RU2230553C2 - Способ модулирования функции серин/треонин протеинкиназы соединением на основе азабензимидазола, способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, способ профилактики или лечения патологических состояний в организме, соединение на основе азабензимидазола, способ его синтеза и фармацевтическая композиция - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины и органической химии и касается новых производных азабензимидазола формулы I, II или III, модулирующих функции серин/треонин протеинкиназ, способам модулирования функции серин/треонин протеинкиназ, способу идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, способ лечения связанных с серин/треонин протеинкиназой патологических состояний с помощью указанных соединений, способу синтеза указанных на основе соединений формулы I, II или III. Соединения обеспечивают эффективное модулирование функции серин/треонин протеинкиназ и снижают количество побочных эффектов при лечении соответствующих заболеваний. 6 с. и 26 з.п. ф-лы, 5 табл.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Следующее описание предпосылок создания изобретения предназначено для объяснения изобретения и не может рассматриваться как предшествующий уровень техники.

Трансдукция клеточных сигналов - фундаментальный механизм, посредством которого внешние воздействия, регулирующие разнообразные процессы в клетке, передаются внутрь клетки. Одним из ключевых биохимических механизмов трансдукции сигнала является обратимое фосфорилирование белков, которое позволяет регулировать активность зрелых белков путем изменения их структуры и функции.

Наиболее охарактеризованные протеинкиназы эукариот фосфорилируют белки по гидроксигруппам остатков серина, треонина и тирозина. Эти киназы подразделяются в основном на две группы - специфично фосфорилирующие остатки серина и треонина и специфично фосфорилирующие остатки тирозина. Некоторые киназы относятся к ферментам с двойной специфичностью, они способны фосфорилировать как остаток тирозина, так и остатки серина/треонина.

Протеинкиназы характеризуют также по локализации в клетке.

Некоторые киназы являются трансмембранными рецепторными белками, способными связывать лиганды на внешней стороне клеточной мембраны. Связывание лигандов ведет к изменению каталитической активности рецепторной протеинкиназы. Другие киназы являются нерецепторными белками и не имеют трансмембранного домена. Эти нерецепторные протеинкиназы могут присутствовать в различных отделах клетки от внутренней стороны клеточной мембраны до клеточного ядра.

Многие киназы включены в регуляторный каскад, где их субстратами могут быть другие киназы, активность которых регулируется путем их фосфорилирования. В конечном счете активность последующего эффектора модулируется фосфорилированием в результате активации такого пути.

Семейство серин/треонин протеинкиназ включает такие ферменты, которые регулируют многие стадии сигнального каскада, включая каскады, контролирующие клеточный рост, миграцию и дифференциацию клеток, генную экспрессию, мышечное сокращение, метаболизм глюкозы, биосинтез белка и регуляцию клеточного цикла.

Примером нерецепторной протеинкиназы, фосфорилирующей белки-мишени по остаткам серина и треонина, является RAF (киназа быстро увеличивающейся фибросаркомы). RAF модулирует каталитическую активность других протеинкиназ, таких как протеинкиназа, которая фосфорилирует и тем самым активирует митоген-активируемую протеинкиназу (МАРК). Собственно RAF активируется заякоренным на мембране белком RAS, который в свою очередь активируется в ответ на активацию лигандами рецепторных тирозин протеинкиназ, таких как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR). О важной роли RAF в регуляции клеточных процессов свидетельствуют данные о том, что измененные формы RAF могут вызвать развитие онкологического заболевания в организме. Данные о значении RAF в развитии злокачественных опухолей приводятся в статье Monia с соавт., Nature Medicine, 2, 668 (1996), полностью включенной в описание в качестве ссылки, включая все фигуры и таблицы.

Уровень техники

В поисках новых способов лечения онкологических заболеваний и др. заболеваний специалисты в области химии и биохимии создали, синтезировали и испытали соединения, которые ингибируют функцию протеинкиназ. Некоторые низкомолекулярные органические соединения составляют класс соединений, которые модулируют функцию протеинкиназ. Примерами соединений, которые согласно опубликованным данным ингибируют функцию протеинкиназ, являются бис-моноциклические, бициклические или гетероциклические арилсодержащие соединения (PCTWO 92/20642), производные винилен-азоиндола (РСТ WO 94/14808), 1-циклопропил-4-пиридилхинолоны (патент США № 5330992), соединения ряда стирила (патент США № 5217999), стирил-замещенные пиридилы (патент США № 5302606), некоторые производные хиназолина (заявка на выдачу европейского патента № 0566266 A1), селеноиндолы и селениды (РСТ WO 94/03427), трициклические полигидроксильные соединения (РСТ WO 92/21660) и соединения на основе бензилфосфоновой кислоты (РСТ WO 91/15495).

Соединения, которые могут проходить через клеточные мембраны и проявляют устойчивость к кислотному гидролизу, обладают значительным преимуществом как лекарственные средства, так как становятся биодоступными после перорального введения. Однако многие из этих ингибиторов обладают слабой ингибирующей активностью в отношении протеинкиназ. Кроме того, они могут ингибировать многие другие протеинкиназы и, следовательно, при использовании в качестве лекарственных средств будут вызывать множество побочных эффектов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение частично относится к способам модуляции функции серин/треонин протеинкиназ соединениями на основе азабензимидазола. Способы включают клетки, экспрессирующие серин/треонин протеинкиназу, такую как RAF. Кроме того, в заявке описываются способы профилактики и лечения патологических состояний организма, связанных с серин/треонин протеинкиназой, с использованием соединения по изобретению. Более того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим соединения, идентифицированные способами по изобретению.

1. Способы тестирования соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы

Способы по настоящему изобретению обеспечивают средства для модулирования функций как рецепторных, так и плазматических серин/треонин протеинкиназ. Эти способы обеспечивают средства модулирования ферментов как in vitro, так и in vivo. Для применения in vitro способы по изобретению частично относятся к способу идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназ.

Таким образом, первым аспектом изобретения является способ модулирования функции серин/треонин протеинкиназы соединением на основе азабензимидазола. Азабензимидазол по выбору замещен соответствующими группами. Способ включает контактирование клеток, экспрессирующих серин/треонин протеинкиназу, с соединением по изобретению.

Термин "функция" означает роль, выполняемую серин/треонин протеинкиназой в клетке. Семейство серин/треонин протеинкиназ включает ферменты, регулирующие многие стадии сигнальных каскадов, включая каскады, контролирующие клеточный рост, миграцию и дифференциацию клеток, генную экспрессию, мышечное сокращение, метаболизм глюкозы, биосинтез белка и регуляцию клеточного цикла.

Термин "модулирует" означает свойство соединения изменять функцию протеинкиназы. Модулятор предпочтительно активирует каталитическую активность протеинкиназы, более предпочтительно активирует или ингибирует каталитическую активность протеинкиназы в зависимости от концентрации соединения, воздействующего на протеинкиназу или наиболее предпочтительно ингибирует каталитическую активность протеинкиназы.

Термин "каталитическая активность", используемый в данном тексте, означает скорость, с которой протеинкиназа фосфорилирует субстрат. Каталитическую активность можно определить, например, по количеству субстрата, превратившегося в продукт, как функцию времени.

Фосфорилирование субстрата происходит в активном центре протеинкиназы. Обычно активный центр представляет собой полость (в белковой глобуле), в которой субстрат связывается с протеинкиназой и фосфорилируется.

Термин "субстрат", используемый в данном тексте, относится к молекуле, фосфорилируемой серин/треонин протеинкиназой. Предпочтительно субстрат является пептидом, более предпочтительно белком. В отношении протеинкиназы RAF предпочтительным субстратом является МЕК (митоген и внеклеточная регуляторная киназа), а субстратом МЕК является МАРК.

Термин "активирует" означает усиление клеточной функции протеинкиназы. Предпочтительной функцией протеинкиназы является взаимодействие с природным связывающим партнером, наиболее предпочтительно каталитическая активность.

Термин "ингибирует" означает снижение клеточной функции протеинкиназы. Предпочтительной функцией протеинкиназы является взаимодействие с природным связывающим партнером, наиболее предпочтительно каталитическая активность.

Термин "модулирует" также означает изменение функции протеинкиназы путем увеличения или уменьшения вероятности образования комплекса между протеинкиназой и природным связывающим партнером. Предпочтительно модулятор увеличивает вероятность образования комплекса между протеинкиназой и природным связывающим партнером, более предпочтительно увеличивает или уменьшает вероятность образования комплекса между протеинкиназой и природным связывающим партнером в зависимости от концентрации соединения, воздействующего на протеинкиназу, наиболее предпочтительно снижает вероятность образования комплекса между протеинкиназой и природным связывающим партнером.

Термин "комплекс" означает агрегат, по крайней мере, из двух молекул. связанных друг с другом. Трансдуцирующие сигнал комплексы часто содержат, по крайней мере, две связанные друг с другом молекулы белка. Например, субъединицы рецепторной протеинкиназы, GRB2, 80S, RAF и RAS собираются в трансдуцирующий сигнал комплекс в ответ на митогенный лиганд.

Термин "природный связывающий партнер" означает полипептиды, которые связываются с протеинкиназой в клетках. Природный связывающий партнер может выполнять функцию усиления сигнала в процессе трансдукции сигнала протеинкиназой. Изменение взаимодействия протеинкиназы с природным связывающим партнером может проявляться как увеличение или уменьшение вероятности того, что это взаимодействие произойдет, или как увеличение или уменьшение концентрации комплекса протеинкиназа/природный связывающий партнер.

Природный связывающий партнер протеинкиназы связывается с высоким сродством с внутриклеточным фрагментом протеинкиназы. Высокое сродство означает константу равновесия порядка 10^-6 или менее. Кроме того, природный связывающий партнер может также кратковременно взаимодействовать с внутриклеточным фрагментом протеинкиназы и модифицировать ее за счет химической реакции. Природные связывающие партнеры протеинкиназы выбирают из группы, которая включает (но не ограничивается перечисленным) SRC гомологичный домен 2 (SH2) или домен 3 (SH3), другие фосфорилтирозин-связывающие домены (РТВ), гуаниннуклеотид обменные факторы, протеинфосфатазы и другие протеинкиназы. Способы определения изменений взаимодействия протеинкиназы с природными связывающими партнерами хорошо известны в данной области техники.

Термин "серин/треонин протеинкиназа" означает фермент, аминокислотная последовательность которого, по крайней мере, на 10% идентична другим ферментам, фосфорилирующим белки по остаткам серина и треонина. Серин/треонин протеинкиназа катализирует присоединение фосфатной группы к белкам по остаткам серина и треонина. Серин/треонин протеинкиназы могут существовать в форме мембранно-связанных белков, а также в форме плазматических белков.

Термин "контактирование", используемый в данном тексте, означает смешивание раствора, содержащего соединение на основе азабензимидазола по изобретению, с жидкой средой для культивирования клеток согласно способу. Раствор, содержащий соединение по изобретению, может также включать другой компонент, такой как диметилсульфоксид (ДМСО), который способствует поглощению клетками соединения или соединений на основе азабензимидазола. Раствор, содержащий соединение на основе азабензимидазола, может быть добавлен в среду для культивирования клеток с помощью любого дозирующего устройства, такого как пипетка или шприц.

Термин "соединение на основе азабензимидазола" относится к органическому замещенному азабензимидазольному соединению.

Соединения на основе азабензимидазола представлены общей формулой:

Термин "замещенный", используемый в данном тексте, относится к соединению на основе азабензимидазола, которое является производным с любым числом заместителей.

Предпочтительным вариантом воплощения изобретения является способ модулирования функции серин/треонин протеинкиназы, в котором протеинкиназа означает RAF.

RAF протеинкиназа фосфорилирует белки-мишени по остаткам серина или треонина. Одним из таких белков является протеинкиназа (МЕК), которая фосфорилирует и в результате активирует митоген-активируемую протеинкиназу (МАРК). Собственно RAF активируется гидролизующим гуанинтрифосфат мембранным ферментом RAS в ответ на активацию митогенами рецепторных тирозин протеинкиназ, таких как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR).

Способы по изобретению позволяют обнаруживать соединения, которые модулируют функцию протеинкиназы RAF в клетках. RAF фосфорилирует протеинкиназу МЕК, которая в свою очередь фосфорилирует митоген-активируемую протеинкиназу (МАРК). Способы анализа, которые позволяют определить уровни фосфорилирования протеинкиназы МЕК ферментом RAF, являются недостаточно чувствительными в связи с очень низким уровнем фосфорилирования МЕК. С целью повышения чувствительности метода согласно способу по изобретению контролируют фосфорилирование двух ферментов МЕК и МАРК. Сигнал фосфорилирования МАРК усиливает сигнал фосфорилирования МЕК и позволяет определить уровень RAF-зависимого фосфорилирования с помощью аналитического метода, такого как иммуноферментный анализ. Кроме того, способ анализа по изобретению выполняется с высокой производительностью, что позволяет за короткий период времени анализировать множество соединений.

Другим аспектом изобретения является способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, включающий такие стадии контактирования клеток, экспрессирующих серин/треонин протеинкиназу, с соединением, и мониторинг эффекта на клетки.

Термин "мониторинг" означает наблюдение за эффектом, полученным после добавления испытуемого соединения к клеткам согласно изобретению. Результат может проявляться в форме изменения клеточного фенотипа, пролиферации, каталитической активности протеинкиназы или взаимодействия между протеинкиназой и природным связывающим партнером.

Термин "эффект" означает изменение или отсутствие изменения клеточного фенотипа или клеточной пролиферации. "Эффект" также означает изменение или отсутствие изменения каталитической активности протеинкиназы. "Эффект" также означает изменение или отсутствие изменения взаимодействия между протеинкиназой и природным связывающим партнером.

