TW581815B

TW581815B - Methods of modulating serine/threonine protein kinase function with azabenzimidazole-based compounds

Info

Publication number: TW581815B
Application number: TW087115979A
Authority: TW
Inventors: Gerald Mcmahon; Harald App; Heinz Weinberger; Bernhard Kutscher
Original assignee: Zentaris Gmbh
Priority date: 1997-09-26
Filing date: 1998-09-25
Publication date: 2004-04-01
Also published as: EP1017384B1; SK4152000A3; ZA988797B; KR20010015623A; US6093728A; EP1017384A1; IL135109A; NZ503432A; IL158649A0; TR200001546T2; UA72448C2; PT1017384E; ATE281834T1; WO1999016438A1; CN1278172A; HUP0004024A3; PL339744A1; AU9578198A; CA2305370A1; HK1032206A1

Description

581815 A7 B7 五、發明説明（發明背t * 本發明背景之以下描述經提供以幫承認爲本發明之先前技藝。瞭知本發明細胞訊息轉導爲基礎機構，藉此外仏〜破调即多種細晌過程經轉播至細胞之内部。訊自韓道夕 ' 丨洮心锷等 < —個關鍵生化機構涉及蛋白質可送磷酸化，其由改變並 ^ 、 /、W队又/、、、，。構和功能而能調節成熟蛋白質之活性。但不請先閱方, 部屮 r'j ίί 在眞核生物中最佳特性化之蛋白質激酶在絲胺酸、蘇胺酸和路胺酸殘基之醇部分磷酸化蛋白質。此些激酶大略屬於2群，該等對磷酸化絲胺酸和蘇胺酸特異者，及該等對磷酸化酪胺酸特異者。一些激酶，稱爲”二元特異性”激酶，能在酪胺酸以及絲胺酸/蘇胺酸殘基上磷酸化。蛋白質激酶亦可由其在細胞内之位置所特性化。一些激酶爲外在結合配位體至細胞膜之穿透膜多體蛋白質。結合配位體改變受體蛋白質激酶之催化活性。其他的爲缺少穿透膜功能部位之非受體蛋白質。#受體蛋白質激酶可見於細胞膜至核之内表面上多種細胞間室。許多激酶係涉及調節連鎖反應，其中其受質可包括其他激酶，其反應係由其磷酸化狀態所調節。最終地’下游文動器之活性係由自如此途徑之活化生成磷酸化所調節。絲胺酸/蘇胺酸激酶族包括以下成員’調節訊息連鎖反應之許多步驟，包括控制細胞生長、過移、分化、签因各見、肌肉收縮、葡萄糖代謝、細胞蛋白質合成及調節細胞"目環之連鎖反應。 -4 - 中困國家標皁（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐注孤

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B7 B7 五、發明説明（2 請先閱讀背冬 Ϊ 事在絲胺故和蘇胺酸殘基上磷酸化查白質標的之非受體蛋白質激酶之實例爲RAF。RAF調節其他蛋白質激酶之催化活性’如能磷酸化之蛋白質激酶，及因而活化絲裂素活化之蛋白質激酶（MAPK)。RAF本身係由膜錨泊之蛋白皙 RAS所活化，其依序係對配位體活化之酪胺酸受體蛋白質激酶反應而活化，如表皮生長因子受體（EGFR)和血小板衍生之生長因子受體（PDGFR)。RAF在控制細胞事件之生物里要性係以下發現所背書，即改變形式之RAF可在生物體中導致癌症。RAF在惡性重要性之註據係提供於Monia等 ’ 1996，自然醫學2 : 668，在此以其全體包括所有圖表併入供參考。在發明癌症和其他疾病之新穎治療之努力中，生醫研究者和化學家已設計、合成及測試抑制蛋白質激酶功能之分子。一些小的有機分子形成一類調節蛋白質激酶功能之化合物。經報導抑制蛋白質激酶功能之分子實例爲雙單環、雙環或雜環芳基化合物（PCT WO 92/20642)、伸乙烯基吖巧哚衍生物（PCT WO 94/14808)、1-環丙基-4-吡啶基喹啉酮（美國專利號5,330,992)、苯乙烯基化合物（美國專利號 5,2 17,999)、苯乙烯基取代之吡啶基化合物（美國專利號 5,3〇2,606)、某些峻唑淋衍生物（洲專利中請案號〇 566 266 A 1)、硒口?丨哚類和硒化物（pct WO 94/03427)、三環多羥基化合物（PCT WO 92/2 1660)及芊基膦酸化合物（PCT WO 91/15495) 〇可橫過細胞膜和對酸水解具抗性之化合物爲潛有利之治 -5- 本纸张尺度述川中围國家標苹（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 581815 A7 五、發明説明（3 B7 部次 il $ »* 1) J >/; f η 因爲在Π服施用至病人後，其可變成高度生物有效的。然而，首1夕 Ψ ,Μ 〜夕1 ^蛋白質激酶抑制劑僅薄弱地抑制蛋白貝激酶之功能。士卜从 _ ^ 、外’ ”夕抑制多種蛋白質激酶及因此將在作爲疾病治療劑時導致多重副作用。 I明簡要本發明係部分；關、7 β ^ ’關以虱苯幵咏唑基質化合物調節絲胺酸 /:胺鉍蛋白質激酶功能之方法。該等方法併入表現絲胺酸酸忠白貝激酶如RAF之細胞。此外，本發明描述在生 :、本發明鑑定〈化合物預防和治療絲胺酸/蘇胺酸虫白“之_有關〈異常症狀之方法。再者，本發明係有關包括由本發明之方法鑑定之化合物醫藥組合物。 L 酸蛋白質激酶功能之化厶物> + 本發明万法提供調節受體和胞質液絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激2兩者功能之方法。此些方法提供在試管中和體内兩者凋印酵素 < 方法。爲試管中施用，本發明之方法部份有關，足凋節絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物之方法。因此，在第一個要素中，本發明特徵在以氮笨弁咪唑基質义化合物調節絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之方法。氮苯幷咪唑化合物視情況以有機基團取代。該方法包栝以該化合物接觸表現絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶之細胞。 ’’功能”—詞指絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶之細胞角色。絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶族包括以下成員，其在訊息連鎖反 -6 本纸张尺度这丨丨】中囤Μ家標卑（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之毛意事項 1·—-- Ϊν·^ιρ4 頁) 訂 ^81815 A7 B7 五、發明説明（4 應中調節許多步驟，包括控制細胞生長、過移、分化、臬因表現、肌肉收縮、葡萄糖代謝、細胞蛋白質合成及調節細胞循環之連鎖反應。 :周印Θ指化合物改變蛋白質激酶功能之能力。調節物較佳地戌化蛋白質激酶之催化活性，更佳地活化或抑制，白質激，之催化活性’根據曝露至蛋白質激酶之化合物辰度，或瑕佳地抑制蛋白質激酶之催化活性。化☆活性一詞，在本發明之文中，定義著蛋白質激酶 %故化文質足速率。催化活性可經測定，例如由測定受質在時間〜函I卜轉化成產物之量。f質之_酸化發生在蛋白質激酶之活性部位上。活性部位通常爲凹處，其中受質與蛋白質激酶結合及經磷酸化。又/ 闲，如在此所用，指由絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶罐酸化之分子。受質較佳地爲肽及更佳地蛋㈣。有關於蛋白質激酶RAF，較佳之受質爲MEK及MEK受質MAPK。活化一闲指增加蛋白質激酶之細胞功能。蛋白質激酶功能杈佳地馬與天然結合搭檔之交互作用及佳地催化活性。抑制凋詣降低蛋白質激酶之細胞功能。蛋白質激醃功能較佳地爲與天然結合搭檔之交互作用及最佳地催化活性。 •’調整i 一詞亦指改變蛋白質激酶之功能，由增加或降低在蛋白質激酶和天然結合搭檔間形成複合物之可能性。調整物較佳地增加如此在蛋白質激酶和天然結合搭標間形成複合物之可能性，更佳地增加或降低在蛋白f激酶和天然 -7 - 581815 * 1* }ί\ 部中 κ B7五、發明説明（5 ) 結合搭檔間形成複合物之可能性，辕據曝露至蛋白質激酶之化合物濃度，及最佳地降低在蛋白質激酶和天然結搭檔間形成複合物之可能性。 ’’複合物”一詞指相互結合之至少2個分子之組合。訊息傳導複合物時常含至少2個相互結合之蛋白質分子。例如，蛋白質酪胺酸受體蛋白質激酶GRB2、SOS、RAF和 RAS組合以對絲裂素配位體反應形成訊息傳導複合物。 ”天然結合搭檔’’ 一詞指在細胞中結合蛋白質激酶之多肽。天然結合搭檔可在蛋白質激酶訊息傳導過程中扮演傳播訊息之角色。在蛋白質激酶和天然結合搭檔間交互作用之變化可本身明示爲形成交互作用之增加或降低可能性，或蛋白質激酶/天然結合搭檔複合物之增加或降低濃度。蛋白質激酶天然結合搭檔可以高親和力與蛋白質激酶細胞内區域結合。高親和力代表平衡結合常數在1 (T6莫耳濃度或更少之等級内。此外，天然結合搭樓亦可短暫地與蛋白質激酶内區域交互作用及將其化學修飾。蛋白質激酶天然結合搭檔係選自一群包括，但不限於SRC同質性2 (SH2) 或3 (SH3)功能部位、其他磷酸基酪胺酸結合（PT B)功能部位、鳥嗓呤核替酸交換因子、蛋白質鱗酸酶及其他蛋白質激酶。測定在蛋白質激酶和其天然結合搭檔間交互作用變化之方法在技藝中係易得的。 ”絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶” 一詞指具至少10%胺基酸與其他si素相同之胺基酸序列之酵素，其在絲胺酸和蘇胺酸殘基上磷酸化蛋白質。絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶催化添加 -8- 請先閱讀背 δ 之注，

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本紙张尺度適;丨]屮國园家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 581815

、發明説明（6 舛=根在蛋白質（絲胺和蘇胺酸殘墓上。絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶可存在爲膜結合蛋白質或胞質液蛋白質。人j接觸"一詞如在此所用指混合包括本發明氮苯并咪唑化合物 < 溶液與浴洗本方法細胞之液體媒液。包括化合物之各欣耶可包括另一種成份，如二甲基亞砜（DMS〇)，其促進氮苯幷咪唑化合物或化合物類攝入本方法之細胞中。包括氮苯幷咪唑化合物之溶液可由利用傳送裝置如吸管基質設備或’主射筒基質設備加入浴洗細胞之媒液。、氮冬幷噑唑基質之化合物之，，一詞指以化學取代基取代 <氮苯幷咪唑有機化合物。氮苯幷咪唑化合物爲下式者：

(請先閱讀背面之注意事項I H—

、1Τ Κ·:';/Γ.·部屮，欠打5消氕合Μ杉卬欠取氏词，參閲本發明，指以任何數目化學取代基衍生化之氮苯幷咪岭化合物。在較佳t具體實施例中，本發明係有關調整絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之方法，其中蛋白質激酶爲謹。 RAF虫白只破g每磷酸化蛋白質標的在絲胺酸或蘇胺酸殘基ji 種如此之蛋白質標的爲蛋白質激酶（MEK)，其鱗酸化和其後活化絲裂素活化之蛋白質激酶(ΜΑρκ)。raf 本身由膜結合鳥臂吟三鱗酸水解酵素RAS對絲裂素剌激受體蛋白質s㈣酸激，如表皮生長因子受體（egfr)和血小板衍生生長因子受體（PDGFR)反應而活化。 -9- 210X 297 公釐） 581815 A7 B7 五、發明説明（7 本發明方法可偵測在細胞中調整kAF蛋白質激酶功能之化合物。RAF磷酸化蛋白質激酶（MEK)，其依序磷酸化絲裂素活化之蛋白質激酶（MAPK)。僅由RAF監視MEK磷酸化之分析法並不靈敏，因爲MEK之磷酸化量不顯著。爲克服此靈敏性困境，MEK和ΜAPK兩者之磷酸化係採用於本發明之分析法。ΜΑΡΚ磷酸化訊息放大ΜΕΚ磷酸化訊息及允許RAF依賴之磷酸化在分析法中經跟隨，如酵素連結免疫吸附法。此外，本發明之分析法以高貫穿形態進行，使許多化合物可在短時間内快速經監測。在另一個要素中，本發明描述鏗定調整絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物之方法，包括以化合物接觸表現絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶之細胞及在細胞上監測效果之步 ”監測”一詞指觀察添加化合物至本方法細胞之效果。效果可顯示於細胞表現型、細胞增殖、蛋白質激酶催化活性之變化，或於蛋白質激酶和天然結合搭檔間之交互作用。 ”效果”描述在細胞表現型或細胞增殖之變化或無變化。•’ 效果”亦可述蛋白質激酶催化活性之變化或無變化。”效果” 亦可描述在蛋白質激酶和天然結合搭檔間交互作用之變化或無變化。本發明之較佳具體實施例係有關鑑定調整絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物之方法，其中效果爲細胞表現型之變化或無變化。 ”細胞表現型’’ 一詞指細胞或組織之表面外觀或細胞或组本紙張尺度適州中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 581815 A7 B7 五、發明説明（8 ) 織之功能。細胞表現型之實例爲細胞大小（縮小或放大）、細胞增殖（增加或降低細胞數目）、細胞分化（細胞形狀變化或典.¾:化）、細胞殘存、死亡（細胞死亡）或代謝營養物之利用（例如葡萄糖攝取）。細胞表現型之變化或無變化係易由技藝中熟知之技術測定。在另一個較佳具體實施例中，本發明係有關鑑定調整絲胺鉍/蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物之方法，其中效果爲細胞增殖之變化或無變化。 ' ”細胞增殖”一詞指一群細胞分裂之速率。在容器中生長之細胞數目可由熟諳此技藝者定量，當該員在界定之體積中使用平常之光學顯微鏡目視計算細胞數目。可替代地，細胞增殖率可由實驗室裝置定量，其光學地或傳導地在適當之媒液中測定細胞密度。在另丨固罕乂佳具體實施例中，本發明係有關鑑定調整絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物之方法，其中效果爲在絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶和天然結合搭檔間交互作用之變化或無變化。人互作用一词，在本發明之文中，描述在蛋白質激酶細胞内區域和天然結合搭檔或化合物間形之複合物。，，交互作用”一詞亦可延伸至在本發明化合物和在研究中蛋白暂 ^酶之細胞内區域與細胞外區域間形成之複合物。雖然胞 ’、液白’、忒6每將不具細胞外區$，但受體蛋白質激酶將錨泊細胞外和細胞内之兩區域。 ’’細胞内區域詞，如在此所用，指在細胞内部存在之 (請先閱讀背面之注意事項再頁}

--ϊ 1— I I - · -11 581815 A7 B7 五、發明説明（9 部屮 •火 $ Λ >/'] 於竹蛋白質激酶部分。”細胞外區域”一詞如在此所用，指在細胞外面存在之蛋白質激酶邵分。在較佳之具體實施例中，本發明係有關鑑定調整絲胺酸/ 蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物之方法，其進一步包括以下步驟：（a)解離細胞提供包括絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶之解離物；（b)吸附絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶至抗體上；培養吸附之絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶與受質或受質類：及 (d)吸附受質或受質類至固體撐體或抗體上。監測在細胞上效果之步驟包括測定受質或受質類之磷酸濃度。 π解離” 一詞，如在此所用，指裂解細胞完整性之方法，使其内部内容物經釋出。細胞解離係由熟諳此技藝所知之 ά午多技藝元成。該方法較佳地由超晋波震堡或細胞剪刀技術及更佳地由清潔劑技術完成。 π抗體"一詞，如在此所用，指特異結合蛋白質激酶之蛋白質分子。抗體較佳地結合至一群蛋白質激酶及更佳地特異結合至RAF蛋白質激酶。 ”特異結合”一詞，如在此所用，指較其他蛋白質激酶或細胞蛋白質，以更高親和力結合蛋白質激酶之抗體。特異結合至蛋白質激酶之抗體將較其他任何蛋白質激酶或細胞蛋白質結合使高濃度之特定蛋白質激酶。 ”吸附”一詞，如在此所用，指分子結合至抗體或固體撐體之表面上。固體撐體之實例爲化學修飾之纖維素，如磷酸基纖維素及耐龍。抗體可鍵連至固體撐體，使用熟諳此技勢者沾知之技術。見例如Harl〇和Lane，抗體實驗室手

