KR100547929B1 - 세린/트레오닌 단백질 키나제 기능을 조절하기 위한 아자벤즈이미다졸계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

세린/트레오닌 단백질 키나제 기능을 조절하기 위한 아자벤즈이미다졸계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명의 한 양태는 아자벤즈이미다졸계 화합물을 사용하여 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 세린/트레오닌 단백질 키나제(예: RAF)를 발현하는 세포에 도입된다. 또한, 본 발명에는 유기체에서 세린/트레오닌 단백질 키나제-관련된 비정상 상태를 본 발명에 의해 동정된 화합물을 사용하여 예방 및 치료하는 방법이 기술되어 있다. 또한, 본 발명은 아자벤즈이미다졸 화합물 및 이들 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
세린/트레오닌 단백질 키나제, 아자벤즈이미다졸계 화합물, 인산화, 천연 결합 파트너, 조절, 세포, 암

Description

세린/트레오닌 단백질 키나제 기능을 조절하기 위한 아자벤즈이미다졸계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물{Azabenzimidazole-based compounds for modulating serine/threonine protein kinase function, a method for synthesizing the same and a pharmaceutical composition comprising the same}
본 발명의 배경에 대한 다음 설명은 본 발명의 이해를 보조하고자 제공되지만, 본 발명의 선행 기술로는 인정되지는 않는다.
세포 신호전달(signal transduction)은 기본 메커니즘이며, 이에 의해 다양한 세포 과정을 조절하는 외부 자극이 세포의 내부로 중계된다. 신호전달의 중요한 생화학적 메커니즘의 하나는 단백질의 가역성 인산화를 포함하며, 이에 의해 이의 구조 및 기능을 변화시킴으로써 성숙한 단백질의 활성을 조절할 수 있다.
진핵세포에서 가장 특징적인 단백질 키나제는 세린, 트레오닌 및 티로신 잔기의 알콜 잔기에 대한 단백질을 인산화시킨다. 이들 키나제는 크게 두 그룹, 세린 및 트레오닌의 인산화에 특이적인 키나제 및 티로신의 인산화에 특이적인 키나제가 해당한다. "이중 특이성" 키나제로 언급되는 특정 키나제는 세린/트레오닌 잔기 뿐만 아니라 티로신에 대해 인산화시킬 수 있다.
단백질 키나제는 또한 세포내의 이의 위치에 의해 특징지워질 수 있다. 특정 키나제는 외부의 리간드를 세포막에 결합시킬 수 있는 트랜스막 수용체 단백질이다. 리간드의 결합에 의해 수용체 단백질 키나제의 촉매 활성이 변화된다. 다른 것은 트랜스막 도메인이 없는 비-수용체 단백질이다. 비-수용체 단백질 키나제는 세포막의 내부 표면 내지 핵을 포함하는 다양한 세포 구획에서 발견될 수 있다.
많은 키나제는 이의 기질이, 활성이 이의 인산화 상태에 의해 조절되는 다른 키나제를 포함할 수 있는 조절 다단계에 포함된다. 궁극적으로 하류 이펙터의 활성은 이러한 경로의 활성화로부터 초래되는 인산화에 의해 조절된다.
세린/트레오닌 키나제 패밀리는 세포 성장, 이행, 분화, 유전자 발현, 근육 수축, 글루코스 대사, 세포 단백질 합성 및 세포 사이클의 조절을 제어하는 다단계(cascade)를 포함하여, 여러 시그날링 다단계를 조절하는 요소들을 포함한다.
세린 및 트레오닌 잔기에 대한 단백질 표적을 인산화시키는 비-수용체 단백질 키나제의 예에는 RAF가 있다. RAF는, 예를 들어 마이토젠(mitogen) 활성화된 단백질 키나제(MAPK)를 인산화시켜 활성화시키는 다른 단백질 키나제를 조절한다. RAF 자체는 막 고정된 단백질 RAS에 의해 활성화되며, 이는 다시 리간드 활성화된 티로신 수용체 단백질 키나제[예: 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 혈소판-유도된 성장 인자 수용체(PDGFR)]에 반응하여 활성화된다. 세포내 사건의 조절에서 RAF의 생물학적 중요성은 RAF의 변화된 형태가 유기체에서 암을 유발할 수 있다는 발견에 의해 강조된다. 악성종양에서 RAF의 중요성에 대한 증거가 문헌에 기술되어 있으며[참조: Monia et al., 1996, Nature Medicine 2: 668], 이는 도면 및 표를 포함하여 전체가 본원에서 참고로 인용된다.
암 및 다른 질환의 신규한 치료법을 밝혀내려는 노력에서, 생의학적 연구자 및 화학자들은 단백질 키나제의 기능을 억제하는 분자를 고안하고, 합성하고, 시험했다. 특정한 소형 유기 분자는 단백질 키나제의 기능을 조절하는 종류의 화합물을 형성한다. 단백질 키나제의 기능을 억제한다고 보고된 분자의 예에는 비스 모노사이클릭, 비사이클릭 또는 헤테로사이클릭 아릴 화합물(PCT WO 92/20642), 비닐렌-아자인돌 유도체(PCT WO 94/14808), 1-사이클로프로필-4-피리딜-퀴놀론(미국 특허 제5,330,992호), 스티릴 화합물(미국 특허 제5,217,999호), 스티릴-치환된 피리딜 화합물(미국 특허 제5,302,606호), 특정 퀴나졸린 유도체(EP 출원 제0 566 266 A1호), 셀레오인돌 및 셀레나이드(PCT WO 94/03427), 트리사이클릭 폴리하이드록실 화합물(PCT WO 92/21660) 및 벤질포스폰산 화합물(PCT WO 91/15495)이 있다.
세포막을 횡단할 수 있고 산 가수분해에 내성이 있는 화합물이 잠재적으로 유리한 치료제이며, 이들이 환자에게 경구 투여한 후에 생이용율이 높아질 수 있기 때문이다. 그러나, 많은 이러한 단백질 키나제 억제제는 단백질 키나제의 기능을 약하게만 억제한다. 또한, 많은 것이 각종 단백질 키나제를 억제하며, 따라서 질병에 대한 치료제로서 다수의 부작용을 유발한다.
발명의 요약
본 발명의 한 양태는 아자벤즈이미다졸계 화합물을 사용하여 세린/트레오닌 단백질 키나제를 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 세린/트레오닌 단백질 키나제(예: RAF)를 발현하는 세포를 포함한다. 또한, 본 발명에는 유기체에서 세린/트레오닌 단백질 키나제-관련된 비정상 상태를 본 발명에 의해 동정된 화합물을 사용하여 예방 및 치료하는 방법이 기술되어 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
I. 세린/트레오닌 단백질 키나제 기능을 조절하는 화합물을 선별하는 방법
본 발명의 방법은 수용체 및 세포질의 세린/트레오닌 단백질 키나제 둘다의 기능을 조절하는 수단을 제공한다. 이들 방법은 시험관내에서 및 생체내 둘다에서 효소를 조절하는 수단을 제공한다. 시험관내 적용에 대해, 본 발명의 방법의 한 양태는 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 제1 양태에 있어서, 본 발명은 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 아자벤즈이미다졸계 화합물을 사용하여 조절하는 방법을 특징으로 한다. 아자벤즈이미다졸 화합물은 유기 그룹에 의해 임의로 치환된다. 이 방법은 세린/트레오닌 단백질 키나제를 발현하는 세포를 화합물과 접촉시킴을 포함한다.
"기능"이란 용어는 세린/트레오닌 단백질 키나제의 세포내 역할만을 언급한다. 세린/트레오닌 단백질 키나제 패밀리는 세포 성장, 이행, 분화, 유전자 발현, 근육 수축, 글루코스 대사, 세포 단백질 합성 및 세포 사이클의 조절을 제어하는 다단계를 포함하여 여러 시그날링 다단계를 조절하는 요소들을 포함한다.
"조절"이라는 용어는 단백질 키나제의 기능을 변화시키는 화합물의 능력을 언급한다. 조절물질은 바람직하게는 단백질 키나제의 촉매 활성을 활성화시키고, 더욱 바람직하게는 단백질 키나제의 촉매 활성을 단백질 키나제에 노출된 화합물의 농도에 따라서 활성화시키거나 억제하고, 가장 바람직하게는 단백질 키나제의 촉매 활성을 억제한다.
본 발명에서 "촉매 활성"이란 용어는 단백질 키나제가 기질을 인산화시키는 속도로서 정의된다. 촉매 활성은, 예를 들어, 생성물로 전환된 기질의 양을 시간의 함수로서 측정함으로써 측정할 수 있다. 기질의 인산화는 단백질 키나제의 활성 부위에서 일어난다. 활성 부위는 정상적으로는 기질이 단백질 키나제에 결합하여 인산화되는 공동이다.
본원에서 사용된 "기질"이란 용어는 세린/트레오닌 단백질 키나제에 의해 인산화된 분자를 언급한다. 기질은 바람직하게는 펩타이드이고, 더욱 바람직하게는 단백질이다. 단백질 키나제 RAF와 관련하여, 바람직한 기질은 MEK이고, MEK 기질은 MAPK이다.
"활성화되다"라는 용어는 단백질 키나제의 세포 기능의 증가를 언급한다. 단백질 키나제 기능은 바람직하게는 천연 결합 파트너와의 상호작용이며, 가장 바람직하게는 촉매 활성이다.
"억제하다"라는 용어는 단백질 키나제의 세포 기능의 감소를 언급한다. 단백질 키나제 기능은 바람직하게는 천연 결합 파트너와의 상호작용이며, 가장 바람직하게는 촉매 활성이다.
"조절하다"라는 용어는 또한 단백질 키나제 및 천연 결합 파트너 사이에 착체가 형성되는 확률의 증가 또는 감소에 의한 단백질 키나제 기능의 변화를 언급한다. 조절물질은 바람직하게는 이러한 착체가 단백질 키나제와 천연 결합 파트너 사이에 형성되는 확률을 증가시키고, 더욱 바람직하게는 착체가 단백질 키나제와 천연 결합 파트너 사이에 단백질 키나제에 노출된 화합물의 농도에 따라서 형성되는 확률을 증가 또는 감소시키고, 가장 바람직하게는 착체가 단백질 키나제와 천연 결합 파트너 사이에 형성되는 확률을 감소시킨다.
"착체"라는 용어는 서로 결합된 둘 이상의 분자의 결합물을 언급한다. 신호전달 착체는 간혹 서로 결합된 둘 이상의 단백질 분자를 함유한다. 예를 들어, 단백질 티로신 수용체 단백질 키나제, GRB2, SOS, RAF 및 RAS는 결합되어 마이토젠 리간드에 반응하는 신호전달 착체를 형성한다.
"천연 결합 파트너"라는 용어는 세포내의 단백질 키나제에 결합되는 폴리펩타이드를 언급한다. 천연 결합 파트너는 단백질 키나제 신호전달 과정에서 신호를 전파하는 역할을 할 수 있다. 단백질 키나제와 천연 결합 파트너 사이의 상호작용에서의 변화는 상호작용이 형성되는, 증가 또는 감소된 확률로서, 또는 단백질 키나제/천연 결합 파트너 착체의 증가 또는 감소된 농도로서 자체에 나타날 수 있다.
단백질 키나제 천연 결합 파트너는 단백질 키나제의 세포내 영역에 높은 친화성으로 결합될 수 있다. 고 친화성은 10-6M 이하의 차수에 대한 평형 결합 상수를 나타낸다. 또한, 천연 결합 파트너는 단백질 키나제 세포내 영역과 일시적으로 상호작용하여 이를 화학적으로 개질시킬 수 있다. 단백질 키나제 천연 결합 파트너는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는 그룹으로부터 선택된다: SRC 상동체 2(SH2) 또는 3(SH3) 도메인, 다른 포스포릴 티로신 결합(PTB) 도메인, 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자, 단백질 포스파타제 및 다른 단백질 키나제. 단백질 키나제 및 이의 천연 결합 파트너 사이의 상호작용에서의 변화를 측정하는 방법은 당해 분야에서 용이하게 사용할 수 있다.
"세린/트레오닌 단백질 키나제"라는 용어는 세린 및 트레오닌 잔기에 대한 단백질을 인산화시키는 다른 효소와 10% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 효소를 언급한다. 세린/트레오닌 단백질 키나제는 세린 및 트레오닌 잔기에 대한 단백질로 인산염의 부가를 촉매화한다. 세린/트레오닌 단백질 키나제는 막 결합 단백질 또는 세포질 단백질로서 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 "접촉"이라는 용어는 본 발명의 아자벤즈이미다졸 화합물을 포함하는 용액을 이 방법의 세포를 침지시키는 액체 매질과 혼합하는 것을 언급한다. 화합물을 포함하는 용액은 또한 다른 성분, 예를 들어, 아자벤즈이미다졸 화합물(들)이 이 방법의 세포로 흡수되는 것을 촉진시키는 디메틸설폭사이드(DMSO)를 포함할 수 있다. 아자벤즈이미다졸 화합물을 포함하는 용액은 운반 장치(예: 피펫을 기본으로 하는 장치 또는 주사기를 기본으로 하는 장치)를 사용하여 세포를 침지시킨 매질에 가할 수 있다.