Предпочтительным вариантом воплощения изобретения является способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, в котором эффектом является изменение или отсутствие изменения клеточного фенотипа.

Термин "клеточный фенотип" относится к внешнему виду клетки или ткани или к функции клетки или ткани. Примерами клеточного фенотипа являются размер клеток (уменьшение или увеличение), клеточная пролиферация (увеличение или уменьшение числа клеток), клеточная дифференциация (изменение или отсутствие изменений формы клеток), выживание клеток, апоптоз (гибель клеток) или усвоение метаболитических питательных веществ (например, потребление глюкозы). Изменение или отсутствие изменений клеточного фенотипа легко определить способами, известными в данной области техники.

Другим предпочтительным вариантом воплощения изобретения является способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, в котором эффектом является изменение или отсутствие изменения клеточной пролиферации.

Термин "клеточная пролиферация" относится к скорости, с которой происходит деление группы клеток. Количество клеток, выращиваемых в сосуде для культивирования, может быть подсчитано специалистом в данной области техники, когда визуально подсчитывают число клеток в определенном объеме, используя обычный световой микроскоп. По альтернативному варианту скорость клеточной пролиферации рассчитывают с использованием приборов, в которых плотность клеточной суспензии в соответствующей питательной среде измеряют оптическим или кондуктометрическим методами.

Другим предпочтительным вариантом воплощения изобретения является способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, в котором эффектом является изменение или отсутствие изменения взаимодействия между серин/треонин протеинкиназой и природным связывающим партнером.

Термин "взаимодействие", используемый в данном тексте, относится к комплексу, образованному между внутриклеточным фрагментом протеинкиназы и природным связывающим партнером или соединением. Термин "взаимодействие" может также распространяться на комплекс, образованный между соединением по изобретению и внутриклеточным и внеклеточным фрагментами исследуемой протеинкиназы. Хотя плазматическая протеинкиназа не имеет внеклеточного фрагмента, рецепторная протеинкиназа имеет оба фрагмента.

Термин "внутриклеточный фрагмент", используемый в данном тексте, означает ту часть молекулы протеинкиназы, которая расположена внутри клетки Термин "внеклеточный фрагмент", используемый в данном тексте, означает ту часть молекулы протеинкиназы, которая экспонирована на внешней стороне мембраны.

Предпочтительным вариантом воплощения изобретения является способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, который, кроме того, включает следующие стадии: (а) лизирование клеток с получением лизата, содержащего серин/треонин протеинкиназу; (б) адсорбцию серин/треонин протеинкиназы на антителах; (в) инкубацию адсорбированной серин/треонин протеинкиназы с субстратом или субстратами; (г) адсорбцию субстрата или субстратов на твердом носителе или на антителах. Стадия мониторинга эффекта на клетки включает измерение концентрации фосфата в субстрате или в субстратах.

Термин "лизирование", используемый в данном тексте, относится к способу разрушения клетки с высвобождением внутреннего содержимого. Лизирование клеток осуществляют различными способами, известными специалистам в данной области техники. Предпочтительно клетки разрушают обработкой ультразвуком или гомогенизацией, более предпочтительно обработкой детергентами.

Термин "антитело", используемый в данном тексте, относится к белку, который специфически связывает протеинкиназу. Предпочтительно антитело связывает один класс протеинкиназ, более предпочтительно специфически связывает протеинкиназу RAF.

Термин "специфически связывает", используемый в данном тексте. относится к антителу, которое связывает протеинкиназу с более высоким сродством, чем другую протеинкиназу или клеточный белок. Специфически связывающее протеинкиназу антитело адсорбирует большее количество специфической протеинкиназы по сравнению с другой протеинкиназой или клеточным белком.

Термин "адсорбирование", используемый в данном тексте, относится к связыванию молекулы на поверхности антитела или твердого носителя. Примерами твердых носителей являются химически модифицированная целлюлоза, такая как фосфоцеллюлоза, и нейлон. Антитела могут быть связаны с твердым носителем способами, хорошо известными специалистам в данной области техники. См., например, руководство Harlo & Lane. Antibodies, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories.

Термин "измерение концентрации фосфата", используемый в данном тексте, относится к методикам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Эти методики могут включать количественное определение содержания фосфата в субстрате или определение относительного содержания фосфата в субстрате. Эти методики могут включать адсорбцию субстрата на мембране и определение содержания фосфата в субстрате по измерению радиоактивности.

Другим предпочтительным вариантом воплощения изобретения является способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, который, кроме того, включает следующие стадии: (а) лизирование клеток с получением лизата, содержащего RAF; (б) адсорбцию RAF на антителах; (в) инкубирование адсорбированной RAF с МЕК и МАРК; (г) адсорбцию МЕК и МАРК на твердом носителе или на антителах. Стадия мониторинга эффекта на клетки включает определение концентрации фосфата в вышеупомянутых МЕК и МАРК.

Предпочтительным вариантом воплощения изобретения является способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, в котором соединение на основе азабензимидазола имеет структуру, представленную формулами I, II или III, как определено в описании, или любую формулу из подгрупп, представленных в описании.

Термин "соединение" означает соединение или его фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, амид, пролекарство, изомер или метаболит.

Термин "фармацевтически приемлемая соль" означает форму соединения, которая не изменяет биологическую активность и другие свойства соединения.

Фармацевтические соли могут быть получены взаимодействием соединения по изобретению с неорганическими или органическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, пара-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и т.п.

Термин "пролекарство" означает агент, который превращается в исходное лекарственное соединение in vivo. В некоторых ситуациях пролекарства можно ввести более простым способом, чем исходное лекарственное соединение. Например, пролекарство может быть биодоступным при пероральном введении, а исходное соединение не обладать таким свойством, или пролекарство может иметь хорошую растворимость, что позволяет вводить его внутривенно.

Другим предпочтительным вариантом воплощения изобретения является способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, в котором соединение на основе азабензимидазола имеет структуру, представленную формулами I, II или III, причем соединение азабензимидазола выбирают из группы, включающей соединения SABI (группа структур соединений на основе азабензимидазола).

Термин "соединения SABI" означает группу соединений на основе азабензимидазола, имеющих структуру, представленную формулами А или В, и пронумерованных от А-1 до А-198 в таблице 1.

II. Способы профилактики или лечения патологических состояний

Другим аспектом изобретения является описание способа профилактики или лечения патологических состояний организма путем введения в организм соединения согласно изобретению, определенного в данном тексте формулами I, II или III с любыми соответствующими ограничительными условиями, представленными в данном тексте.

Термин "организм" относится к любому живому объекту, включающему, по крайней мере, одну клетку. Организмом может быть простой объект, такой как эукариотическая клетка или сложный организм, такой как млекопитающее. В предпочтительном варианте воплощения изобретения организмом является человек или млекопитающее.

Термин "профилактика" относится к способу согласно изобретению для снижения вероятности или ликвидации возможности возникновения или развития в организме патологических состояний.

Термин "лечение "означает способ согласно изобретению, позволяющий получить терапевтический эффект и, по крайней мере, частично облегчать или нейтрализовать патологическое состояние организма.

Термин "терапевтический эффект" относится к ингибированию клеточного роста, который является причиной патологического состояния или способствует возникновению патологического состояния. Термин "терапевтический эффект" относится также к ингибированию факторов роста, вызывающих или способствующих возникновению патологического состояния (например, онкологических заболеваний). Терапевтический эффект означает также в некоторой степени облегчение одного или более симптомов патологического заболевания. Относительно лечения онкологических заболеваний термин "терапевтический эффект" означает одно или более следующих воздействий: (а) уменьшение размера опухоли; (б) ингибирование (т.е. замедление или подавление) метастазирования опухоли; (в) подавление роста опухоли и (г) в некоторой степени облегчение одного или более симптомов патологических состояний. Соединения, проявляющие эффективность против лейкемий, могут быть определены, как указано в данном тексте за исключением того, что эти соединения вместо подавления метастазирования могут в большей степени замедлять или снижать пролиферацию или рост клеток.

Термин "патологическое состояние" относится к функции клеток или тканей организма, которые отличаются от нормальной функции данного организма. Термин "патологическое состояние" может относиться к пролиферации клеток, дифференциации клеток или выживанию клеток.

Патологические состояния, связанные с нарушением пролиферации клеток, включают онкологические заболевания, такие как фиброзные и мезангиальные нарушения, нарушения развития и образования кровеносных сосудов, заживление ран, псориаз, сахарный диабет и воспалительные процессы.

Патологические состояния, связанные с нарушением дифференциации, включают (но не ограничены нейродегенеративными нарушениями) замедление процессов заживления ран и технику имплантации тканей.

Патологические состояния, связанные с нарушением выживания клеток, относятся к состояниям, при которых активированы или нарушены пути запрограммированной гибели клеток (апоптоз). Ряд протеинкиназ включены в процессы протекания апоптоза. Нарушение функции одной из протеинкиназ может привести к иммортализации клеток или к преждевременной гибели клеток.

В данной области техники известны простые способы для оценки явлений пролиферации, дифференциации и выживания клеток. Такие способы могут включать наблюдение за количеством клеток или за внешним видом клеток под микроскопом в течение времени (например, дней).

Термин "введение" в широком смысле означает обеспечение организма соединением и более конкретно способ введения соединения в клетки или ткани организма. Профилактику или лечение патологических состояний можно проводить, если клетки или ткани организма существуют внутри организма или вне организма. Клетки, существующие вне организма, можно культивировать или выращивать в чашках Петри. В данной области техники известен ряд способов введения соединений в клетки, существующие внутри организма, включая (но не ограничиваясь ими) способы орального, парентерального, кожного, инъекционного и аэрозольного введения. В данной области техники известен также ряд способов введения соединений в клетки, существующие вне организма, включая (но не ограничивая) методы микроинъекции, методы трансформации и методы с использованием носителей.

Согласно предпочтительному варианту воплощения изобретение относится к способу профилактики или лечения патологических состояний организма, в котором используют соединение на основе азабензимидазола, имеющее структуру, определенную формулами I, II и III, как указано в данном тексте, или соответствующее любой подгруппе этих соединений, как определено в данном тексте.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретение относится к способу профилактики или лечения патологических состояний организма, в котором соединение на основе азабензимидазола выбирают из группы, включающей соединения SABI.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретение относится к способу профилактики или лечения патологических состояний организма, в котором организмом является млекопитающее.

Термин "млекопитающее" относится к таким организмам, как мыши, крысы, кролики, морские свинки и козы, более предпочтительно обезьяны и приматы, наиболее предпочтительно человек.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретение относится к способу профилактики или лечения патологических состояний организма, в котором патологическим состоянием является онкологическое заболевание или фиброзные нарушения.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретение относится к способу профилактики или лечения патологических состояний организма, в котором онкологическое заболевание выбирают из группы, включающей рак легких, рак яичников, рак молочной железы, рак мозга, рак внутриаксиального мозга, рак ободочной кишки, рак предстательной железы, саркома, саркома ксеродермы, меланома и глиома.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретение относится к способу профилактики или лечения патологических состояний организма, в котором патологическим состоянием являются состояния, связанные с нарушением пути трансдукции сигнала, характеризующимся взаимодействием между серин/треонин протеинкиназой и природным связывающим партнером.

Термин "путь трансдукции сигнала" относится к распространению сигнала. В основном внешний сигнал передается через клеточную мембрану и превращается в внутриклеточный сигнал. Затем этот сигнал вызывает клеточный ответ. Термин включает также сигналы, которые распространяются только внутри клетки. Обычно к полипептидам, включенным в процессы трансдукции сигнала, относятся рецепторные и нерецепторные протеинкиназы, рецепторные и нерецепторные протеинфосфатазы, факторы нуклеотидного обмена и факторы транскрипции.

Термин "отклонение" в сочетании с процессом трансдукции сигнала относится к протеинкиназе, которая находится в организме в сверхактивированном или подавленном состоянии. В результате мутаций фермент обладает пониженной или повышенной каталитической активностью по сравнению с протеинкиназной активностью клеток дикого типа. В результате мутаций фермент не способен взаимодействовать с природным связывающим партнером и не модифицируется другой протеинкиназой или протеинфосфатазой.

Термин "активирование или нарушение патологического взаимодействия" относится к способу, который осуществляется путем введения соединения по изобретению в клетки или ткани организма. Соединение может активировать взаимодействие между протеинкиназой и природными связывающими партнерами благодаря предпочтительным взаимодействиям с многочисленными атомами на межсубъединичной поверхности комплекса. В другом случае, соединение ингибирует взаимодействие между протеинкиназой и природными связывающими партнерами благодаря разрушению предпочтительных взаимодействий между атомами на межсубъединичной поверхности комплекса.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретение относится к способу профилактики или лечения патологических состояний организма, в котором серин/треонин протеинкиназой является RAF.