_ 12 - 尺度速/丨]中囤國家標孪297公iT 面之注，意

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W 581815 A7 B7 五、發明説明（10) 中

A I，1989，冷泉港實驗室。 ”測定磷酸濃度’’ 一詞，如在此所用，指熟諳此技藝者常知之技術。此些技術可涉及在受質内定量磷酸度或在受質内測定相對量之磷酸。此些技術可包括吸附受質至膜上及在受質内由射性測定偵測磷酸之量。在另一個較佳具體實施例中，本發明係有關鑑定調整絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物之方法及進一步包括以下步驟：（a)解離細胞提供包括RAF之解離物；（b)吸附RAF至抗體；（c)培養吸附之RAF與MEK和MAPK ;及 (d)吸附MEK和MAPK至固體撐體或抗體或抗體類。測定在細胞上效果之步驟包括監測該MEK和MAPK 之鱗酸濃度。在較佳之具體實施例中，本發明係有關鑑定調整絲胺酸/ 蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物之方法，其中氮苯幷咪吐基質之化合物具如在此界定，在式I、II、III中説明之:结構或在此説明之其任何次群。 ”化合物”一詞指化合物或其在醫藥上可接受之鹽、酯、醢:胺、原藥、異構物或代謝物。 ”在醫藥上可接受之鹽”一詞指不廢止化合物生物活性和性質之化合物調配物。醫藥鹽可由本發明之化合物與無機或有機酸反應獲得，如鹽酸、氫溪酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲績酸、乙橫酸、對甲苯橫酸、柳酸及其類似物。 ”原藥’’ 一詞指在體内經轉化成母藥之劑。原藥在一些情況下可較母藥更易施用3例如，原藥由口服施用可爲生物 -13- 本纸张尺度述州中國國家標隼（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項# 1 頁)

、1T 五、發明説明（11 A7 B7

有政的’但母樂並不是，或原藥可政進溶解度以允許靜脈施用。在另一個較佳具體實施例中，本發明係有關鑑定調整絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物之方法，其中氮苯幷咪唑基質之化合物具在式ί、π或m中説明之結構，其中氮苯幷味峻化合物係選自一群包括SABW合物。 SABI化口 #闲指一群氮笨弁咪唑基質之化合物，具在式…中説明之結構，及在以下表中编號A_w: (請先閱讀背面之毛意事項 Η; 、1Τ

•r, 部中而消合 η 卬化合物 I； — ------一 Z3 Χι R.4 Α-1 表基 --^~__ 0 - - Α-2 冬基 S - - Α-3 苯基 Γ ι·ιιΐί^- 0 甲基 0 Α-4 尽基 0 乙基 0 Α-5 2 -硝基苯基〇 - - Α-6 3-硝基苯基〇 - - Α-7 4-硝基苯基 0 - - Α-8 2 -鼠私基〇 - 1 一 1

V -14 581815 A7 7 Β 五、發明説明（32 ) 化合物 Κι Χι R.4 Zs A-9 3-氯苯基 0 - - A-10 4-氯苯基〇 - - A-1 1 2 -甲基苯基〇 - - A-12 3-甲基苯基〇 - - A-13 4-曱基苯基 0 - - A-14 2-氟苯基 0 - - A-15 3 -氟苯基 0 - - A-1 ό 4-氟苯基 0 1 - - Α-17 1 2-(二氟曱基）苯基 [ 0 - - Α-18 3-(二氣甲基）苯基 0 - - Α-19 4-(三氟甲基）苯基 0 - - Α-20 2 -甲氧基苯基〇 - - Α-2 1 3 -曱氧基表基〇 - - Α-22 4-甲氧基苯基〇 - - Α-23 2-羧基苯基 0 - - Α-24 3-羧基苯基〇 - - Α-25 4-羧基苯基〇 - - A - 2 6 | 2 -硝某i基 _1_一，一_L S - - A-27 j _石肖基私基 S - - I I I I II - I I m --j - I . - ml - - 1..... (請先閱讀背面之注意事項再頁)

-15- 本纸張尺度述;丨]中K國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公t ) 581815 A7 B7 五、發明説明（13) 化合物 Κι ~ Χι Ka Z3 Α-28 4 -硝基豕基 S - - Α-29 2 -氯苯基 S - - Α-30 3-氯苯基 S - - Α-3 1 4-氯苯基 S - - Α-32 2-曱基苯基 S - - Α-33 3 -曱基苯基 · S - - Α-34 4-曱基苯基 S - - Α-35 2-氟*苯基 S - - Α - 36 3 -氟各基 S - - A-37 4 -氣表基 S - - A-38 2-(三氟甲基）苯基 S - - A-39 3-(二氣曱基）苯基 S - A-40 4-(三氟甲基）苯基 S - - A-4 1 1 ! 2-甲氧基苯基、 S - - 1 ； A-42 3-甲氧基苯基 S - - A-43 4-曱氧基苯基 S - - A-44 2-羧基苯基 S - - A-45 3 -叛基苯基 S | - - A-46 4-羧基苯基 S 麵 - (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

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-16- 本纸張尺度適/丨]屮國國家標準（〔奶）八4規格（210父297公漦） 581815 A7 B7 五、發明説明（14 部屮义;) J 合li 化合物 Κι Χι E.4 Z3 A-47 苯基 NH - - A-48 2-硝基苯基 NH - - A-49 3 -硝基豕基 NH - - A-50 4 _石肖基苯基 NH - - A-51 2-氯苯基 NH - - A-52 3 -氯苯基 NH - - A-53 4-氯苯基 NH - - A-54 2-甲基苯基 NH - - A-55 3-甲基苯基 NH - - A-56 4-甲基苯基 NH - - A-57 2 -氟苯基 NH - - A-58 3 -氣苯基 NH 麵 - A-59 4 -氟苯基 NH - A-60 2-(三氟甲基）苯基 NH - 麵 A-61 3-(二氟甲基）本·基 NH - - A-62 4-(三氟甲基）苯基 NH - - ί ί Α-63 2-甲氧基苯基 NH - - Α-64 3-甲氧基苯基 NH - - Α-65 4-甲氧基苯基 NH - -17- 本纸张尺度ii;丨]屮困园家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 581815 A7 B7 五、發明説明（15 ) 才Γ r'】化合物 Κι Χι R4 Z3 A-66 2-羧基苯基 NH - - A-67 3 -致基苯基 NH - • A-68 4-致基表基 NH - - A-69 2-硝基苯基〇甲基〇 A-70 3 _硝基表基〇甲基〇 A-71 4 -硝基豕基〇甲基〇 A-72 2-氯苯基〇甲基 0 A-73 3 -氯表基〇甲基〇 ) A-74 4-氣苯基 1 0 甲基 0 A-75 I 2-曱基苯基〇甲基〇 A-76 3-曱基苯基 0 甲基 0 1 A-77 4-曱基苯基〇甲基 0 A - 78 I i 2 -氟表基 0 曱基〇 1 A-79 3 -氟苯基〇甲基〇 A-80 4-說表卷 0 甲基〇 A-8 1 2-(二氟甲基）苯基〇甲基’ 0 A-82 3-(三氟甲基）苯基〇甲基〇 1 A-83 4-(三氟甲基）苯基 i__________!____L 〇曱基〇 ί A-84 1 2-曱氧基苯基〇甲基 0 1 請先閱讀背 ιέ 之注* 意，事 y η 訂

I -18- 本纸烺尺度述;丨]中®國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公f ) 581815 A7 7 Β 五、發明説明（16) ί:····;·:^*·^!''Μ屮丨夂 ο 碑^·;,;;- 化合物 Ri Xl R4 Z3 A-85 3-曱氧基苯基 0 曱基 0 A-86 4-甲氧基苯基〇曱基〇 A-87 2-羧基苯基 0 曱基〇 A-88 3_羧基苯基 0 甲基〇 A-89 4-叛基苯基〇甲基〇 /a-90 苯基 S 曱基〇 A-91 2 -硝基各基 S 甲基〇 A-92 3-硝基苯基 S 曱基〇 A-93 _1 4-硝基苯基 1 S 甲基〇 | A-94 2 -氯表基 1 S 甲基〇 A-95 3-氯苯基 S 甲基〇 A-96 4-氯苯基 S 甲基〇 A-97 2-甲基苯基 S 甲基〇 A-98 3-曱基苯基 S 甲基〇 A-99 4-甲基苯基 S 甲基〇 A -100 2 -氟本基 S 甲基〇 A-101 3 -氟苯基 S 曱基〇 A-102 4 -氟豕基 S 甲基〇 A-103 ! 2-(三氟甲基）苯基 1 S 甲基 1 〇 (請先閱讀背面之注意事項再}

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-19- 本紙張尺度i4)ntra國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公漦） 581815 A7 B7 五、發明説明（17 部屮 -小人:) _丁 >/] f: 么、化合物 Ri Χι S-4 Zs A-104 3-(二氟曱基）苯基 S 甲基〇 A-105 4-(三氟甲基）苯基 S 曱基〇 A-106 2 -甲氧基苯基 S 曱基〇 A-107 3-曱氧基苯基 S 曱基 0 A-108 4-甲氧基苯基 S 曱基〇 A-109 2-羧基苯基 S 曱基〇 | A-1 10 1 3-羧基苯基 S 曱基〇 A-1 1 1 4-羧基苯基 S 甲基 0 A-1 12 本基 NH 甲基〇 A-1 13 2 -硝基苯基 NH 甲基〇 | A-1 14 3-硝基苯基 NH 曱基 0 ί A-1 15 4 -硝基表基 NH 甲基〇 A-1 16 2-氯苯基 NH 甲基〇 A-1 17 3-氯苯基 NH 甲基〇 A-1 18 4-氣苯基 NH 甲基〇 A-1 19 2-甲基苯基 i NH 甲基〇 1 A-120 3 _曱基苯基 NH 甲基〇 A-121 i 4-甲基苯基 NH 曱基〇 f A-122 2 -氟苯基 NH 甲基〇 -20- 本纸张尺度述川中围國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐）請先閱讀背 ιέ 之注· 意事 Η 訂 581815 Β7 五、發明説明（18 )

Y* ¥ 屮 il 又h \ · \\ .T A η 化合物 Κι i Χι r4 L· Α-123 3 -氟各基 NH 甲基〇 Α-124 4 -氟苯基 NH 曱基〇 Α-125 2-(三氟甲基）苯基 NH 甲基 0 Α-126 3-(二氣甲基）苯基 NH 甲基〇 Α-127 4-(三氟甲基）苯基 NH 甲基〇 Α-128 2-曱氧基苯基 NH 甲基〇 Α-129 3-甲氧基苯基 NH 曱基〇 Α-130 4-甲氧基苯基 1 NH 丨甲基〇 Α-1 3 1 2-羧基苯基 NH 曱基〇 Α-132 3-羧基苯基 NH 甲基〇 Α-133 4-羧基苯基 NH 曱基〇 Α-134 2 -硝基表基〇乙基〇 Α-135 1 3 -石肖基苯基〇乙基〇 Α-136 4 -硝基苯基〇乙基〇 Α-137 2-氯苯基〇乙基〇 Α-138 3-氯苯基〇乙基〇 Α-139 4-氯苯基〇乙棊〇 Α-140 i 2 _甲基各基〇乙基〇 ί ! A-141 ί 1 3 -甲基苯基 0 乙基〇請先閱讀背 ιέ 之注* 意事項

-21 - 本紙張尺度適;丨]中围國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 581815 A 卬 A7 B7 五、發明説明（19 ) 化合物 Ri Χι ! S.4 1 Ζ3 1 A-142 4-曱基苯基 0 乙基〇 A-143 2-氟苯基〇乙基 0 A-144 3 _氟苯基 0 乙基 0 A-145 4 -氣私基〇乙基〇 A-146 2-(三氟甲基）苯基 0 乙基〇 j A-147 j 3-(三氟甲基）苯基 . 〇乙基〇 A-148 4-(三氟甲基）苯基〇乙基〇 A-149 2-甲氧基苯基〇乙基〇 A-150 3-曱氧基苯基〇乙基〇 A-151 4-曱氧基苯基 0 乙基〇 A-152 2-羧基苯基 0 1 乙基 0 A-153 3-羧基苯基〇乙基〇 A-154 1 4-羧基苯基〇乙基〇 A-155 苯基 S 乙基〇 A-156 i i 2 -硝基禾基 S 乙基〇 A-157 3 -石肖基苯基 S 乙基〇 A-158 4-石肖基苯基 S 乙基〇 A-159 2-氣苯基 S 乙基 0 I A-160 3-氣苯基 S 乙基 1 〇 -22- 本纸張尺度这;丨]中囷囚家標準（〇阳）八4規格（210\ 297公釐） 581815 A7

7 B 五、發明説明（20 ) 「於合 ^r?l-卬4':yr 化合物 Ri 1 Χι r4 Zs A-161 4-氯苯基 S 乙基 0 A-162 2 _甲基本基 S 乙基 0 A-163 3-甲基苯基 S 乙基〇 A-164 4-曱基苯基 S 乙基〇 A-165 2 -氟苯基 S 乙基〇 A-166 3 -氟豕基 S 乙基〇 1 A-167 4-氟苯基 ―― ________ 1 S 乙基〇 A-168 2-(三氟曱基）苯基 S 乙基〇 A-169 3-(二氟甲基）苯基 S 乙基〇 A-170 4-(三氟曱基）苯基 1 S 乙基〇 A-171 1 2-曱氧基苯基 S 乙基 0 A-172 3-甲氧基苯基 S 乙基〇： ! | A-173 4 -甲氧基表基 S 乙基〇 A-174 2-瘦基苯基 S 乙基〇 A-175 3 -叛基苯基 S 乙基〇 A-176 4-叛基豕基 S 乙基〇 A-177 ί 1 琴巷 ί NH 乙基〇 A-178 2 -石肖基尽基· NH ί 乙基〇 A-179 ί 3 _石肖基表基 I ~ NH 乙基〇 i (請先閱讀背面之注意事項再尽頁

-23- 本紙张尺度適/丨]屮囚园家標率（(^$)八4規格（210/ 297公釐） 581815 A7

B 五、發明説明（21) ,v ,n?I ' ' /%. 7 4H J- 4 MW— . ^ y \ /1 - ?· Γ. tr 化合物 Κι 1 Χι r4 Z±3 A-180 4 -石肖基苯基 NH 乙基〇 A-18 1 2 -氯苯基 NH 乙基〇 A-182 3-氯苯基 NH 乙基〇 A-183 4 -氯豕基 NH 乙基〇 A-184 2-甲基苯基 NH 乙基〇 A-185 3-曱基苯基 NH 乙基〇 A-186 4 -甲基苯基 NH 乙基〇 A-187 2 -氟苯基 NH 乙基〇 1 A-188 3 -氟各基 NH 乙基〇 1 A-189 4 -氟苯基 NH 乙基〇 A-190 2-(三氟甲基）苯基 NH 乙基〇 A-19 1 3-(三氟甲基）苯基 NH 乙基〇 A-192 4-(三氟甲基）苯基 NH 乙基 0 A-193 2-曱氧基苯基 NH 乙基〇 A-194 3 -曱氧基私基 NH 乙基〇 A-195 4-曱氧基苯基 NH 乙基〇 1 A-196 2-羧基苯基 NH 乙基〇 A-197 3-羧基苯基 NH 乙基〇 A-198 j ； 4-羧基苯基 NH 1 乙基 i 〇 (請先閱讀背面之注意事項再^1^4頁