"아자벤즈이미다졸계 화합물"이란 용어는 화학적 치환체에 의해 치환된 아자벤즈이미다졸 유기 화합물을 언급한다. 아자벤즈이미다졸 화합물은 다음 일반적 구조의 것이다:
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본 발명에 관하여 "치환된"이란 용어는 임의의 수의 화학적 치환체에 의해서 유도체화된 아자벤즈이미다졸 화합물에 관한 것이다.
바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 단백질 키나제가 RAF인 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 방법에 관한 것이다.
RAF 단백질 키나제는 세린 및 트레오닌 잔기에 대한 단백질 표적을 인산화시킨다. 이러한 한가지 단백질 표적은 인산화되어 마이토젠 활성화된 단백질 키나제(MAPK)를 활성화시키는 단백질 키나제(MEK)이다. RAF 자체는 마이토젠-자극된 수용체 단백질 티로신 키나제, 예를 들어, 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 혈소판-유도된 성장 인자 수용체(PDGFR)에 반응하여 막-결합된 구아닌 삼인산염 가수분해 효소 RAS에 의해 활성화된다.
본 발명의 방법에 의해, 세포내에서 RAF 단백질 키나제의 기능을 조절하는 화합물을 검출할 수 있다. RAF는 단백질 키나제(MEK)를 인산화시키고, 이는 다시 마이토젠-활성화된 단백질 키나제(MAPK)를 인산화시킨다. RAF에 의한 MEK의 인산화만을 모니터링하는 분석은, MEK의 인산화 수준이 현저하지 않기 때문에 민감하지 않다. 이러한 민감성 난제를 극복하기 위해서, MEK 및 MAPK의 인산화가 본 발명의 분석에서 수행된다. MAPK 인산화 신호는 MEK 인산화 신호를 증폭시키고 RAF-의존성 인산화가 효소-결합된 면역흡착 분석과 같은 분석에서 수행되게 한다. 또한, 본 발명의 분석은 많은 화합물이 단기간에 빨리 모나터링될 수 있도록 고처리량 형태로 수행된다.
다른 양태에 있어서, 본 발명에는 세린/트레오닌 단백질 키나제를 발현하는 세포를 화합물과 접촉시키고, 세포에 대한 효과를 모니터링하는 단계를 포함하여, 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 화합물을 동정하는 방법이 기술되어 있다.
"모니터링"이라는 용어는 화합물을 이 방법의 세포에 가한 효과의 관찰을 언급한다. 효과는 세포 표현형, 세포 증식, 단백질 키나제 촉매 활성, 또는 단백질 키나제와 천연 결합 파트너 사이의 상호작용에서의 변화로 나타난다.
"효과"라는 용어는 세포 표현형 또는 세포 증식에서의 변화 또는 변화의 부재를 기술하는 것이다. "효과"는 또한 단백질 키나제의 촉매 활성에서의 변화 또는 변화의 부재를 기술할 수 있다. "효과"는 또한 단백질 키나제와 천연 결합 파트너 사이의 상호작용에서의 변화 또는 변화의 부재를 기술할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태는 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 효과란 세포 표현형에서의 변화 또는 변화의 부재이다.
"세포 표현형"이란 용어는 세포 또는 조직 또는 세포 또는 조직의 기능의 외적인 형상을 언급한다. 세포 표현형의 예에는 세포 크기(감소 또는 증가), 세포 증식(증가 또는 감소된 세포의 수), 세포 분화(세포 형상에서의 변화 또는 변화의 부재), 세포 생존, 아폽토시스(apoptosis, 세포 사멸) 또는 대사 영양소의 사용(예: 글루코스 흡수)이 있다. 세포 표현형에서의 변화 또는 변화의 부재는 당해 분야에 공지된 기술에 의해 용이하게 측정된다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 효과란 세포 증식에서의 변화 또는 변화의 부재이다.
"세포 증식"이란 용어는 일군의 세포가 분열되는 속도에 관한 것이다. 용기내에서 성장하는 세포의 수는 당해 분야의 전문가에 의해, 한정된 용적에서 세포의 수를 통상의 광학 현미경을 사용하여 육안으로 계수하는 경우에 정량화할 수 있다. 또는, 세포 증식 속도는 적합한 매질중의 세포의 밀도를 광학적으로 또는 전도성을 이용하여 측정하는 실험실 장치에 의해 정량화할 수 있다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 효과란 세린/트레오닌 단백질 키나제와 천연 결합 파트너 사이의 상호작용에서의 변화 또는 변화의 부재이다.
본 발명에서 "상호작용"이란 용어는 단백질 키나제의 세포내 영역 및 천연 결합 파트너 또는 화합물 사이에 형성된 착체를 기술하는 것이다. "상호작용"이란 용어는 또한 연구에서 단백질 키나제의 세포내 영역 및 세포외 영역을 갖는, 본 발명의 화합물 사이에 생성된 착체로 확대된다. 세포질 단백질 키나제에는 세포외 영역이 없지만, 수용체 단백질 키나제는 세포외 및 세포내 영역 둘다를 포함한다.
본원에 사용된 "세포내 영역"이란 용어는 세포의 내부에 존재하는 단백질 키나제 부분을 언급한다. 본원에서 사용된 "세포외 영역"이란 용어는 세포의 외부에 존재하는 단백질 키나제 부분을 언급한다.
바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 다음 단계를 추가로 포함하여, 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다: (a) 세포를 용해시켜 세린/트레오닌 단백질 키나제를 포함하는 용해물을 제공하는 단계; (b) 세린/트레오닌 단백질 키나제를 항체에 흡착시키는 단계; (c) 흡착된 세린/트레오닌 단백질 키나제를 기질(들)과 함께 항온처리하는 단계; 및 (d) 기질(들)을 고형 지지체 또는 항체에 흡착시키는 단계. 세포에 대한 효과를 모니터링하는 단계는 기질(들)의 인산염 농도를 측정함을 특징으로 한다.
본원에서 사용된 "용해"라는 용어는 세포의 내부 내용물이 유리되도록 본래의 세포를 파괴하는 방법에 관한 것이다. 세포 용해는 당해 분야의 전문가에게 공지된 많은 기술에 의해 달성된다. 이 방법은 바람직하게는 초음파 분해 또는 세포 시어링(sheering) 기술 및 더욱 바람직하게는 세정 기술에 의해 달성된다.
본원에서 사용된 "항체"라는 용어는 단백질 키나제에 특이적으로 결합하는 단백질 분자를 언급한다. 항체는 바람직하게는 1종의 단백질 키나제에 결합하고, 더욱 바람직하게는 RAF 단백질 키나제에 특이적으로 결합한다.
본원에서 사용된 "특이적으로 결합하다"라는 용어는 다른 단백질 키나제 또는 세포 단백질보다 높은 친화성을 갖는 단백질 키나제에 결합하는 항체에 관한 것이다. 단백질 키나제에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 단백질 키나제 또는 세포 단백질보다 높은 농도의 특이적 단백질 키나제에 결합한다.
본원에서 사용된 "흡착"이란 용어는 항체 또는 고형 지지체의 표면에 대한 분자의 결합을 언급한다. 고형 지지체의 예는 화학적으로 개질된 셀룰로스(예: 포스포셀룰로스) 및 나일론이 있다. 항체는 당해 분야의 각 전문가에게 공지된 기술 을 사용하여 고형 지지체에 결합시킬 수 있다[참조: Harlo & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories].
본원에서 사용된 "인산염 농도를 측정하다"라는 용어는 당해 분야의 전문가에게 일반적으로 공지된 기술에 관한 것이다. 이들 기술은 기질내의 인산염 농축물의 농도를 정량화하거나 또는 기질내의 인산염의 상대량을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 이들 기술은 기질을 막에 흡착시키고 기질내의 인산염의 양을 방사능 측정에 의해 검출하는 것을 포함할 수 있다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 다음 단계를 추가로 포함하여, 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다: (a) 세포를 용해시켜 RAF를 포함하는 용해물을 제공하는 단계; (b) RAF를 항체에 흡착시키는 단계; (c) 흡착된 RAF를 MEK 및 MAPK와 함께 항온처리하는 단계; (d) MEK 및 MAPK를 고형 지지체 또는 항체(들)에 흡착시키는 단계. 세포에 대한 효과를 측정하는 단계는 상기 MEK 및 MAPK의 인산염 농도를 모니터링함을 특징으로 한다.
바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 아자벤즈이미다졸계 화합물은 본원에서 정의된 화학식 I, II 또는 III 또는 본원에서 기술된 이의 소그룹중 어느 하나로 기술된 구조를 갖는다.
"화합물"이란 용어는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르, 아미드, 프로드럭, 이성체 또는 대사물질을 언급한다.
"약제학적으로 허용되는 염"이란 용어는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 제거하지 않는 화합물의 형태를 언급한다. 약제학적 염은 본 발명의 화합물을 무기산 또는 유기산(예: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등)과 반응시켜 수득할 수 있다.
"프로드럭"이란 용어는 생체내에서 모 약물로 전환되는 제제를 언급한다. 프로드럭은 특정한 상황에서 모 약물보다 쉽게 투여할 수 있다. 예를 들어, 프로드럭은 경구 투여에 의해 생이용성이 될 수 있지만, 모 약물은 그렇지 않거나, 또는 프로드럭은 정맥내 투여가능하도록 용해성을 개선시킬 수 있다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 아자벤즈이미다졸 화합물이 SABI 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아자벤즈이미다졸계 화합물은 화학식 I, II 또는 III으로 기술된 구조를 갖는다.