III. Соединения и фармацевтические композиции согласно изобретению

Другим аспектом изобретения являются соединения на основе азабензимидазола, имеющие структуры формул I, II или III

где

(a) R₁, R₂, R₃ и R₄ независимо выбирают из группы, включающей

(i) водород;

(ii) насыщенный или ненасыщенный алкил;

(iii) NХ₂Х₃, где Х₂ и X₃ независимо выбирают из группы. включающей водород, насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец;

(iv) галоген или тригалогенметил;

(v) кетон формулы -СО-Х₄, где Х₄ выбирают из группы. включающей водород, алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец;

(vi) карбоновая кислота формулы -(Х₅)_n-СООН или сложный эфир формулы -(X₆)_n-COOH-X₇, где Х₅, X₆ и Х₇ независимо выбирают из группы, включающей алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, а n равно 0 или 1;

(vii) спирт формулы (X₈)_n-OH или алкоксиостаток формулы -(X₈)₄-O-Х₉, где Х₈ и Х₉ независимо выбирают из группы, включающей водород, насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, где кольцо по выбору замещено одним или более заместителями, которые независимо выбирают из группы, включающей алкил, алкокси, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нитро и сложноэфирные остатки, а n равно 0 или 1;

(viii) амид формулы -NHCOX₁₀, где Х₁₀ выбирают из группы, включающей алкил, гидроксил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, где кольцо по выбору замещено одним или более заместителями, которые независимо выбирают из группы, включающей алкил, алкокси, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нитро и сложноэфирные остатки;

(ix) -SO₂NX₁₁X₁₂, где Х₁₁ и Х₁₂ независимо выбирают из группы, включающей водород, алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец;

(х) остаток гомоциклического или гетероциклического кольца, по выбору замещенный одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбираемыми из группы, включающей алкил, алкокси, галоген. тригалогенметил, карбоксилат, нитро и сложноэфирные остатки;

(xi) альдегид формулы -СО-Н и

(xii) сульфон формулы -SO₂-X₁₃, где Х₁₃ выбирают из группы, включающей насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклического или гетероциклического кольца;

(б) Z₁ и Z₂ независимо выбирают из группы, включающей азот, серу, кислород, NH и NR₄, при условии, что если один из Z₁ и Z₂ означает азот, NH или NR₄, то другой из Z₁ и Z₂ означает азот, серу, кислород, NH или NR₄, и

(в) Z₃ и X₁ независимо выбирают из группы, включающей азот, cеpу и кислород.

Термин "насыщенный алкил" означает алкильный остаток, не содержащий любых алкеновых или алкиновых остатков. Алкильный остаток может быть разветвленным или линейным.

Термин "ненасыщенный алкил" означает алкильный остаток, который содержит, по крайней мере, один остаток алкена или алкина. Алкильный остаток может быть разветвленным или линейным.

Термин "амин" означает остаток формулы NR₁R₂, где R₁ и R₂ независимо выбирают из группы, включающей водород, насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, в которых кольцо по выбору может быть замещено одним или более заместителей, независимо выбираемых из группы, включающей алкил, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нитро или сложноэфирные остатки.

Термин "арил" означает ароматическую группу, содержащую, по крайней мере, одно кольцо с конъюгированной системой п-электронов, и включает карбоциклический арил (например, фенил) и гетероциклические арильные группы (например, пиридин). Термин "карбоциклический" означает соединение, содержащее одну или более ковалентно замкнутых циклических структур, состоящих только из атомов углерода. Таким образом, термин "карбоциклическое кольцо" отличается от термина "гетероциклическое кольцо", в котором в структуре кольца содержится, по крайней мере, один атом, отличный от углерода. Термин "гетероарил" означает арильную группу, содержащую, по крайней мере, одно гетероциклическое кольцо.

Термин "галоген" означает атом, который выбирают из группы, включающей фтор. хлор, бром и иод.

Термин "кетон" означает остаток формулы -(R)_n-CO-R’, где R и R’ выбирают из группы, включающей насыщенный и ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, а n равно 0 или 1.

Термин "карбоновая кислота" означает остаток формулы -(R)_n-COOH, где R выбирают из группы, включающей насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, а n равно 0 или 1.

Термин "сложный эфир" означает остаток формулы -(R)_n-COOR’, где R и R’ независимо выбирают из группы, включающей насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, а n равно 0 или 1.

Термин "спирт" означает заместитель формулы -ROH, где R выбирают из группы, включающей водород, насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, и где остаток кольца по выбору замещен одним или более заместителями, которые независимо выбирают из группы, включающей алкил, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нитро и сложноэфирные остатки.

Термин "амид" означает заместитель формулы -NHCOR, где R выбирают из группы, включающей водород, алкил, гидроксил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, где остаток кольца по выбору замещен одним или более заместителями, которые независимо выбирают из группы, включающей алкил, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нитро и сложноэфирные остатки.

Термин "алкоксильный остаток" означает заместитель формулы -OR, где R является водородом или насыщенным или ненасыщенным алкильным остатком.

Термин "альдегид" означает остаток формулы -(R)_n-CHO, где R выбирают из группы, включающей насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, а n равно 0 или 1.

Термин "сульфон" означает остаток формулы -SO₃-R, где R выбирают из группы, включающей насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения описано соединение на основе азабензимидазола, имеющее структуру формулы I, II или III, где Z₁ и Z₂ независимо выбирают из группы, включающей азот и NH.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения описано соединение на основе азабензимидазола, имеющее структуру формулы I, II или III, где R₁, R₂, R₃ и R₄ независимо выбирают из группы, включающей водород, насыщенный или ненасыщенный алкил, замещенный по выбору остатками гомоциклических или гетероциклических колец, где остаток кольца по выбору замещен одним, двумя или тремя заместителями, которые независимо выбирают из группы, включающей алкил, алкокси, галоген, тригалогенметил, гидрокси, алкокси, карбоксилат, нитро и сложноэфирные остатки; и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, которые по выбору замещены одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, включающей алкил, алкокси, галоген, тригалогенметил, гидрокси, алкокси, карбоксилат, нитро и сложноэфирныс остатки.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения описано соединение на основе азабензимидазола, имеющее структуру формулы I, II или III, где R₂ и R₃ являются водородом.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения описано соединение на основе азабензимидазола, имеющее структуру формулы I, II или III, где R₁ является фенильной группой, по выбору замещенной одним. двумя или тремя заместителями, которые независимо выбирают из группы, включающей алкил, алкокси, галоген, тригалогенметил, гидрокси, алкокси, карбоксилат, нитро или сложноэфирные остатки.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения описано соединение на основе азабензимидазола, имеющее структуру формулы или III, где R₁ выбирают из группы, включающей заместители SABI.

Термин "заместители SABI" означает группу заместителей, включающую фенил, 2-нитрофенил, 3-нитрофенил, 4-нитрофенил, 2-хлорфенил, 3-хлорфенил, 4-хлорфенил, 2-метилфенил, 3-метилфенил, 4-метилфенил, 2-фторфенил, 3-фторфенил, 4-фторфенил, 2-(трифторметил)фенил, 3-(трифторметил)фенил, 4-(трифторметил)фенил, 2-метоксифенил, 3-метоксифенил, 4-метоксифенил, 2-карбоксифенил, 3-карбоксифенил и 4-карбоксифенил.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения описано соединение на основе азабензимидазола, имеющее структуру формулы I, II или III, где X₁ является серой.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения описано соединение на основе азабензимидазола, имеющее структуру формулы I, II или III, где X₁ является кислородом.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения описано соединение на основе азабензимидазола, имеющее структуру формулы I, II или III, где Z₃ является кислородом.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения описано соединение на основе азабензимидазола, имеющее структуру формулы I, II или III, где R₄ выбирают из группы, включающей метил и этил.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения описано соединение на основе азабензимидазола, имеющее структуру формулы I, II или III, где соединение на основе азабензимидазола выбирают из группы, включающей соединения SABI.

Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, включающая соединение по изобретению, как определено в данном тексте, или его соль и физиологически приемлемый носитель или разбавитель.

Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, включающая соединение, имеющее структуру формулы I, II или III, как определено в данном тексте, или их подгруппы, описанные в данном тексте.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения описана фармацевтическая композиция, в которой соединение на основе азабензимидазола выбирают из группы, включающей соединения SABI.

Термин "фармацевтическая композиция" означает смесь соединения азабензимидазола по изобретению с другими химическими компонентами, такими как разбавители или носители. Фармацевтическая композиция способствует ускорению введения соединения в организм. В данной области техники известны многочисленные способы введения соединения, включая, но не ограничиваясь ими, оральный, инъекционный, аэрозольный, парентеральный и местный способы. Фармацевтические композиции могут быть также получены при взаимодействии соединений с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и т.п.

Термин "физиологичеки приемлемый" относится к носителю или разбавителю, которые не приводят к снижению биологической активности и нейтрализации свойств соединения.

Термин "носитель" относится к химическому соединению, которое облегчает введение соединения в клетки или ткани. Например, диметилсульфоксид (ДМСО) является широко распространенным носителем, поскольку он способствует поглощению многих органических соединений клетками или тканями организма.

Термин "разбавитель" относится к химическим соединениям, которые в виде водного раствора растворяют активное соединение, а также стабилизируют биологически активную форму соединения. В данной области техники в качестве разбавителей используют соли, растворенные в буферных растворах. Одним из самых широко используемых буферных растворов является фосфатный буферный раствор, содержащий хлорид натрия, так как указанный буферный раствор по составу аналогичен солевому составу крови человека Так как соли буферного раствора могут поддерживать рН раствора при низких концентрациях, буферный разбавитель редко модифицирует биологическую активность соединения.

IV. Способы синтеза согласно изобретению

Другим аспектом изобретения является способ синтеза соединения на основе азабензимидазола формулы I, II и III, включающий следующие стадии:

(а) взаимодействие 2-амино-6-хлор-3-нитропиридина со вторым реагентом в растворителе с образованием первого промежуточного соединения, причем вторым реагентом является замещенный арильный цикл; (б) восстановление первого промежуточного соединения в присутствии катализатора и восстанавливающего агента с образованием второго промежуточного соединения; (в) взаимодействие второго промежуточного соединения с третьим реагентом и (г) очистка соединения по изобретению.

Согласно предпочтительному варианту воплощения изобретения используют способ синтеза соединения по изобретению, в котором замещенным арильным циклом является замещенный фенол, замещенный тиофенол и замещенный анилин.

Согласно предпочтительному варианту воплощения изобретения используют способ синтеза соединения по изобретению, в котором замещенный фенол, замещенный тиофенол и замещенный анилин выбирают из группы, включающей реагенты SABI.

Термин "реагенты SABI" относится к группе реагентов, включающей натриевые соли фенола, 2-нитрофенола, 3-нитрофенола, 4-нитрофенола, 2-хлорфенола, 3-хлорфенола, 4-хлорфенола, 2-крезола, 3-крезола, 4-крезола, 2-фторфенола, 3-фторфенола, 4-фторфенола, 2-(трифторметил)фенола, 3-(трифторметил)фенола, 4-(трифторметил)фенола, 2-метоксифенола, 3-метоксифенола, 4-метоксифенола, 2-гидроксибензойной кислоты, 3-гидроксибензойной кислоты, 4-гидроксибензойной кислоты, тиофенола, 2-нитротиофенола, 3-нитротиофенола, 4-нитротиофенола, 2-хлортиофенола, 3-хлортиофенола, 4-хлортиофенола, 2-тиокрезола, 3-тиокрезола, 4-тиокрезола, 2-фтортиофенола, 3-фтортиофенола, 4-фтортиофенола, 2-(трифторметил)тиофенола, 3-(трифторметил)тиофенола, 4-(трифторметил)тиофенола, 2-метоксибензолтиола, 3-метоксибензолтиола, 4-метоксибензолтиола, 2-меркаптобензойной кислоты, 3-меркаптобензойной кислоты, 4-меркаптобензойной кислоты, анилина, 2-нитроанилина, 3-нитроанилина, 4-нитроанилина, 2-хлоранилина, 3-хлоранилина, 4-хлораналина, 2-толуидина, 3-толуидина, 4-толуидина, 2-фторанилина, 3-фторанилина, 4-фторанилина, 2-(трифторметил)анилина, 3-(трифторметил)анилина, 4-(трифторметил)анилина, 2-анизидина, 3-анизидина, 4-анизидина, 2-аминобензойной кислоты, 3-аминобензойной кислоты и 4-аминобензойной кислоты.

Согласно предпочтительному варианту воплощения изобретения используют способ синтеза соединения по изобретению, в котором растворителем является н-пропанол.

Согласно другому предпочтительному варианту воплощения изобретения используют способ синтеза соединения по изобретению, в котором восстанавливающим агентом является водород.

Согласно другому предпочтительному варианту воплощения изобретения используют способ синтеза соединения по изобретению, в котором катализатором является никель Ренея.

Согласно другому предпочтительному варианту воплощения изобретения используют способ синтеза соединения по изобретению, в котором третьим реагентом является Ο-метилизомочевина.

Согласно другому предпочтительному варианту воплощения изобретения используют способ синтеза соединения по изобретению, в котором третий реагент является продуктом реакции S-метилизотиоуроний сульфата и алкилхлорформиата.

Согласно другому предпочтительному варианту воплощения изобретения используют способ синтеза соединения по изобретению, в котором алкилхлорформиатом является метилхлорформиат.

Согласно другому предпочтительному варианту воплощения изобретения используют способ синтеза соединения по изобретению, в котором алкилхлорформиатом является этилхлорформиат.

Описание сущности изобретения, представленное выше, не ограничивает объем изобретения, и другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из следующего описания предпочтительных вариантов воплощения изобретения, а также из формулы изобретения.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В настоящем изобретении, в частности, описаны способы модулирования функции серин/треонин протеинкиназ с помощью соединений на основе азабензимидазола. Кроме того, изобретение, в частности, относится к способам идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназ. Эти способы включают использование клеток, экспрессирующих серин/треонин протеинкиназу, например киназу RAF.

RAF является нерецепторной протеинкиназой, которая включается в клеточную мембрану в процессе связывания с активированным ферментом RAS, гидролизующим гуанинтрифосфат. RAS активизируется в процессе связывания активированным рецептором тирозин протеинкиназы, таким как EGFR или PDGFR, с белком-адаптором GRB2 и с фактором гуаниннуклеотидного обмена SOS. SOS отщепляет гуаниндифосфат от RAS, заменяет его на гуанинтрифосфат, тем самым активируя RAS. Затем RAS связывается с RAF и таким образом активирует RAF. Затем RAF может фосфорилировать другие белковые мишени по остаткам серина и треонина, такие как киназу (МЕК), которая фосфорилирует и, следовательно, активирует митоген-активированную протеинкиназу (МАРК). Таким образом, RAF является медиаторным фактором, контролирующим митоген-активированную трансдукцию сигнала.