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-24- U匕尺度这;丨]中园园家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐）、，· 'ή\ 本纸张尺度拭 - . 五、發明説明（22) 1 - 在另一個要素中，昱a二u '、尽發明特徵係在生物體中預防或治療 :、：二狀之方法’由施用本發明之化合物，如在此由式、 ,,从义ι,π所啊疋，具在此提供之任何強制劑，至生物體。生工物/係有關任何活的實體，包括至少1個細胞。之|可如眞核細胞—樣簡單或如哺乳類-樣複雜。在較佳具體實施中，生物指人或哺乳類。残、、防 '"司扎本發明之方法降低生物沾染或發展異常症太 < 可能性，或消除其可能性。 ,〗、”治療”一詞指本發明之方法具治療效果及在生物體中至 /郅份減輕或廢止異常症狀。制>s潦效果’’ 一詞指導致或提供異常症狀之細胞生長之抑治療效果”―詞亦指導致或提供異常症狀（例如癌症） ^長因子之抑制。治療效果解除1或多種異常症狀之徵 :=某種程度。參閲癌症之治療，治療效果指以下之】或户t . (a)腫瘤大小（降低；（b)抑制（即緩慢或停止）腫瘤録 :”⑷抑制腫瘤生長；及⑷消除，或多種與異常症狀有關 7候至某種程度。對抗白血病展現效力之化合物可如在 ^斤述地鑑定，除了非抑制轉移，化合物反而可緩慢或降在、、项胞增殖或細胞生長。斗"異常症狀”一詞指生物之細胞或紐織之功能，其衍生自 =生物之其正常功能。異常症狀可有關於細胞增殖分化或細胞殘存。脃異常細胞增殖症狀包括癌症如纖維變性和腎小球環膜隋 -25- 川中四囤家標準（CNS )八4規格（2!0X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再贾)

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ii Α7 Β7 五發明説明（23) 2㈣血官生成和脈管生成、傷癒合、乾癬、糖尿病和發生。

異常分化症狀句起，V 狀匕待但不限於神經退化障礙、緩慢癒傷率及组織移植技術。。、斧¥細胞殘存症狀有關計劃細胞死亡（死滅）途徑經活化或廢止D正狀。多數蛋白質激酶與死滅途徑有關。任何一種蛋白貝激酶功能之異常可導致細胞不死或過早細胞死亡。細胞增殖、分化和殘存係由技藝中之方法簡單測定之現象。此些方法可涉及有關於時間（例如天）在顯微鏡下觀察細跑數目或細胞外觀。 π施用’’ 一詞概括有關供給至生物體及更特定地併入化合物至生物之細胞或組織之方法。異常症狀可在生物之細胞或組織於生物體中或生物體外時預防或治療。存在於生物體外面之細胞可維持或生長在細胞培養瓜中。爲在生物體内錨泊之細胞，在技藝中存在以施用化合物之許多技術，包括（但不限於）口服、腸外、皮膚、注射和噴霧應用。爲生物體外之細胞，在技藝中存在以施用化合物之多重技術，包括（但不限於）細胞微注射技術、轉移技術及載體技術。在較佳之具體實施例中，本發明係有關在生物體中預防或治療異常症狀之方法，其中氮苯幷咪唑基質之化合物具如在此界定，在式I、II或III中説明之結構或其在此説明 4任何次群。在另一個較佳具體貫施例中，本發明係有關在生物粗中預防或治療異常症狀之方法，其中氮苯幷咪唑化合物係選 •26· _______

本纸悵尺度述州中固國家標率（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） "°^15 A7 ____：______^--- 1 '發明説明（24) 自〜群包括SABI化合物。在另一個較佳具體實施例中，本發明係有關在生A肢| 預防或治療異常症狀之方法，其中生物爲哺乳類。，，哺乳類，，一詞指較佳地如此生物爲小鼠、大鼠、兔子、天竺鼠和山羊，更佳地猴子和猿猴，及最佳地人類。在另一個較佳具體實施例中’本發明係有關在生物體中預防或治療異常症狀之方法’其中異常症狀爲癌症或纖維變性障礙。在再一個較佳具體實施例中’本發明係有關在生物體中預防或治療異常症狀之方法’其中癌症係選自一群包括肺癌、卵巢癌、乳癌、腦癌、内抽腦癌、結腸癌、前列腺癌、肉瘤、著色性乾皮病、黑瘤和神經膠瘤° 在再一個較佳具體實施例中，本發明係有關在生物體中預防或治療異常症狀之方法，其中該方法施至與訊息傳導途徑異常有關之異常症狀，特徵在絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶和天然結合搭檔間之交互作用。，，訊息傳導途徑’，一詞指訊息之傳播。通常，細胞外訊息經細胞膜傳遞變成細胞内訊息。此訊息然後可刺激細胞反應。此詞亦包涵在細胞内整個傳播之訊息。涉及訊息傳導過程之多肽分子典型地爲受體和非受體蛋白質激酶、受體和非受體蛋白質磷酸酶、核甞酸交換因子及轉錄因子。，，異常"一詞，與訊息傳導過程聯結，指在生體中過度或低表現之蛋白質激酶，經突變使其催化活性較野生型蛋白質激酶活性更低或更高，經突變使其不與夭然結合搭檔交 -27- 本纸佐尺度述/1]屮囚國家摞淨-(( 210X 297^^7^ ^ 一^ (請先閱讀背面之注意事項再^^本頁

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五、發明説明（25) 、卜用不再由另種蛋白質激酶·或蛋白質鱗酸酶修飾，或不再與天然結合搭檔交互作用。 ’’促進或裂解異當交百你m ” •人互作用一詞指可由施用本明之化合物至生物體中之細胞成 &人^ 肥义組織而几成之方法。化合物可促進在蛋白質激酶和天炊钍人拉# pq、、 t m 丄t ........ 口搭榣^〈叉互作用，由與複合界囬上t多原子形成合適之交互作用。可替代地，化合物可抑制在蛋白質激酶和天然結合搭檔間之交互作用，由折衷在複合物界面上之原子間形成之合適交互作用。在另一個較佳具體實施例中，本發明係有關在生物體中預防或治療兴¥症狀之方法，其中絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶爲RAF。 IIL.本發明之I合物和_醫藥組合物在另一個要素中，本發明特徵在具在式I、II、ΠΙ中說明之結構之氮笨幷咪唑化合物：請 £ 閱讀背之注* 意事項

訂

-28- ^纸张尺度iiffl中®國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公楚）

I 581815 A7 B7 況、烷氧基中η爲0或1 Η ό )V 部中 •火 il Mj \ ^ >7； f Aίί 五、發明説明（26) 其中 — (a) Ri、、R3和r4係獨立選自一群包括 (i) 氫； (ii) 飽和或不飽和烷基； (iii) Νχ2Χ3，其中x2和x3係獨立選自一群包括氫、飽和或不飽和烷基及同質環或雜環狀環部分： (iv) 鹵素或三鹵甲基； (V) 式-C〇-X4之酮，其中X4選自一群包括氫、烷基及同質環或雜環狀環部分； (vl)式-(Wc〇〇H 之羧酸或式-(x6)n-co〇-x7 I酯，其中X5、χδ和X7係獨立選自一群包括烷基及同質環或雜環狀環部分其中η爲〇或1 ; (νπ)式（Χ8)η-ΟΗ之醇或式-(X8)n_〇_X9之烷氧基部分，其中ΧΑ Χ“系獨立選自—群包括&、飽和：不飽和烷基及同質環或雜環狀環部分，其中環係祁泣一以1或多個取代基取代，其獨立選自一群包括烷某一一自素、三自甲基、竣酸基、硝基和酿及其 (v!ii)式-NHCOX,。之_，其巾χι。係獨立選自— 群包㈣基、經基及同質環或雜環狀環部分，其係視情況以1或多個取代基取代，龙畏 /、竭立選自一群包幾酸基、硝基和括燒基、氧基、函素甲基、 ⑻式-S〇2NXllXl2，其中X|1和Xi2係選自群 ___-29-

本紙張尺度過/丨]中S囤家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 581815

部屮 A A7 B7 五、發明説明（27) 包括氫、燒基及同質環或雜環狀環邵分； (X) 同質環或雜環狀環部分，視情況以1、2或3 個取代基取代，其獨立選自一群包括烷基、烷氧基、鹵素、三函曱基、羧酸基、硝基和酯部分； (xi) 式-CO-X之醛；及， (xii) 式-S02-X13之碱，其中X13係選自一群包括飽和或不飽和淀基及同質環或雜環狀環邵分； (b) Zi和Z2係獨立選自一群包括氮、硫、氧、NH和 NR4，其限制條件係若Zi和Z2之一爲氮、NH或NR4，然後Z!和Z2之另一爲氮、硫、氧、NH或NR4 ;及 (c) Z3和Xi係獨立選自一群包括氮、硫和氧。 ”飽和烷基”一詞指不含任何烯或炔部分之烷基部份。烷基邵分可爲分支或不分支的。 ’’不飽和燒基’’ 一詞指含至少一個烯或块邵分t坑基部份。烷基部分可爲分支或不分支的。 ’’胺"一詞指式之化學部分，其中R!和R2係獨立選自一群包括氫、飽和或不飽和院基及同質環或雜環狀環邵分，其中環係視情況以1或多個取代基取代，其獨立選自一群包括烷基、鹵素、三鹵甲基、羧酸基、硝基及酯部分。 ”芳基” 一詞指芳族基，其具至少1個含共軛兀電子系統之環及包括碳環芳基（例如苯基）和雜環芳基（例如吡啶）。’’ 碳環’’ 一詞指含1或多個共價閉合環結構，化合物，及其形成環主幹之原子全爲碳原子。該詞因此碳環與雜環狀環，其中環主幹含至少1個不同於碳之原子。”雜芳基” 一詞指 -30- 本纸張尺度ii/Π中Κ囚家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐）請先閱讀背 τέ 之注· 意事項

581815 A7 B7 五、發明説明（28) 含至少1個雜環狀環之芳基。 Π鹵素” 一詞指選自一群包括氟、氯、溴和礎之原子。 ”酮’’一詞指具式-(R)n-CO-R’之化學部分，其中尺和R，係選自一群包括飽和或不飽和淀基及同質環或雜環狀環部分及其中η爲0或1。 ”羧酸’’一詞指具式-(R)n-COOH之化學部分，其中r係選自一群包括飽和或不飽和烷基及同質環或雜環狀環部分，及其中η爲0或1。 ”酯”一詞指具式-(R)n-CO〇R，之化學部分，其中R和R，係獨互選自一群包括飽和或不飽和燒基及同質環或雜環狀環部分及其中η爲0或1。 ’’醇’’ 一詞指具式-ROH之化學取代基，其中R係選自一群包括氫、飽和或不飽和说基及同質環或雜環狀環部分，其中環部分係視情況以1或多個取代基取代，其中獨立選自一群包括烷基、鹵素、三鹵甲基、羧酸基、硝基和酯基圈。 ”醯胺’’一詞指式-NHCOR之化學取代基，其中R係選自一群包括氫、烷基、羥基及同質環或雜環狀環部分，其中該環係視情況以1或多個取代基取代，其獨立選自一群包括反基、1¾素、三卣甲基、幾酸基、硝基或g旨。 ’’烷氧基部分"一詞指式-〇R之化學取代基，其中R爲气或飽和或不飽和燒基部分。，•醛”一詞指具式-(R)n-CH〇之化學部分，其中R係選自一群包括飽和或不飽和烷基及同質環或雜環狀環部分及其中η爲0或i。 ’、 31 - 本趴乐尺度適 /¾¾¾¾¾. ( CNS ) ( 210X 297^1 --—~— - (請先閱讀背面之注意事項再^^4頁

581815 A7 B7 Λ; 部中 •火 il $

>/； f. A -32- 五、發明説明（29) ”石風”一詞指具式_s〇2_R之化學部分，其中r係選自一群包括飽和或不飽和垸基及同質環或雜環狀環部分。在另一個較佳具體實施例中，本發明係有關具在式〗、n 或III中説明之結構之氮苯弁咪唑基質化合物，其中4和 Z2係獨立選自一群包括氮和NH。在再一個較佳具體實施例中，本發明係有關具在式丨、n 或III中説明 < 結構之氮苯幷咪唑基質化合物，其中R1、 R2、R3和R4係獨立選自一群包括氫、飽和或不飽和烷基，視情況以同質環或雜環狀環部分，其中環部分係視情況以1、2或3個取代基取代，其中獨立選自一群包括烷基、烷氧基、画素、三自甲基、羥基、烷氧基、羧酸基、硝基和酯邵分，及同質環或雜環狀環部分，視情況以丨、2或3個取代基取代，其獨立選自一群包括烷基、烷氧基、卣素、三鹵甲基、經基、烷氧基、竣酸基、硝基和酯部分。在其他車父佳具體實施例中，本發明係有關具在式I、π 或111中説明之結構之氮苯幷咪唑基質化合物，其中R2和 R3爲氫。在另一個較佳具體實施例中，本發明係有關具在式I、n 或hi中説明之結構之氮苯幷咪唑基質化合物，其中爲夺基’視情況以1、2或3個取代基取代，其獨立選自一群包括燒基、烷氧基、鹵素、三函曱基、羧酸基、硝基或酯部分。在再一個較佳具體實施例中，本發明係有關具在式I、π 或ΠΙ中說明之結構之氮苯幷咪唑基質化合物，其中R1係本紐灯娜請閱讀背之注意事項再 ii 581815 Α7 Β7 五、發明説明（3〇: ^沪部屮次 ^:^-x;m τ,ί/;於合 Μ ,^卬’^-:, 選自一群包括SABI取代基。 •’SABI取代基”一詞指一群取代基包括苯基、2-硝基苯基、3-硝基苯基、4-硝基苯基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2-曱基苯基、3 -曱基苯基、4-甲基苯基、2-氟苯基、3_氟苯基、4-氟苯基、2-(三氟甲基）苯基、3-(三氟甲基）苯基、4-(三氟甲基）苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基笨基、4-甲氧基苯基、羧基苯基、％羧基苯基和‘羧基苯在并他較佳具體實施例中，本發明係有關具在式I、n 汉III中説明之結構之氮苯并咪唑基質化合物，其中XI爲硫。在另一個較佳具體實施例中，本發明係有關具在式i、Η 或III中說明之結構之氮苯幷咪唑基質化合物，立中氧。 ' •在丹一個較佳具體實施例中，本發明係有關具在式〗、Η 或III中死明I結構之氮苯幷咪唑基質化合物，其中乙氧。 .在其他較佳具體實施例中，本發明係、有關具在式卜n ^中"免明 <結構之乳苯幷咪°坐基質化合物，其中R4係選自一群包括曱基和乙基。 ” 、在另二個季交佳具體實施例中，本發明係有關具在式I、u 或况明I結構I氮苯幷咪唑基質化合物，：IL中氮笨幷咪唑：合物係選自-群包括SABI化合物。在乃_要素中’本發明特徵在一種醫藥組合物，包括 (請先閲讀背面之：/X意事項再^^4頁}

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-33 五、發明説明（如在此所特定之本發明化合之载體或稀釋劑。或其鹽及在生理上可接受在另-個要素中，本發一具如在此界定> 4 '、育關—種醫樂組合物，包招〈式ί、Π或ms 其任何次群。〜構之化合物或在此說明之，其中氮苯并咪：：：::：自：發明係有關醫藥組合抽，，醫藥組合物，，―詞指本發“ 2包括SABI化合物。化學成份如稀釋劑或載體之二：表幵咪峻化合物與其侦物之施至生物體。在1:;:二物，醫藥組合物促進化合括，但不限於口服、'，、二她用化合物之多重技銜包組合物亦可 /王、』、噴霧、腸外和局部施用。醫藥、石^ ‘合物與無機酸反應獲得，如鹽酸、氫漠酸酸；：=、《、甲續酸、乙續酸、對綱酸、柳化及其類似物。人从在生理上可接党—詞界定載體或稀釋劑，其不廢止化合物之生物活性和性質。如y載體，，一詞界定化學化合物，其促進化合物併入細胞或、一 4中。I列如二甲基亞砜（DMS〇)爲常用之載體，因其促進泎夕有機化合物攝入生物體之細胞或組織中。、’’釋釋劑”一詞界定在水中稀釋之化學化合物，其將溶解所要之化合物以及穩定化合物之生物活性形式。在缓衝溶 /足中尽解之鹽經利用在技藝中作爲稀釋劑。一種當用之緩衝落液爲磷酸鹽缓衝鹽水，因爲其模擬人血液之鹽狀態。因爲緩衝鹽可在低濃度下控制溶液之pH，緩衝之稀釋劑很 -34- 本纸张尺度制巾囚邮標準（CNS) A4規格（210>< 297公楚） (請先閲讀背面之注意事項再