"SABI 화합물"이란 용어는 화학식 A 또는 B의 구조를 갖고, 다음 표에서 A-1 내지 A-198로 번호 매겨진 아자벤즈이미다졸계 화합물 그룹을 언급한다:
Figure 112000005791758-pct00002
Figure 112000005791758-pct00003
화합물 번호 R 1 X 1 R 4 Z 3
A-1 페닐 O - -
A-2 페닐 S - -
A-3 페닐 O 메틸 0
A-4 페닐 O 에틸 0
A-5 2-니트로페닐 O - -
A-6 3-니트로페닐 O - -
A-7 4-니트로페닐 O - -
A-8 2-클로로페닐 O - -
A-9 3-클로로페닐 O - -
화합물 번호 R 1 X 1 R 4 Z 3
A-10 4-클로로페닐 O - -
A-11 2-메틸페닐 O - -
A-12 3-메틸페닐 O - -
A-13 4-메틸페닐 O - -
A-14 2-플루오로페닐 O - -
A-15 3-플루오로페닐 O - -
A-16 4-플루오로페닐 O - -
A-17 2-(트리플루오로메틸)페닐 O - -
A-18 3-(트리플루오로메틸)페닐 O - -
A-19 4-(트리플루오로메틸)페닐 O - -
A-20 2-메톡시페닐 O - -
A-21 3-페톡시페닐 O - -
A-22 4-메톡시페닐 O - -
A-23 2-카복시페닐 O - -
A-24 3-카복시페닐 O - -
A-25 4-카복시페닐 O - -
A-26 2-니트로페닐 S - -
A-27 3-니트로페닐 S - -
A-28 4-니트로페닐 S - -
A-29 2-클로로페닐 S - -
A-30 3-클로로페닐 S - -
A-31 4-클로로페닐 S - -
A-32 2-메틸페닐 S - -
A-33 3-메틸페닐 S - -
A-34 4-메틸페닐 S - -
A-35 2-플루오로페닐 S - -
A-36 3-플루오로페닐 S - -
A-37 4-플루오로페닐 S - -
A-38 2-(트리플루오로메틸)페닐 S - -
화합물 번호 R 1 X 1 R 4 Z 3
A-39 3-(트리플루오로메틸)페닐 S - -
A-40 4-(트리플루오로메틸)페닐 S - -
A-41 2-메톡시페닐 S - -
A-42 3-메톡시페닐 S - -
A-43 4-메톡시페닐 S - -
A-44 2-카복시페닐 S - -
A-45 3-카복시페닐 S - -
A-46 4-카복시페닐 S - -
A-47 페닐 NH - -
A-48 2-니트로페닐 NH - -
A-49 3-니트로페닐 NH - -
A-50 4-니트로페닐 NH - -
A-51 2-클로로페닐 NH - -
A-52 3-클로로페닐 NH - -
A-53 4-클로로페닐 NH - -
A-54 2-메틸페닐 NH - -
A-55 3-메틸페닐 NH - -
A-56 4-메틸페닐 NH - -
A-57 2-플루오로페닐 NH - -
A-58 3-플루오로페닐 NH - -
A-59 4-플루오로페닐 NH - -
A-60 2-(트리플루오로메틸)페닐 NH - -
A-61 3-(트리플루오로메틸)페닐 NH - -
A-62 4-(트리플루오로메틸)페닐 NH - -
A-63 2-메톡시페닐 NH - -
A-64 3-메톡시페닐 NH - -
A-65 4-메톡시페닐 NH - -
A-66 2-카복시페닐 NH - -
A-67 3-카복시페닐 NH - -
화합물 번호 R 1 X 1 R 4 Z 3
A-68 4-카복시페닐 NH - -
A-69 2-니트로페닐 O 메틸 O
A-70 3-니트로페닐 O 메틸 O
A-71 4-니트로페닐 O 메틸 O
A-72 2-클로로페닐 O 메틸 O
A-73 3-클로로페닐 O 메틸 O
A-74 4-클로로페닐 O 메틸 O
A-75 2-메틸페닐 O 메틸 O
A-76 3-메틸페닐 O 메틸 O
A-77 4-메틸페닐 O 메틸 O
A-78 2-플루오로페닐 O 메틸 O
A-79 3-플루오로페닐 O 메틸 O
A-80 4-플루오로페닐 O 메틸 O
A-81 2-(트리플루오로메틸)페닐 O 메틸 O
A-82 3-(트리플루오로메틸)페닐 O 메틸 O
A-83 4-(트리플루오로메틸)페닐 O 메틸 O
A-84 2-메톡시페닐 O 메틸 O
A-85 3-메톡시페닐 O 메틸 O
A-86 4-메톡시페닐 O 메틸 O
A-87 2-카복시페닐 O 메틸 O
A-88 3-카복시페닐 O 메틸 O
A-89 4-카복시페닐 O 메틸 O
A-90 페닐 S 메틸 O
A-91 2-니트로페닐 S 메틸 O
A-92 3-니트로페닐 S 메틸 O
A-93 4-니트로페닐 S 메틸 O
A-94 2-클로로페닐 S 메틸 O
A-95 3-클로로페닐 S 메틸 O
A-96 4-클로로페닐 S 메틸 O
화합물 번호 R 1 X 1 R 4 Z 3
A-97 2-메틸페닐 S 메틸 O
A-98 3-메틸페닐 S 메틸 O
A-99 4-메틸페닐 S 메틸 O
A-100 2-플루오로페닐 S 메틸 O
A-101 3-플루오로페닐 S 메틸 O
A-102 4-플루오로페닐 S 메틸 O
A-103 2-(트리플루오로메틸)페닐 S 메틸 O
A-104 3-(트리플루오로메틸)페닐 S 메틸 O
A-105 4-(트리플루오로메틸)페닐 S 메틸 O
A-106 2-메톡시페닐 S 메틸 O
A-107 3-메톡시페닐 S 메틸 O
A-108 4-메톡시페닐 S 메틸 O
A-109 2-카복시페닐 S 메틸 O
A-110 3-카복시페닐 S 메틸 O
A-111 4-카복시페닐 S 메틸 O
A-112 페닐 NH 메틸 O
A-113 2-니트로페닐 NH 메틸 O
A-114 3-니트로페닐 NH 메틸 O
A-115 4-니트로페닐 NH 메틸 O
A-116 2-클로로페닐 NH 메틸 O
A-117 3-클로로페닐 NH 메틸 O
A-118 4-클로로페닐 NH 메틸 O
A-119 2-메틸페닐 NH 메틸 O
A-120 3-메틸페닐 NH 메틸 O
A-121 4-메틸페닐 NH 메틸 O
A-122 2-플로로페닐 NH 메틸 O
A-123 3-플로로페닐 NH 메틸 O
A-124 4-플로로페닐 NH 메틸 O
A-125 2-(트리플로로메틸)페닐 NH 메틸 O
화합물 번호 R 1 X 1 R 4 Z 3
A-126 3-(트리플루오로메틸)페닐 NH 메틸 O
A-127 4-(트리플루오로메틸)페닐 NH 메틸 O
A-128 2-메톡시페닐 NH 메틸 O
A-129 3-메톡시페닐 NH 메틸 O
A-130 4-메톡시페닐 NH 메틸 O
A-131 2-카복시페닐 NH 메틸 O
A-132 3-카복시페닐 NH 메틸 O
A-133 4-카복시페닐 NH 메틸 O
A-134 2-니트로페닐 O 에틸 O
A-135 3-니트로페닐 O 에틸 O
A-136 4-니트로페닐 O 에틸 O
A-137 2-클로로페닐 O 에틸 O
A-138 3-클로로페닐 O 에틸 O
A-139 4-클로로페닐 O 에틸 O
A-140 2-메틸페닐 O 에틸 O
A-141 3-메틸페닐 O 에틸 O
A-142 4-메틸페닐 O 에틸 O
A-143 2-플루오로페닐 O 에틸 O
A-144 3-플루오로페닐 O 에틸 O
A-145 4-플루오로페닐 O 에틸 O
A-146 2-(트리플루오로메틸)페닐 O 에틸 O
A-147 3-(트리플루오로메틸)페닐 O 에틸 O
A-148 4-(트리플루오로메틸)페닐 O 에틸 O
A-149 2-메톡시페닐 O 에틸 O
A-150 3-메톡시페닐 O 에틸 O
A-151 4-메톡시페닐 O 에틸 O
A-152 2-카복시페닐 O 에틸 O
A-153 3-카복시페닐 O 에틸 O
A-154 4-카복시페닐 O 에틸 O
화합물 번호 R1 X1 R4 Z3
A-155 페닐 S 에틸 O
A-156 2-니트로페닐 S 에틸 O
A-157 3-니트로페닐 S 에틸 O
A-158 4-니트로페닐 S 에틸 O
A-159 2-클로로페닐 S 에틸 O
A-160 3-클로로페닐 S 에틸 O
A-161 4-클로로페닐 S 에틸 O
A-162 2-메틸페닐 S 에틸 O
A-163 3-메틸페닐 S 에틸 O
A-164 4-메틸페닐 S 에틸 O
A-165 2-플루오로페닐 S 에틸 O
A-166 3-플루오로페닐 S 에틸 O
A-167 4-플루오로페닐 S 에틸 O
A-168 2-(트리플루오로메틸)페닐 S 에틸 O
A-169 3-(트리플루오로메틸)페닐 S 에틸 O
A-170 4-(트리플루오로메틸)페닐 S 에틸 O
A-171 2-메톡시페닐 S 에틸 O
A-172 3-메톡시페닐 S 에틸 O
A-173 4-메톡시페닐 S 에틸 O
A-174 2-카복시페닐 S 에틸 O
A-175 3-카복시페닐 S 에틸 O
A-176 4-카복시페닐 S 에틸 O
A-177 페닐 NH 에틸 O
A-178 2-니트로페닐 NH 에틸 O
A-179 3-니트로페닐 NH 에틸 O
A-180 4-니트로페닐 NH 에틸 O
A-181 2-클로로페닐 NH 에틸 O
A-182 3-클로로페닐 NH 에틸 O
A-183 4-클로로페닐 NH 에틸 O
화합물 번호 R 1 X 1 R 4 Z 3
A-184 2-메틸페닐 NH 에틸 O
A-185 3-메틸페닐 NH 에틸 O
A-186 4-메틸페닐 NH 에틸 O
A-187 2-플루오로페닐 NH 에틸 O
A-188 3-플루오로페닐 NH 에틸 O
A-189 4-플루오로페닐 NH 에틸 O
A-190 2-(트리플루오로메틸)페닐 NH 에틸 O
A-191 3-(트리플루오로메틸)페닐 NH 에틸 O
A-192 4-(트리플루오로메틸)페닐 NH 에틸 O
A-193 2-메톡시페닐 NH 에틸 O
A-194 3-메톡시페닐 NH 에틸 O
A-195 4-메톡시페닐 NH 에틸 O
A-196 2-카복시페닐 NH 에틸 O
A-197 3-카복시페닐 NH 에틸 O
A-198 4-카복시페닐 NH 에틸 O
II. 비정상 상태를 예방 또는 치료하는 방법
다른 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III으로 본원에 특정된 본 발명의 화합물을 본원에 제공된 구속 조건으로 유기체에게 투여함으로써 유기체에서 비정상 상태를 예방하거나 치료하는 방법을 특징으로 한다.
"유기체"라는 용어는 하나 이상의 세포를 포함하는 생존하는 실재물에 관한 것이다. 유기체는 진핵생물 세포처럼 간단하거나 포유동물처럼 복잡할 수 있다. 바람직한 양태에서, 유기체는 사람 또는 포유동물을 언급한다.
"예방"이란 용어는 유기체가 비정상 상태에 걸리거나 이를 나타내는 확률을 감소시키거나 이러한 가능성을 제거하는 본 발명의 방법에 관한 것이다.
"치료"라는 용어는 치료학적 효과를 갖고 유기체의 비정상 상태를 적어도 일부 경감시키거나 제거하는 본 발명의 방법에 관한 것이다.
"치료학적 효과"라는 용어는 비정상 상태를 유발하거나 이에 공헌하는 세포 성장의 억제에 관한 것이다. "치료학적 효과"라는 용어는 또한 비정상 상태(예: 암)를 유발하거나 이에 공헌하는 성장 인자의 억제에 관한 것이다. 치료학적 효과는 비정상 상태의 하나 이상의 증상을 어느 정도로 경감시킨다. 암의 치료에 관해서, 치료학적 효과는 다음 중의 하나 이상을 언급한다: (a) 종양 크기의 감소; (b) 종양 전이의 억제(즉, 둔화 또는 중단); (c) 종양 성장의 억제; 및 (d) 비정상 상태와 관련된 증상중의 하나 이상을 어는 정도로 경감시키는 것. 백혈병에 대한 효능을 나타내는 화합물은 본원에 기술된 바와 같이 동정할 수 있으며, 단 전이를 억제하기보다는 차라리, 화합물이 대신에 세포 증식 또는 세포 성장을 둔화 또는 감소시킬 수 있다.
"비정상 상태"라는 용어는 유기체의 정상 상태로부터 벗어난 유기체의 세포 또는 조직의 기능에 관한 것이다. 비정상 상태는 세포 증식, 세포 분화 또는 세포 생존에 관련될 수 있다.
변형된 세포 증식 상태는 암, 예를 들어, 섬유증 및 메산쥼(mesangial) 장애, 비정상 혈관형성 및 맥관형성, 상처 치유, 건선, 진성 당뇨병 및 염증을 포함한다.
변형된 분화 상태는 신경변성 장애, 느린 상처 치유 속도 및 조직 이식 기술을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
변형된 세포 생존 상태는 계획된 세포 사멸(아폽토시스) 경로가 활성화되거나 제거되는 상태에 관한 것이다. 다수의 단백질 키나제가 아폽토시스 경로와 관련된다. 하나의 단백질 키나제의 기능의 변화는 세포 불멸 또는 조기 세포 사멸을 초래할 수 있다.
세포 증식, 분화 및 생존은 당해 분야의 방법에 의해 간단히 측정되는 현상이다. 이들 방법은 현미경으로 시간 경과에 따른(예를 들어, 일) 세포의 수 또는 세포의 외관의 관찰을 포함할 수 있다.
"투여"라는 용어는 광범위하게는 유기체로의 공급 및 더욱 특히 유기체의 세포 또는 조직에 화합물을 혼입하는 방법에 관한 것이다. 비정상 상태는, 유기체의 세포 또는 조직이 유기체내에 또는 유기체의 외부에 존재하는 경우에 예방 또는 치료할 수 있다. 유기체의 외부에 존재하는 세포는 세포 배양 접시에서 유지되거나 성장할 수 있다. 유기체내에 포함되는 세포에 대해, 당해 분야에 경구, 비경구, 피부, 주사 및 에어로졸 적용을 포함하여(그러나 이로 제한되지는 않는다) 화합물을 투여하는 많은 기술이 현존한다. 유기체의 외부의 세포에 대해, 당해 분야에 세포 미량주사(microinjection) 기술, 형질전환 기술 및 담체 기술을 포함하여(그러나 이로 제한되지는 않는다) 화합물을 투여하는 많은 기술이 현존한다.
바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 유기체에서 비정상 상태를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 아자벤즈이미다졸계 화합물은 본원에 정의된 화학식 I, II 또는 III 또는 본원에 기술된 이의 소그룹으로 기술된 구조를 갖는다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 유기체에서 비정상 상태를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 아자벤즈이미다졸계 화합물은 SABI 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 유기체에서 비정상 상태를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 유기체는 포유동물이다.
"포유동물"이란 용어는 바람직하게는 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그 및 염소, 더욱 바람직하게는 원숭이 및 영장류, 가장 바람직하게는 사람과 같은 유기체를 언급한다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 유기체에서 비정상 상태를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 비정상 상태는 암 또는 섬유증 장애이다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 유기체에서 비정상 상태를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 암은 폐암, 난소암, 유방암, 뇌암, 내축성 뇌암, 결장암, 전립선암, 육종, 카포씨(Kaposi) 육종, 흑색종 및 신경교종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 유기체에서 비정상 상태를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 방법은 세린/트레오닌 단백질 키나제와 천연 결합 파트너 사이의 상호작용으로 특징지워지는 신호전달 경로의 변형과 관련된 비정상 상태에 적용한다.