В связи с важной ролью RAF в жизнедеятельности клеток модификации в аминокислотной последовательности RAF могут привести к изменению его функции и, следовательно, модифицировать поведение клеток. Роль RAF в клеточной пролиферации подтверждается обнаружением взаимосвязи мутаций в аминокислотной последовательности RAF с опухолями и онкологическими заболеваниями. Так как мутации в молекуле RAF. вызывающие онкологическое заболевание в клетках, приводят к образованию молекул RAF с нерегулируемой каталитической активностью, то ингибиторы RAF могут снизить или даже оборвать пролиферацию клеток, вызывающую онкологическое заболевание этих клеток.

Способы согласно настоящему изобретению могут быть использованы для определения соединений, модулирующих функцию протеинкиназы RAF в клетках. RAF фосфорилирует МЕК, которая в свою очередь фосфорилирует митоген-активированную протеинкиназу (МАРК). Методы определения только фосфорилирования МЕК с помощью RAF являются не достаточно чувствительными, так как уровни фосфорилирования МЕК невысоки. Чтобы преодолеть эту проблему, в способ определения согласно изобретению включено определение фосфорилирования как МЕК, так и МАРК. Сигнал фосфорилирования МАРК усиливает сигнал фосфорилирования МЕК и позволяет определять уровень RAF-зависимого фосфорилирования методом иммуно-ферментного анализа (ИФА). Кроме того, способ согласно изобретению характеризуется высокой производительностью, и таким образом можно быстро проанализировать множество соединений за короткий период времени.

С помощью способов согласно настоящему изобретению идентифицируют соединения, ингибирующие функцию протеинкиназы RAF. Такими соединениями являются производные на основе азабензимидазола.

Хотя производные на основе азабензимидазола хорошо изучены относительно их способности ингибировать ферменты, включенные в синтез нуклеотидов у бактерий, многие из этих соединений еще не достаточно исследованы по отношению к ингибированию протеинкиназ.

Так как RAF характеризуется высокой аминокислотной гомологией с другими серин/треонин протеинкиназами, можно предположить, что соединения на основе азабензимидазола будут ингибировать другие серин/треонин протеинкиназы, отличающиеся от RAF, включая рецепторные и нерецепторные серин/треонин протеинкиназы.

Способы согласно изобретению относятся также к другим соединениями, которые модулируют функцию RAF в клетках, так как высокая производительность этих способов позволяет анализировать большое число молекул за короткий промежуток времени. Следовательно, с помощью способов согласно изобретению можно идентифицировать ряд существующих молекул, не включенных в область данного изобретения и модулирующих функцию STK.

I. Биологическая активность соединений на основе азабензимидазола

Соединения на основе азабензимидазола согласно настоящему изобретению анализируют по их способности ингибировать функцию протеинкиназы RAF. Биологические способы анализа и результаты определения ингибирующей способности представлены в данном тексте описания. Для измерения модулирования функции протеинкиназы соединениями на основе азабензимидазола используют методы с высокой производительностью, аналогичные опубликованным Tang с соавт. в заявке на выдачу патента США, cep. № 08/702232 "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for Treatment of Disease" (Комбинаторная библиотека индолинон-содержащих и аналогичных продуктов, способы лечения заболеваний), Lyon & Lyon Docket № 221/187, поданной 23 августа 1996 года. Заявка № 08/702232 полностью включена в данное описание изобретения, включая любые фигуры.

II. Заболевания-мишени, предназначенные для лечения соединениями на основе азабензимидазола

Разработанные в данном изобретении способы, соединения и фармацевтические композиции предназначены для ингибирования нарушений клеточной пролиферации путем модулирования функции протеинкиназы RAF. Нарушения пролиферации приводят к нежелательной пролиферации одной или более подгрупп клеток в многоклеточном организме, что в свою очередь наносит вред организму. Способы, соединения и фармацевтические композиции, описанные в данном тексте, могут быть также использованы для профилактики и лечения других нарушений в организме, таких как нарушения, связанные с преждевременной гибелью клеток (то есть неврологические заболевания) или с воспалительным процессом. Такие нарушения могут являться результатом несоответствующей функции молекул RAF или несоответствующей функции молекул, подобных протеинкиназе RAF.

Изменение функции молекул протеинкиназы RAF или протеинкиназ, подобных RAF, может привести в увеличению или снижению клеточной пролиферации, которые наблюдаются при определенных заболеваниях. Аномальные состояния клеточной пролиферации включают опухолевые заболевания, фиброзные нарушения, мезангиальные нарушения, аномальные образования и развитие сосудов, заживление ран, псориаз, рестеноз и воспалительные процессы.

Фиброзные нарушения относятся к аномальному образованию внеклеточного матрикса клеток. Примером фиброзного нарушения является цирроз печени. Это заболевание характеризуется увеличением концентрации компонентов внеклеточного матрикса, что приводит к образованию рубцов в печени, а затем к заболеванию печени.

Пролиферативные нарушения мезангиальных клеток происходят из-за аномальной дифференциации мезангиальных клеток и включают различные заболевания почек у человека, такие как гломерулонефрит, диабетическая нефропатия, злокачественный нефросклероз, синдромы тромбозной микроангиопатии, отторжение трансплантата и гломерулопатии.

Предпочтительными типами онкологических заболеваний, которые могут подвергаться лечению с использованием способов и соединений по изобретению, являются рак легких, рак яичников, рак молочной железы, рак мозга, рак внутриаксиального мозга, рак ободочной кишки, рак предстательной железы, саркома ксеродермы, меланома и глиома. Данные, подтверждающие эффективность использования способов и соединений по изобретению для задерживания или изменения направления пролиферации раковых клеток, представлены в данном тексте описания в виде ссылок.

Нарушения процессов образования и развития сосудов являются результатом избыточной пролиферации кровеносных сосудов. Пролиферация кровеносных сосудов необходима для ряда нормальных процессов, таких как эмбриональное развитие, образование желтого тела, заживление ран и регенерация органов. Однако пролиферация кровеносных сосудов играет также значительную роль в развитии раковых опухолей. Другие примеры нарушений пролиферации кровеносных сосудов включают артрит, при котором новые капиллярные сосуды проникают в сустав и разрушают хрящ. Кроме того, заболевания, связанные с пролиферацией кровеносных сосудов, включают глазные заболевания, такие как диабетическая ретинопатия, при которой новые капилляры проникают в стекловидное тело, вызывают кровотечение и слепоту. И наоборот, нарушения, связанные с сужением, спазмами или закупориванием кровеносных сосудов, такие как рестеноз, также являются результатом отрицательного влияния на регуляцию протеинкиназ.

Более того, процессы образования и развития кровеносных сосудов связаны с ростом злокачественных опухолей и метастазированием. Для продолжения роста быстроразвивающейся раковой опухоли требуется снабжение насыщенной кислородом кровью с питательными веществами. В результате в большинстве случаев одновременно с ростом опухоли образуется аномально большое число капиллярных кровеносных сосудов, обеспечивающих снабжение опухоли. Кроме обеспечения опухоли питательными веществами новые кровеносные сосуды, внедренные в опухоль, служат воротами для опухолевых клеток, что обеспечивает включение опухолевых клеток в кровоток и их метастазирование в отдаленных участках организма (Статья Folkman, J. Natl. Cancer Inst., вып.82, стр.4-6, 1990).

Несоответствующая активность RAF может стимулировать нарушение пролиферации клеток. Показано, что молекулы, специфически модулирующие функцию протеинкиназы RAF, ингибируют клеточную пролиферацию. Более конкретно, молекулы антисмысловых нуклеиновых кислот, которые предназначены как для связывания матричной РНК, кодирующей протеинкиназу RAF, так и для блокирования трансляции с этой матрицы, эффективно обращают трансформацию клеток А549 in vitro (Статья Monia и соавт., Nature Medicine, вып.2, стр.688, 1996). Эта статья полностью включена в текст настоящего изобретения в качестве ссылки, включая все фигуры и таблицы. Клетки А549 означают злокачественные клетки человека.

Эти исследования, направленные на антисмысловые RAF, свидетельствуют о том, что соединения на основе азабензимидазола по изобретению, которые модулируют функцию протеинкиназы RAF, могут снижать и, по-видимому, обращать пролиферацию злокачественных клеток в организме. Данные соединения на основе азабензимидазола можно анализировать in vitro с помощью методов, описанных в примере. Более того, эти соединения на основе азабензимидазола можно анализировать in vivo no их влиянию на опухолевые клетки с использованием ксенотрансплантатных методов, также описанных в примере.

Существует, по крайней мере, два пути, по которым несоответствующая активность RAF может вызывать нежелательную клеточную пролиферацию определенного типа клеток: (1) прямое стимулирование роста отдельной клетки или (2) увеличение новообразования кровеносных сосудов в конкретных участках, таких как опухолевая ткань, тем самым способствуя росту ткани.

Использование настоящего изобретения будет более эффективным, если прежде всего определить, побуждается ли нарушение клеточной пролиферации киназой RAF. Как только такие нарушения идентифицированы. можно выявить пациентов, страдающих от таких нарушений, путем анализа симптомов с использованием процедур, хорошо известных терапевтам или ветеринарам, являющимся специалистами в данной области техники. Такие пациенты могут быть подвергнуты лечению, как указано в данном тексте описания.

Определение зависимости нарушения клеточной пролиферации от киназы RAF можно осуществить путем определения прежде всего уровня активности RAF в клетке или в определенном участке тела пациента. Например, в случае раковых клеток уровень активности одной или более RAF можно сравнить с уровнем активности в клетках при независимых от RAF и вызванных RAF онкологических заболеваниях. Если в опухолевых клетках наблюдается более высокий уровень активности RAF, чем в клетках при зависимых от RAF онкологических заболеваниях, предпочтительно равны и или более по сравнению с зависимыми от RAF онкологическими заболеваниями, то такие клетки являются объектом для лечения с использованием модулирующих RAF способов и соединений по изобретению.

В случае нарушений клеточной пролиферации, возникающих из-за нежелательной пролиферации не-раковых клеток, уровень активности RAF сравнивают с уровнем активности в общей популяции (например, средний уровень активности, наблюдаемый в общей популяции людей или животных за исключением людей или животных, страдающих от нарушений клеточной пролиферации). Если нарушение, связанное с нежелательной клеточной пролиферацией, характеризуется более высоким уровнем активности RAF по сравнению с наблюдаемым уровнем в общей (основной) популяции, то это нарушение является объектом для лечения с использованием описанных модулирующих RAF способов и соединений по изобретению.

III. Фармацевтические композиции и введение соединении на основе азабензимидазола

Способы получения фармацевтических композиций, содержащих соединения, способы определения количеств соединений для введения пациентам и способы введения соединений в организм описаны Tang с соавт. в заявке на выдачу патента США cep. № 08/702232 "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for Treatment of Disease" (Комбинаторная библиотека индолинон-содержащих и аналогичных продуктов, способы лечения заболеваний), Lyon & Lyon Docket № 221/187, поданной 23 августа 1996 г., и Buzzetti с соавт. в публикации международной патентной заявки WO 96/22976 "Hydrosoluble 3-Arylidone-2-Oxindol Derivatives as Tyrosine Kinase Inhibitors" (Водорастворимые производные 3-арилиден-2-оксиндола в качестве ингибиторов тирозинкиназы), опубликованной 1 августа 1996 г. Обе публикации полностью включены в данное описание изобретения, включая любые фигуры. Специалисту в данной области техники представляется очевидным, что указанные описания могут быть использованы в изобретении и могут быть легко приспособлены для использования в условиях изобретения.

Примеры

Приведенные ниже примеры не ограничивают область изобретения и представляют различные аспекты и признаки настоящего изобретения. В примерах описаны способы синтеза соединений настоящего изобретения и способы измерения воздействия соединения на функцию протеинкиназы RAF.

Использованные в методиках клетки имеются в продаже. Векторы нуклеиновых кислот, содержащиеся в клетках, также имеются в продаже, а последовательности генов различных протеинкиназ легко определить с помощью баз данных по последовательностям. Таким образом, специалист в данной области техники при необходимости может легко получить линии клеток с помощью комбинирования промышленно выпускаемых препаратов клеток, векторов нуклеиновых кислот и генов протеинкиназ, используя методы, легко доступные для специалиста в данной области техники.

Пример 1: Методики синтеза азобензоимидазолсодержащих соединений по настоящему изобретению

Настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами без ограничений, в которых, если особо не оговорено:

(i) упаривание осуществляют на роторном испарителе в вакууме;

(ii) процессы проводят при атмосферном давлении инертного газа, такого как азота;

(iii) высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводят на обращеннофазном силикагеле Merck LiChrosorb RP-18 (Merck, Дармштадт, Германия);

(iv) выходы соединений приведены только для иллюстрации и не обязательно являются максимально возможными;

(v) температуры плавления приведены без учета поправки и были определены с помощью цифрового прибора для определения температуры плавления HWS Mainz SG 2000;

(vi) структуры всех соединений формул I, II и III настоящего изобретения подтперждены спектроскопией протонного магнитного резонанса на спектрофотометре Bruker AMX500-NMR, элементным анализом и, в определенных случаях, масс-спектроскопией;

(vii) чистоту соединений определяют с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на силикагеле (Merck Silica Gel 60 F254) или с помощью ВЭЖХ;

(vii) промежуточные соединения обычно полностью не характеризуют и чистоту оценивают методами ТСХ или ВЭЖХ.