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• 7 部中央 I A 卬五、發明説明（32 少修飾化合物之生物活性。 ιγ^本發明之合座方法在另一個要素中，本發明係有關合成式j、π或m之氮苯幷咪攻化合物之方法，包括以下之步驟：（勾將2_胺基_ 6-氣-3-硝基吡啶與第2個反應物溶劑中反應，生成第丨個中間物，其中第2個反應物爲取代之芳基環；（1))在觸媒和還原劑之存在下還原第1個中間物，生成第2個中間物； (c)將第2個中間物與第3個反應物反應；及（d)純化本發明之化合物。在較佳之具體實施例中，本發明係有關合成本發明化合物之方法’其中取代之芳基環爲取代酚、取代硫酚和取代笨胺。在另一個較佳具體實施例中，本發明係有關合成本發明化合物足方法’其中取代驗、取代硫紛和取代苯胺係^^自一群包括SABI反應物。 ’’ S A BI反應物’’ 一詞指一群反應物包括以下之鈉綠··於 2- 硝基酚、3-硝基酚、4-硝基酚、2-氣酚、3·氯驗、4 $ §分、2 -曱酚、3 -甲驗、4 -曱紛、2 -氟紛、3 -氟紛、4 - g , 、2 -(三氟曱基）驗、3 -(三氟甲基）臉、4 -(三氟甲基）§分、 2 -甲氧基驗、3 -甲氧基紛、4 -甲氧基紛、2-¾基苯曱於 3- 羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、硫酚、2-硝基硫紛、' 3 -石·句基硫驗、4 -稍基硫紛、2 -鼠硫驗、J -鼠碳、心氯较酉,、 2-硫曱酚、3-硫甲酚、4-硫甲酚、2-氣硫酚、3_氟硫紛、 4- 氟磽酚、2-(三氟曱基）硫酚、3-(三氣甲基）硫酚、(二 -35- 本紙張尺度远州屮同囚家標牟（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

581815 A7 B7 五、發明説明（33) 氟甲基）¾酚、2-甲氧基苯硫醇、3·甲氧基苯硫醇、仁甲氧基苯硫醇、2-氫硫基苯曱酸、3 _氫硫基苯甲酸、肛氣硬基表甲尽胺、2 -硝基苯胺、3 -硝基苯胺、4 -硝基苯胺、2-氯苯胺、3_氯苯胺、4_氯苯胺、2-甲苯胺、夂甲苯胺、4-曱苯胺、2_氟苯胺、弘氟苯胺、4_氟苯胺、2气三氟甲基）苯胺、3·(三氟甲基）苯胺、4-(三氟曱基）苯胺、2_曱氧苯胺、3-曱氧苯胺、扣曱氧苯胺、2-胺基苯甲酸、夂胺基苯曱酸、和4-胺基苯甲酸。在幸父佳之具體實施例中，本發明係有關合成本發明化合物之方法，其中溶劑爲正丙醇。在另一個較佳具體實施例中，本發明係有關合成本發明化合物之方法，其中還原劑爲氫氣。

在再一個較佳具體實施例中，本發明係有關合成本發明化合物之方法，其中觸媒爲拉尼鎳。 Λ J 在再7個較佳具體實施例中，本發明係有關合成本發明化。物〜方π，其中第3個反應物爲〇 _甲基異腸。在另一個較佳具體實施例中，本發明係有關合成本發明化合物之方法，其中第3個反應物爲s_甲基異硫錁硫酸鹽和烷基氯甲酸酯反應之產物。一

在再一個較佳具體實施例中，本發明係有關合成本發明化合物之方法，其中烷基氣甲酸酯爲氯曱酸甲酯。' J 在再一個較佳具體實施例中，本發明係有關合成本發明化6物足方法，其中 '反基氯甲酸酯爲氣甲酸乙酯。上述之本發明簡要爲非限制性的及本發明之.其他面貌和 -36- 本如乐尺度逃)丨]中_家標準（) Λ4規格（21〇>< 297公 (請先閱讀背面之注意事項再

部十次 I I 义:j j； .τ >/； f A ii 卬 V- 581815 A7 B7 部屮

A 五、發明説明（34) 優點將自以下較佳具體實施例之描述，及自申請專利範圍而明顯的。較佳具體實施例之描述本發明係部分關於以氮苯并咪唑基質化合物調整絲胺酸 /蘇胺酸蛋白質激酶功能之方法。此外，本發明係部分有關鐘定調整絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物之方法。該等方法併入表現絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶& RAF之細胞。 RAF爲非受體蛋白質激酶，其在其結合至活化raS，鳥嗓吟三磷酸水解酵素時，經徵召至細胞膜上。RAS在活化受體蛋白質駱胺酸激酶如EGFR或PDGFR結合至較接物蛋白質GRB2及鳥嘌呤核苷酸交換因子s〇S時活化。SOS自 RAS除去鳥嘌呤二磷酸，以鳥嘌呤三磷酸將其置換，及因而活化RAS。RAS然後結合RAF及結果活化RAF。RAF 然後可磷酸化其他蛋白質標的在絲胺酸和蘇胺酸殘基上，如激酶（MEK)，其磷酸化及結果活化絲裂素活化之蛋白質激酶（MAPK)。因此，RAF在絲裂素活化之訊息轉導中供作中間控制因子。由於RAF在細胞中之重要調節角色，RAF胺基酸序列足修飾可改變其功能及結果修飾細胞行爲。在細胞增殖中 RAF之角色係由raf胺基酸序列之突變已與腫瘤和癌症有關之觀察所背書。因爲RAF之突變生成細胞中之癌症，導致RAF展現未調節之催化活性，RAF之抑制可減輕或甚至廢止在此細跑中導致癌症之細胞增殖。 -37- 本纸张尺度適州屮闷囤家標準（CNS )六4規格（2i〇'X 297公漦） 581815 A7 B7 五、發明説明（35) 中 •火

A 尽發明之方法可偵測在細胞中調整蛋白質激酶RAF功能 <化合物。RAF ,酸化}種蛋白質激酶（MEK)，其依序磷酸化絲裂素活化之蛋白質激酶（MAPK)。僅監測MEK由Raf 噚酸化之分析法並不靈敏，因爲MEK之磷酸化量不顯著。馬克服此靈敏性難處，MEK和ΜΑρκ兩者之磷酸化經採用在本發明之分析法中。ΜΑρκ磷酸化訊息放大mek磷酸化訊息及允許RAF依賴之磷酸化在酵素連結免疫吸附法 :經跟隨。此外，纟發明之分析法較佳地在高貫穿形態進行，使許多化合物可在短時間内快速經監測。本發明乙方法已鑑足抑制RAF蛋白質激酶功能之化/合物。此些化合物爲氮苯幷咪唑基質之衍生物。雖然氮苯幷咪 %基貝4何生物已測試其抑制在細胞中涉及該苷酸合成酵素之能力，但許多此些化合物未曾顯著探索關於蛋白質= 自号抑制。因爲RAF對其他絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶展現顯著胺基酸同質性，本發明之氮苯幷咪唑基質化合物可能地：制非RAF之絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶。因此，本發明方法亦有關和RAF之絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶，包為球 ^ 體絲胺酸m胺酸蛋.白質激酶。括一 #雙本發明方法亦關於其他化合物，其調整在細胞之raf功能，⑼本方法之高貫穿要纟允許廣列之分子^短時間5 測試。因此，本發明方法可鑑定不在本發明中揭示而調冬 STK功能之存在分子。正 --—_______ 本紙佐尺度迖家標卑（CNS) Λ4ΰ^· -38- (210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再

·_ 丁、-口

丄ου 五、發明説明（3e) A7 B7 L _棊質化合物、'矿：月虱冬幵味唑基質化合物經測試其抑制RAF蛋白f ::〜能力。生物分析法及此些抑制研究之結編 ::…用以測定蛋白質激酶功能之氮苯弁咪峻基質化告 •J凋王足万法係相似於該等述於由Tang等之美國專利申請案序號〇湖2,232，及標題，，㈣㈣組合庫和有關產品及治潦疾病之方法”，（Lyon* Ly〇iM#忘綠號22i/i87)， 1996年8月23曰申請，關於本發明之高貫穿要素。〇8/702,232中請案係在此以其全體併人供參考，包括任何圖。 —查基赴咪唑基質化金疾病在此所述之方法、化合物和醫藥组合物經設計由調整 RAF蛋白質激酶而抑制細胞增殖障礙。增殖障礙在多細胞生物中适成1或多種次組細胞I不想要細胞增殖，造成對生物鱧之傷害。在此所逑之方法、化合物和醫藥組合物亦有用於治療和預防在生物體中之其他障礙，如有關過早細胞死亡（例如神經性疾病）或發炎之障礙。此些障礙可爲RAF 分子不適當作用足結果或RAF-有關蛋白質激酶分子不適當作用之結果3 R A F貪白貝放每或與R A F有關免白質激酶之功能改變可導致在某些疾病中出現心增強或降低細.胞增殖狀態。異常細增殖狀怨包括癌症、纖維交性障礙、腎小球環膜障礙、異常血管生成和脈管生成、傷癒合、乾癬、再狹有和發生。纖維變性障礙有關細胞性細胞外基質之異常形成。纖維 -39- 本纸张尺度述以屮SΗ家標導（CNS ) Λ4規格（210x 297公釐） 581815 A7 B7 五、發明説明（37 ) 部 t I;： A il 卬變性=礙之實例爲肝硬化。肝硬化特徵在增加濃度之細胞外基貝成份，造成肝瘢之形成。肝硬化可導致如肝之硬化疾病。田=^球裱膜細胞增殖障礙發生，因爲腎小球環膜細皰之 ^小琢環膜増殖障礙包括不同之人腎疾病及臂 ^ 5火、搪尿腎病、惡性腎硬化、血栓微血管病微候群、移植排斥和腎絲球病變。可由本κ明 < 方法和化合物治療之較佳型癌症爲肺癌、 :巢癌、乳癌、腦癌、内軸腦癌、結腸癌、前列腺癌、著巴性乾皮症：黑瘤和神經膠瘤。本發明化合物和方法可有利用以私|和逆轉癌細胞之增殖之證據係在此提出供參考。 g生成和脈官生成障礙源自血管之過度增殖。血管增殖係、必要於多種正常生理過程如胚胎發展、黃體形成、傷癒口和态g再生。然而’血管增殖市在癌瘤發展中是必要的。血管增㈣礙之其他實例包括關節炎，其中新微血答侵入關節及破壞軟骨。此外，也管增殖疾病包括眼疾病: 擔尿視網膜病，其在視網膜中新微血管侵人玻璃狀體、流血及学致失明。相反地，有關血m㈣或封^障礙如再狹有，亦供發於蛋白質激酶之相反調節中。再：g管生成和血管生成係與惡性固態腫瘤之生長和二“。劇烈生長之癌瘤需要含營養素和氧多之血供給以“生A °結果’異常大數吕之微血管時常與腫瘤一致生長及作腫瘤之供給線。除供給營養素予腫瘤夕卜，埋藏在 (請先閱讀背面之注意事項再、1Τ

-40- ^«1815 A7 B7 五、發明説明（38) 腫溜中I新血管提供腫瘤細胞之通路，以進入循環及轉移土生物體中心末梢邵位。F〇lkman ，1990, J. Natl. Cancer inst. 82 : 4-6。不適當之RAF活性可刺激細胞增殖障礙。分子特定地設计以凋整RAF蛋白質激酶功能已顯示抑制細胞增殖。特定抗知覺核酸分子，其經設計結合至編碼RAF蛋白質激酶<信息RNA及封阻自該信息轉譯，有效地在試管中逆轉形A549細胞。Monia等，1996，自然醫學2 ·· 688，在此以其全體包括所有圖表併入供參考。试此RAF-標的抗知覺研究提供本發明氮苯并咪唑分子之凋即RAF蛋白質激酶之功能，可封阻及可能地逆 :在生物中惡性細胞之增殖。此些氮苯并咪唑分子可在此 =之試管中方法由實施制試。再者，氮苯幷咪咬化合之L J 4其在腫瘤細胞上之作用，由在此亦由實施例提供 <齐種移植物方法。型法，其中不適當心活性可刺激特殊或⑺:⑴特殊細胞之直接刺激生長，織之：長（増加血管形成，如腫瘤組織，因而促進組本u明之用途由首先鑑定是而促進。一曰4 + A I、殖障礙係RAF驅動一如此卩早礙經鑑定，受苦由分析並汽# I — 又古於如此障礙之病人可 •，、徵狀I疋，使熟諳此技藝之程序。如此病既生或獸醫師熟知之 % ; σ此病人然使可如在此所述地治療。列夂是否細胞增殖障礙係 · 功可由先測定生病人 -41 - (210X 297公漦） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

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581815 ~~~---- 五、發明説明（39 ) 體内細胞中或殊部φ I & D Λ ρ^ $ 、不1中發生RAF活性之量而完成。例如，在癌細胞之例中，.1或多種W活性之量可與非RAF驅動癌 :和RAF驅動癌症比較。若癌細胞較raf驅動癌症具更高二< RAF活彺，較佳地等於或大於RAF驅動癌症，然後其爲治療之候選物，使用所述本發明RAF調整方法和化合物^ 在細胞增障礙因非癌細胞之不想要増殖而起之例中， RAF活性之量與在_般族群中發生之量比較（例如在一般人或動物族群中發生之平均f，排除罹患細胞增殖障礙之孩等人或動物^若不想要細胞增殖障礙特徵在較在—般族群中發生者更南之RAF量時，然後障礙爲治療之候選物，使用所述之本發明RAF調整方法和化合物。 ^复赛革弁咪唑基質化厶铷之施用_ 製，化合物之醫藥調配物之方法，測定要施至病人之化合物f之万法，及施用化合物至生物體之形式係揭示於由 Tang等 < 吴國專利申請案序號〇8/7〇2,232，及標題，，《嗓 4酮组合庫和有關產品及治療疾病之方法，，，（4^和Ly⑽ 備忘錄號221/187)，η%年8月2S日及國際專利公佈號 W0 96/22976，由Buzzem等及標題，，水溶性3_亞芳基_2_ 吟吲哚衍生物作爲酪胺酸激酶抑制劑，，，i 996年8月i曰公饰’兴兩者在此以其全體包括任何圖併入供參考。熟諳此 ik il 又:】技藝者應瞭解如此説明書可應用至本發明及可輕易將其調舀己a 實施例以下之實施例爲非限制性的及僅爲本發明不同要素和面 -42- 本纸张尺度述m园家標丰（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 581815 A7 B7 五、發明説明（40