"신호전달 경로"라는 용어는 신호의 전파를 의미한다. 일반적으로, 세포외 신호는 세포막을 통해 전달되어 세포내 신호로 된다. 다음에, 이 신호는 세포 반응을 자극할 수 있다. 이 용어는 또한 세포내에 완전히 전파되는 신호를 포함한다. 신호전달 과정에 포함되는 폴리펩타이드 분자는 일반적으로 수용체 및 비-수용체 단백질 키나제, 수용체 및 비-수용체 단백질 포스파타제, 뉴클레오티드 교환 인자 및 전사 인자이다.
신호전달 과정과 관련하여 "변형"이란 용어는 유기체에서 과도하게 또는 불완전하게 나타나고, 이의 촉매 활성이 자생 단백질 키나제 활성보다 낮거나 높도록 돌연변이되고, 천연 결합 파트너와 더이상 상호작용하지 못하고, 다른 단백질 키나제 또는 단백질 포스파타제에 의해 더이상 개질되지 않고, 천연 결합 파트너와 더이상 상호작용하지 않도록 돌연변이되는 단백질 키나제에 관한 것이다.
"비정상 상호작용의 촉진 또는 방해"라는 용어는 본 발명의 화합물을 유기체의 세포 또는 조직에 투여하여 달성될 수 있는 방법에 관한 것이다. 화합물은 착체 표면에서 다수의 원자와의 유리한 상호작용을 형성시킴으로써 단백질 키나제와 천연 결합 파트너 사이의 상호작용을 촉진시킬 수 있다. 또는, 화합물은 착체 표면에서 원자 사이에 형성된 유리한 상호작용을 절충함으로써 단백질 키나제와 천연 결합 파트너 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 유기체에서 비정상 상태를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 세린/트레오닌 단백질 키나제는 RAF이다.
III. 본 발명의 화합물 및 약제학적 조성물
다른 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 아자벤즈이미다졸 화합물을 특징으로 한다:
Figure 112000005791758-pct00004
Figure 112000005791758-pct00005
Figure 112000005791758-pct00006
상기식에서,
(a) R1, R2, R3 및 R4는
(i) 수소,
(ii) 포화 또는 불포화 알킬,
(iii) NX2X3(여기에서, X2 및 X3은 수소, 포화 또는 불포화 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다),
(iv) 할로겐 또는 트리할로메틸,
(v) 화학식 -CO-X4의 케톤(여기에서, X4는 수소, 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다),
(vi) 화학식 -(X5)n-COOH의 카복실산 또는 화학식 -(X6)n-COO-X 7의 에스테르(여기에서, X5, X6 및 X7은 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, n은 0 또는 1이다),
(vii) 화학식 (X8)n-OH의 알콜 또는 화학식 -(X8)n-O-X9의 알콕시 잔기(여기에서, X8 및 X9는 수소, 포화 또는 불포화 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 환은 알킬, 알콕시, 할로겐, 트리할로메틸, 카복실레이트, 니트로 및 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환되고, n은 0 또는 1이다),
(viii) 화학식 -NHCOX10의 아미드(여기에서, X10은 알킬, 하이드록실 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 환은 알킬, 알콕시, 할로겐, 트리할로메틸, 카복실레이트, 니트로 및 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된다),
(ix) -SO2NX11X12(여기에서, X11 및 X12는 수소, 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다),
(x) 알킬, 알콕시, 할로겐, 트리할로메틸, 카복실레이트, 니트로 및 에스테 르 잔기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나, 두개 또는 세개의 치환체에 의해 임의로 치환된 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기,
(xi) 화학식 -CO-H-의 알데히드, 및
(xii) 화학식 -SO2-X13의 설폰(여기에서, X13은 포화 또는 불포화 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
(b) Z1 및 Z2는 질소, 황, 산소, NH 및 NR4로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 단 Z1 및 Z2중의 하나가 질소, NH 또는 NR4인 경우, Z1 및 Z2중의 나머지 것은 질소, 황, 산소, NH 또는 NR4이고;
(c) Z3 및 X1은 질소, 황 및 산소로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
"포화 알킬"이란 용어는 알켄 또는 알킨 잔기를 함유하지 않는 알킬 잔기를 언급한다. 알킬 잔기는 분지되거나 분지되지 않을 수 있다.
"불포화 알킬"이란 용어는 하나 이상의 알켄 또는 알킨 잔기를 함유하는 알킬 잔기를 언급한다. 알킬 잔기는 분지되거나 분지되지 않을 수 있다.
"아민"이란 용어는 화학식 NR1R2의 화학적 잔기(여기에서, R1 및 R2는 수소, 포화 또는 불포화 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 환은 알킬, 할로겐, 트리할로메틸, 카복실레이 트, 니트로 및 에스테르 잔기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된다)를 언급한다.
"아릴"이란 용어는 공액된 π 전자 시스템을 갖는 하나 이상의 환을 갖고 카보사이클릭 아릴(예: 페닐) 및 헤테로사이클릭 아릴 그룹(예: 피리딘)을 둘다 포함하는 방향족 그룹을 언급한다. "카보사이클릭"이란 용어는 하나 이상의 공유 폐환 구조를 함유하고, 환의 골격을 형성하는 원자가 모두 탄소 원자인 화합물에 관한 것이다. 따라서, 이 용어는 카보사이클릭 환을, 탄소와는 상이한 하나 이상의 원자를 함유하는 헤테로사이클릭 환과 구별한다. "헤테로아릴"이란 용어는 하나 이상의 헤테로사이클릭 환을 함유하는 아릴 그룹을 언급한다.
"할로겐"이란 용어는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 원자를 언급한다.
"케톤"이란 용어는 화학식 -(R)n-CO-R'의 화학적 잔기(여기에서, R 및 R'는 포화 또는 불포화 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, n은 0 또는 1이다)를 언급한다.
"카복실산"이란 용어는 화학식 -(R)n-COOH의 화학적 잔기(여기에서, R은 포화 또는 불포화 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, n은 0 또는 1이다)를 언급한다.
"에스테르"라는 용어는 화학식 -(R)n-COOR'의 화학적 잔기(여기에서, R 및 R'는 포화 또는 불포화 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루 어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, n은 0 또는 1이다)를 언급한다.
"알콜"이란 용어는 화학식 -ROH의 화학 치환체(여기에서, R은 수소, 포화 또는 불포화 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 환 잔기는 알킬, 할로겐, 트리할로메틸, 카복실레이트, 니트로 및 에스테르 잔기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된다)를 언급한다.
"아미드"라는 용어는 화학식 -NHCOR의 화학 치환체(여기에서, R은 수소, 알킬, 하이드록실 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 환은 알킬, 할로겐, 트리할로메틸, 카복실레이트, 니트로 및 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된다)를 언급한다.
"알콕시 잔기"라는 용어는 화학식 -OR의 화학 치환체(여기에서, R은 수소 또는 포화 또는 불포화 알킬 잔기이다)를 언급한다.
"알데히드"라는 용어는 화학식 -(R)n-CHO의 화학적 잔기(여기에서, R은 포화 또는 불포화 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, n은 0 또는 1이다)를 언급한다.
"설폰"이란 용어는 화학식 -SO2-R의 화학적 잔기(여기에서, R은 포화 또는 불포화 알킬 및 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)를 언급한다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 아자벤즈이미다졸계 화합물(여기에서, Z1 및 Z2는 질소 및 NH로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 아자벤즈이미다졸계 화합물(여기에서, R1, R2, R3 및 R4는 수소, 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기에 의해 임의로 치환된, 포화 또는 불포화 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 환 잔기는 알킬, 알콕시, 할로겐, 트리할로메틸, 하이드록시, 카복실레이트, 니트로 및 에스테르 잔기, 및 알킬, 알콕시, 할로겐, 트리할로메틸, 하이드록시, 카복실레이트, 니트로 및 에스테르 잔기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나, 두개 또는 세개의 치환체에 의해 임의로 치환된 호모사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 잔기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나, 두개 또는 세개의 치환체에 의해 임의로 치환된다)에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 아자벤즈이미다졸계 화합물(여기에서, R2 및 R3은 수소이다)에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 아자벤즈이미다졸계 화합물(여기에서, R1은 알킬, 알콕시, 할로겐, 트리할로메틸, 카복실레이트, 니트로 및 에스테르 잔기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나, 두개 또는 세개의 치환체에 의해 임의로 치환된 페닐이다)에 관한 것 이다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 아자벤즈이미다졸계 화합물(여기에서, R1은 SABI 치환체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)에 관한 것이다.
"SABI 치환체"라는 용어는 페닐, 2-니트로페닐, 3-니트로페닐, 4-니트로페닐, 2-클로로페닐, 3-클로로페닐, 4-클로로페닐, 2-메틸페닐, 3-메틸페닐, 4-메틸페닐, 2-플루오로페닐, 3-플루오로페닐, 4-플루오로페닐, 2-(트리플루오로메틸)페닐, 3-(트리플루오로메틸)페닐, 4-(트리플루오로메틸)페닐, 2-메톡시페닐, 3-메톡시페닐, 4-메톡시페닐, 2-카복시페닐, 3-카복시페닐 및 4-카복시페닐로 이루어진 치환체 그룹을 언급한다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 아자벤즈이미다졸계 화합물(여기에서, X1은 황이다)에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 아자벤즈이미다졸계 화합물(여기에서, X1은 산소이다)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 아자벤즈이미다졸계 화합물(여기에서, Z3은 산소이다)에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 아자벤즈이미다졸계 화합물(여기에서, R4는 메틸 및 에틸로 이루어진 그룹으로 부터 선택된다)에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 아자벤즈이미다졸계 화합물(여기에서, 아자벤즈이미다졸 화합물은 SABI 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)에 관한 것이다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 본원에서 특정된 본 발명의 화합물 또는 이의 염, 및 생리학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 본원에서 정의된 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 화합물 또는 본원에 기술된 이의 소그룹을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 아자벤즈이미다졸 화합물이 SABI 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
"약제학적 조성물"이란 용어는 본 발명의 아자벤즈이미다졸 화합물과 다른 화학적 성분(예: 희석제 또는 담체)의 혼합물을 언급한다. 약제학적 조성물은 유기체에 화합물의 투여를 용이하게 한다. 경구, 주사, 에어로졸, 비경구 및 국소 투여를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 화합물을 투여하는 다수의 방법이 당해 분야에 현존한다. 약제학적 조성물은 또한 화합물을 무기산(예: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등)과 반응시켜 수득할 수 있다.
"생리학적으로 허용되는"이란 용어는 생물학적 활성 및 화합물의 특성을 제거하지 않는 담체 또는 희석제를 정의한다.
"담체"라는 용어는 세포 또는 조직으로 화합물의 혼입을 용이하게 하는 화학적 화합물로서 정의된다. 예를 들어, 디메틸 설폭사이드(DMSO)는, 유기체의 세포 또는 조직으로 많은 유기 화합물의 흡수를 촉진시키기 때문에, 일반적으로 사용되는 담체이다.
"희석제"라는 용어는 관심있는 화합물을 용해시키고 화합물의 생물학적 활성형을 안정화시키는, 물에 희석되는 화학적 화합물을 정의한다. 완충액에 용해된 염은 당해 분야에서 희석제로서 사용된다. 일반적으로 사용되는 완충액은 인산염 완충된 식염수이며, 이는 사람 혈액의 염 조건과 흡사하기 때문이다. 완충염은 용액의 pH를 낮은 농도에서 조절할 수 있으므로, 완충된 희석제는 화합물의 생물학적 활성을 거의 변화시키지 않는다.
IV. 본 발명의 합성 방법
다른 양태에 있어서, 본 발명은 다음 단계를 포함하여, 화학식 I, II 또는 III의 아자벤즈이미다졸 화합물을 합성하는 방법에 관한 것이다: (a) 2-아미노-6-클로로-3-니트로피리딘을 치환된 아릴 환인 제2 반응물을 용매중에서 반응시켜 제1 중간체를 수득하는 단계; (b) 제1 중간체를 촉매 및 환원제의 존재하에 환원시켜 제2 중간체를 수득하는 단계; (c) 제2 중간체와 제3 반응물을 반응시키는 단계; 및 (d) 본 발명의 화합물을 정제하는 단계.
바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 합성하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 치환된 아릴은 치환된 페놀, 치환된 티오페놀 및 치환된 아닐 린이다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 치환된 페놀, 치환된 티오페놀 및 치환된 아닐린이 SABI 반응물로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 본 발명의 화합물을 합성하는 방법에 관한 것이다.
