem octowym. Całkowicie wysuszono płytki odwracając je do góry dnem na ręczniki papierowe.

5. Rozpuszczano barwnik w 100 ml/studzienkę 10 mM zasady Tris przez 5-10 minut w wytrząsarce.

6. Odczytano płytki w Dynatech ELISA Plate REader przy 570 nm w odniesieniu do630 nm.

Wybrane związki hamujące stopień wzrostu komórek nadeksprymujących RAS przedstawiono w tabeli 3.

Tabel a 3

Związek	IC50 (μΜ) RAS/NIH3T3
A-3	40
A-4	20

PL 191 618 B1

P r z y k ł a d 6: Test mierzący działanie związków opartych na azobenzimidazolu na wzrost komórek A549.

Poniższy test służy do zmierzenia stopnia wzrostu komórek A549. Celem testu jest oznaczenie działania związków na wzrost komórek ludzkiego raka płuca A549. Komórki A549 można łatwo uzyskać ze źródeł komercyjnych, takich jak ATCC (CCL185).

Materiały

96-studzienkowe jałowe płytki o płaskim dnie

96-studzienkowe jałowe płytki o okrągłym dnie jałowy 25 ml lub 100 ml zbiornik pipety, pipety wielo-kanałowe jałowe końcówki do pipet jałowe 15 ml i 50 ml probówki Odczynniki

0,4% SRB w 1% kwasie octowym

10mM zasadowy Tris

10% TCA

1% kwas octowy jałowy DMSO (Sigma) związek w DMSO (100 mM lub mniej stężony roztwór bazowy)

Trypsin-EDTA (GIBCO BRL)

Linia komórkowa i pożywka wzrostowa komórki ludzkiego raka płuca A549 (ATTC CCL185)

10% surowica cielęca w Ham F12-K Protokół:

Dzień 0: Wysiewanie komórek:

Tą część testu przeprowadzono w komorze z przepływem laminarnym.

1. Trypsynizacja komórek. Przeniesiono 200 μl zawiesiny komórek do 10 ml izotonu. Policzono komórki Coulter Counter.

2. Rozcieńczono komórki w pożywce wzrostowej do 20000 komórek/ml. Przeniesiono po 100 μl komórek do każdej ze studzienek 96-studzienkowej płytki z płaskim dnem dodając po 2000 komórek/studzienkę.

3. Połowę płytki (4 rzędy) użyto dla każdego ze związków w czterech powtórzeniach dla każdego stężenia związku oraz zestawu 4 studzienek do kontroli z pożywką.

4. Delikatnie wytrząsano płytki, aby pozwolić na równomierne przyczepienie siękomórek.

5. Inkubowano płytki w inkubatorze w 37°C w 10%CO2.

Dzień 1: Dodanie związku:

Tą część testu przeprowadzono w komorze z przepływem laminarnym.

1. Do 96-studzienkowych płytek z okrągłym dnem do kolumn 1 do 11 dodano 120 μl pożywki wzrostowej zawierającej 2X końcowego % DMSO wyznaczonego z poszukiwania najwyższego stężenia związku. Na przykład, jeżeli najwyższe stężenie wynosiło 100 μΜ roztworu przygotowanego ze 100 mM roztworu bazowego, 1X DMSO wynosiło 0,1%, a więc 2X DMSO wynosiło 0,2%. Płytkę tę użyto do oznaczenia miana związku, 4 rzędy na związek.

2. W jałowej 15 ml probówce przygotowano 2X roztwór najwyższego stężenia znalezionego dla związku w pożywce wzrostowej plus 2X DMSO. Potrzebny był 1 ml na linię komórkową. Stężenie początkowe związku zazwyczaj wynosiło 100 μΜ, ale mogło się ono różnić w zależności od rozpuszczalności związku.

3. Przeniesiono 240 μl 2X początkowego roztworu związku w czterech powtórzeniach do 12 kolumn 96-studzienkowych płytek o okrągłym dnie. Wykonano kolejne rozcieńczenia 1:2 wzdłuż płytki od prawej do lewej przenosząc 120 μl z kolumny 12 do kolumny 11, z kolumny 11 do 10 itd. aż do kolumny 2. Przeniesiono 100 μl rozcieńczonych związków i 100 μl pożywki do kolumny 1, na 100 μl pożywki w odpowiadających im studzienkach 96-studzienkowej płytki z płaskim dnem. Całkowita objętość na studzienkę powinna wynosić 200 pi.