貌之代表。實施例描述合成本發明化人物；二、i ^ 、。物又乃法及測定化合物在RAF蛋白質激酶功能之效果之方法。在方法中所用之細胞係商業可得的。由細胞錨泊之核酸载體亦爲商業可得的及不同蛋白質激酶之基因序列在序列資料庫中係易取得的。因此，熟諳此技藝者可輕易以時間性方式再創造細胞系，甴合併商業可得細胞、商業可得核酸载體及蛋白質激酶基因，使用熟諳此技藝者易得之技術。：合成本發明氮苯弁味化合物本發明現將説明於以下之非限制性實施例，中其，除另有說明： (0蒸發由旋轉蒸發在眞空下進行； (ii)操作在惰性氣體如氮氣之氣壓下進行； (出）高效液相層析法（HPLC)在默克LiChrosorb RP-i8逆相石夕々上進行，獲自E.默克，Darmstadt，德國； (iv) 產品經給定僅供説明及不必須是可獲得之最大量； (v) 點这未經修正及使用HWS Mainz SG 2000數位这點裝置測定； (vi) 本發明式I、η和ΠΙ所有化合物之結構係由質子核磁共振分光法在Bruker AMX500-NMR分光光度計、由元素微分析及在某些例中由質譜法確認； (νπ)結構之純度由薄層層析法（TLC)使用矽膠（默克矽膠60 F254)或由HPLC進行；及 >/； A ii (vil)中間物通常不全部特性化及純度係由薄層層析法 (TLC)或由HPLC評估。 -43 - 581815 A7 B7 五、發明説明（41 ) 合成程序

峻并|~4,5-1)~^比咬 2-胺基-3-硝基-6-(苯基氫硫基）吡啶由加熱2_胺基_6_氯· 3-硝基吡啶（84.0克，0.484莫耳）和硫酚化鈉（Fluka)(72 〇克，0.545莫耳）在2-丙醇（1500毫升）中在迴流下2小時製備。冷至室溫後，懸浮液以水（1 〇〇毫升）稀釋，固體由眞空過濾收集，以水和2-丙醇清洗及在50 °C下在眞空下乾燥，得到109.1克（95%產量）之2-胺基-3-硝基(苯基氫硫基）吡啶，m.p. 148-152 °C。部屮 ίΙ· /:】 ϋ t ;/； f： 2, j-二胺基- 6-(苯基氫硫基）吡啶由氫化2-胺基硝某· 苯基氫硫基）吡啶（107.1克，0.433莫耳）在5大氣壓h2 |在克拉屬-Ni存在卜在1200 ¾升2 -丙醇中在70 °C下製備。4小時（29· 1升氫氣）後，反應混合液經冷至4，而同時繼續攪拌。沈殿物由眞空過遽收集，以2 _丙醇清洗及在50 °C下在眞空下乾燥。合併之濾液在減壓下濃縮及自丙醇再結晶。以1000毫升THF清洗氫化裝置2次、在減取下蒸發及自2-丙醇再結晶後，沈澱物經收集及在5()。。下/ 眞空下乾燥，得到84.0克（8 7.1 %產量）之2,3-二胺基·6•(笨基氫硫基）吡啶，m.p. Π 9-1 22 °C)。 2 ·甲氧基羰基胺基-6 -苯基氫硫基-3 Η -咪吐基[4，5 »· b ] p比咬經製備，由逐滴添加氣曱酸酯（3 4毫升，0.4 4莫耳）至s甲基異硫錁硫酸鹽（53克，〇. 19莫耳）（Aldrich)在68毫升水+ 冷（5-15°C)溶液，而溫度維持低於20°C。其後，水性氛寄

581815 A7 .^..(^^---1411 lJy' / iy- T- ^ MJ /0 ΛΜ B7 五、發明説明（42) 化鈉（1 16克，25% NaOH)經小心加入及發生白色沈澱物。 20分鐘後，加入水（210毫升）及pH以乙酸（冰，34毫升）調至4.0。在此混合液中’逐滴加入2,3 -二胺基- 6- (本基鼠硫基）吡啶（37.8克，0· 174莫耳）在210毫升乙醇之溶液及熱至85-90 °C 2小時。冷却反應混合液過夜後，沈澱物由過濾分開，以溫水（1〇〇〇毫升）清洗，乾.燥及自乙酸和乙醇在4 °C下再結晶。沈澱物由過濾收集，以甲醇清洗及在50 °C下在眞空下乾燥，得到30克（57.4%產量）之2-甲氧基羰基胺基-6 -表基鼠硫基-3 Η -味峻开[4，5 - b ] p比症’ in · p. 2 6 9 -274 °C (分解）。 4匕合物A-3 : 2_甲氧基窥基胺基_(6 -苯氧基- 3H -味口坐并 f4,5-bl 吡啶藉驗化納替代在實施例A-90中之硫驗化納，相同方法得到2-甲氧基羰基胺基-(6-苯氧基-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶， m.p. >280 °C (分解）。化合物A-4 : 2-乙氧基羰基胺基-6-苯氧基-3H-咪唑幷 f4,5-bl 吡啶藉氣甲酸乙酯替代在實施例A-3中之氣甲酸甲酯，相同方法得到2 -乙氧基援基胺基- (6 -苯氧基- 3H -味峻并[4,5-b] 吡啶，m.p. >280 °C (分解）。化合物A -1 : 2 -乳-6-表军L基- 3H -味峻[ 4，5 - b 1 口比症由〇-甲基異腸直接與2，3 -二胺基-6 -(表基風硫基）p比咬反應，替代在實施例A_3中S-甲基異硫蘇硫酸鹽和氯甲酸曱酯反應之產物，相同方法得到2-氧-(6-苯氧基-3H-咪唑并-45- 本纸張尺度述州中^國家標準（〇\5)八4規格（210'乂 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

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581815 A7 B7 發明説明（43) >/; 乂，、ii [4,5-b]吡啶，m.p. 277-278 °C。复合物A-2 : 苯基氫硫基-3H-咪唑弁猎硫汾化鈉替代在實施例A-1中之酚化鈉，相同方法得到2-氧-(6-苯基氫硫基_3H_咪唑幷[4,5_b]吡啶， 254。。。 … 化合物Ao - A-25 藉適當之酚化物替代在實施例A-1中之酚化鈉，相同方法得到以下實施例。爲實施例A-23、A·24和A-25，幾基由甲基、乙基、苄基、第三丁基或其他合適酯保護及然後在最後步驟中去保護，得到化合物。 Α·5 2·氧·6_(2-硝基苯氧基）-3Η-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2-氧-6-(3-硝基苯氧基）·3Η_咪唑幷[4,5讣]吡啶 2-氧-6-(4-硝基苯氧基咪唑幷[4,5吨]吡啶 2-氧-6-(2-氯苯氧基）-3Η-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2 -氧- 6- (3-氯苯氧基）_3H-咪峻幷[4,5-b]P比咬 2-氧-6-(4-氯苯氧基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2-氧-6-(2-曱基苯氧基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2-氧-6-(3-曱基苯氧基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2-氧-6-(4-甲基苯氧基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2-氧-6-(2-氟苯氧基）-3H-咪唑幷[4,5邛]吡啶氧-6-(3-氟苯氧基）_3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2-氧-6-(4-氟苯氧基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2-氧-6-[2-(三氟甲基）苯氧基]_3H-咪峻幷[4，tb]吡 A-6 A-7 A-8 A-9 A-10 A-1 1 A-12 A-13 A-14 A-15 A-16A-17 啶 -46 - 本紙张尺度述州屮囚囤家標準（CNS ) Λ4規格（2丨0x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再

、1T

ί 中 il ll j /7' ii A7 B7 五、 A-18 啶 A-19 啶 A-20 A-21 A-22 A-23 A-24 A-25 A-27 A-28 A-29 A-30 A-3 1 A-32 A-33 A-34 發明説明（44 氧6 [〇_(二氟甲基）苯氧基]-3H_咪唑幷办匕 -氧6 [4_(二氟甲基）苯氧基卜3H_咪唑幷[々Lb] ‘ ^ 6 (2-甲氧基苯氧基）-3H-咪唑并[4,5讣]吡啶 ^ ^ 6 -甲氧基苯氧基）-3H-咪唑幷[4,5_b]吡啶 6 (4-曱氧基苯氧基）_3H_咪唑幷吡啶 -氧6 (2-叛基苯氧基）·3Η_咪唑幷[4,5_b]吡啶 2·氧羧基苯氧基）-3H_咪唑弁[4,5讣]吡= 2-氧-6-(4·羧基苯氧基）-3Η_咪唑并[4 5·: 化合物 A - 2 6 j^Aj-^4 6 ： S il曰之爲酌化物替代在實施例A_2中之硫紛化鈉，神同，成得到以下實施例。爲實施例A-44、A-45和A-46，由，基乙卷、卞基、第三丁基或其他合適醋保遂及然後在最後步驟中去保護，得到化合物。 A-26 2-氧·6-(2-硝基苯基氫硫基）-3H_咪唑幷[4,5_b]吡啶 2-氧-6-(3_硝基苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡唉 2-氧-6-(4_硝基苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡唉 2-氧-6-(2-氣苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2氣-6 - (j -鼠表基風硫基）_ 3 Η -味坐并[4，5 - b ]17比咬 2_氧_6-(4-氯苯基氫硫基）-3H_咪唑并[4,5-b]吡啶 2 -氧- 6- (2 -曱基苯基氫硫基）-3H-味咬幷[4,5-b]p比唉 2-氧-6-(3-甲基苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4,5_b]吡啶 2_氧- 6-(4-曱基苯基氫硫基）-3H-咪唑并[4,5汁]吡啶 -47 - 本纸张尺度述州十间囤家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公漦）

581815 A7 B7 五、發明説明（45) 2-氧-6-(2-氟苯基氫硫基）-3合-咪峻弁[4,5-|)]17比< 2 -氧- 6_(3 -氟私基氫硫基）-3H-味嗅并比唉 2-氧- 6-(4 -氟苯基氫硫基）-3H-咪峻并[4,5-b]P比淀 2-氧-6-[2-(三氟曱基）苯基氫硫基]_3{|_咪峻幷[4 s 2 -氧-6-[3-(三氟曱基）苯基氫硫基]-3H-咪峻并[4 5 2-氧- 6·[4-(三氟甲基）苯基氫硫基]-3H-咪咬弁[4 5 2-氧-6-(2-甲氧基苯基氫硫基）-3Η-咪唑幷[4,5讣]吨 2-氧- 6-(3 -甲氧基苯基氫硫基）-3Η-咪峻幷[4,5-1)]% 2 -氧- 6- (4-甲氧基苯基氫硫基）-3H-咪岭幷[4,5-b]；^ 2 -氧-6 - (2 -援基苯基氫硫基）-3 Η -咪π坐幷[4，5 - b p比唆 2 -氧-6·(3 -複基苯基氫硫基）-3H -咪唾幷[4,5-b]P比淀 2 -氧-6 - (4 -複基苯基氫硫基）-3 Η -咪峰弁[4，5 - b ]峨这好沪部中^;.(r^-XJm J消於众卬^- A*35 A-36 Ad? Am bh比淀 A-39 b ] 口比淀 A，40 bp比啶 A - 4 1 啶 A-42 啶 A*4 3 啶 A-44 A-45 A-4 6 物 A-47 - A-68 藉適當之苯胺鹽替代在實施例A -1中之紛化納，相同方法得到以下貫施例。爲實施例A - 6 6、A · 6 7和A - 6 8，幾基係由甲基、乙基、字基、第三丁基或其他合適g旨保護及然後在最後步骤中去保護，得到化合物。 A- 47 2 -氣-6-苯基胺基-3H -味π坐弁[4,5-b]p比咬 -48- 本纸iR尺度適;!]中0國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 581815 A7 B7 五、發明説明（46 ) A-48 2-氧- 6-(2-確基苯基胺基）-3H-咪峻幷[4,54]吨/ A-49 2-氧_6-(3·硝基苯基胺基>3Η-咪唑幷[4,5、bj咕^ A-50 2-氧-6_(4-硝基苯基胺基）-311-咪唑幷[455、13]外# A-51 2-氧-6-(2-氯苯基胺基）-3η-咪唑弁[4,5_b]p比淀 A-52 2-氧-6_(3-氯苯基胺基）-3H-咪唑幷[4,5_b]咐淀 A-53 2-氧-6-(4-氯苯基胺基）-3H-咪唑并[4,5-b]吨咬 A'54 2_氧-6-(2 -甲基苯基胺基）_3H-咪唑幷[4,5_b]吡> A-55 2_氧-6-(3-甲基苯基胺基）-3H-咪唑幷[4,5咄]咕♦ A-56 2-氧-6-(4-甲基苯基胺基）-3Η-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-57 2_氧- 6-(2-氟苯基胺基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡咬 A-58 2_氧-6-(3-氟苯基胺基）_3H-咪唑弁[4,5-b]吡咬 A-5 9 2-氧-6-(4-氟苯基胺基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡咬 A-60 2_氧-6-[2-(三氟甲基）苯基胺基]-3H-咪唑并[4,弘b] 咣啶 A-61 2-氧-6-[3-(三氟甲基）苯基胺基]-3H-咪唑并[4,5-b] 吡啶 A-62 2-氧-6-[4-(三氟甲基）苯基胺基]-3H-咪唑并[4,5-b] 吡啶 -/Γ- 部屮 -失 ϋ j Α Α-63 A - 6 4 A-65 A - 6 6 A-67 A-68 2-氧-6-(2-甲氧基苯基胺基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2-氧-6-(3-曱氧基苯基胺基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2-氧-6-(4-甲氧基苯基胺基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2-氧-6-(2-羧基苯基胺基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 2-氧-6-(3-羧基苯基胺基）-3H-咪唑弁[4,5-b]吡啶 2·氧-6-(4-幾基苯基胺基）-3H-咪唑弁[4,5-b]吡啶 -49- 本纸张尺度送CNS ) Λ4規格（210'乂297公漦了 581815 B*7 五、發明説明（47 ) 化合物 A-69 - A-89 : - (請先閱讀背面之注意事項再iP?本頁藉適當驗化物替代在實施例A-3中之驗化鈉，相同方法得到以下實施例。爲實施例A-87、A-88和A-89，叛基係甴甲基、乙基、芊基、第三丁基或其他合適酯保護及然後在最後步驟中去保護，得到化合物。 A-69 2-曱氧基羰基胺基-6-(2-硝基苯氧基）-3H-咪唑幷 [4,5-b]吡啶 A-70 2-曱氧基羰基胺基-6-(3-硝基苯氧基）-3H-咪唑弁 [4，5 - b ] p比咬 A- 71 2 -甲氧基援基胺基- 6- (4 -硝基豕乳基-味峻并 [4,5-b]吡啶 A - 7 2 2-曱氧基藏基胺基-6-(2-氯本乳基）-31^-味。坐并 [4，5 - b ] p比咬 A-73 2-曱氧基羰基胺基-6-(3 -氣苯氧基）-3H-咪唑幷 [4,5-b]吡啶 A-74 2-甲氧基羰基胺基-6-(4-氯苯氧基）-3H-咪唑幷 [4,5-b]吡啶 A-75 2-甲氧基羰基胺基-6-(2-曱基苯氧基）-3H-咪唑弁經濟部中央標準局負工消f合作社印製 [4，5 - b ] p 比症 A-76 2-甲氧基羰基胺基-6-(3-甲基苯氧基）-3H-咪唑幷 [4,5-b]吡啶 A-77 2-甲氧基羰基胺基-6-(4-甲基苯氧基）-3H-咪唑并 [4，5 · b ]巧匕症 A-78 2-甲氧基羰基胺基-6-(2-氟苯氧基）-3H-咪唑幷 -5〇- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公芨) 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 581815 B7 五、發明説明（48 ) [4,5-b]吡啶 A - 7 9 2-曱乳基援基胺基-6-(3-氣表氧基）-3H -味峻并 [4，5 - b ] ρ比咬 A - 8 0 2-甲氧基談基胺基-6-(4-氣表氧味口生弁 [4:5_b]吡啶 A-81 2-曱氧基羰基胺基-6-[2-(三氟甲基）苯氧基]-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-82 2-甲氧基談基胺基-6- [3-(三氟曱基）苯氧基]-3H -味唑幷[4,5-b]吡啶 A-83 2-甲氧基羰基胺基-6-[4-(三氟甲基）苯氧基]-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶 A-84 2-曱氧基羰基胺基-6-(2 -曱氧基苯氧基）-3H-咪唑幷 [4,5-b]吡啶 A-85 2-甲氧基羰基胺基-6-(3-甲氧基苯氧基）-3H-咪唑弁 [4,5-b]吡啶 A-86 2-曱氧基羰基胺基-6-(4-甲氧基苯氧基）-3H-咪唑幷 [4,) - b ] p比淀 A-87 2-曱氧基羰基胺基-6-(2-羧基苯氧基）-3H-咪唑并 [4，5 - b ] p 比咬 A-88 2-甲氧基羰基胺基-6-(3-羧基苯氧基）-3H-咪唑并 [4,5-b]吡啶 A-89 2-曱氧基羰基胺基-6-(4-羧基苯氧基）-3H-咪唑并 [4,5-b]吡啶 -51 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公总） (請先閱讀背面之注意事項再本頁