"SABI 반응물"이란 용어는 페놀, 2-니트로페놀, 3-니트로페놀, 4-니트로페놀, 2-클로로페놀, 3-클로로페놀, 4-클로로페놀, 2-크레졸, 3-크레졸, 4-크레졸, 2-플루오로페놀, 3-플루오로페놀, 4-플루오로페놀, 2-(트리플루오로메틸)페놀, 3-(트리플루오로메틸)페놀, 4-(트리플루오로메틸)페놀, 2-메톡시페놀, 3-메톡시페놀, 4-메톡시페놀, 2-하이드록시벤조산, 3-하이드록시벤조산, 4-하이드록시벤조산, 티오페놀, 2-니트로티오페놀, 3-니트로티오페놀, 4-니트로티오페놀, 2-클로로티오페놀, 3-클로로티오페놀, 4-클로로티오페놀, 2-티오크레졸, 3-티오크레졸, 4-티오크레졸, 2-플루오로티오페놀, 3-플루오로티오페놀, 4-플루오로티오페놀, 2-(트리플루오로메틸)티오페놀, 3-(트리플루오로메틸)티오페놀, 4-(트리플루오로메틸)티오페놀, 2-메톡시벤젠티올, 3-메톡시벤젠티올, 4-메톡시벤젠티올, 2-머캅토벤조산, 3-머캅토벤조산, 4-머캅토벤조산, 아닐린, 2-니트로아닐린, 3-니트로아닐린, 4-니트로아닐린, 2-클로로아닐린, 3-클로로아닐린, 4-클로로아닐린, 2-톨루이딘, 3-톨루이딘, 4-톨루이딘, 2-플루오로아닐린, 3-플루오로아닐린, 4-플루오로아닐린, 2-(트리플루오로메틸)아닐린, 3-(트리플루오로메틸)아닐린, 4-(트리플루오로메틸)아닐린, 2-아니시딘, 3-아니시딘, 4-아니시딘, 2-아미노벤조산, 3-아미노벤조산 및 4-아미노벤조산으로 이루어진 반응물 그룹을 언급한다.
바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 용매가 n-프로판올인, 본 발명의 화합물의 합성방법에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 환원제가 수소인, 본 발명의 화합물의 합성방법에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 촉매가 라니 니켈인, 본 발명의 화합물의 합성방법에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 제3 반응물이 O-메틸이소우레아인, 본 발명의 화합물의 합성방법에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 제3 반응물이 S-메틸이소티오우로늄 설페이트 및 알킬 클로로포르메이트의 반응 생성물인, 본 발명의 화합물의 합성방법에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 알킬 클로로포르메이트가 메틸 클로로포르메이트인, 본 발명의 화합물의 합성방법에 관한 것이다.
여전히 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 알킬 클로로포르메이트가 에틸 클로로포르메이트인, 본 발명의 화합물의 합성방법에 관한 것이다.
상기 기술된 본 발명의 요약은 비제한적이며, 본 발명의 다른 특징 및 잇점은 바람직한 양태에 대한 다음 설명 및 청구범위로부터 명백하다.
바람직한 양태에 대한 설명
본 발명의 한 양태는 아자벤즈이미다졸계 화합물을 사용하여 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 한 양태는 세린/트레오닌 단백질 키나제의 기능을 조절하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 세린/트레오닌 단백질 키나제(예: RAF)를 발현하는 세포를 포함한다.
RAF는, 활성화된 RAS인 구아닌 삼인산염 가수분해 효소에 결합하는 경우, 세포막에 보충되는 비-수용체 단백질 키나제이다. RAS는, 활성화된 수용체 단백질 티로신 키나제(예: EGFR 또는 PDGFR)가 어댑터 단백질(adaptor protein), GRB2 및 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자, SOS에 결합하는 경우에 활성화된다. SOS는 RAS로부터 구아닌 이인산염을 제거하고, 이를 구아닌 삼인산염으로 대체하고, 이에 의해 RAS를 활성화시킨다. 다음에, RAS는 RAF에 결합하고, 결국 RAF를 활성화시킨다. 다음에, RAF는 다른 단백질 표적, 예를 들어, 인산화되어 결국 마이토젠-활성화된 단백질 키나제(MAPK)를 활성화시키는 키나제(MEK)를 세린 및 트레오닌 잔기에 대해 인산화시킬 수 있다. 따라서, RAF는 마이토젠-활성화된 신호전달에서 중간 조절 인자로서 사용된다.
세포에서 RAF의 중요한 조절 역할에 기인하여, RAF의 아미노산 서열에 대한 변형은 이의 기능을 변화시키고, 결국 세포 거동을 변화시킬 수 있다. 세포 증식에서 RAF의 역할은 RAF의 아미노산 서열에 대한 돌연변이가 종양 및 암과 연관되어 있다는 관찰에 의해 뒷받침된다. 세포에서 암을 유발하는 RAF에 대한 돌연변이는 비조절 촉매 활성을 나타내는 RAF 분자를 생성시키므로, RAF의 억제제는 이들 세포에서 암을 유발하는 세포 증식을 감소시키거나 심지어 제거할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 세포에서 단백질 키나제 RAF의 기능을 조절하는 화합물을 검출할 수 있다. RAF는 단백질 키나제(MEK)를 인산화시키고, 이는 다시 마이토젠-활성화된 단백질 키나제(MAPK)를 인산화시킨다. MEK의 RAF에 의한 인산화만을 모니터링하는 분석은, MEK의 인산화 수준이 중대하지 않으므로 민감하지 않다. 이러한 민감성 난제를 극복하기 위해서, MEK 및 MAPK의 인산화가 본 발명의 분석에서 수행된다. MAPK 인산화 신호는 MEK 인산화 신호를 증폭시키고 RAF-의존성 인산화가 효소-결합된 면역흡착 분석에서 수행되게 한다. 또한, 본 발명의 분석은 바람직하게는 많은 화합물이 단기간에 빨리 모나터될 수 있도록 높은 처리형으로 수행된다.
본 발명의 방법에 의해 RAF 단백질 키나제의 기능을 억제하는 화합물을 동정하였다. 이들 화합물은 아자벤즈이미다졸계 유도체이다. 아자벤즈이미다졸계 유도체는 세균의 뉴클레오티드 합성과 관련된 효소의 억제능에 대해 시험해 왔지만, 이들 화합물중 대다수는 단백질 키나제 억제에 대해 아직 충분하게 조사되지 않았다.
RAF는 다른 세린/트레오닌 단백질 키나제에 대해 상당한 아미노산 상동성을 나타내므로, 본 발명의 아자벤즈이미다졸계 화합물은 마찬가지로 RAF 이외의 세린/트레오닌 단백질 키나제를 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 또한 수용체 및 비-수용체 세린/트레오닌 단백질 키나제를 포함하여 RAF 이외의 세린/트레오닌 단백질 키나제에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 또한 세포에서 RAF의 기능을 조절하는 다른 화합물에 관한 것이며, 이는 본 방법의 고처리량 양상이 광범위한 배열의 분자를 단기간에 시험가능하도록 하기 때문이다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 STK 기능을 조절하는 본 발명에 기술되지 않은 현존하는 분자를 동정할 수 있다.
I. 아자벤즈이미다졸계 화합물의 생물학적 활성
본 발명의 아자벤즈이미다졸계 화합물을 RAF 단백질 키나제 기능을 억제하는 능력에 대해 시험한다. 이들 억제의 생물학적 분석 및 연구 결과가 본원에 보고된다. 단백질 키나제 기능의 아자벤즈이미다졸계 화합물 조절을 측정하는 데에 사용되는 방법은 본 방법의 고처리량의 측면에서 문헌에 기술된 방법과 유사하다[참조: 1996년 8월 23일에 출원된 탱(Tang) 등의 미국 특허원 제08/702,232호; 발명의 명칭 "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease", (Lyon & Lyon Docket No. 221/187)]. 제08/702,232호 특허원은 도면을 포함하여 이의 전문이 본원에서 참고로 인용된다.
II. 아자벤즈이미다졸계 화합물에 의해 치료되는 표적 질병
본원에 기술된 방법, 화합물 및 약제학적 조성물은 RAF 단백질 키나제의 기능을 조절하여 세포 증식 장애를 억제하기 위해 고안되었다. 증식 장애는 다세포성 유기체에서 하나 이상의 세포의 부분집합의 원치 않는 세포 증식을 초래하여 유기체를 손상시킨다. 본원에 기술된 방법, 화합물 및 약제학적 조성물은 또한 유기체의 다른 장애, 예를 들어, 조기 세포 사멸과 관련된 장애(즉, 신경학적 질환) 또는 염증을 치료 및 예방하기에 유용할 수 있다. 이들 장애는 부적합하게 기능하는 RAF 분자의 결과 또는 부적합하게 기능하는 RAF-관련된 단백질 키나제 분자의 결과일 수 있다.
RAF 단백질 키나제 또는 RAF와 관련된 단백질 키나제의 기능 변화는 특정 질환에서 명백한 증가된 또는 감소된 세포 증식 상태를 유도할 수 있다. 변형된 세포 증식 상태는 암, 섬유증 장애, 메산쥼 장애, 비정상 혈관형성 및 맥관형성, 상처 치유, 건선, 재발협착증 및 염증을 포함한다.
섬유증 장애는 세포의 세포외 매트릭스의 비정상 형태에 관한 것이다. 섬유증 장애의 예에는 간경변이 있다. 간경변은 세포외 매트릭스 성분의 증가된 농도에 의해 특징지워지고, 이는 간 반흔의 형성을 초래한다. 간경변은 간경변증과 같은 질환을 유발할 수 있다.
메산쥼 세포 증식 장애는 메산쥼 세포의 비정상 증식에 기인하여 일어난다. 메산쥼 증식 장애는 사람의 각종 신장 질환, 예를 들어, 사구체신염, 당뇨병성 신증, 악성 신경화증, 혈전증성 미소혈관증 증후군, 이식 거부반응 및 신사구체병증을 포함한다.
본 발명의 방법 및 화합물에 의해 치료될 수 있는 바람직한 종류의 암에는 폐암, 난소암, 유방암, 뇌암, 내축성 뇌암, 결장암, 전립선암, 카포씨(Kaposi) 육종, 흑색종 및 신경교종이 있다. 본 발명의 화합물 및 방법이 암 세포의 증식을 저지하고 반전시키는 데에 유효하게 사용될 수 있는 증거가 본원에 참고로 제공되어 있다.
혈관형성 및 맥관형성 장애는 과도한 혈관 증식으로부터 초래된다. 혈관 증식은 많은 정상적인 생리학적 과정(예: 배아 발생, 황체 형성, 상처 치유 및 기관 재생)에서 필수적이다. 그러나 혈관 증식은 또한 암 종양의 진행에 필수적이다. 혈관 증식 장애의 다른 예에는 관절염이 포함되며, 이 경우에는 새로운 모세 혈관이 관절을 침범하고, 연골을 파괴한다. 또한, 혈관 증식 질환은 안 질환(예; 당뇨병성 망막병증)을 포함하고, 이 경우에는 망막내의 새로운 모세혈관이 유리체를 침범하고, 출혈되어 실명을 유발한다. 반대로, 혈관의 축소, 수축 또는 폐쇄에 관련된 장애(예: 재발협착증)는 또한 단백질 키나제의 역 조절에 포함된다.
또한, 맥관형성 및 혈관형성은 악성 고형 종양의 성장 및 전이와 연관된다. 격렬하게 성장하는 암 종양은 계속 성장하기 위한 영양소 및 산소가 풍부 혈액 공급을 필요로 한다. 그 결과, 비정상적으로 많은 수의 모세혈관은 간혹 종양과 제휴하여 성장하고, 종양에 대한 공급 라인으로 작용한다. 종양에 영양소를 공급하는 것 이외에, 종양에 매봉된 새로운 혈관은 유기체에서 종양 세포에 대한 통로를 제공하여 순환계로 도입되고 원거리 부위로 전이한다[참조: Folkman, 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:4-6].
부적합한 RAF 활성은 세포 증식 장애를 자극할 수 있다. RAF 단백질 키나제의 기능을 조절하도록 특정하게 고안된 분자는 세포 증식을 억제하는 것으로 나타났다. 특히, RAF 단백질 키나제를 암호화하는 전령 RNA에 결합하고 이 전령으로부터 전사를 차단하도록 고안된 안티센스 핵산 분자는 시험관내에서 A549 세포의 형질전환을 효과적으로 반전시킨다[참조: Monia et al., 1996, Nature Medicine 2: 688, 모든 도면 및 표를 포함하여 이의 전문이 본원에서 참고로 인용된다]. A549 세포는 사람의 악성 세포이다.
이러한 RAF-표적화 안티센스 연구는 RAF 단백질 키나제의 기능을 조절하는 본 발명의 아자벤즈이미다졸 분자가 유기체에서 악성 세포의 증식을 저지하고, 마찬가지로 반전시킬 수 있다는 증거를 제시한다. 이러한 아자벤즈이미다졸 화합물은 본원에서 실시예로 제공된 시험관내 방법으로 시험될 수 있다. 또한, 아자벤즈이미다졸 화합물은 본원에서 또한 실시예에 의해 제공된 이종이식 방법에 의해 생체내에서 종양 세포에 대한 이의 효과를 시험할 수 있다.
부적합한 RAF 활성이 특정한 종류의 세포의 원치 않는 세포 증식을 자극할 수 있는 두가지 이상의 방법이 있다: (1) 특정한 세포의 성장을 직접 자극하는 것 또는 (2) 특정한 영역(예: 종양 조직)의 혈관형성을 증가시키고, 이에 의해 조직의 성장을 촉진시키는 것.
본 발명의 사용은 세포 증식 장애가 RAF에 의해 유발되는지 여부를 먼저 확인함으로써 용이하게 된다. 일단 이러한 장애가 확인되면, 이러한 장애로 고생하는 환자는 당해 분야의 전문 기술을 가진 전문의 또는 수의사에게 익히 공지된 방법을 사용하여 환자의 증상을 분석함으로써 확인할 수 있다. 다음에, 이러한 환자는 본원에 기술된 바와 같이 치료할 수 있다.