Методики синтеза

Соединение A-90:

2-метоксикарбониламино-6-(фенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

2-Амино-3-нитро-6-(фенилмеркапто)пиридин получают кипячением с обратным холодильником 2-амино-6-хлор-3-нитропиридина (84,0 г, 0,484 моль) и тиофенолята натрия (Fluka) (72,0 г, 0,545 моль) в 2-пропаноле (1500 мл) в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры полученную суспензию разбавляют водой (100 мл), твердый остаток собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и 2-пропанолом и сушат в вакууме при 50°С, при этом получают 109,1 г (выход 95%) 2-амино-3-нитро-6-(фенилмеркапто)пиридина, т.пл.148-152°С.

2,3-Диамино-6-(фенилмеркапто)пиридин получают гидрированием 2-амино-3-нитро-6-(фенилмеркапто)пиридина (107,1 г, 0,433 моль) под давлением 5 атм в атмосфере Н₂ в присутствии 30 г Ni-Ренея в 1200 мл 2-пропанола при 70°С. Через 4 ч (29,1 л водорода) реакционную смесь охлаждают до 4°С при постоянном перемешивании. Остаток собирают фильтрованием в вакууме, промывают 2-пропанолом и сушат при 50°С в вакууме. Объединенные фильтраты концентрируют при пониженном давлении и перекристаллизовывают из 2-пропанола. После двойного промывания прибора для гидрирования 1000 мл ТГФ, упаривания при пониженном давлении и перекристаллизации из 2-пропанола осадок собирают и высушивают при 50°С в вакууме, при этом получают 80,4 г (выход 87,1%) 2,3-диамино-6-(фенилмеркапто)пиридина, т.пл.119-122°С.

2-Meтоксикарбониламино-6-(фенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин получают добавлением по каплям метилхлорформиата (34 мл, 0,44 моль) в охлажденный (5-15°С) раствор сульфата S-метилизотиоурония (53 г, 0,19 моль) (Aldrich) в 68 мл воды при температуре ниже 20°С. Затем осторожно добавляют водный раствор гидроксида натрия (116 г, 25% NaOH), при этом образуется белый осадок. После 20 мин добавляют воду (210 мл) и доводят рН до 4,0 уксусной кислотой (ледяная кислота, 34 мл). В полученную смесь по каплям добавляют раствор 2,3-диамино-6-(фенилмеркапто) пиридина (37,8 г, 0,174 моль) в 210 мл этанола и нагревают при 85-90°С в течение 2 ч. После охлаждения реакционной смеси в течение ночи осадок выделяют фильтрованием, промывают теплой водой (1000 мл), сушат и перекристаллизовывают из уксусной кислоты и этанола при 4°С. Осадок выделяют фильтрованием, промывают метанолом и сушат при 50°С в вакууме, при этом получают 30 г (выход 57,4%) 2-метоксикарбониламино-6-(фенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридина, т.пл.269-274°С (разл.).

Соединение А-3: 2-Метоксикарбониламино-6-фенокси-3H-имидазо[4,5-b]пиридин

2-Метоксикарбониламино-6-фенокси-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин получают по аналогичной методике, как в примере А-90, заменяя тиофенолят натрия на фенолят натрия, т.пл.>280°С (разл.).

Соединение А-4: 2-этоксикарбониламино-6-фенокси-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

2-Этоксикарбониламино-6-фенокси-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин получают по аналогичной методике, указанной в примере А-3, заменяя метил хлорформиат на этилхлорформиат, т.пл.>280°С (разл.).

Соединение А-1: 2-оксо-6-фенокси-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

2-Оксо-6-фенокси-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин получают по аналогичной методике, указанной в примере А-3, используя прямое взаимодействие O-метилизомочевины с 2,3-диамино-6-(фенилмеркапто)пиридином вместо продукта реакции сульфата S-метилизотиоурония и метилхлорформиата, т.пл.277-278°С.

Соединение А-2: 2-Оксо-6-фенилмеркапто-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

2-Оксо-6-фенилмеркапто-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин получают по аналогичной методике, указанной в примере А-1, заменяя фенолят натрия на тиофенолят натрия, т.пл.253-254°С.

Сoединения А-5-А-25

Следующие соединения получают по аналогичной методике, указанной в примере А-1, заменяя фенолят натрия на соответствующий тиофенолят натрия. В примерах А-23, А-24 и А-25 карбоксильные группы защищают метиловым, этиловым, бензиловым, трет-бутиловым или другими подходящими сложными эфирами и затем на последней стадии снимают защиту с образованием требуемых соединений.

А-5 2-оксо-6-(2-нитрофенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-6 2-оксо-6-(3-нитрофенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-7 2-оксо-6-(4-нитрофенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-8 2-оксо-6-(2-хлорфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-9 2-оксо-6-(3-хлорфенокси)-3Н-имидазо [4,5-b]пиридин

A-10 2-оксо-6-(4-хлорфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-11 2-оксо-6-(2-метилфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-12 2-оксо-6-(3-метилфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-13 2-оксо-6-(4-метилфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-14 2-оксо-6-(2-фторфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-15 2-оксо-6-(3-фторфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-16 2-оксо-6-(4-фторфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-17 2-оксо-6-[2-(трифторметил)фенокси]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-18 2-оксо-6-[3-(трифторметил)фенокси]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-19 2-оксо-6-[4-(трифторметил)фенокси]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-20 2-оксо-6-(2-метоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-21 2-оксо-6-(3-метоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-22 2-оксо-6-(4-метоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-23 2-оксо-6-(2-карбоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-24 2-оксо-6-(3-карбоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-25 2-оксо-6-(4-карбоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

Соединения А-26-А-46

Следующие соединения получают по аналогичной методике, указанной в примере А-2, заменяя тиофенолят натрия на соответствующий тиофенолят. В примерах А-44, А-45 и А-46 карбоксильные группы защищают метиловым, этиловым, бензиловым, трет-бутиловым или другими подходящими сложными эфирами и затем на последней стадии снимают защиту с образованием требуемых соединений.

А-26 2-оксо-6-(2-нитрофенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-27 2-оксо-6-(3-нитрофенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-28 2-оксо-6-(4-нитрофенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-29 2-оксо-6-(2-хлорфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-30 2-оксо-6-(3-хлорфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-31 2-оксо-6-(4-хлорфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-32 2-оксо-6-(2-метилфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-33 2-оксо-6-(3-метилфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-34 2-оксо-6-(4-метилфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-35 2-оксо-6-(2-фторфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-36 2-оксо-6-(3-фторфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-37 2-оксо-6-(4-фторфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-38 2-оксо-6-[2-(трифторметил)фенилмеркапто]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-39 2-оксо-6-[3-(трифторметил)фенилмеркапто]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-40 2-оксо-6-[4-(трифторметил)фенилмеркапто]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-41 2-оксо-6-(2-метоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-42 2-оксо-6-(3-метоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-43 2-оксо-6-(4-метоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-44 2-оксо-6-(2-карбоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-45 2-оксо-6-(3-карбоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-46 2-оксо-6-(4-карбоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

Соединения А-47-А-68

Следующие соединения получают по аналогичной методике, указанной в примере А-1, заменяя фенолят натрия на соответствующую анилиновую соль. В примерах А-66, А-67 и А-68 карбоксильные группы защищают метиловым, этиловым, бензиловым, трет-бутиловым или другими подходящими сложными эфирами и затем на последней стадии снимают защиту с образованием требуемых соединений.

А-47 2-оксо-6-фениламино-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-48 2-оксо-6-(2-нитрофениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-49 2-оксо-6-(3-нитрофениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-50 2-оксо-6-(4-нитрофениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-51 2-оксо-6-(2-хлорфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-52 2-оксо-6-(3-хлорфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-53 2-оксо-6-(4-хлорфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-54 2-оксо-6-(2-метилфениламино)-3Н-имидаз [4,5-b]пиридин

А-55 2-оксо-6-(3-метилфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-56 2-оксо-6-(4-метилфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-57 2-оксо-6-(2-фторфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-58 2-оксо-6-(3-фторфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-59 2-оксо-6-(4-фторфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-60 2-оксо-6-[(2-трифторметил)фениламино]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-61 2-оксо-6-[(3-трифторметил)фениламино]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-62 2-оксо-6-[(4-трифторметил)фениламино]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-63 2-оксо-6-(2-метоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-64 2-оксо-6-(3-метоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-65 2-оксо-6-(4-метоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-66 2-оксо-6-(2-карбоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-67 2-оксо-6-(3-карбоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-68 2-оксо-6-(4-карбоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

Соединения А-69-А-89

Следующие соединения получают по аналогичной методике, указанной в примере А-3, заменяя фенолят натрия на соответствующий фенолят. В примерах А-87, А-88 и А-89 карбоксильные группы защищают метиловым, этиловым, бензиловым, трет-бутиловым или другими подходящими сложными эфирами и затем на последней стадии снимают защиту с образованием требуемых соединений.

А-69 2-метоксикарбониламино-6-(2-нитрофенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-70 2-метоксикарбониламино-6-(3-нитрофенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-71 2-метоксикарбониламино-6-(4-нитрофенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-72 2-метоксикарбониламино-6-(2-хлорфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-73 2-метоксикарбониламино-6-(3-хлорфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-74 2-метоксикарбониламино-6-(4-хлорфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-75 2-метоксикарбониламино-6-(2-метилфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-76 2-метоксикарбониламино-6-(3-метилфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-77 2-метоксикарбониламино-6-(4-метилфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-78 2-метоксикарбониламино-6-(2-фторфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-79 2-метоксикарбониламино-6-(3-фторфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-80 2-метоксикарбониламино-6-(4-фторфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-81 2-метоксикарбониламино-6-[2-(трифторметил)фенокси]-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-82 2-метоксикарбониламино-6-[3-(трифторметил)фенокси]-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-83 2-метоксикарбониламино-6-[4-(трифторметил)фенокси]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-84 2-метоксикарбониламино-6-(2-метоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-85 2-метоксикарбониламино-6-(3-метоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-86 2-метоксикарбониламино-6-(4-метоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-87 2-метоксикарбониламино-6-(2-карбоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-88 2-метоксикарбониламино-6-(3-карбоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-89 2-метоксикарбониламино-6-(4-карбоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

Соединения А-91-А-111

Следующие соединения получают по аналогичной методике, указанной в примере А-90, заменяя тиофенолят натрия на соответствующий тиофенолят. В примерах А-109, А-110 и А-111 карбоксильные группы защищают метиловым, этиловым, бензиловым, трет-бутиловым или другими подходящими сложными эфирами и затем на последней стадии снимают защиту с образованием требуемых соединений.

А-91 2-метоксикарбониламино-6-(2-нитрофенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-92 2-метоксикарбониламино-6-(3-нитрофенилмеркапто)-3Н-имидазо [4,5-b]-пиридин

А-93 2-метоксикарбониламино-6-(4-нитрофенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-94 2-метоксикарбониламино-6-(2-хлорфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-95 2-метоксикарбониламино-6-(3-хлорфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

A-96 2-метоксикарбониламино-6-(4-хлорфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-97 2-метоксикарбониламино-6-(2-метилфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-98 2-метоксикарбониламино-6-(3-метилфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-99 2-метоксикарбониламино-6-(4-метилфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-100 2-мотоксикарбониламино-6-(2-фторфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-101 2-метоксикарбониламино-6-(3-фторфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-102 2-метоксикарбониламино-6-(4-фторфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-103 2-метоксикарбониламино-6-[2-(трифторметил)фенилмеркапто]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-104 2-метоксикарбониламино-6-[3-(трифторметил)фенилмеркапто]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-105 2-метоксикарбониламино-6-[4-(трифторметил)фенилмеркапто]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-106 2-метоксикарбониламино-6-(2-метоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-107 2-метоксикарбониламино-6-(3-метоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b] пиридин

А-108 2-метоксикарбониламино-6-(4-метоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-109 2-метоксикарбониламино-6-(2-карбоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-110 2-метоксикарбониламино-6-(3-карбоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-111 2-метоксикарбониламино-6-(4-карбоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

Соединения А-112-А-133

Следующие соединения получают по аналогичной методике, указанной в примере А-3, заменяя фенолят натрия на соответствующую анилиновую соль. В примерах А-131, А-132 и А-133 карбоксильные группы защищают метиловым, этиловым, бензиловым, трет-бутиловым или другими подходящими сложными эфирами и затем на последней стадии снимают защиту с образованием требуемых соединений.

А-112 2-метоксикарбониламино-6-фениламино-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-113 2-метоксикарбониламино-6-(2-нитрофениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-114 2-метоксикарбониламино-6-(3-нитрофениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-115 2-метоксикарбониламино-6-(4-нитрофениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-116 2-метоксикарбониламино-6-(2-хлорфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-117 2-метоксикарбониламино-6-(3-хлорфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-118 2-метоксикарбониламино-6-(4-хлорфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-119 2-метоксикарбониламино-6-(2-метилфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-120 2-метоксикарбониламино-6-(3-метилфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-121 2-метоксикарбониламино-6-(4-метилфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-122 2-метоксикарбониламино-6-(2-фторфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-123 2-метоксикарбониламино-6-(3-фторфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-124 2-метоксикарбониламино-6-(4-фторфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-125 2-метоксикарбониламино-6-[2-(трифторметил)фениламино]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-126 2-метоксикарбониламино-6-[3-(трифторметил)фениламино]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-127 2-метоксикарбониламино-6-[4-(трифторметил)фениламино]-3Н-имидазо [4,5-b]пиридин

А-128 2-метоксикарбониламино-6-(2-метоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-129 2-метоксикарбониламино-6-(3-метоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-130 2-метоксикарбониламино-6-(4-метоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-131 2-метоксикарбониламино-6-(2-карбоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-132 2-метоксикарбониламино-6-(3-карбоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-133 2-метоксикарбониламино-6-(4-карбоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

Соединения А-134-А-154

Следующие соединения получают по аналогичной методике, указанной в примере А-4, заменяя фенолят натрия на соответствующий фенолят. В примерах А-152, А-153 и А-154 карбоксильные группы защищают метиловым, этиловым, бензиловым, трет-бутиловым или другими подходящими сложными эфирами и затем на последней стадии снимают защиту с образованием требуемых соединений.