581815 Λ7 B7 五、發明説明（49 ) 化合物 A-91 - A-111 : ’ 藉適當之硫酚化物替代在實施例A-90中之硫酚化鈉，相同方法得到以下實施例。爲實施例A-1 09、A-1 1 0和A-1 1 1 ，羧基係由曱基、乙基、芊基、第三丁基或其他合適酯保護及然後在最後步驟中去保護，得到化合物。 A-91 2 -甲氧基後基胺基- 6- (2 -硝基本基氮硫基）όΗ -味峻幷[4,5-b]吡啶 A- 9 2 2 -曱氧基談基胺基- 6- (3 -硝基表基鼠硫基）-3H -11 禾峻幷[4,5-b]吡啶 A - 9 3 2-甲氧基藏基胺基-6 - (4 -硝基冬基氮硫基）-：> Η -味峻并[4,5-b]吡啶 A - 9 4 2 -甲氧基談基胺基- 6- (2 -氯本基氮硫基）-3H -味岭并 [4,5_b]吡啶 A-95 2-甲氧基羰基胺基-6-(3 -氯苯基氫硫基）-3H-咪唑幷 [4，5 - b ]竹匕症 A-96 2-甲氧基羰基胺基-6-(4-氯苯基氫硫基）-3H-咪唑幷 [4，5 - b ] 口比咬 A-97 2-曱氧基羰基胺基-6-(2-甲基苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4:5-b]吡啶 A-98 2-甲氧基羰基胺基-6-(3-曱基苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-99 2-甲氧基羰基胺基-6-(4-曱基苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-1 00 2 -甲氧基羰基胺基-6-(2-氟苯基氫硫基）-3H-咪唑# -52- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公犮） (請先閱讀背面之注意事項再本頁、-口經濟部中央標準局員工消f合作社印製 581815 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（5〇 ) [4,5-b]吡啶 A-101 2 -甲氧基羰基胺基-6-(3-氟苯基氫硫基）-3Η-咪唑幷 [4,5-b]吡啶 A-102 2-甲氧基羰基胺基-6-(4-氟苯基氫硫基）-3H-咪唑幷 [4,5-b]吡啶 A-1 03 2-甲氧基羰基胺基-6-[2-(三氟甲基）苯基氫硫基]-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-1 04 2-甲氧基羰基胺基-6-[3-(三氟甲基）苯基氫硫基]-3H-咪峻并[4,5-b]p比淀 A-105 2-甲氧基羰基胺基-6-[4-(三氟曱基）苯基氫硫基]-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-106 2-曱氧基羰基胺基-6-(2-曱氧基苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-107 2-甲氧基羰基胺基-6-(3 -曱氧基苯基氫硫基）-3H-咪哇幷[4,5-b]p比症 A- 1 08 2 -曱氧基羰基胺基-6-(4-甲氧基苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-109 2-甲氧基羰基胺基-6-(2-羧基苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-1 10 2-曱氧基羰基胺基-6-(3-羧基苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-1 1 1 2-曱氧基羰基胺基-6-(4-羧基苯基氫硫基）-3H-咪唑弁[4,5-b]吡啶 (請先閱讀背面之注意事項再本頁

、11

-53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公浼） 581815 B7 五、發明説明（51) 化合物 A-112 - A-133 : " 藉適當之苯胺鹽替代在實施例A-3中之酚化鈉，相同方法得到以下實施例。爲實施例A_ 1 3 1、A-1 32和A-1 33，羧基係由甲基、乙基、芊基、第三丁基或其他合適酯保護及然後在最後步驟中去保護，得到化合物。 A-1 12 2-曱氧基羰基胺基-6-苯基胺基-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-113 2 -曱氧基援基胺基- 6- (2 -硝基豕基胺基）-3H -味17坐并 [4，5 - b ] π 比咬 A-114 2-曱氧基談基胺基-6-(3 -硝基苯基胺基）-311_味η坐并 [4，5 - b ] ?比淀 A-115 2-甲氧基藏基胺基-6-(4-硝基本基胺基）-3 Η -味峻并 [4，5 - b ] π 比症 A-116 2-甲氧基羰基胺基-6-(2-氯苯基胺基）-3Η-咪唑幷 [4,5-b]吡啶 A-1 17 2 -曱氧基談基胺基-6-(3 -氣木基胺基）-3H -味u坐弁 [4,5-b]吡啶 A-118 2-曱氧基羰基胺基-6-(4-氣苯基胺基）-3H-咪唑并 [4,5-b]吡啶 A-1 19 2-曱氧基羰基胺基-6-(2-甲基苯基胺基）-3H-咪唑幷 [4,5-b]吡啶 A-120 2-曱氧基羰基胺基-6-(3-甲基苯基胺基）-3H-咪唑幷 [4,5-b]吡啶 A-〗2 1 2-曱氧基羰基胺基-6-(4-曱基苯基胺基）-3H-咪唑并 -54- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公犮） (請先閲讀背面之注意事項再本頁

、\=口經濟部中央標準局員工消f合作社印製經濟部中央標绛局貝工消f合作社印裝 581815 Λ7 ______B7 五、發明説明（52 ) [4，5 - b ] 0 比咬 A-122 2 -曱氧基幾基胺基- 6- (2 -氣苯基胺基）-3H -味峰并 [4，5 - b ] p比咬 A-123 2-曱氧基羰基胺基-6-(3 -氟苯基胺基）-3H-咪唑并 [4,5-b]^b ^ A-124 2-曱氧基羰基胺基-6-(4-氟苯基胺基）-3H-咪唑并 [4，5 - b ] p 比淀 A-125 2-曱氧基羰基胺基-6-[2-(三氟曱基）苯基胺基]-3H-咪唑弁[4J-b]吡啶 A-126 2-甲氧基羰基胺基-6-[3-(三氟甲基）苯基胺基]-3H-咪唑幷[4,5_b]吡啶 A-127 2-甲氧基羰基胺基-6-[4-(三氟曱基）苯基胺基]-3H-咪唑幷[4,5-b]p比啶 A- 128 2 -甲氧基羰基胺基-6-(2-曱氧基苯基胺基）-3H-咪唑 # [4,5-b]吡啶 A-! 29 2-曱氧基羰基胺基-6-(3-曱氧基苯基胺基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A- 130 2-曱氧基羰基胺基-6-(4-甲氧基苯基胺基）-3H-咪。坐并[4,5-b]吡啶 A- IjI 2 -曱氧基談基胺基- 6- (2 -竣基苯基胺基）-3H -味。二幵 [4，5 - b ] ρ比唉 A- 132 2-曱氧基羰基胺基-6-(3-羧基苯基胺基）-3H-咪峻幷 [4,5-b]吡啶 A-1 33 2-甲氧基羰基胺基-6-(4-羧基苯基胺基）-3H-咪咬拜 -55- 本纸蒗尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公浼） (請先閱讀背面之注意事項再iPP本頁)

、1T 581815 Λ7 B 7 五、發明説明（53 ) [4,5-b]吡啶化合物 A-134 - A-154 : 藉適當之酚化物替代在實施例A-4中之酚化鈉，相同方法得到以下實施例。爲實施例A-152、A-153和A-154，羧基係由甲基、乙基、芊基、第三丁基酯或其他合適酯保護及然後在最後步驟中去保護，得到化合物。 A- 134 2-乙氧基羰基胺基-6-(2-硝基苯氧基）-3H-咪唑幷 [4,5-b]巧匕咬 A- 1 35 2-乙氧基羰基胺基-6-(3-硝基苯氧基）-3H-咪唑并 [4,5-b]吡啶 · A -136 2-乙乳基談基胺基-6-(4-硝基苯乳基）-3 Η -味峻并 [4,5 - b ] ρ比淀 A- 137 2-乙氧基羰基胺基-6-(2-氯苯氧基）-3H-咪唑幷[4,5-b p比啶 A-138 2 -乙氧基談基胺基- 6- (3 -氯苯乳基）-3H -味峻弁[4,5-b]吡啶 A--139 2 -乙氧1基援基胺基- 6- (4 -氯表氧基）-311-味。坐并[4,5-b ] p比症 A- 140 2-乙氧基羰基胺基-6-(2-曱基笨氧基）-3H-咪唑并 [4,5-b]^b A-14 1 2-乙氧基羰基胺基-6-(3-曱基苯氧基）-3H-咪唑幷 [4,5-b]吡啶 A-142 2-乙氧基談基胺基-6-(4-曱基禾乳基）-3H -味:开 [4,5-b]吡啶 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公犮）請先閱讀背 & 冬意事頁經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581815 Λ7 B7 五、發明説明（54 )

A- 143 2-乙氧基羰基胺基-6-(2-氟苯氧基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-144 2 -乙氧基藏基胺基- 6- (3 -鼠苯乳基）-3H -味峻并[4,5_ b]吡啶 A-145 2-乙氧基羰基胺基-6-(4-氟苯氧基）-3H-咪唑弁[4,5-b ]。比症 A-146 2 -乙氧基援基胺基-6- [2-(二氣甲基）私氧基]-3H -味唑幷[4,5-b]吡啶 A-147 2-乙氧基羰基胺基-6-[3-(三氟甲基）苯氧基]-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-148 2-乙氧基羰基胺基-6-[4-(三氟曱基）苯氧基]-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-149 2 -乙氧基藏基胺基- 6- (2 -曱氧基苯氧基）-3H -味峻并 [4,5-b]吡啶

A- 150 2-乙氧基羰基胺基-6-(3-甲氧基苯氧基）-3H-咪唑幷 [4,5-b]吡啶 A-15 1 2-乙氧基羧基胺基- 6-(4-甲氧基苯氧基）-3H-咪唑弁 [4,5-b]吡啶 A- 152 2-乙氧基羰基胺基-6-(2-羧基苯氧基）-3H-咪唑并 [4，5 - b ] p比咬 A-153 2-乙氧基藏基胺基- 6- (3 -複基表氧基）-3Η-^σ坐并 [4,5-b]吡啶 A- 15 4 2-乙氧基羰基胺基-6-(4-羧基苯氧基）-3H-咪唑# [4,5-b]吡啶 -57-

CNS

I 581815 Λ7 B7 五、發明説明（55 ) 化合物 A-155 - A-176 ·· 藉適當之硫酚化物替代在實施例A-4中酚化鈉，相同方法得到以下實施例。爲實施例A-l74、A-175和A-176，羧基係由甲基、乙基、芊基、第三丁基或其他合適酯保護及然後在最後步驟中去保護，得到化合物。 A-155 2 -乙氧基談基胺基-6 -本基風硬基-Η -味峻并[4,5-b] 巧匕啶 A-156 2 -乙氧基談基胺基-6 - (2 -硝基苯基風硫基）〇 Η -米峻并[4,5-b]口比咬 A-157 2 -乙氧基談基胺基- 6- (3 -硝基各基鼠硫基）-3H -味c坐幷[4,5-b]^:啶 A-158 2·乙氧基藏基胺基- 6- (4 -硝基苯基氮硫基）-3H -味。坐幷[4,5-b]吡啶 A-159 2 -乙氧基談基胺基- 6- (2 -氯苯基風疏基）-：>Η-_π圭并 [475-b]吡啶 A-160 2 -乙氧基談基胺基- 6- (3 -氣本基氮硫基）-：>^1-味％并 [4,5-b]吡啶 A-161 2 -乙氧基援基胺基- 6- (4 -氣表基氮疏基）-：> Η -味咬并 [4，5 - b ] 口比咬 ( A-162 2 -乙氧基談基胺基- 6- (2 -甲基禾基鼠石瓦基）咬小并[4，5 - b ] p比咬 I A- 1 63 2-乙氧基羰基胺基-6-(3-甲基苯基氫硫基）-3H-咪唑 1 ΐ 幷[4,5-b]口比啶 i A- 164 2-乙氧基羰基胺基-6-(4-甲基苯基氫硫基）-3H-咪唑

ί I ή'

V -5S- 本4¾尺度.丨ί/Π 达（CNS 2:()、二。·'公分、

581815 A7 B7 五、發明説明（56 ) 幷[4,5-b]吡啶 _ A-165 2-乙氧基羰基胺基-6-(2-氟苯基氫硫基）-3Η-咪唑弁 [4,5-b]吡啶 A-166 2 -乙氧基藏基胺基-6-(3 -鼠苯基氮硫基）-3H -味峻并 [4,5-b]吡啶 A-167 2-乙氧基羰基胺基-6-(4-氟苯基氫硫基）-3H-咪唑并 [4,5 - b ] p比淀 A-168 2-乙氧基援基胺基-6- [2-(二鼠甲基）苯基氮硫基]-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-169 2-乙氧基羰基胺基-6-[3-(三氟甲基）苯基氫硫基]-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A- 170 2 -乙氧基羰基胺基-6-[4-(三氟甲基）苯基氫硫基]-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-17 1 2·乙氧基羰基胺基-6-(2-曱氧基苯基氫硫基）-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶 A-172 2 -乙氧基談基胺基- 6- (3 -甲氧1基豕基鼠硫基）-3H -味唑并[4,5-b]吡啶 A-173 2 -乙氧基羰基胺基-6-(4-曱氧基苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-174 2-乙氧基羰基胺基-6-(2-羧基苯基氫硫基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A ii (讀先閱讀背面之注意事項再本TJr 訂