세포 증식 장애가 RAF에 의해 유발되는가의 여부는 세포내에서 또는 환자 신체의 특정 위치에서 일어나는 RAF 활성의 수준을 먼저 측정함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 암 세포의 경우에 하나 이상의 RAF 활성의 수준은 비-RAF 유발된 암 및 RAF 유발된 암에 대해 비교할 수 있다. 암 세포가 RAF 유발된 암보다 RAF 활성 수준이 높은 경우, 바람직하게는 RAF에 의해 유발된 암과 동일하거나 또는 이보다 큰 경우, 상기 암 세포는 본 발명의 기술된 RAF 조절 방법 및 화합물을 사용한 치료의 후보일 수 있다.
비-암 세포의 원치 않는 증식에 기인하여 일어나는 세포 증식 장애의 경우, RAF 활성의 수준은 일반적 집단에서 일어나는 수준(예를 들어, 세포 증식 장애로 고생하는 사람 또는 동물을 제외한 사람 또는 동물의 일반적 집단에서 일어나는 평균 수준)에 상당한다. 원치 않는 세포 증식 장애가 일반적 집단에서 일어나는 것보다 높은 RAF 수준에 의해 특징지워지는 경우, 장애는 본 발명의 기술된 RAF 조절 방법 및 화합물을 사용하는 치료에 대한 희망이 있다.
III. 아자벤즈이미다졸계 화합물의 약제학적 조성물 및 이의 투여
화합물의 약제학적 제형을 제조하는 방법 및 환자에게 투여하는 화합물의 양을 측정하는 방법, 및 유기체에 화합물을 투여하는 방식이 문헌에 기술되어 있으며, 이는 둘다 도면을 포함하여 이의 전문이 본원에서 참고로 인용되어 있다[참조: 1996년 8월 23일에 출원된 탱(Tang) 등의 미국 특허원 제08/702,232호, 발명의 명칭 "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease", (Lyon & Lyon Docket No. 221/187); 1996년 8월 1일에 공개된 버젯티(Buzzetti) 등의 국제 특허 공보 제WO 96/22976호, 발명의 명칭 "Hydrosoluble 3-Arylidene-2-Oxindole Derivatives as Tyrosine Kinase Inhibitors"]. 당해 분야의 전문가라면, 이러한 기술이 본 발명에 적용가능하고 이에 용이하게 변용시킬 수 있음을 이해할 것이다.
다음 실시예는 비제한적이며, 본 발명의 많은 양태 및 특징을 대표하는 것에 불과하다. 실시예에는 본 발명의 화합물을 합성하는 방법 및 RAF 단백질 키나제의 기능에 대한 화합물의 효과를 측정하는 방법이 기술되어 있다.
방법에 사용되는 세포는 시판된다. 세포에 포함된 핵산 벡터는 또한 시판되며, 많은 단백질 키나제에 대한 유전자의 서열은 서열 데이터 뱅크에서 쉽게 입수할 수 있다. 따라서, 당해 분야의 전문가는 시판 세포, 시판 핵산 벡터 및 단백질 키나제 유전자를 당해 분야의 전문가가 용이하게 수행할 수 있는 기술을 사용하여 결합시킴으로써 시기적절한 방법으로 세포주를 쉽게 재생시킬 수 있다.
실시예 1
본 발명의 아자벤즈이미다졸 화합물을 합성하는 방법
본 발명은 이제 다음 비제한 실시예로 예시되며, 여기에서 달리 언급하지 않는 한:
(i) 증발은 진공하에 회전 증발시켜 수행하고;
(ii) 작업은 불활성 기체(예: 질소)의 대기하에 수행하고;
(iii) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 독일 다름시타트 소재의 E. Merck로부터 수득한 Merck LiChrosorb RP-18 역상 실리카 상에서 수행하고;
(iv) 수율은 예시하기 위해서만 제공되며, 반드시 수득가능한 최대치는 아니며;
(v) 융점은 보정되지 않으며, HWS Mainz SG 2000 디지탈 융점 장치를 사용하여 측정하고;
(vi) 본 발명의 화학식 I, II 또는 III의 모든 화합물의 구조는 Bruker AMX500-NMR 분광광도계 상에서 양자 자기 공명 분광법에 의해, 원소 미량분석에 의해, 및 특정한 경우, 질량 분광법에 의해 확인하고;
(vii) 구조체의 순도는 실리카 겔(Merck Silica Gel 60 F254)을 사용하여 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 또는 HPLC에 의해 수행하고;
(viii) 중간체는 일반적으로 충분히 특징지워지지 않고, 순도는 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 또는 HPLC에 의해 수득한다.
합성 방법
화합물 A-90: 2-메톡시카보닐아미노-(6-페닐머캅토-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
2-아미노-3-니트로-6-(페닐머캅토)피리딘은 2-아미노-6-클로로-3-니트로피리딘(84.0g, 0.484mol) 및 나트륨 티오페놀레이트(Fluka)(72.0g, 0.545mol)을 2-프로판올(1500ml)중에서 환류하에 2시간 동안 가열하여 제조한다. 실온으로 냉각시킨 후, 현탁액을 물(100ml)로 희석시키고, 고체를 진공 여과시켜 수집하고, 물 및 2-프로판올로 세척하고, 50℃에서 진공하에 건조시켜 2-아미노-3-니트로-6-(페닐머캅토)피리딘 109.1g을 수득한다(수율 95%, 융점 148 내지 152℃).
2,3-디아미노-6-(페닐머캅토)피리딘은 2-아미노-3-니트로-6-(페닐머캅토)피리딘(107.1g, 0.433mol)을 5atm의 H2하에 2-프로판올 1200ml중의 라니 니켈 30g의 존재하에 70℃에서 수소화시켜 제조한다. 4시간 후에(수소 29.1L), 반응 혼합물을 계속 교반하면서 4℃로 냉각시킨다. 침전물을 진공 여과시켜 수집하고, 2-프로판올로 세척하고, 50℃에서 진공하에 건조시킨다. 여액을 합하여 감압하에 농축시키고, 2-프로판올로부터 재결정시킨다. 수소화 장치를 THF 1000ml로 2회 세척한 후, 감압하에 증발시키고 2-프로판올로부터 재결정시키고, 침전물을 수집하고, 50℃에서 진공하에 건조시켜 2,3-디아미노-6-(페닐머캅토)피리딘 80.4g을 수득한다(수율 87.1%, 융점 119 내지 122℃).
2-메톡시카보닐아미노-6-페닐머캅토-3H-이미다조[4,5-b]피리딘은 메틸 클로로포르메이트(34ml, 0.44mol)를 물 68ml중의 S-메틸이소티오우로늄 설페이트(53g, 0.19mol)(Aldrich)의 차가운(5 내지 15℃) 용액에, 온도를 20℃ 이하로 유지하면서 적가하여 제조한다. 이후에, 수성 수산화나트륨(116g, 25% NaOH)을 조심해서 가하면 백색 침전물이 생긴다. 20분 후, 물(210ml)를 가하고, pH를 아세트산(빙상, 34ml)을 사용하여 4.0으로 조정한다. 이 혼합물에 에탄올 210ml중의 2,3-디아미노-6-(페닐머캅토)피리딘(37.8g, 0.174mol)의 용액을 적가하고, 85 내지 90℃로 2시간 동안 가열한다. 반응 혼합물을 밤새 냉각시킨 후, 침전물을 여과시켜 분리하고, 온수(1000ml)로 세척하고, 건조시키고 아세트산 및 에탄올로부터 4℃에서 재결정시킨다. 침전물을 여과시켜 수집하고, 메탄올로 세척하고 50℃에서 진공하에 건조시켜 2-메톡시카보닐아미노-(6-페닐머캅토-3H-이미다조[4,5-b]피리딘 30g을 수득한다(수율 57.4%, 융점 269 내지 274℃(분해)).
화합물 A-3: 2-메톡시카보닐아미노-(6-페녹시-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
실시예 A-90의 나트륨 티오페놀레이트 대신에 나트륨 페놀레이트로 대체시켜, 동일한 방법에 의해 2-메톡시카보닐아미노-(6-페녹시-3H-이미다조[4,5-b]피리딘을 수득한다. 융점 >280℃(분해).
화합물 A-4: 2-에톡시카보닐아미노-6-페녹시-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
실시예 A-3의 메틸 클로로포르메이트 대신에 에틸 클로로포르메이트로 대체시켜, 동일한 방법에 의해 2-에톡시카보닐아미노-(6-페녹시-3H-이미다조[4,5-b]피리딘을 수득한다. 융점 >280℃(분해).
화합물 A-1: 2-옥소-6-페녹시-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
실시예 A-3의, S-메틸이소티오우로늄 설페이트와 메틸 클로로포르메이트의 반응 생성물 대신에 O-메틸이소우레아를 2,3-디아미노-6-(페닐머캅토)피리딘과 직접 반응시켜, 동일한 방법으로 2-옥소-6-페녹시-3H-이미다조[4,5-b]피리딘을 수득한다. 융점 277 내지 278℃.
화합물 A-2: 2-옥소-6-페닐머캅토-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
실시예 A-1의 나트륨 페놀레이트 대신에 나트륨 티오페놀레이트로 대체시켜, 동일한 방법으로 2-옥소-(6-페닐머캅토-3H-이미다조[4,5-b]피리딘을 수득한다. 융점 253 내지 254℃.
화합물 A-5 내지 A-25
실시예 A-1의 나트륨 페놀레이트를 적합한 페놀레이트로 대체시켜, 동일한 방법으로 다음 화합물들을 수득한다. 화합물 A-23, A-24 및 A-25의 경우, 카복시 그룹을 메틸, 에틸, 벤질, t-부틸 또는 다른 적합한 에스테르에 의해 보호시킨 다음에, 마지막 단계에서 탈보호시켜 당해 화합물들을 수득한다.
A-5 2-옥소-6-(2-니트로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-6 2-옥소-6-(3-니트로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-7 2-옥소-6-(4-니트로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-8 2-옥소-6-(2-클로로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-9 2-옥소-6-(3-클로로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-10 2-옥소-6-(4-클로로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-11 2-옥소-6-(2-메틸페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-12 2-옥소-6-(3-메틸페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-13 2-옥소-6-(4-메틸페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-14 2-옥소-6-(2-플루오로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-15 2-옥소-6-(3-플루오로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-16 2-옥소-6-(4-플루오로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-17 2-옥소-6-[2-(트리플루오로메틸)페녹시]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-18 2-옥소-6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-19 2-옥소-6-[4-(트리플루오로메틸)페녹시]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-20 2-옥소-6-(2-메톡시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-21 2-옥소-6-(3-메톡시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-22 2-옥소-6-(4-메톡시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-23 2-옥소-6-(2-카복시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-24 2-옥소-6-(3-카복시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-25 2-옥소-6-(4-카복시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
화합물 A-26 내지 A-46
실시예 A-2의 나트륨 티오페놀레이트를 적합한 티오페놀레이트로 대체시켜, 동일한 방법으로 다음 화합물들을 수득한다. 화합물 A-44, A-45 및 A-46의 경우, 카복시 그룹을 메틸, 에틸, 벤질, t-부틸 또는 다른 적합한 에스테르에 의해 보호시킨 다음에, 마지막 단계에서 탈보호시켜 당해 화합물들을 수득한다.
A-26 2-옥소-6-(2-니트로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-27 2-옥소-6-(3-니트로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-28 2-옥소-6-(4-니트로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-29 2-옥소-6-(2-클로로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-30 2-옥소-6-(3-클로로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-31 2-옥소-6-(4-클로로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-32 2-옥소-6-(2-메틸페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-33 2-옥소-6-(3-메틸페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-34 2-옥소-6-(4-메틸페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-35 2-옥소-6-(2-플루오로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-36 2-옥소-6-(3-플루오로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-37 2-옥소-6-(4-플루오로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-38 2-옥소-6-[2-(트리플루오로메틸)페닐머캅토]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-39 2-옥소-6-[3-(트리플루오로메틸)페닐머캅토]-3H-이미다조[4,5-b]피리 딘
A-40 2-옥소-6-[4-(트리플루오로메틸)페닐머캅토]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-41 2-옥소-6-(2-메톡시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-42 2-옥소-6-(3-메톡시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-43 2-옥소-6-(4-메톡시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-44 2-옥소-6-(2-카복시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-45 2-옥소-6-(3-카복시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-46 2-옥소-6-(4-카복시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
화합물 A-47 내지 A-68
실시예 A-1의 나트륨 페놀레이트를 적합한 아닐린염으로 대체시켜, 동일한 방법으로 다음 화합물들을 제공한다. 화합물 A-66, A-67 및 A-68의 경우, 카복시 그룹을 메틸, 에틸, 벤질, t-부틸 또는 다른 적합한 에스테르에 의해 보호시킨 다음에, 마지막 단계에서 탈보호시켜 당해 화합물들을 수득한다.