А-134 2-этоксикарбониламино-6-(2-нитрофенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-135 2-этоксикарбониламино-6-(3-нитрофенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-136 2-этоксикарбониламино-6-(4-нитрофенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-137 2-этоксикарбониламино-6-(2-хлорфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-138 2-этоксикарбониламино-6-(3-хлорфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-139 2-этоксикарбониламино-6-(4-хлорфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-140 2-этоксикарбониламино-6-(2-метилфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-141 2-этоксикарбониламино-6-(3-метилфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-142 2-этоксикарбониламино-6-(4-метилфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-143 2-этоксикарбониламино-6-(2-фторфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-144 2-этоксикарбониламино-6-(3-фторфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-145 2-этоксикарбониламино-6-(4-фторфенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-146 2-этоксикарбониламино-6-[2-(трифторметил)фенокси]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-147 2-этоксикарбониламино-6-[3-(трифторметил)фенокси]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-148 2-этоксикарбониламино-6-[4-(трифторметил)фенокси]-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-149 2-этоксикарбониламино-6-(2-метоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-150 2-этоксикарбониламино-6-(3-метоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-151 2-этоксикарбониламино-6-(4-метоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-152 2-этоксикарбониламино-6-(2-карбоксифенокси)-3H-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-153 2-этоксикарбониламинo-6-(3-карбоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-154 2-этоксикарбониламино-6-(4-карбоксифенокси)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

Соединения А-155-А-176

Следующие примеры получают по аналогичной методике, указанной в примере А-4, заменяя фенолят натрия на соответствующий тиофенолят. В примерах А-174, А-175 и А-176 карбоксильные группы защищают метиловым, этиловым, бензиловым, трет-бутиловым или другими подходящими сложными эфирами и затем на последней стадии снимают защиту с образованием требуемых соединений.

А-155 2-этоксикарбониламино-6-фенилмеркапто-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-156 2-этоксикарбониламино-6-(2-нитрофенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-157 2-этоксикарбониламино-6-(3-нитрофенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-158 2-этоксикарбониламино-6-(4-нитрофенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-159 2-этоксикарбониламино-6-(2-хлорфенилмеркапто)-3Н-мидазо[4,5-b]-пиридин

А-160 2-этоксикарбониламино-6-(3-хлорфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-161 2-этоксикарбониламино-6-(4-хлорфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-162 2-этоксикарбониламино-6-(2-метилфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-163 2-этоксикарбониламино-6-(3-метилфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-164 2-этоксикарбониламино-6-(4-метилфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-165 2-этоксикарбониламино-6-(2-фторфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-166 2-этоксикарбониламино-6-(3-фторфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-167 2-этоксикарбониламино-6-(4-фторфенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-168 2-этоксикарбониламино-6-[2-(трифторметил)фенилмеркапто]-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-169 2-этоксикарбониламино-6-[3-(трифторметил)фенилмеркапто]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-170 2-этоксикарбониламино-6-[4-(трифторметил)фенилмеркапто]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-171 2-этоксикарбониламино-6-(2-метоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-172 2-этоксикарбониламино-6-(3-метоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-173 2-этоксикарбониламино-6-(4-метоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-174 2-этоксикарбониламино-6-(2-карбоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-175 2-этоксикарбониламино-6-(3-карбоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-176 2-этоксикарбониламино-6-(4-карбоксифенилмеркапто)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

Соединения А-177-А-198

Следующие примеры получают по аналогичной методике, указанной в примере А-4, заменяя фенолят натрия на соответствующую анилиновую соль. В примерах А-196, А-197 и А-198 карбоксильные группы защищают метиловым, этиловым, бензиловым, трет-бутиловым или другими подходящими сложными эфирами и затем на последней стадии снимают защиту с образованием требуемых соединений.

А-177 2-этоксикарбониламино-6-фениламино-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-178 2-этоксикарбониламино-6-(2-нитрофениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-179 2-этоксикарбониламино-6-(3-нитрофениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-180 2-этоксикарбониламино-6-(4-нитрофениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-181 2-этоксикарбониламино-6-(2-хлорфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-182 2-этоксикарбониламино-6-(3-хлорфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-183 2-этоксикарбониламино-6-(4-хлорфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-184 2-этоксикарбониламино-6-(2-метилфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-185 2-этоксикарбониламино-6-(3-метилфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-186 2-этоксикарбониламино-6-(4-метилфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-187 2-этоксикарбониламино-6-(2-фторфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-188 2-этоксикарбониламино-6-(3-фторфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-189 2-этоксикарбониламино-6-(4-фторфениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]-пиридин

А-190 2-этоксикарбониламино-6-[2-(трифторметил)фениламино]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-191 2-этоксикарбониламино-6-[3-(трифторметил)фениламино]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-192 2-этоксикарбониламино-6-[4-(трифторметил)фениламино]-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-193 2-этоксикарбониламино-6-(2-метоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-194 2-этоксикарбониламино-6-(3-метоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-195 2-этоксикарбониламино-6-(4-метоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-196 2-этоксикарбониламино-6-(2-карбоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-197 2-этоксикарбониламино-6-(3-карбоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

А-198 2-этоксикарбониламино-6-(4-карбоксифениламино)-3Н-имидазо[4,5-b]пиридин

Пример 2: Метод определения фосфорилирующей функции RAF

Этот метод анализа позволяет определить степень катализируемого RAF фосфорилирования МЕК (белка-мишени протеинкиназы RAF), а также степень фосфорилирования МАРК (белка-мишени протеинкиназы МЕК). Последовательность гена RAF описана в статье Bonner c соавт., 1985, Molec. Cell. Biol., 5:1400-1407, и может быть получена в различных базах данных по последовательностям генов. Конструкция вектора нуклеиновой кислоты и клеточных линий, использованных для этой части изобретения, полностью описана в статье Morrison с соавт., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8855-8859.

Материалы и реагенты

1. Клетки Sf9 (Spodoptera frugiperda); GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

2. Буфер RIPA: 20 мМ Tris/HCl pH 7.4, 137 мМ NaCl, 10% раствор глицерина, 1 мМ PMSF, 5 мг/л апротенина, 0,5% Тритон Х-100.

3. Гибридный белок тиоредоксин-МЕК (Т-МЕК): экспрессию и очистку Т-МЕК афинной хроматографией осуществляют согласно рекомендациям производителей (каталог К 350-01 и R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego. CA).

4. His-MAPK (ERK 2); экспрессию His-содержащего МАРК осуществляют в клетках XL1 Blue, трансформированных вектором pUC18, кодирующим His-MAPK. His-MAPK очищают Ni-афинной хроматографией по известной методике (каталог 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA).

5. Антитела овцы против lgG мыши: Jackson laboratories, West Grove, PA (каталог 515-006-008, Lot# 28563).

6. Антитела, специфичные к протеинкиназе белка RAF-1: URP2653 фирмы UBI.

7. Буфер для нанесения: PBS, раствор хлорида натрия в фосфатном буфере фирмы GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

8. Буфер для промывки: TBST - 50 мМ Трис/НСl рН 7,2, 150 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100.

9. Блокирующий буфер: TBST, 0,1% этаноламин рН 7,4.

10. ДМСО, фирмы Sigma, St. Louis, МО.

11. Буфер для киназной реакции (KB): 20 мМ Hepes/HCl pH 7,2, 150 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100, 1 мМ PMSF, 5 мг/л апротенина, 75 мкМ ортованадата натрия, 0,5 мМ DTT и 10 мМ MgCl₂.

12. Смесь АТФ: 100 мМ MgCl₂, 300 мкМ АТФ, 10 мкКи γ-³³P АТФ (Dupont-NEN)/мл.

13. Раствор для остановки реакции: 1% фосфорная кислота фирмы Fisher, Pittsburgh, PA.

14. Полоски фильтровальной бумаги на основе фосфата целлюлозы Walla фирмы Wallac, Turku, Finland.

15. Раствор для промывки фильтров: 1% фосфорная кислота; фирмы Fisher, Pittsburgh, PA.

16. Устройство Plate Harvester Tomtec, фирмы Wallac, Turku, Finland.

17. Ридер Wallac beta plate, Turku, Finland.

18. Полипропиленовые планшеты для ИФА с V-образным дном с 96 лунками фирмы NUNC (Applied Scientific Catalog, AS-72092).

Методика

Все последующие стадии осуществляют при комнатной температуре, если специально не оговорено.

1. Нанесение антител: лунки планшета уравновешивают 100 мкл очищенной аффинной хроматографией специфичной антисывороткой овцы против антител мыши (1 мкг/100 мкл буфера для нанесения) в течение ночи при 4°С. Планшеты можно использовать в течение 2 недель при хранении их при 4°С.

2. Переворачивают планшет и удаляют жидкость. Добавляют 100 мкл блокирующего раствора и инкубируют в течение 30 мин.

3. Удаляют блокирующий раствор и промывают 4 раза буфером для промывки. Помещают чашку на бумажное полотенце и удаляют избыток жидкости.

4. В каждую лунку добавляют по 1 мкг атител, специфичных к RAF-1, и инкубируют в течение 1 ч. Промывают, как описано на стадии 3.

5. Размораживают лизаты клеток Sf9, инфицированных RAS/RAF, и разбавляют их буфером TBST до концентрации 10 мкг/100 мкл. В лунки добавляют по 10 мкг разбавленного лизата и инкубируют в течение 1 ч. В процессе инкубирования планшеты встряхивают. В отрицательном контроле лизат не добавляют. Лизаты из клеток насекомых SF9, инфицированных RAS/RAF, получают после инфицирования клеток рекомбинантными бакуловирусами (5 Mol а каждый вирус) и сбора клеток через 48 ч. Клетки промывают 1 раз PBS и лизируют в буфере RIPA. Нерастворимые компоненты удаляют центрифугированием (5 мин при 10000×g). Аликвоты лизатов замораживают в смеси сухой лед/этанол и хранят при -80°С до использования.

6. Несвязанные компоненты удаляют и промывают, как описано выше (стадия 3).

7. В каждую лунку добавляют 2 мкг Т-МЕК и 2 мкг His-MAPK и доводят объем до 40 мкл буфером для киназной реакции. Методы очистки Т-МЕК и МАРК из клеточных экстрактов описаны ниже в данном примере.

8. Соединения (стандартный концентрированный раствор 10 мг/мл ДМСО) или 20-кратные экстракты предварительно разбавляют в смеси TBST + 1% ДМСО. В лунку добавляют по 5 мкл предварительно разбавленных соединений/экстрактов, описанных на стадии 6. Инкубируют в течение 20 мин. В контроле лекарственные вещества отсутствуют.

9. Киназную реакцию активируют добавлением 5 мкл смеси АТФ, во время инкубирования планшет встряхивают на шейкере для планшетов ИФА.

10. Киназную реакцию останавливают через 60 мин добавлением в каждую лунку 30 мкл буфера для остановки реакции.

11. Фосфоцеллюлозные полоски фильтровальной бумаги и планшет помещают в устройство Tomtec. Осуществляют процесс сбора и фильтр промывают раствором для промывки фильтров в соответствии с рекомендациями поставщиков. Полоски фильтровальной бумаги сушат. Полоски фильтровальной бумаги запечатывают и помещают их в держатель. Держатель помещают в прибор для определения радиоактивности и в фильтрах определяют количество радиоактивного фосфора.

Другой способ: аликвоты объемом 40 мкл из отдельных лунок планшета можно перенести в соответствующие позиции фосфоцеллюлозных полосок фильтровальной бумаги. После сушки фильтров на воздухе их помещают в поддон. Поддон аккуратно покачивают и меняют промывной раствор каждые 15 мин в течение 1 ч. Полоски фильтровальной бумаги сушат на воздухе. Полоски фильтровальной бумаги запечатывают и помещают их в держатель, подходящий для определения количества радиоактивного фосфора в образцах. Держатель помещают в измерительный прибор и в полосках определяют количество радиоактивного фосфора.

Величины lC₅₀ определяют в соответствии с методикой для соответствующих соединений на основе азабензимидазола методом ИФА-RAF-1:

Величина lC₅₀ - концентрация ингибитора на основе азабензимидазола, которая приводит к уменьшению количества фосфорилированного белка-мишени или клеточного роста на 50%. Величины lC₅₀, определенные по степени фосфорилирования RAF-1 методом ИФА, представлены в таблице 2.

Пример 3: Очистка МАРК и МЕК

Белки МАРК и МЕК легко экспрессируются в клетках посредством субклонирования гена, кодирующего последовательность данных белков, в промышленно выпускаемый вектор, который экпрессирует белки с полигистидиновым свободным концом. Гены, кодирующие последовательности этих белков, можно получить в соответствующих лабораториях, где обычно работают с данными белками, или с помощью клонирования этих генов в клетках, содержащих библиотеки кДНК.

Библиотеки выпускаются фирмами, и специалисты в данной области техники могут легко создать зонды нуклеиновых кислот, гомологичные молекулам кДНК, кодирующих последовательности МЕК или МАРК, с использованием последовательностей нуклеиновых кислот МЕК и МАРК, доступных в различных базах данных генов, таких как Genbank. Клонирование гена можно провести очень быстро с использованием методик, легко доступных для специалистов в данной области.