A- 1 75 2-乙氧基羰基胺基-6-(3-羧基苯基氫硫基）-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶 A- 176 2-乙氧基羰基胺基-6-(4-羧基苯基氫硫基）-3Η-咪唑 -59 W1815 A7 B7 .·〆屮 >v; f 合 ii 卬五、發明説明（57 弁[4,5-b]吡啶 t合物 A_177 A-198 ：藉適當之苯胺鹽替代在實施例A-4中酚化鈉，相同方法得到以下實施例。爲實施例A-196、A-197和A-198，羧基係由曱基、乙基、苄基、第三丁基或其他合適酯保護及然後在最後步驟中去保護，得到化合物。 A-177 2-乙氧基羰基胺基_6_苯基胺基_3Η·咪唑幷[4,5_bhb 啶 A- 178 2 -乙氧基羰基胺基-6-(2-硝基苯基胺基）-3H-咪唑幷 [4,5-b]p 比咬 A-179 2-乙氧基羰基胺基_6_(3·硝基苯基胺基）_3H_咪唑幷 [4,5-13]?比咬 A -! 80 2 -乙氧基羰基胺基_6-(4-硝基苯基胺基）_3H-咪唑幷 [4，5 - b ]吹淀 A-1 8 1 2-乙氧基羰基胺基-6-(2-氯苯基胺基卜3咪唑幷 [4，5 - b ] 口比淀 A-182 2 -乙氧基羰基胺基_6-(3 -氯苯基胺基）-3H-咪唑幷 [4，5 - b ] ρ比咬 m 2_乙氧基羰基胺基-6气4_氣苯基胺基）_3H_咪唑幷 [4，5 - b ] ρ比咬 A-184 2-乙氧基羰基胺基-6_(2-曱基苯基胺基>3H_咪唑幷 [4，5 - b ]叶匕咬 A-18 3 2-乙氧基羰基胺基-6-(3 -曱基苯基胺基H-咪唑幷 [4，5 - b ] ρ比唉 -60- CNS ) Λ4^ ( 2!〇χΊ7^\^~ 581815 A7 -^ ' 〜、-一 B7 五、發明説明（ss^ A-186 2-t* -μ- ν, 氣基竣基胺基- 6- (4 -甲基苯基胺基）-3Η -味峻并 [4,5-b]。比咬 A-187 2-. 氧I裝基胺基-6-(2 -說苯基胺基）-3H-味峻并 [4，5 - b ] p比咬 A ** 1 S 8 2-7^ 一氣基襞基胺基-6-(3 -氟苯基胺基）-3H-咪峻幷 [4,5-b]吡啶 A -1 8 9 9 /- ^ 〜-乙氧基羰基胺基-6-(4-氟苯基胺基）-3H-咪唑弁 [4,5-b]P 比啶 A-1 9〇乙氧基羰基胺基-6-[2-(三氟甲基）苯基胺基]_3 H-咪峻幷[4,5讣]吡啶 A-191 2-乙氧基羰基胺基三氟甲基）苯基胺基]_3H_ 咪峻幷[4,5-b]吡啶 A-192 2-乙氧基羰基胺基-6-[4_(三氟甲基）苯基胺基卜3H-咪峻幷[4,5-b]?比咬 A-19j 2 -乙氧基羰基胺基-6_(2_曱氧基苯基胺基）-3H-咪唑幷[4，5 - b ] p比咬 A-194 2 -乙氧基羰基胺基_6-(3 -曱氧基苯基胺基）_3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 K-:;;r:部 t-v5-^r^-^J,、h 5·;/)伶合竹；；；卬^. A-195 2 -乙氧基羰基胺基- 6-(4 -曱氧基苯基胺基）-3H-咪唑幷[4,5-b]吡啶 A-196 2 -乙氧基羰基胺基- 6-(2-竣基苯基胺基）_3H-咪唑幷 [4，5 - b ] p比淀 A-1 97 2 -乙氧基談基胺基- 6-(3-幾基苯基胺基）_3H-咪峻并 [4，5 - b ] p比咬 -61 - 本纸烺尺度適/丨]中园國家標準（CNS )八4規格（210X 297公犮.) 581815 A7 _______ B7 五、發明説明（59) A-198 2-乙氧基羰基胺基-6-(4-羧基苯基胺基）-3H-咪唑弁 [4,5-b]p 比淀實施例2 ：測定RAF磷酸化功能之分析法以下分析法報導RAF-催化磷酸化其標的蛋白質MEK以及MEK之標的MAPK之量。RAF基因序列係述於Bonner 等，19 85, Molec. Cell. Biol. 5 : 1400-1407，及易取得於多重基因序列資料庫。本發明此部分所用之核酸載體和細胞之構築係全部述於Morrison等，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 8855-8859。材料與試劑 1. Sf9草地粘蟲細胞；GIBCO-BRL，蓋色斯堡，馬里蘭州3 2· RIPA 緩衝液·· 20 毫莫耳濃度丁ris/HCl pH 7.4，137 毫莫耳濃度NaCl，10%甘油，1毫莫耳濃度PMSF，5毫克/升抗蛋白酶肽，0.5% Triton X-100 ; 3. 硫氧化還原素-MEK融合蛋白質（T-MEK) : T-MEK 表現及由親和力層析法純化係根據廠商程序進行。目綠號 K 350-0 1 和 R 350-40，Invitrogen 公司，聖地牙哥，加州。 4· His-MAPK (erk 2) ; His-標示之 MAPK 在以編碼 His-MAPK之pUCl8載體轉形之XL1藍細胞中表現。His-MAPK由N;i-親和力層析法純化。目錄號27-4949-01 ，

Pharmacia, Alameda ，力口州，如在此所述。 5 · 绵羊抗小鼠IgG :傑克生實驗室公司，西格拉夫，賓州。目號 5 1 5-006-008，批號 28563。 ____-62- 本纸張尺度適國家標準（（ΓΝ^ΤΤϋ格（2!0:>< 297公货) 一 581815 ^••'"•'部中"^Ί,^Γ而i:h ' A7 B7 五、發明説明（60 ) 6. RAF-1蛋白質激酶特定之抗體：URP2653自UBI。 7. 塗布缓衝液：PBS ;磷酸鹽缓衝鹽水，GIBCO-BRL ，蓋色斯堡，馬里蘭州。 8·清洗緩衝液：TBST-50毫莫耳濃度Tris/HCl pH 7.2 ，150 毫莫耳濃度 NaCl，0.1% Triton X-100 9·封阻緩衝液：ΤΒST，〇. 1%乙醇胺pH 7.4 10· DMSO，Sigma，聖路市，密蘇里州 11.激酶緩衝液（KB): 20毫莫耳濃度希皮士/HC1 pH 7.2 ，150毫莫耳濃度NaCl，〇」％TritonX-l〇〇，1毫莫耳濃度PMSF，5毫克/升抗蛋白酶肽，75微莫耳濃度正釩酸鈉，0.5毫莫耳濃度DT丁和1〇毫莫耳濃度jyjgCh。 12· ATP混物：1〇〇毫莫耳濃度MgCl2，300微莫耳濃度 ATP，微居里 γ-33Ρ ATP (杜邦-NEN)/毫升。 1 3 ·終止溶液：1 %石粦酸；Fisher，匹茲堡，賓州。 14.瓦拉克（Wallac)纖維素磷酸鹽濾紙墊；瓦拉克，土庫，芬蘭。 1 5 .滤紙 >貧洗落液：1 %臂酸，F i s h e r，匹兹堡，賓州。 1 6. T 〇 m t e c板採收器，瓦拉克，土庫，芬蘭。 1 7 ·瓦拉克板閲讀機# 1 2 0 5，瓦拉克，土庫，芬蘭。 18. NUNC 96-格V底聚丙烯板供應用科學目綠號AS_ 72092之化合物。程序所有以下步驟在室溫下進行，除非另有說明。 1. ELISA板塗布；ELISA #以100微升綿羊抗小鼠親和 -63- 本纸张尺度迅川屮《國¥標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再 1: 、\'5 581815 A7 B7 五、發明説明（61 )

-Μ* 屮义:J

f- A 加純化抗血清（1微克/ 1 〇〇微升塗布緩衝液）在4 °C下塗布過夜。ELISA板可在4 °C下保存時使用2週。 2· 翻轉平板及除去液體。加入1 〇〇微升封阻溶液及培養3 0分鐘。 3，除去封阻溶液及以清洗緩衝液清洗4次。在紙巾上輕拍平板，除去過量液體。 4. 加入1微克RAF-1特異之抗體至各格及培養1小時。如在步驟3中所述地清洗。 5. 解凍自RAS/RAF感染Sf9細胞之解離物及以TBST 稀釋至10微克/100微升。加入10微克稀解離物至盤中及培養1小時。在培養期間振盪平板。負控制組未接受解離物。自RAS/RAF感染Sf9昆蟲細胞之解離物在細胞以重組才干狀病毒在各病毒MOI爲5下感染後製備，及4 8小時後採收。細胞以PBS清洗1次及在RIPA緩衝液中解離。不溶性物質由離心（在1 〇 000x g下5分鐘）除去。部分解離物在乾冰/乙醇中冷凍及保存在-80。(：下直至使用。 6. 除去非結合物質及如上概要地清洗（步驟3)。 7. 每格加入2微克T-MEK和2微克His-MAEPK及以激酶緩衝液調整體積至40微升。自細胞萃取物純化T-MEK 和ΜAPK之方法係在此由實施例提供。 8. 預稀釋化合物（母液10毫克/毫升DMSO)或萃取物20 倍於TBST加上1% DMSO。加入5微升預稀釋化合物/萃取物至在步驟6中所述之格子中。培養20分鐘。控制組未接受藥劑。 -64 - 本紙ft尺度述川中S囤家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公漦） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

581815 A7 B7 五'、發明説明（62 ) 9*甴添加5微升ATP混料開始激酶反應；在培養期間在ELISA板振盪器上振盪平板。 10·在60分鐘後由添加30微升終止溶液至各格而停止激酶反應。 11.將磷酸基纖維素墊和ELISA板置於Tomtec板採收機上。採收及以根庭商建議心滤紙清洗溶液清洗滤紙。乾燥濾墊。密封濾墊及將其置於容器内。插入容器至放射性偵測裝置及在濾墊上定量放射性磷。可替代地，自分析板之個格之40微升部分可轉至場酸基纖維素濾墊上之相對應置。風乾濾墊後，將濾墊置於盤上。溫和搖幌盤子，在15分鐘時換清洗溶液至1小時。風乾濾墊：密封濾蟄及將其置於適合測定在樣品中放射性磷之容器。插入容器至偵測設備及定量在濾墊上之磷。 IC5G係根據爲以下氮苯幷咪唑基質化合物之實驗手册在 RAF-1 ELISA分析法中測定： (A-l) ' Η (請先閱讀背面之注意事項再本百〇、1Τ

* ·· 'Λ:

I (Α-2)

-65 本纸張尺度適州屮囤國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ297公趁） 581815 A7 B7 五、發明説明（63 (Α-3) η

、ch2ch3

ch3

.7 、部中a I 及

(A-90) H IC5〇値爲降低最大量磷酸化標的蛋白質或細胞生長50%所需之氮苯幷咪唑基質抑制劑濃度。在RAF-1磷酸化分析法中測定之IC50値係描述於表1中：

An 卬 i： -66- 本紙烺尺度述川t园Η家標牟（CNS ) /\4規格（210X 297公楚） 581815

五、發明説明（64)

皇例3 ： ΜΑΡΚ和ΜΕΚ之純化，六破碼 JL. zjr tlr 歹裏、· MAPK和MEK蛋白質係易於細胞中表現，®入眈訂去真·多離形：此些蛋白質之基因至商業可得之載體中，其衣现，、 ^ 曰 ^ ^ 酸標籤之蛋白質。编碼此些蛋白質之基因係易目只‘· > 、 r P^7 ’其遇常在做此些蛋白質的，或由自含cDNA庫之,.. 、殖此些基因。基因庫係易於商業取得的及熟諳此技勢者可易於自MEK和MAPK之核酸序列，在多基因資料庫如

Genbank中可獲得，設計同質於编碼MEK或MAPK之cDNA 分子核酸探針。基因之選殖可在短時段内完成，使用熟讀此技藝者目前可取得之技術。 ΜEK和MPAK蛋白質自細胞萃取物之純化可使以下之實驗手研完成，其係調適自Robbins等，1 993, J. Biol· Chem· 268 : 5097-5106 : 3 ·由熟諳此技藝者易取得之超音波振盪、滲透壓或法式壓破技銜醇離細跑。 A 卬 2.以下揭示之平衡緩衝液平衡與鎳或鈷共軛之固體撐 -67- 本纸佐尺度述州十囚囤家標丰（CNS ) Λ4規格（210X 297公f ) 581815 A7 B7 五、發明説明（65 體。多離胺酸標籤特異地結合至在固體撐體上之鎳和麵原子。平衡可由等於1 〇倍固體撐體體積之平衡緩衝液體積清洗樹脂3次。固體撐體係易爲熟諳此技藝者所取得的。 3. 添加細胞解離物至固體·撐體上及在容器中平衡一段時間。可替代地，固體撐體可填充在蛋白質層析管柱内及解離物及可流經固體撐體。 4· 以下揭示之清洗緩衝液清洗固體撐體。 5.自固體撐體以一量之溶析緩衝液（以下提供）溶析 MEK或MAPK蛋白質，其自固體撐體除去顯著部分蛋白質。皮盪緩衝液 50毫莫耳濃度磷酸鈉pH 8·0 0·3莫耳濃度氯化鈉 1 0毫莫耳濃度β-氫硫基乙醇 1% ΝΡ40 10毫莫耳濃度NaF 0 5毫莫耳濃度Pefablock

部中火义:J 50毫莫耳濃度磷酸鈉pH 8.0 0.J莫耳濃度氯化鈉 10毫莫耳濃度β_氫硫基乙醇 1% ΝΡ40

1〇愛吴耳濃度NaF 1毫莫耳濃度咪唑

Aii 卬嘗: ___ -68- 4 ·⑽尺/以則’丨’卿幻辟（cns ) Λ4規格（」Qx 297公釐） 581815 A7 B7 五、發明説明（66 清洗缓衝液 50毫莫耳濃度磷酸鈉pH 8.0 0.3莫耳濃度氯化鈉 10毫莫耳濃度β-氫硫基乙醇 1% ΝΡ 40 10毫莫耳濃度NaF 1 〇毫莫耳濃度咪唑溶析缓衝液 50毫莫耳濃度磷酸鈉pH 8.0 0.3莫耳濃度氯化鈉 10毫莫耳濃度β-氫硫基乙醇 1% ΝΡ 40 10毫莫耳濃度NaF 10-500毫莫耳濃度咪唑實施例4 ：測定EGF受體磷酸化功能之分析法在整個細胞中EGF受體激酶活性（EGFR-NIH3T3分析法）經測定，如詳述於PCT公佈號WO 9640 1 16，1996年6月 5曰由Tang等申請，及標題”治療疾病之吲哚啉酮化合物π ，在此以其全體包括任何圖併入供參考3 在EGF受體磷酸化分析法中測定之IC5〇値係描述於表2 中： -69- 本纸?&尺度適;丨]屮囚國家標準（〔吣）/\4規格（2丨0、乂 297公漦）請先閱讀背面之注意畢項再 t 581815 A7 B7 五、發明説明（67 ) 表2 化合物 IC5Q(微莫耳濃度） A-1 >100 A-2 > 100 A-3 > 100 A-4 > 100

實施例5 ：測定氮苯幷咪唑基質化合物在表現RAS細胞之生長效果之分析法以下分析法測定表現RAS之NIH-3T3細胞之生長速率。分析法目的在測定化合物在過度表現Η - R a s之NIΗ - 3 T 3細胞生長上之效果。材料 96-格平底無菌板 96 -格圓底兵菌板無菌25毫升或100毫升儲水瓶吸管，多槽吸管器無菌吸管尖無菌15毫升及50毫升試管試劑 f: A 卬 0.4% SRB在1%乙酸中 10毫莫耳濃度Tns鹼 10% TCA i %乙酸 -70- 本纸依尺度述州中K國家標準（CNS )八4規格（210X 297公釐） 581815 A7 B7 五、發明説明（無菌 DMSO (Sigma) ' 化合物在DMSO中（100毫莫耳濃度或更少之母液）胰蛋白酶-EDTA (GIBCO BRL) 3丁3/H-Ras (NIHdT3選體7細胞，表現生瘤H-Ras之基因體斷片）。細胞可使用以下實驗手册構築：次選殖編碼Ras之基因斷片至商業可得之載體，其一請先閱讀背面之注意事項 >/；合卬爵穩定地轉移感染NIH-3T3細胞。斷片係自dHa -ras 因體轉形對偶基因。 2.以次選殖載體甴磷酸鈣法轉移感染NIH-3T3細胞。在2%血清在DMEM中選定表現Ras構體之細胞。玎見之焦在z週後見到。集中轉形之細胞以生成穩定轉形之細胞系。 ▲長培 2%小牛血清/DMEM + 2毫莫耳濃度麩醯胺酸，Pen/Strep 賞驗手册：― 吊〇天：細胞塗板：此d 77之分析法係在層流抽氣櫥中進行。 1 ’騰蛋白酶處理之細胞。轉移2 0 0.微升細胞懸浮液至 1 〇笔升寺'爷壓水。以Coulter計數器計算細胞。 -.在生長培養基中稀釋細胞至60,000個細胞/毫升。轉移100微升細胞至96-盤平底板之各袼中，得到6000個細沒/格。之基訂—