A-47 2-옥소-6-페닐아미노-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-48 2-옥소-6-(2-니트로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-49 2-옥소-6-(3-니트로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-50 2-옥소-6-(4-니트로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-51 2-옥소-6-(2-클로로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-52 2-옥소-6-(3-클로로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-53 2-옥소-6-(4-클로로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-54 2-옥소-6-(2-메틸페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-55 2-옥소-6-(3-메틸페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-56 2-옥소-6-(4-메틸페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-57 2-옥소-6-(2-플루오로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-58 2-옥소-6-(3-플루오로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-59 2-옥소-6-(4-플루오로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-60 2-옥소-6-[2-(트리플루오로메틸)페닐아미노]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-61 2-옥소-6-[3-(트리플루오로메틸)페닐아미노]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-62 2-옥소-6-[4-(트리플루오로메틸)페닐아미노]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-63 2-옥소-6-(2-메톡시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-64 2-옥소-6-(3-메톡시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-65 2-옥소-6-(4-메톡시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-66 2-옥소-6-(2-카복시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-67 2-옥소-6-(3-카복시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-68 2-옥소-6-(4-카복시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘

화합물 A-69 내지 A-89
실시예 A-3의 나트륨 페놀레이트를 적합한 페놀레이트로 대체시켜, 동일한 방법으로 다음 화합물들을 수득한다. 화합물 A-87, A-88 및 A-89의 경우, 카복시 그룹을 메틸, 에틸, 벤질, t-부틸 또는 다른 적합한 에스테르에 의해 보호시킨 다음에, 마지막 단계에서 탈보호시켜 당해 화합물들을 수득한다.
A-69 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-니트로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-70 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-니트로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-71 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-니트로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-72 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-클로로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-73 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-클로로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-74 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-클로로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-75 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-메틸페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-76 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-메틸페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-77 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-메틸페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-78 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-플루오로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-79 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-플루오로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-80 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-플루오로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-81 2-메톡시카보닐아미노-6-[2-(트리플루오로메틸)페녹시]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-82 2-메톡시카보닐아미노-6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-83 2-메톡시카보닐아미노-6-[4-(트리플루오로메틸)페녹시]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-84 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-메톡시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-85 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-메톡시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-86 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-메톡시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-87 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-카복시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-88 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-카복시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-89 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-카복시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
화합물 A-91 내지 A-111
실시예 A-90의 나트륨 티오페놀레이트를 적합한 티오페놀레이트로 대체시켜, 동일한 방법으로 다음 화합물들을 수득한다. 화합물 A-109, A-110 및 A-111의 경우, 카복시 그룹을 메틸, 에틸, 벤질, t-부틸 또는 다른 적합한 에스테르에 의해 보호시킨 다음에, 마지막 단계에서 탈보호시켜 당해 화합물들을 수득한다.
A-91 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-니트로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피 리딘
A-92 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-니트로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-93 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-니트로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-94 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-클로로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-95 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-클로로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-96 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-클로로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-97 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-메틸페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-98 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-메틸페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-99 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-메틸페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-100 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-플루오로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-101 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-플루오로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b] 피리딘
A-102 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-플루오로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-103 2-메톡시카보닐아미노-6-[2-(트리플루오로메틸)페닐머캅토]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-104 2-메톡시카보닐아미노-6-[3-(트리플루오로메틸)페닐머캅토]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-105 2-메톡시카보닐아미노-6-[4-(트리플루오로메틸)페닐머캅토]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-106 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-메톡시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-107 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-메톡시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-108 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-메톡시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-109 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-카복시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-110 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-카복시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-111 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-카복시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피 리딘
화합물 A-112 내지 A-133
실시예 A-3의 나트륨 페놀레이트를 적합한 아닐린염으로 대체시켜, 동일한 방법으로 다음 화합물들을 수득한다. 화합물 A-131, A-132 및 A-133의 경우, 카복시 그룹을 메틸, 에틸, 벤질, t-부틸 또는 다른 적합한 에스테르에 의해 보호시킨 다음에, 마지막 단계에서 탈보호시켜 당해 화합물들을 수득한다.
A-112 2-메톡시카보닐아미노-6-페닐아미노-3H-이미다조[4,5-A-112
A-113 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-니트로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-114 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-니트로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-115 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-니트로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-116 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-클로로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-117 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-클로로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-118 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-클로로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-119 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-메틸페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-120 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-메틸페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-121 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-메틸페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-122 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-플루오로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-123 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-플루오로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-124 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-플루오로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-125 2-메톡시카보닐아미노-6-[2-(트리플루오로메틸)페닐아미노]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-126 2-메톡시카보닐아미노-6-[3-(트리플루오로메틸)페닐아미노]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-127 2-메톡시카보닐아미노-6-[4-(트리플루오로메틸)페닐아미노]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-128 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-메톡시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-129 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-메톡시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-130 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-메톡시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-131 2-메톡시카보닐아미노-6-(2-카복시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-132 2-메톡시카보닐아미노-6-(3-카복시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-133 2-메톡시카보닐아미노-6-(4-카복시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
화합물 A-134 내지 A-154
실시예 A-4의 나트륨 페놀레이트를 적합한 페놀레이트로 대체시켜, 동일한 방법으로 다음 화합물들을 제공한다. 화합물 A-152, A-153 및 A-154의 경우, 카복시 그룹을 메틸, 에틸, 벤질, t-부틸 에스테르 또는 다른 적합한 에스테르에 의해 보호시킨 다음에, 마지막 단계에서 탈보호시켜 당해 화합물들을 수득한다.
A-134 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-니트로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-135 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-니트로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-136 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-니트로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-137 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-클로로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-138 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-클로로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-139 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-클로로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-140 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-메틸페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-141 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-메틸페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-142 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-메틸페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-143 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-플루오로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-144 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-플루오로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-145 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-플루오로페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-146 2-에톡시카보닐아미노-6-[2-(트리플루오로메틸)페녹시]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-147 2-에톡시카보닐아미노-6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-148 2-에톡시카보닐아미노-6-[4-(트리플루오로메틸)페녹시]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-149 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-메톡시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-150 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-메톡시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-151 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-메톡시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-152 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-카복시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-153 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-카복시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-154 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-카복시페녹시)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
화합물 A-155 내지 A-176
실시예 A-4의 나트륨 페놀레이트를 적합한 티오페놀레이트로 대체시켜, 동일한 방법으로 다음 화합물들을 수득한다. 화합물 A-174, A-175 및 A-176의 경우, 카복시 그룹을 메틸, 에틸, 벤질, t-부틸 또는 다른 적합한 에스테르에 의해 보호시킨 다음에, 마지막 단계에서 탈보호시켜 당해 화합물들을 수득한다.
A-155 2-에톡시카보닐아미노-6-페닐머캅토-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-156 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-니트로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-157 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-니트로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-158 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-니트로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b] 피리딘
A-159 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-클로로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-160 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-클로로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-161 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-클로로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-162 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-메틸페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-163 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-메틸페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-164 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-메틸페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-165 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-플루오로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-166 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-플루오로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-167 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-플루오로페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-168 2-에톡시카보닐아미노-6-[2-(트리플루오로메틸)페닐머캅토]-3H-이미 다조[4,5-b]피리딘
A-169 2-에톡시카보닐아미노-6-[3-(트리플루오로메틸)페닐머캅토]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-170 2-에톡시카보닐아미노-6-[4-(트리플루오로메틸)페닐머캅토]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-171 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-메톡시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-172 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-메톡시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-173 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-메톡시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-174 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-카복시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-175 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-카복시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-176 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-카복시페닐머캅토)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
화합물 A-177 내지 A-198
실시예 A-4의 나트륨 페놀레이트를 적합한 아닐린염으로 대체시켜, 동일한 방법으로 다음 화합물들을 수득한다. 화합물 A-196, A-197 및 A-198의 경우, 카복시 그룹을 메틸, 에틸, 벤질, t-부틸 또는 다른 적합한 에스테르에 의해 보호시킨 다음에, 마지막 단계에서 탈보호시켜 당해 화합물들을 수득한다.
A-177 2-에톡시카보닐아미노-6-페닐아미노-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-178 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-니트로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-179 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-니트로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-180 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-니트로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-181 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-클로로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-182 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-클로로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-183 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-클로로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-184 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-메틸페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-185 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-메틸페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-186 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-메틸페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-187 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-플루오로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-188 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-플루오로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-189 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-플루오로페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-190 2-에톡시카보닐아미노-6-[2-(트리플루오로메틸)페닐아미노]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-191 2-에톡시카보닐아미노-6-[3-(트리플루오로메틸)페닐아미노]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-192 2-에톡시카보닐아미노-6-[4-(트리플루오로메틸)페닐아미노]-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-193 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-메톡시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-194 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-메톡시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-195 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-메톡시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-196 2-에톡시카보닐아미노-6-(2-카복시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-197 2-에톡시카보닐아미노-6-(3-카복시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리딘
A-198 2-에톡시카보닐아미노-6-(4-카복시페닐아미노)-3H-이미다조[4,5-b]피리리딘
실시예 2: RAF의 인산화 기능을 측정하는 분석
다음 분석은 표적 단백질 MEK 뿐만 아니라 MEK의 표적 MAPK의 RAF-촉매화된 인산화의 양을 보고한다. RAF 유전자 서열은 문헌에 기술되어 있으며[참조: Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol. 5: 1400-1407], 다수의 유전자 서열 데이터 뱅크에서 입수할 수 있다. 본 발명의 이러한 부분에 사용되는 핵산 벡터 및 세포주의 작제는 문헌에 상세히 기술되어 있다[참조: Morrison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8855-8859].
물질 및 시약
1. Sf9(Spodoptera frugiperda) 세포(제조원: GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)
2. RIPA 완충액: 20mM Tris/HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1mM PMSF, 5mg/L 아프로테닌(Aprotenin), 0.5% 트리톤(Triton) X-100
3. 티오레독신-MEK 융합 단백질(T-MEK): 친화성 크로마토그래피에 의한 T-MEK 발현 및 정제는 제조업자의 방법에 따라서 수행한다. Catalog# K 350-01 및 R 350-40(제조원: 미국 캘리포니아 샌 디에고 소재의 Invitrogen Corp.)
4. His-MAPK(ERK 2): His-태그 MAPK는 His-MAPK를 암호화하는 pUC18 벡터를 사용하여 형질전환된 XL1 Blue 세포에서 발현된다. His-MAPK은 Ni-친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 본원에 기술된 카탈로그 # 27-4949-01(제조원: 미국 캘리포니아 알라메다 소재의 Pharmacia)
5. 양의 항마우스 IgG: 카탈로그 # 515-006-008, Lot# 28563(제조원: 미국 캘리포니아 웨스트 그로브 소재의 Jackson laboratories)
6. RAF-1 단백질 키나제 특이적 항체: URP2653(제조원: UBI)
7. 피복 완충액: PBS; 인산염 완충된 식염수(제조원: GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)
8. 세척 완충액: TBST - 50mM 트리스/HCl pH 7.2, 150mM NaCl, 0.1% 트리톤 X-100
9. 차단 완충액: TBST, 0.1% 에탄올아민 pH 7.4
10. DMSO(제조원: 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma)
11. 키나제 완충액(KB): 20mM Hepes/HCl pH 7.2, 150mM NaCl, 0.1% 트리톤 X-100, 1mM PMSF, 5mg/L 아프로테닌, 75mM 오르토바나듐산나트륨, 0.5mM DTT 및 10mM MgCl2
12. ATP 혼합물: 100mM MgCl2, 300mM ATP, 10mCi g-33P ATP(DUPONT-NEN)/ml
13. 정지 용액: 1% 인산(제조원: 미국 펜실베니아 피츠버그 소재의 Fisher)
14. Wallac 셀룰로스 인산염 여과 매트(제조원: 핀란드 투르크 소재의 Wallac)
15. 여과 세척액: 1% 인산(제조원: 미국 펜실베니아 피츠버그 소재의 Fisher)
16. Tomtec 플레이트 수집기(제조원: 핀란드 투르크 소재의 Wallac)
17. Wallac 베타 플레이트 판독기 # 1205(제조원: 핀란드 투르크 소재의 Wallac)
18. 화합물에 대한 NUNC 96-웰 V형 기저 폴리프로필렌 플레이트, Applied Scientific Catalog # AS-72092
과정
다음 단계는 모두, 특별히 명시되지 않는 한 실온에서 수행한다.
1. ELISA 플레이트 피복: ELISA 웰을 4℃에서 양 항마우스 친화성 정제된 항혈청 100ml(1mg/100ml 도포 완충액)으로 밤새 피복시킨다. ELISA 플레이트는, 4℃에서 저장하는 경우 2주간 사용할 수 있다.
2. 플레이트를 뒤집어서 액체를 제거한다. 차단액 100ml를 가하고, 30분 동안 항온처리한다.
3. 차단액을 제거하고, 세척 완충액으로 4회 세척한다. 플레이트를 종이 타월상에서 가볍게 두드리고, 과량의 액체를 제거한다.