Очистка белков МЕК и МАРК из клеточных экстрактов может быть проведена с использованием следующего модифицированного способа, описанного в статье Robbins с соавт., 1993, J. Biol. Chem., 268: 5097-5106:

1. Клетки лизируют методами озвучивания, осмотического шока или гомогенизатора типа French Press, имеющимися в распоряжении специалистов в данной области. Подходящий буфер для озвучивания описан ниже.

2. Твердый носитель, предварительно связанный с ионами никеля или кобальта, уравновешивают в равновесном буфере, описанном ниже. Полигистидиновый свободный конец специфически связывается с атомами кобальта или никеля на твердом носителе. Уравновешивание достигается 3-кратным промыванием смолы 10 объемами равновесного буфера по отношению к объему твердого носителя. Твердый носитель легко доступен для специалистов в данной области.

3. Клеточные лизаты добавляют к твердому носителю и уравновешивают в сосуде в течение некоторого периода времени. Другим способом, твердый носитель можно поместить в хроматографическую колонку и провести хроматографию лизата на твердом носителе.

4. Твердый носитель промывают буфером для промывки, описанным ниже.

5 Белки МЕК и МАРК элюируют необходимым количеством буфера для промывки (описанным ниже) для элюции основного количества белка из твердого носителя.

Буфер для озвучивания

50 мМ фосфат натрия рН 8,0

0,3 М хлорид натрия

10 мМ β-меркаптоэтанол

1% NP40

10 мМ NaF

0,5 мМ Pefablock

Уравновешивающий буфер

50 мМ фосфат натрия рН 8,0

0,3 М хлорид натрия

10 мМ β-меркаптоэтанол

1% NP40

10 мМ NaF

1 мМ имидазол

Буфер для промывки

50 мМ фосфат натрия рН 8,0

0,3 М хлорид натрия

10 мМ β-меркаптоэтанол

1% NP40

10 мМ NaF

10 мМ имидазол

Буфер для элюирования

50 мМ фосфат натрия рН 8,0

0,3 М хлорид натрия

10 мМ β-меркаптоэтанол

1% NP40

10 мМ NaF

10-500 мМ имидазол

Пример 4. Метод определения фосфорилирующей функции рецептора EGF

Киназную активность рецептора EGF (метод анализа EGFR-NIH3T3) в целых клетках определяют, как подробно описано в РСТ Publication WO 9640116, поданной 5 июня 1996 г. Tang с соавт. "Indolinone Compounds for the Treatment of Disease" (Соединения индолинона для лечения заболеваний", полностью включенной в настоящее описание, включая любые фигуры.

Величины lC₅₀, измеренные методом определения фосфорилирующей функции рецептора EGF, представлены в таблице 3.

Пример 5: Метод определения воздействия соединений на основе азабензимидазола на рост клеток, экспрессирующих RAS

Приведенный ниже метод предназначен для измерения скоростей роста клеток NIH-3T3, экспресирующих RAS. Цель метода заключается в определении эффекта соединений на рост клеток NIH-3T3, экспрессирующих H-Ras.

Материалы

Стерильные планшеты с 96 лунками с плоским дном

Стерильные планшеты с 96 лунками с круглым дном

Стерильная емкость объемом 25 мл или 100 мл

Пипетки, многоканальный пипетман

Стерильные наконечники для пипеток

Стерильные пробирки объемом 15 мл и 50 мл

Реагенты

0,4% SRB в 1% уксусной кислоте

10 мМ Трис-основание

10% ТХУ (трихлоруксусная кислота)

1% уксусная кислота

Стерильный ДМСО (Sigma)

Соединение в ДМСО (100 мМ или менее стандартного раствора)

Трипсин-ЭДТА (GIBCO BRL)

Клеточная линия

3Т3/H-Ras (клон 7 клеток NIH ЗТЗ, экспрессирующих геномный фрагмент гена онкогенной H-Ras).

Клетки получают в соответствии со следующей методикой:

1. Фрагмент гена, кодирующий последовательность Ras, субклонируют в промышленно выпускаемый вектор, который будет стабильно трансфектировать клетки NIH-3T3. Этот фрагмент происходит из генетически трансформированной аллели cHa-ras.

2. Клетки NIH-3T3 трансфектируют субклонированным вектором фосфаткальциевым методом. Клетки, экспрессирующие Ras, отбирают в 2% сыворотку в DMEM. Заметные колонии наблюдают через 2 недели. Трансформированные клетки собирают для создания устойчивой трансформированной клеточной линии.

Среда роста

2% сыворотка теленка/DMEM + 2 мМ глутамин, Pen/Strep

Методика:

День 0: Нанесение клеток на планшеты:

Данную стадию метода осуществляют в ламинаре.

1. Клетки обрабатывают трипсином. 200 мкл суспензии клеток переносят в 10 мл изотонического буфера. Число клеток подсчитывают с помощью прибора Coulter Counter.

2. Клетки разбавляют до концентрации 60000 клеток/мл средой для роста. В каждую лунку планшета с 96 лунками с плоским дном переносят по 100 мкл клеток, т.е. по 6000 клеток на лунку.

3. Для каждого соединения используют половину планшета (четыре ряда) и по четыре лунки для каждой концентрации соединения. Четыре лунки оставляют для контроля среды.

4. Мягко встряхивают планшет для равномерного связывания с клетками.

5. Планшет инкубируют при 37°С в инкубаторе, содержащем 10% СО₂.

День 1: Добавление соединения:

Данную стадию проводят под ламинаром.

1. В планшет с 96 лунками с круглым дном в каждую лунку вертикальных рядов (столбцов) с 1 по 11 добавляют по 120 мкл среды для роста, содержащей ДМСО, с концентрацией, в 2 раза большей (2х) по сравнению с конечной концентрацией ДМСО, определенной для самой высокой концентрации тестируемого соединения. Например, если самая высокая концентрация составляет 100 мкМ, которая была получена из стандартного концентрированного раствора (100 мМ), то концентрация 1х ДМСО равна 0,1%, и тогда 2х ДМСО будет составлять 0,2%. Этот планшет используют для титрования соединения, четыре ряда на 1 соединение.

2. В стерильной пробирке объемом 15 мл готовят раствор с самой высокой концентрацией соединения в среде роста + 2х ДМСО. Требуется 1 мл на 1 клеточную линию. Начальная концентрация соединения обычно составляет 100 мкМ, но может изменяться в зависимости от растворимости соединения.

3. В четыре лунки столбца 12 планшета с 96 лунками с круглым дном помещают по 240 мкл исходного раствора 2х с начальной концентрацией соединения. Проводят серию разбавлений 1:2 по направлению справа налево, перенося по 12 мкл из лунки колонки 12 в лунку колонки 11, из лунки колонки 11 в лунку колонки 10 и так далее до лунки колонки 2. Затем переносят по 100 мкл разбавлений соединения и по 100 мкл среды из колонки 1 в соответствующие лунки планшета с 96 лунками с плоским дном, в которых содержится по 100 мкл суспензии клеток. Общий объем в лунке должен составлять 200 мкл.

4. Снова помещают планшет в инкубатор и инкубируют в течение 3 дней.

День 4: Окрашивание клеток

Данную стадию проводят на лабораторном столе.

1. Среду удаляют. В каждую лунку добавляют по 200 мкл холодного раствора 10% ТХУ для фиксирования клеток. Планшет инкубируют, по меньшей мере, в течение 60 мин при 4°С.

2. ТХУ удаляют и промывают лунки водопроводной водой 5 раз. Планшет сушат, помещая его рабочей стороной на бумажные полотенца.

3. Клетки окрашивают, добавляя в каждую лунку по 100 мкл 0,4% раствора SRB и инкубируя планшет в течение 10 мин.

4. Раствор SRB удаляют и лунки промывают 1% уксусной кислотой 5 раз. Планшет сушат, помещая его рабочей стороной на бумажные полотенца.

5. Краситель солюбилизируют, добавляя в каждую лунку по 100 мкл 10 мМ раствора Трис-основания и инкубируя в течение 5-10 мин при перемешивании на качалке.

6. Поглощение измеряют при 570 нм по сравнению с 630 нм, помещая планшет в ридер Dynatech ELISA.

Отбирают соединения, ингибирующие скорость роста клеток, сверх-экспрессирующих Ras, как представлено в таблице 4.

Пример 6: Метод определения воздействия соединений на основе азабензимидазола на рост клеток А549.

Приведенный ниже метод предназначен для измерения скоростей роста клеток А549. Цель метода заключается в определении эффекта соединений на рост клеток А549 карциномы легкого человека. Эти клетки можно получить в торгово-промышленных предприятиях, например в коллекции АТСС (CCL185).

Материалы

Стерильные планшеты с 96 лунками с плоским дном

Стерильныe планшеты с 96 лунками с круглым дном

Стерильная емкость объемом 25 мл или 100 мл

Пипетки, многоканальный пипетман

Стерильные наконечники для пипеток

Стерильные пробирки объемом 15 мл и 50 мл

Реагенты

0,4% SRB в 1% уксусной кислоте

10 мМ Трис-основание

10% ТХУ

1% уксусная кислота

Стерильный ДМСО (Sigma)

Соединение в ДМСО (исходный стандартный раствор с концентрацией 100 мМ или менее)

Трипсин-ЭДТА (GIBCO BRL)

Клеточная линия и среда роста

Клетки А549 карциномы легкого человека (АТСС CCL185)

10% сыворотка эмбриона теленка в среде Ham’s F12-K

Методика:

День 0: Нанесение клеток на планшеты:

Данную стадию осуществляют в ламинаре.

1. Клетки обрабатывают трипсином. 200 мкл суспензии клеток переносят в 10 мл изотоничекого буфера. Число клеток подсчитывают с помощью прибора Coulter Counter.

2. Клетки разбавляют до концентрации 20000 клеток/мл средой для роста. В каждую лунку планшета с 96 лунками с плоским дном переносят по 100 мкл клеток, т.е. по 2000 клеток на лунку.

3. Для каждого соединения используют половину планшета (четыре ряда) и по четыре лунки для каждой концентрации соединения. Четыре лунки оставляют для контроля среды.

4. Мягко втряхивают планшеты для равномерного связывания с клетками.

5. Планшеты инкубируют при 37°С в инкубаторе, содержащем 10% СО₂.

День 1: Добавление соединения:

Данную стадию проводят под ламинаром.

1. В планшет с 96 лунками с круглым дном в каждую лунку вертикальных рядов (столбцов) с 1 по 1 1 добавляют по 120 мкл среды для роста, содержащей ДМСО, с концентрацией, в 2 раза большей (2х) по сравнению с конечной концентрацией ДМСО, определенной для самой высокой концентрации тестируемого соединения. Например, если самая высокая концентрация составляет 100 мкМ, которая была получена из концентрированного раствора (100 мМ), то концентрация 1х ДМСО равна 0,1%, и тогда 2х ДМСО будет составлять 0,2%. Этот планшет используют для титрования соединения, по четыре ряда на 1 соединение.

2. В стерильной пробирке объемом 15 мл готовят раствор с самой высокой концентрацией соединения в среде роста + 2х ДМСО. Требуется 1 мл на 1 клеточную линию. Начальная концентрация соединения обычно составляет 100 мкМ, но может изменяться в зависимости от растворимости соединения.

3. В четыре лунки столбца 12 планшета с 96 лунками с круглым дном помещают по 240 мкл исходного раствора 2х с начальной концентрацией соединения. Проводят серию разбавлений 1:2 по направлению справа налево, перенося по 120 мкл из лунки колонки 12 в лунку колонки 11, из колонки 11 в колонку 10 и так далее до колонки 2. Затем переносят по 100 мкл разбавлений соединения и по 100 мкл среды из колонки 1 в соответствующие лунки планшета с 96 лунками с плоским дном, в которых содержится по 100 мкл среды суспензии клеток. Общий объем в лунке должен составлять 200 мкл.

4. Снова помещают планшет в инкубатор и инкубируют в течение 3 дней.

День 5: Окрашивание клеток

Данную стадию проводят на лабораторном столе.

1. Среду удаляют. В каждую лунку добавляют по 200 мкл холодного раствора 10% ТХУ для фиксирования клеток. Планшет инкубируют, по крайней мере, в течение 60 мин при 4°С.

2. ТХУ удаляют и промывают лунки водопроводной водой 5 раз. Планшет сушат, помещая его рабочей стороной на бумажные полотенца.

3. Клетки окрашивают, добавляя в каждую лунку по 100 мкл 0,4% раствора SRB и инкубируя планшет в течение 10 мин.

4. Раствор SRB удаляют и лунки промывают 1% уксусной кислотой 5 раз. Планшет сушат, помещая его рабочей стороной на бумажные полотенца.

5. Краситель солюбилизируют, добавляя в каждую лунку по 100 мкл 10 мМ раствора Трис-основания и инкубируя в течение 5-10 мин при перемешивании на качалке.

6. Поглощение измеряют при 570 нм по сравнению с 630 нм, помещая планшет в ридер Dynatech ELISA.

Отбирают соединения, ингибирующие скорость роста клеток А549, как представлено в таблице 5.

Пpимер 7: Метод определения биологической активности модуляторов RAF in vivo

Ксенотрансплантатный анализ используют для измерения ингибирующей способности соединений по изобретению по отношению к клеткам опухолей яичников, меланомы, предстательной железы, легкого и молочной железы. Методика анализа подробно описана Tang с соавт. в публикации РСТ WO 9640116, поданной 5 июня 1996 г., "Indolinone Compounds for the Treatment of Disease" (Соединения индолинона для лечения заболеваний) и полностью включенной в текст настоящего описания в качестве ссылки, включая любые фигуры.