4. Płytkę ponownie umieszczono w inkubatorze i inkubowano przez 3 dni.

Dzień 5: Wywołanie testu:

Ten etap testu przeprowadzono na stole.

PL 191 618 B1

1. Odessano lub odlano pożywkę. Dodano 200 pl zimnego 10% TCA do każdej ze studzienek, aby utrwalić komórki. Inkubowano płytki przez co najmniej 60 minut w 4°C.

2. Odrzucono TCA i 5-krotnie przepłukano studzienki wodą z kranu. Wysuszono płytki odwracając je do góry dnem na ręczniki papierowe.

3. Barwiono komórki 100 pl/studzienkę 0,4% SRB przez 10 minut.

4. Odlano SRB i przepłukano studzienki 5-krotnie kwasem octowym. Całkowicie wysuszono płytki odwracając je do góry dnem na ręczniki papierowe.

5. Rozpuszczano barwnik w 100 pl/studzienkę 10 mM zasady Tris przez 5-10 minut w wytrząsarce.

6. Odczytano płytki w Dynatech ELISA Plate REader przy 570 nm w odniesieniu do 630 nm. Wybrane związki hamujące stopień wzrostu komórek nadeksprymujących A549 przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4

Związek	IC50(pM)A549
A-3	22 65 (2% FBS)
A-4	6 5,7 (2% FBS)

P r z y k ł a d 7: Sposób wyznaczania aktywności biologicznej modulatorów Raf in vivo

W celu monitorowania hamującego działania związków, według wynalazku, na komórki nowotworowe jajników, czerniaka, prostaty, płuc oraz sutka można zastosować heteroprzeszczepy. Protokół testu opisano szczegółowo w publikacji PCT W09640116, z czerwca 5 1996 Tanga i innych, zatytułowanej „Indolinone Compounds for the Treatment of Disease”, cytowanej tutaj jako pozycja literaturowa w całości, łącznie z rysunkami.

Przykładowo opisany wynalazek można zrealizować bez jakiegokolwiek elementu lub elementów, ograniczenia lub ograniczeń, które nie zostały konkretnie ujawnione. Zastosowane określenia i wyrażenia użyto jako określenia w opisie, a nie jako ograniczenia i nie jest zamiarem poprzez użycie takich terminów i określeń wykluczenie jakichkolwiek równoważników przedstawionych i opisanych cech lub ich części, gdyż należy zdawać sobie sprawę, że możliwe są różne modyfikacje w ramach zakresu zastrzeżonego wynalazku. I tak należy zdawać sobie sprawę, że jakkolwiek wynalazek został konkretnie ujawniony poprzez korzystne rozwiązania i dodatkowe cechy, modyfikacje i warianty ujawnionych koncepcji mogą stać się oczywiste dla specjalistów, oraz że takie modyfikacje i warianty uważa się za objęte zakresem wynalazku zdefiniowanym w załączonych zastrzeżeniach.

Specjalista łatwo stwierdzi, że wynalazek jest dobrze przystosowany do realizacji celów i osiągnięcia efektów i zalet wspomnianych oraz tkwiącym w nim z natury. Kompleksy cząsteczkowe i sposoby, procedury, sposoby obróbki, cząsteczki i konkretne opisane związki, obecnie reprezentatywne dla korzystnych rozwiązań, są jedynie przykładowe i nie należy ich uznawać za ograniczenia zakresu wynalazku. Specjaliści ustalą zmiany i inne zastosowania objęte istotą wynalazku, zdefiniowaną w zakresie zastrzeżeń.

Dla specjalistów zrozumiałe jest, że do ujawnionego wynalazku wprowadzić można różne zamienniki i modyfikacje bez wychodzenia poza zakres i istotę wynalazku.