71 - 本纸从^/1]巾卿 581815 A7 B7 五、發明説明（69

部屮央 j ^ .T ,jf. A 3 ·各化合物使用一半平板（4排）及各化合物濃度4重複格，及一組4格爲培養基控制組。 4 · 溫和振盪平板以允許細胞之均勻附著。 5· 在37 °C下在1〇% c〇2培養箱中培養平板。弟1天：化合物之添加：此部分之分析法係在層流抽氣櫥中進行3 1.在96-格圓底板中，加入120微升生長培養基，含管 fe 1至11之最高篩選化合物濃度中所見之2χ終％ Dms〇。例如，若最高濃度爲1 00微升及此係自1 〇〇毫莫耳濃度母液製備時，IX DMSO爲0· 1%，因此2X DMSO爲〇 2% °此板經用以滴定出化合物，每個化合物4排。 2 ·在無菌1 5毫升試管中，製作最高化合物篩選濃度在生長培養基加上2X DMSO之2X溶液。每一細胞系丨毫升係需要的。化合物之起始濃度經常爲1 00微莫耳濃度，但此濃度可根據化合物之溶解度而變化。 ^ *轉和2 4 0彳政升2 X起始化合物溶液至在9 6 -格圓底板之管柱12之4重複格子中。自右至左以1 : 2系列稀釋跨過板盤，由自管柱12轉移12微升至管柱丨1，管柱n至 1 0及如此至管柱2。轉移1 〇〇微升化合物稀釋液及1 〇〇微开在管柱1之培養基至在96-格平底板之相對應格子中細跑之100微升培養基上。每格總體積應爲200微升。 4 · 將板盤送回培養箱及培養3天。第4天：分柝法之發展：此部分之分析法係在實驗桌上進行。 -72- 川中囚國家標牟（（、吣）/\4規格（210'乂 297公趋 ) 請先閱讀背 τέ 之注· 意事項

頁訂

581815 A7 ____________ 五 '發明説明（70) 1. 抽氣除去或倒去培養基。加入200微升冷10% tca 至各格中以固定細胞。在4 °c下培養板盤至少6 0分鐘。 2. 丟棄TCA及以自來水潤洗格子5次。在紙巾上倒置乾燥板盤。 3. 以100微升/格0.4% SRB染色細胞10分鐘。 4. 倒去SRB及以0.1 %乙酸潤洗格子5次。在紙巾上倒置完全乾燥板盤。 5. 以100微升/格1〇毫莫耳濃度Tris鹼在振盪器上溶化染劑5-10分鐘。 6. 在Dynatech ELISA板閱讀機上在63〇毫微米參考之 5 70毫微米下讀取板盤。選定之化合物抑制過度表現RAS之細胞生長速率，如說明於表3中。表3 化合物 iCW微莫耳濃度） RAS/NIH3T3 A-3 40 A-4 20 部屮 Mj ；/；置^施例θ ：測定氮苯幷咪唑基質化合物在Α549 生長上效果之分析法以下分析法測定A549細胞之生長速率。分析法之目的在别it化合物在A 5 4 9人肺瘤細胞足生長上之效果。a 5 4 9 % 跑係易算商業來源如ATCC (CCL185)取得。 -73-

一國家標準（cns )Λ4規格（2丨0>< 297公釐） 581815 又;】 A 卬 t- A7 B7 五、發明説明（71 ) 材料: 96-格平底無菌板 96-格圓底無菌板無菌25毫升或100毫升儲水瓶吸管，多槽吸管器無菌吸管尖無菌15毫升及50毫升試管試劑= 0.4% SRB在1%乙酸中 10毫莫耳濃度Tris鹼 10% TCA 1 %乙酸無菌 DMSO (Sigma) 化合物在DMSO中（100毫莫耳濃度或更少之母液）跋蛋白 §每-EDTA (GIBCO BRL) 細月包系及生長培養基 A549 人肺瘤細胞（ATCC CCL185) 10%牛胎兒血清在漢姆氏F12-K 實驗手册· 第0天：細胞塗板：此部分之分析法係在層流抽氣糖中進行。 1. 胰蛋白酶處理之細胞：轉移2 0 0微升細胞懸浮液至 10毫升等滲壓水中。以Coulter計數器計算細胞。 2. 在生長培養基中稀釋細胞至20,000個細胞/毫升。轉 -74- 本纸張尺度这川中囤國家標準（(：?^)八4規格（210'乂297公釐）請先閱讀背面意事項再 t 經濟部中央標準局員工消资合作社印製 581815 A 7 ____ _B7__ 五、發明説明（72 ) 移100微升細胞至96-格平底板之各格中，得到2000個細胞/袼。 3 · 各化合物使用一半平板（4排）及各化合物濃度4重複袼，及一組4格爲培養基控制組。 4.溫和振盪平板以允許細胞之均勻附著。 5 ·在3 7 °C下在1 0% C 02培養箱中培養平板。第1天：化合物之添加：此部分之分析法係在層流抽氣櫥中進行。 1. 在96-格圓底板中，加入120微升生長培養基，含在管柱1至1 1之最高篩選化合物濃度中所見之2X終％ DMSO 。例如，若最高篩選濃度爲i 00毫莫耳濃度，及此係自1 〇〇愛莫耳濃度母液製備時，1X DMSO爲0.1%，因此2X DMSO 爲〇.2%。此板經用以滴定出化合物，每個化合物4排。 2. 在無菌15毫升試管中，製作最高化合物篩選濃度在生長培養基加上2X DMSO之2X溶液。每一細胞系1毫升係需要的。化合物之起始濃度經常爲丨〇〇微莫耳濃度，但此;辰度可根據化合物之溶解度而變化。轉私240微升2X起始化合物溶液至在96-格圓底板〜f狂12之4重歿格子中。自右至左以1 : 2系列稀釋跨過板盤，由自管柱丨2轉移120微升至管柱u，管柱n至又、此土管柱2。轉移1 〇〇微升化合物稀釋液及^ 〇〇微汁土。柱1 (培養基至在96-格平底板之相對應格子中細胞4 1 00微升培養基上。每格總體積應爲200微升。 4.將板盤送回培養箱及培養3天。 ____ _ 75_ 本纸張尺度· -――- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 木 581815 ^_I___ 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 Λ 7 _____Η7 、發明説明（73 ) 一第5天：分析法之發展：此邵分之分析法係在實驗桌上進行。 1·抽氣除去或倒去培養基。加入200微升冷10% TCA 至各格中以固定細胞。在4 °C下培養板盤至少60分鐘。 2.丟棄TCA及以自來水潤洗格子5次。在紙巾上倒置乾燥板盤。 3·以1 〇〇微升/格0.4% SRB染色細胞10分鐘。 4. 倒去SRB及以 1 %乙酸潤洗格子5次。在紙巾上倒置完全乾燥板盤。 5. 以100微升/格10毫莫耳濃度Tris鹼在振盪器上溶化染劑5 - 1 〇分鐘。 6. 在Dynatech ELISA板閱讀機上在63〇毫微米參考之 570毫微米下讀取板盤。選定之化合物抑制A549細胞之生長速率，如説明於表4 中0 表4 化合物 IC5G(微莫耳濃度） A549 A_3 22 65 (2% FBS) A-4 6 5.7 (2% FBS) : 測定RAF調多ί ;物體内生物活性乏異種移植研究可用以監測本發明化合物在抑制印巢、 -76- 、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公簸） 581815 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 A7 B7五、發明説明（74 ) 瘤、前列腺、肺和乳房腫瘤細胞上之效果。分析法之實驗手册係詳述於PCT公佈號W96401 16，1996年6月5日由 Tang等申請，及標題”治療疾病之^嗓p林酮化合物”，在此以其全體包括任何圖併入供參考。在此説明地描述之本發明可在無任何組件或組件類、不在此特定揭示限制或限制類下實施。已採用之名詞和表達可作描述，但非限制之名詞，及在使用如此名詞和表達時無意排除其所示和所述之特徵或部分之任何相當物，但應認知地，不同之修飾在申請專利範圍之本發明範_内是可能的。因此，當然地，雖然本發明已由較佳之具體實施例和選擇性特性所特異地揭示，但在此揭示概念之修飾和變異可甴熟諳此技藝者所採用，及如此修飾和變異可考慮在本發明之範15壽内，如由隨附之申請專利範圍所界定。熟諳此技藝者應感謝本發明經完全調適以實施目皂物及得到所述之終點和優點以及該等在此所固有的。在此所述之分子複合物和方法、程序、處理、分子、特定化合物經呈現爲較佳具體實施例之代表，係例證的及無意作爲本發明範疇之限制。其中之變化或其他用途將發生至熟諳此技藝者，其包涵在本發明之精神内，係由申請專利範圍之範疇所界定。對熟諳此技藝者易於清楚地，改變之取代和修飾法可對在此所述之本發明製作，而不偏離本發明之範疇和精神。在本説明書中所提及之所有專利和出版物皆對熟諳此技藝者指示本發明相關之程度。所有專利和出版物皆在此併 -77- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公焚) (請先閱讀背面之注意事項 -ilII 再^^本頁)

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581815 Λ7 B7 五、發明説明（75 ) 經濟部中央標準局員工消f合作社印製入供參考至相同程度，雖然各個別出版物經特定地和個別地指出經併入供參考。在此説明地描述之本發明合適地可在無任何組件或組件類，不在此特足揭示之限制或限制類下實施。因此，例如在此之各例中，任何”包括”、”必要地包含”和”包含”筈詞可與其他2詞之任一置換。已採用之各詞和表達可作爲描述，但非限制足名詞，及在使用如此名詞和表達時無意排除其所示和所述之特徵或部分之任何相當物，但應認知地，不同之修飾在申請專利範圍之本發明範疇内是可能的。因此，當然地，雖然本發明已由較佳之具體實施例和選擇性特性所特異地揭示，但在此揭示概念之修飾和變異可由熟諳此技藝者所採用，及如此修飾和變異可考慮在^發明之範疇内，如由隨附之申請專利範圍所界定。此外，當本發明之特徵或要夺# λ/ί ， t 、，一 μ 乂詈常係以Markush群方式描逑時，熟諳此技藝者應瞭解本發明因而亦以…訂匕虬群之任何個別成員或次群之成員描^。例如，若χ經描述爲一群包括溴、氯和碘時，X之申情象 _ Y明專利靶圍馬溴及X之申請專利範圍溴和碘亦全然地經插述。· 先前未在此併入供參考之該等文了又以，包括專利和非糞利兩種文獻，係在此表達地併人供所有目的之參考。mi 體實施例係在以下之申請專利範圍内。 /、 -78« 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210x2^^ (請先閱讀背面之注意事項再本頁}

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Claims

15979號申請專利案中文申凊專利範圍替拖太(Q2年Η月）D8 A8 B8 C8

申清專利祀圍 1· 一種以氮苯并咪唑化合物在活體外調節絲.胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之方法，其中該氮苯并咪唑化合物係選自由2-氧-6-苯氧基-3Η-咪唑并[4,5-b]吡啶、2-氧-6-苯基氫硫基-3Η·咪唑并[4,5-b]吡啶、2-甲氧基羰基胺基-6-苯氧基 -3H_咪唑并-[4,5-b]吡啶、2-乙氧基羰基胺基-6-苯氧基 -3H_咪唑并_[4,5-b]吡啶及2-甲氧基羰基胺基-6-苯基氫硫基-3-咪峻并_[4,5-b]吡啶所組成之群之化合物，該方法包括以該化合物接觸表現該絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶之細胞之步驟。 2·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶為RAF。 3· —種鑑定調整絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶raf功能之化合物之方法，其包括： (a) 以該化合物接觸表現該絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶RAF之細胞；及 (b) 在該等細胞上監測效果。 4.根據申請專利範圍第3項之方法，其中該效果為細胞表現型之變化或無變化。 5·根據申凊專利範圍第3項之方法，其中該效果為細胞增殖之變化或無變化。 6·根據申請專利範圍第3項之方法，其中該效果為該絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶RAF之催化活性之變化或無變化。 7·根據申請專利範圍第3項之方法，其中該效果為該絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶RAF與天然結合搭檔間交互作用之 0 \5$\55067-921128 DQC 5 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)八4規格(2ι〇χ297公釐） 581815

κ、申請專利範圍變化或無變化，如在此所述。 8·根據申請專利範圍第3項之方法，包括以下步驟： (a) 解離該等細胞，得到一包括絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶RAF之解離物； (b) 吸附該絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶RAF至抗體上； (c) 培養該吸附之絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶RAF與受質或受質群；及 (d) 吸附該受質或受質群至固體ix體或抗體上；其中在該等細胞上監測該效果之該步驟包括測定該受質或受質群之磷酸濃度。 9.根據申請專利範圍第3項之方法，其進一步包括以下步驟： (a) 解離該等細胞，得到包括RAF之解離物； (b) 吸附該RAF至抗體； (c) 培養吸附之RAF與MEK和MAPK ;及 (d) 吸附該MEK和MAPK至固體載或抗體或抗體群上；其中在該等細胞上測定該效果之該步驟包括監測該MEK 和MAPK之磷酸濃度。 1〇· —種在生物體中預防或治療絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶有關之異常症狀之醫藥組合物，其係包含選自由2 ·氧-6 ·苯氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶、2-氧-6-苯基氫硫基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶、2-甲氧基羰基胺基-6-苯氧基-3H-咪唑并 _[4,5-b]吡啶、2-乙氧基羰基胺基-6-苯氧基-3H-咪唑并 - 0 \55\SS^b7-9?l S Λ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(21〇χ 29；^#) 一 581815 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 •[4,5-b]咐咬及孓甲氧基羰基胺基苯基氫硫基咪唑并-[4,5-b]吡啶所組成之群之化合物。 U·根據申請專利範圍第1 〇項之醫藥組合物，其中該生物體為哺乳類。根據申請專利範圍第1 〇項之醫藥組合物，其中該異常症狀為癌症或纖維變性障礙。 13·根據申請專利範圍第1 2項之醫藥組合物，其中該異常症狀為選自肺癌、卵巢癌、乳癌、腦癌、内軸腦癌、結腸癌、W列腺癌、肉瘤、著色性乾皮病、黑瘤和神經膠瘤所組成之群之癌症。 14·根據申請專利範圍第j 〇項之醫藥組合物，其中該異常症狀係與訊息傳導途徑異常有關，特徵在絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶和天然結合搭檔間之交互作用。 15·根據申請專利範圍第14項之醫藥組合物，其中該絲胺酸 /蘇胺酸蛋白質激酶為RAF。 16. —種氮苯并咪唑化合物，其係選自由2_氧_6_苯氧基_3h_ 咪唑并[4,5-b]吡哫、2·氧苯基氫硫基·3H-咪唑并[4,5_b] 吡啶、2 -甲氧基羰基胺基苯氧基_3H_咪唑并_[4,54]吡啶、2-乙氧基羰基胺基-6-苯氧基-3H-咪唑并-[4,5-b]吡啶及2-甲氧基羰基胺基苯基氫硫基_3_咪唑并_[4,5_y吡啶所組成之群之化合物。 17· 一種調整絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之醫藥組合物，包括根據申請專利範圍第16項之氮苯并味唆化合物及一生理上可接受之載體或稀釋劑。〇 \S5\55Q67-921128.DOC 5___ g ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X -----

iT πΐ815 Α8 Β8 C8 _________D8 申請專利範圍 1S·-種合成根據巾請專利範圍第Μ $之氮苯并咪吐之方法’包括以下之步驟： ()以第2個反應物在溶劑中與2-胺基-6·氯-3-硝基比疋反應，生成第丨個中間物，其中該第2個反應物為取代之芳基環； (b) 在觸媒和還原劑存在下還原該第丨個中間物，生成第2個中間物； (c) 以第3個反應物與第2個中間物反應；及 (d) 純化根據申請專利範圍第1 8項之該化合物。 19·根據申請專利範圍第1 8項之方法，其中該溶劑為正丙醇。 2〇·根據申請專利範圍第18項之方法，其中該還原劑為氫氣。 21·根據申請專利範圍第18項之方法，其中該觸媒為雷氏鎳 (Raney nickel) 〇 22·根據申請專利範圍第1 8項之方法，其中該第3個反應物為0-甲基異脲。 23·根據申請專利範圍第1 8項之方法，其中該第3個反應物為S-甲基異硫錁硫酸鹽和氯甲酸烷基酯之反應產物。 24·根據申請專利範圍第23項之方法，其中該烷基為甲基或乙基。 Q:\5S\55067-921 128 DQC 5 4 i紙張尺度適财國@家鮮(CNS)7^(21G χ 297公董)