Иллюстративно описанное в данном тексте изобретение может быть использовано соответствующим образом при отсутствии любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые подробно не описаны в данном тексте. Использованные в данном тексте термины и выражения следует рассматривать как описательные термины, а не ограничивающие термины, и не следует считать, что при использовании таких терминов и выражений исключены любые эквиваленты рассмотренных или описанных признаков, или их части. Однако следует понимать, что в пределах области заявленного изобретения возможны различные модификации и варианты. Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение подробно описано в виде предпочтительных вариантов воплощения изобретения и необязательных признаков, специалисты в данной области техники могут использовать модификации и варианты описанных в данном тексте концепций, и что такие модификации и варианты будут находиться в пределах области изобретения, заявленной в формуле изобретения.

Специалисту в данной области техники представляется очевидным, что предметы настоящего изобретения легко воспроизвести, а также достичь упомянутые цели, преимущества и признаки, характерные для предмета изобретения. Описанные в настоящем изобретении молекулярные комплексы и способы, методики, способы лечения, молекулы, специфические соединения представлены в качестве демонстративных примеров в виде предпочтительных вариантов воплощения изобретения и не ограничивают объема изобретения. Изменения этих признаков и другие варианты использования, которые будут очевидными для специалистов в данной области техники и которые определены в формуле изобретения, находятся в пределах сущности изобретения.

Специалисту в данной области техники представляется очевидным, что изменение заместителей и модификаций, описанных в данном тексте, возможно только в пределах объема и сущности изобретения.

Все упомянутые в данном тексте патенты и публикации определяют уровень техники, к которому относится изобретение. Все патенты и публикации включены в текст данного описания в качестве ссылок в той же степени, как если бы для каждой определенной публикации было конкретно указано, что она включена в данное описание в качестве ссылки.

Изобретение, иллюстративно описанное в данном тексте, может быть использовано соответствующим образом при отсутствии любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые подробно не описаны в данном тексте. Таким образом, например, любой из использованных в данном тексте терминов "включающий", "содержащий по существу" и "состоящий из" может быть заменен на два других. Использованные в данном тексте термины и выражения следует рассматривать как описательные термины, а неограничивающие термины, и не следует считать, что при использовании таких терминов и выражений исключены любые эквиваленты рассмотренных или описанных признаков, или их части. При этом следует понимать, что возможны различные модификации в заявляемой области изобретения. Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение подробно описано в виде предпочтительных вариантов воплощения изобретения и необязательных признаков, специалисты в данной области техники могут использовать модификации и варианты описанных в данном тексте концепций, и что такие модификации и варианты будут находиться в пределах объема изобретения, заявленного в формуле изобретения.

Кроме того, если признаки или аспекты изобретения описаны в терминах групп Маркуша, то для специалистов в данной области техники представляется очевидным, что в изобретении описан таким образом любой индивидуальный представитель или подгруппа представителей формулы Маркуша. Например, если Х описан как выбираемый из группы, включающей бром, хлор и иод, то пункты, в которых Х означает бром, и пункты, в которых Х означает бром и хлор, полностью описаны.

Те ссылки, которые не были предварительно включены в текст описания в качестве ссылок, включая патентные и непатентные публикации, должны быть полностью включены в текст описания для всех целей. Другие варианты воплощения изобретения заявлены в следующих пунктах формулы.

Claims (32)

1. Соединение на основе азабензимидазола, имеющее структуру, представленную формулой I, II или III

где (a) R₁, R₂, R₃ и R₄ независимо выбраны из группы, включающей (i) водород; (ii) насыщенный или ненасыщенный алкил; (iii) NX₂X₃, где Х₂ и Х₃ независимо выбраны из группы, включающей водород, насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец; (iv) галоген или тригалогенметил; (v) кетон формулы -СО-Х₄, где Х₄ выбран из группы, включающей водород, алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец; (vi) карбоновая кислота формулы -(Х₅)_n-СООН или сложный эфир формулы -(Х₆)_n-СООН-Х₇, где Х₅, Х₆ и Х₇ независимо выбраны из группы, включающей алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, а n равно 0 или 1; (vii) спирт формулы (X₈)_n-OH или остаток алкокси формулы -(X₈)_n-O-X₉, где X₈ и Х₉ независимо выбраны из группы, включающей водород, насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, где кольцо по выбору замещено одним или более заместителями, которые независимо выбраны из группы, включающей алкил, алкокси, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нитро и сложноэфирные остатки, а n равно 0 или 1; (viii) амид формулы -NHCOX₁₀, где Х₁₀ выбран из группы, включающей алкил, гидроксил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, где кольцо по выбору замещено одним или более заместителями, которые независимо выбраны из группы, включающей алкил, алкокси, галоген, тригалогенметил, карбокислат, нитро и сложноэфирные остатки; (ix) -SO₂NX₁₁X₁₂, где Х₁₁ и X₁₂ выбраны из группы, включающей водород, алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец; (х) остаток гомоциклического или гетероциклического кольца, по выбору замещенный одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, включающей алкил, алкокси, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нитро и сложноэфирные остатки; (xi) альдегид формулы -СО-Н и (xii) сульфон формулы -SO₂-X₁₃, где Х₁₃ выбран из группы, включающей насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец;

(б) Z₁ и Z₂ независимо выбраны из группы, включающей азот, серу, кислород, NH и NR₄, при условии, что если один из Z₁ и Z₂ означает азот, NH или NR₄, то другой из Z₁ и Z₂ означает азот, серу, кислород, NH или NR₄, где R₄ определен выше, и

(в) Z₃ и X₁ независимо выбраны из группы, включающей азот, серу и кислород.

2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что упомянутые Z₁ и Z₂ независимо выбраны из группы, включающей азот и NH.

3. Соединение по п.2, отличающееся тем, что R₁, R₂, R₃ и R₄ независимо выбраны из группы, включающей (i) водород; (ii) насыщенный или ненасыщенный алкил, по выбору замещенный остатками гомоциклических или гетероциклических колец, или остатком полициклического кольца, в котором упомянутый циклический остаток по выбору замещен одним, двумя или тремя заместителями, которые независимо выбраны из группы, включающей алкил, галоген, тригалогенметил, гидрокси, алкокси, карбоксилат, нитро и сложноэфирный остаток и (iii) остаток гомоциклического или гетероциклического кольца, по выбору замещенный одним, двумя или тремя заместителями, которые независимо выбраны из группы, включающей алкил, галоген, тригалогенметил, гидрокси, алкокси, карбоксилат, нитро и сложноэфирный остаток.

4. Соединение по п.3, отличающееся тем, что упомянутые R₂ и R₃ являются водородом.

5. Соединение по п.4, отличающееся тем, что упомянутый R₁ является фенильной группой, по выбору замещенной одним, двумя или тремя заместителями, которые независимо выбраны из группы, включающей алкил, алкокси, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нитро или сложноэфирный остаток.

6. Соединение по п.5, отличающееся тем, что упомянутый R₁ выбран из группы, состоящей из заместителей SABI.

7. Соединение по п.6, отличающееся тем, что упомянутый X₁ выбран из группы, включающей серу, кислород и NH.

8. Соединение по п.7, отличающееся тем, что упомянутый Z₃ является кислородом.

9. Соединение по п.8, отличающееся тем, что упомянутый R₄ выбран из группы, включающей метил и этил.

10. Соединение по п.9, отличающееся тем, что упомянутое азабензимидазольное соединение выбрано из группы, состоящей из соединений SABI.

11. Способ модулирования функции серин/треонин протеинкиназы соединением на основе азабензимидазола по пп.1-10, отличающийся тем, что клетки, экспрессирующие упомянутую серин/треонин протеинкиназу, приводят в контактирование с упомянутым соединением.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что упомянутой серин/треонин протеинкиназой является RAF.

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что упомянутое соединение на основе азабензимидазола выбирают из группы, включающей соединения SABI.

14. Способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, отличающийся тем, что осуществляют контактирование клеток, экспрессирующих упомянутую серин/треонин протеинкиназу, с соединением по пп.1-10 и проводят мониторинг эффекта на упомянутые клетки.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что упомянутым эффектом является изменение или отсутствие изменения клеточного фенотипа.

16. Способ по п.14, отличающийся тем, что упомянутым эффектом является изменение или отсутствие изменения клеточной пролиферации.

17. Способ по п.14, отличающийся тем, что упомянутым эффектом является изменение или отсутствие изменения каталитической активности упомянутой серин/треонин протеинкиназы.

18. Способ по п.14, отличающийся тем, что упомянутым эффектом является изменение или отсутствие изменения взаимодействия между упомянутой серин/треонин протеинкиназой и природным связывающим партнером.

19. Способ по п.14, отличающийся тем, что лизируют упомянутые клетки с получением лизата, содержащего серин/треонин протеинкиназу, адсорбируют упомянутую серин/треонин протеинкиназу на антителе, инкубируют адсорбированную серин/треонин протеинкиназу с субстратом или субстратами и адсорбируют упомянутый субстрат или субстраты на твердом носителе или антителе, причем мониторинг упомянутого эффекта на упомянутые клетки включает измерение концентрации фосфата в упомянутом субстрате или субстратах.

20. Способ по п.14, отличающийся тем, что в качестве упомянутой серин/треонин протеинкиназы выбирают RAF, при этом упомянутые клетки лизируют с получением лизата, содержащего RAF, адсорбируют упомянутую RAF на антителе, инкубируют адсорбированную RAF с МЕК и МАРК и адсорбируют упомянутые МЕК и МАРК на твердом носителе или антителах, а эффект на упомянутые клетки измеряют посредством мониторинга концентрации фосфата в упомянутых МЕК и МАРК.

21. Способ профилактики или лечения патологического состояния, связанного с отклонением от нормы пути трансдукции сигнала, характеризующегося взаимодействием между серин/треонин протеинкиназой и природным связывающим партнером в организме, онкологического заболевания или фиброзного нарушения, включающий введение в упомянутый организм соединения на основе азабензимидазола формулы I, II и III

где (a) R₁, R₂, R₃ и R₄ независимо выбирают из группы, включающей (i) водород; (ii) насыщенный или ненасыщенный алкил; (iii) NX₂X₃, где Х₂ и Х₃ независимо выбирают из группы, включающей водород, насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец; (iv) галоген или тригалогенметил; (v) кетон формулы -СО-Х₄, где Х₄ выбирают из группы, включающей водород, алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец; (vi) карбоновая кислота формулы -(Х₅)_n-СООН или сложный эфир формулы -(Х₆)_n-СООН-Х₇, где Х₅, Х₆ и X₇ независимо выбирают из группы, включающей алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, а n равно 0 или 1; (vii) спирт формулы (X₈)_n-OH или остаток алкокси формулы -(X₈)_n-O-Х₉, где X₈ и Х₉ независимо выбирают из группы, включающей водород, насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, где кольцо по выбору замещено одним или более заместителями, которые независимо выбирают из группы, включающей алкил, алкокси, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нитро и сложноэфирные остатки, а n равно 0 или 1; (viii) амид формулы -NHCOX₁₀, где Х₁₀ выбирают из группы, включающей алкил, гидроксил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец, где кольцо по выбору замещено одним или более заместителями, которые независимо выбирают из группы, включающей алкил, алкокси, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нитро и сложноэфирные остатки; (ix) -SO₂NX₁₁X₁₂, где Х₁₁ и X₁₂ выбирают из группы, включающей водород, алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец; (х) остаток гомоциклического или гетероциклического кольца, по выбору замещенный одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, включающей алкил, алкокси, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нитро и сложноэфирные остатки; (xi) альдегид формулы -СО-Н и (xii) сульфон формулы -SO₂-X₁₃, где Х₁₃ выбирают из группы, включающей насыщенный или ненасыщенный алкил и остатки гомоциклических или гетероциклических колец;

(б) Z₁ и Z₂ независимо выбирают из группы, включающей азот, серу, кислород, NH и NR₄, при условии, что если один из Z₁ и Z₂ означает азот, NH или NR₄, то другой из Z₁ и Z₂ означает азот, серу, кислород, NH или NR₄, где R₄ определен выше, и

(в) Z₃ и X₁ независимо выбирают из группы, включающей азот, серу и кислород.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что упомянутым организмом является млекопитающее.

23. Способ по п.21, отличающийся тем, что упомянутое онкологическое заболевание выбирают из группы, включающей рак легких, рак яичников, рак молочной железы, рак мозга, рак внутриаксиального мозга, рак ободочной кишки, рак предстательной железы, саркому, саркому ксеродермы, меланому и глиому.

24. Способ по п.21, отличающийся тем, что в качестве упомянутой серин/треонин протеинкиназы выбирают RAF.

25. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение на основе азабензимидазола по любому из пп.1-10 и физиологически приемлемый носитель или разбавитель.

26. Способ синтеза соединения формулы (I) по п.1, отличающийся тем, что 2-амино-6-хлор-3-нитропиридин вводят в реакцию с замещенным арильным циклом в растворителе с образованием первого промежуточного соединения, восстанавливают полученное первое промежуточное соединение в присутствии катализатора и восстанавливающего агента с образованием второго промежуточного соединения, которое затем вводят в реакцию с O-метилизомочевиной или продуктом реакции сульфата S-метилизотиомочевины и алкилхлорформиата с получением соответствующего целевого продукта, который далее очищают.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что в качестве упомянутого растворителя используют н-пропанол.

28. Способ по п.27, отличающийся тем, что упомянутый замещенный арильный цикл выбирают из группы, содержащей замещенный фенол, замещенный тиофенол и замещенный анилин.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что упомянутые замещенный фенол, замещенный тиофенол и замещенный анилин выбирают из группы соединений SABI.

30. Способ по п.26, отличающийся тем, что в качестве упомянутого восстанавливающего агента используют водород.

31. Способ по п.26, отличающийся тем, что в качестве упомянутого катализатора используют никель Ренея.

32. Способ по п.26, отличающийся тем, что в качестве упомянутого алкила используют метильную или этильную группу.