Wszystkie opisy patentowe i publikacje wspomniane w opisie stanowią wskaźnik poziomu specjalistów, których wynalazek dotyczy. Wszystkie opisy patentowe i publikacje wprowadza się jako źródła literaturowe w stopniu, w jakim każda poszczególna publikacja została konkretnie i indywidualnie wskazana jako źródło.

Przykładowo opisany wynalazek można zrealizować bez jakiegokolwiek elementu lub elementów, ograniczenia lub ograniczeń, które nie zostały konkretnie ujawnione. Tak np. w każdym przypadku każde z określeń „zawierający”, „obejmujący zasadniczo” i „obejmujący” może być zastąpione którymkolwiek z dwóch pozostałych. Zastosowane określenia i wyrażenia użyto jako określenia w opisie, a nie jako ograniczenia i nie jest zamiarem poprzez użycie takich terminów i określeń wykluczenie jakichkolwiek równoważników przedstawionych i opisanych cech lub ich części, gdyż należy zdawać sobie sprawę, że możliwe są różne modyfikacje w ramach zakresu zastrzeżonego wynalazku. I tak należy zdawać sobie sprawę, że jakkolwiek wynalazek został konkretnie ujawniony poprzez korzystne

PL 191 618 B1 rozwiązania i dodatkowe cechy, modyfikacje i warianty ujawnionych koncepcji mogą stać się oczywiste dla specjalistów, oraz że takie modyfikacje i warianty uważa się za objęte zakresem wynalazku zdefiniowanym w załączonych zastrzeżeniach.

Te odnośniki, które nie zostały uprzednio wprowadzone jako źródła, obejmujące zarówno publikacje patentowe, jak i nie patentowe, wprowadza się niniejszym jako źródła. Inne rozwiązania są ujęte w poniższych zastrzeżeniach.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1 . Związek azabenzimidazolowy, wybrany z grupy obejmującej

   a) 2-okso-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę;

   b) 2-okso-6-fenylomerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę;

   c) 2-etoksykarbonyloamino-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę;

   d) 2-etoksykarbonyloamino-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę;

   e) 2-metoksykarbonyloamino-6-fenylomerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pirydynę.
2. 2. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera związek azabenzimidazolowy, określony w zastrz. 1, i fizjologicznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.
3. 3. Sposób wytwarzania związku azabenzimidazolowego, określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że 2-amino-6-chloro-3-nitropirydyna reaguje się z drugim reagentem, wybranym spośród fenolanu sodu lub tiofenolanu sodu, w rozpuszczalniku, z wytworzeniem pierwszego produktu pośredniego, następnie pierwszy produkt pośredni redukuje się w obecności katalizatora i środka redukującego, z wytworzeniem drugiego produktu pośredniego, po czym drugi produkt pośredni reaguje z trzecim reagentem, wybranym z grupy obejmującej O-metyloizomocznik oraz produkt reakcji siarczanu S-metyloizotiouroniowego z chloromrówczanem alkilu, poczym otrzymany związek, określony w zastrz. 1, oczyszcza się.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik stosuje się n-propanol.
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się wodór.
6. 6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako katalizator stosuje się nikiel Raney'a.
7. 7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że alkil stanowi metyl lub etyl.
8. 8. Zastosowanie związku azabenzimidazolowego, określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leków do leczenia stanów związanych z modulacją funkcji serynowo/treoninowej kinazy białkowej.
9. 9. Zastosowanie związku azabenzimidazolowego, określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leków doleczenia raka, zaburzeń zwłóknieniowychoraz innych zaburzeń proliferacyjnych.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do leczenia raka należącego do grupy obejmującej raka płuc, raka jajników, raka sutka, raka mózgu, wewnątrzosiowego raka mózgu, raka okrężnicy, raka gruczołu krokowego, mięsaka, mięsaka Kaposiego, czerniaka i glejaka.
11. 11. Zastosowanie związku azabenzimidazolowego, określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leków do leczenia stanów związanych z zaburzeniami na drodze przekazywania sygnału, określonej jako droga RAF/MEK, charakteryzujących się występowaniem oddziaływania serynowo-treoninowej kinazy białkowej RAF z naturalnie wiązaną do niej cząsteczką.