4. RAF-1에 특이적인 항체 1mg을 각 웰에 가하고, 1시간 동안 항온처리한다. 단계 3에 기술된 바와 같이 세척한다.
5. RAS/RAF 감염된 Sf9 세포로부터 용해물을 해동시키고, TBST를 사용하여 10mg/100ml로 희석시킨다. 희석된 용해물 10mg을 웰에 가하고, 1시간 항온처리한다. 음성 대조군은 용해물을 수용하지 않는다. RAS/RAF 감염된 Sf9 세포로부터의 용해물은, 세포를 각 바이러스에 대한 5의 MOI에서 재조합 바큘로바이러스로 감염시킨 후에 제조하고, 48시간 후에 수집한다. 세포를 PBS로 1회 세척하고, RIPA 완충액에 용해시킨다. 불용성 물질은 원심분리하여 제거한다(10,000 x g에서 5분). 용해물의 분취액을 드라이 아이스/에탄올 중에서 냉동시키고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장한다.
6. 비결합 물질을 제거하고, 상기(단계 3) 기술한 바와 같이 세척한다.
7. 웰당 T-MEK 2mg 및 His-MAEPK 2mg을 가하고, 용적은 키나제 완충액을 사용하여 40ml로 조정한다. 세포 추출물로부터 T-MEK 및 MAPK를 정제하는 방법은 본원에서 실시예로 제공된다.
8. 화합물(모액 10mg/ml DMSO) 또는 TBST와 1% DMSO중의 20배 추출물을 예비희석시킨다. 예비희석된 화합물/추출물 5ml를 단계 6에 기술된 웰에 가한다. 20분 동안 항온처리한다. 대조군은 약물을 수용하지 않는다.
9. ATP 혼합물 5ml를 가하여 키나제 반응을 개시시키고; 항온처리하는 동안 ELISA 플레이트 교반기에서 플레이트를 교반시킨다.
10. 60분 후에 각 웰에 정지 용액 30ml를 가하여 키나제 반응을 중단시킨다.
11. Tomtec 플레이트 수집기에 포스포셀룰로스 매트 및 ELISA 플레이트를 놓는다. 수집하고, 제조업자의 추천에 따른 여과기 세척액을 사용하여 여과기를 세 척한다. 여과 매트를 건조시킨다. 여과 매트를 밀봉하고, 이를 홀더에 놓는다. 홀더를 방사능 검출 장치에 삽입하고, 여과 매트상의 방사성 인을 정량화한다.
또한, 분석 플레이트의 각 웰로부터 40ml 분취액을 포스포셀룰로스 여과 매트 위의 상응하는 위치로 옮긴다. 여과기를 자연 건조시킨 후, 여과기을 트레이에 놓는다. 트레이를 가볍게 흔들고, 세척액을 1시간 동안 15분 간격으로 교체한다. 여과 매트를 공기 건조시킨다. 여과 매트를 밀봉하고, 이를 샘플의 방사성 인을 측정하기에 적합한 홀더에 놓는다. 홀더를 검출 장치에 삽입하고, 여과 매트상에서 방사성 인을 정량화한다.
IC50 값은 다음 아자벤즈이미다졸계 화합물에 대한 프로토콜에 따라서 RAF-1 ELISA 분석으로 측정한다:
Figure 112000005791758-pct00007
Figure 112000005791758-pct00008
Figure 112000005791758-pct00009
Figure 112000005791758-pct00010
Figure 112000005791758-pct00011
IC50 값은 인산화 표적 단백질 또는 세포 성장의 최대량을 50% 감소시키기 위해 필요한 아자벤즈이미다졸계 억제제의 농도이다. RAF-1 인산화 분석으로 측정된 IC50 값은 표 1에 제시한다.
화합물 IC50(μM)
A-1 79
A-2 >100
A-3 6.1
A-4 6.7
A-90 0.95

실시예 3
MAPK 및 MEK의 정제
MAPK 및 MEK 단백질은 이들 단백질을 암호화하는 유전자를 폴리-히스티딘 태그를 갖는 단백질을 발현하는 시판 벡터로 아클로닝시킴으로써 세포내에서 쉽게 발현된다. 이들 단백질을 암호화하는 유전자는 일반적으로 이들 단백질을 사용하여 작업하는 연구소로부터 용이하게 입수가능하거나 cDNA 라이브러리를 함유하는 세포로부터 이들 유전자를 클로닝하여 용이하게 입수할 수 있다. 라이브러리는 시판되고 있으며, 당해 분야의 전문가는 진뱅크(Genbank)와 같은 다수의 유전자 데이터 베이스로 입수할 수 있는 MEK 및 MAPK의 핵산 서열로부터 MEK 또는 MAPK를 암호화하는 cDNA 분자와 상동성인 핵산 프로브를 용이하게 고안할 수 있다. 유전자의 클로닝은 당해 분야의 전문가에게 현재 이용가능한 기술을 사용하여 단기간에 달성할 수 있다.
세포 추출물로부터의 MEK 및 MAPK 단백질의 정제는 문헌[참조: Robbins et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 5097-5106]으로부터 채택된 다음 프로토콜을 사용하여 달성할 수 있다:
1. 세포를 당해 분야의 전문가가 용이하게 이용가능한 초음파처리, 삼투압 응력 또는 프렌치 프레스(French Press) 기술에 의해 용해시킨다. 적합한 초음파처리 완충액은 하기에 제시한다.
2. 니켈 또는 코발트와 접합된 고형 지지체를 다음에 기술된 평형 완충액으로 평형시킨다. 폴리-히스티딘 태그는 고형 지지체에서 니켈 및 코발트 원자에 특이적으로 결합한다. 평형은 수지를 고형 지지체의 용적의 10배에 필적하는 용적의 평형 완충액으로 3회 세척하여 수행할 수 있다. 고형 지지체는 당해 분야의 전문가가 용이하게 입수될 수 있다.
3. 세포 용해물을 상기 고형 지지체에 가하고, 일정 기간동안 용기내에서 평형시킨다. 또는, 고형 지지체를 단백질 크로마토그래피 컬럼내에 충전시키고, 용해물을 고형 지지체를 통해 유동시킬 수 있다.
4. 고형 지지체를 하기에 기술된 세척 완충액으로 세척한다.
5. 상당 부분의 단백질을 고형 지지체로부터 제거하는 (하기에 제공된) 다량의 용출 완충액을 사용하여 고형 지지체로부터 MEK 또는 MAPK 단백질을 용출시킨다.
초음파처리 완충액
50mM 인산나트륨 pH 8.0
0.3M 염화나트륨
10 mM β-머캅토에탄올
1% NP40
10mM NaF
0.5mM 페파블록(Pefablock)
평형 완충액
50mM 인산나트륨 pH 8.0
0.3M 염화나트륨
10 mM β-머캅토에탄올
1% NP40
10mM NaF
1mM 이미다졸
세척 완충액
50mM 인산나트륨 pH 8.0
0.3M 염화나트륨
10 mM β-머캅토에탄올
1% NP40
10mM NaF
10mM 이미다졸
용출 완충액
50mM 인산나트륨 pH 8.0
0.3M 염화나트륨
10 mM β-머캅토에탄올
1% NP40
10mM NaF
10 내지 500mM 이미다졸
실시예 4
EGF 수용체의 인산화 기능을 측정하는 분석
완전한 세포에서 EGF 수용체 키나제 활성(EGFR-NIH3T3 분석)은 문헌에 상세히 기술된 바와 같이 측정하고[참조: 1996년 6월 5일에 출원된 탱(Tang) 등의 PCT 공보 제WO9640116호, 발명의 명칭 "Indolinone Compounds for the Treatment of Disease"], 이 문헌은 도면을 포함하여 이의 전문이 본원에서 참고로 인용되어 있다.
EGF 수용체 인산화 분석으로 측정된 IC50 값은 표 2에 제시한다:
화합물 IC50(μM)
A-1 >100
A-2 >100
A-3 >100
A-4 >100

실시예 5
Ras를 발현하는 세포의 성장에 대한 아자벤즈이미다졸계 화합물의 효과를 측정하는 분석
다음 분석은 RAS를 발현하는 NIH-3T3 세포에 대한 성장 속도를 측정한다. 분석의 목적은 H-Ras를 과도하게 발현하는 NIH 3T3 세포의 성장에 대한 화합물의 효과를 측정하는 것이다.
물질
96웰 평저 멸균 플레이트
96웰 환저 멸균 플레이트
멸균 25ml 또는 100ml 저장기
피펫, 다수 채널의 피펫맨
멸균 피펫 팁(tip)
멸균 15ml 및 50ml 튜브
시약
1% 아세트산중의 0.4% SRB
10mM 트리스 염기
10% TCA
1% 아세트산
멸균 DMSO(Sigma)
DMSO중의 화합물(100mM 이하의 모액)
트립신-EDTA(GIBCO BRL)
세포주
3T3/H-Ras(종양원성 H-Ras의 게놈 단편을 발현하는 NIH 3T3 클론 7 세포)
세포는 다음 프로토콜을 사용하여 작제할 수 있다.
1. NIH-3T3 세포를 안정하게 형질감염시키는 시판 벡터에 Ras를 암호화하는 유전자 단편을 아클로닝한다. 단편은 cHa-ras의 게놈성 형질전환 대립유전자로부터 유래된 것이다.
2. NIH-3T3 세포를 인산칼슘 방법을 사용하여 아클로닝된 벡터로 형질감염시킨다. DMEM 중의 2% 혈청중에서 Ras 작제물을 발현하는 세포를 선택한다. 가시적 초점은 2주 후에 관찰된다. 형질전환된 세포를 모아서 안정하게 형질전환된 세포주를 생성시킨다.
성장 배지
2% 송아지 혈청/DMEM + 2mM 글루타민, Pen/Strep
프로토콜
0일째: 세포 평판배양
본 분석 부분은 층류 후드에서 수행한다.
1. 세포를 트립신처리한다. 세포 현탁액 200ml를 이소톤 10ml로 옮긴다. 세포를 쿨터 계수기(Coulter Counter)로 계수한다.
2. 세포를 60,000개 세포/ml로 성장 배지에 희석시킨다. 세포 100ml를 96웰 평저 플레이트의 각 웰로 옮겨서 6000개 세포/웰을 수득한다.
3. 각 화합물에 대해서는 플레이트의 반(4줄)을, 각 화합물 농도에 대해서는 4배 웰을 사용하고 배지 대조군에 대해서는 4웰 세트를 사용한다.
4. 플레이트를 약하게 교반시켜 세포를 균질하게 부착시킨다.
5. 37℃에서 10% CO2 배양기에서 상기 플레이트를 배양한다.
1일째: 화합물의 첨가
본 분석 부분은 층류 후드에서 수행한다.
1. 96웰 환저 플레이트에서, 화합물의 최고 선별 농도에서 밝혀진 2X 최종 DMSO(%)를 함유하는 성장 배지 120ml를 컬럼 1 내지 11에 가한다. 예를 들어, 최고 농도가 100ml인 경우, 이는 100mM 모액으로부터 제조되고, 1X DMSO는 0.1%이며, 따라서 2X DMSO는 0.2%이다. 상기 플레이트는 화합물당 4줄씩 화합물을 역가측정하는데 사용한다.
2. 멸균 15ml 튜브에서, 성장 배지중의 최고 선별 농도의 화합물과 2X DMSO의 2X 용액을 제조한다. 세포주당 1ml가 필요하다. 화합물의 출발 농도는 일반적으로 100mM이지만, 이 농도는 화합물의 용해도에 따라서 변할 수 있다.
3. 2X 출발 화합물 용액 240ml를 96웰 환저 플레이트의 컬럼 12내의 4배 웰로 옮긴다. 12ml를 컬럼 12에서 컬럼 11로, 컬럼 11에서 컬럼 10 등으로 마지막에는 컬럼 2로 옮김으로써 우측에서 좌측으로 플레이트 전반에 걸쳐서 일련의 1:2 희석액이 되도록 한다. 컬럼 1내의 화합물 희석액 100ml 및 배지 100ml를 96웰 평저 플레이트의 상응하는 웰내의 세포상의 배지 100ml로 옮긴다. 웰에 대한 총 용적은 200ml이다.
4. 플레이트를 배양기로 복귀시키고, 3일 동안 배양한다.
4일: 분석의 전개
본 분석 부분은 벤치상에서 수행한다.
1. 배지를 흡인시키거나, 흘려 보낸다. 차가운 10% TCA 200ml를 각 웰에 가하여 세포를 고정시킨다. 플레이트를 60분 이상동안 4℃에서 배양한다.
2. TCA를 폐기하고, 웰을 수돗물로 5회 헹군다. 플레이트를 종이 타월상에서 뒤집어서 건조시킨다.
3. 세포를 100ml/웰 0.4% SRB를 사용하여 10분 동안 염색시킨다.
4. SRB를 붓고, 1% 아세트산을 사용하여 웰을 5회 헹군다. 플레이트를 종이 타월상에서 완전히 뒤집어서 건조시킨다.
5. 염료를 100ml/웰 10mM 트리스 염기로 5 내지 10분 동안 진탕기에서 용해시킨다.
6. 플레이트를 Dynatech ELISA Plate Reader상에서 630nm에서 참고하여 570nm에서 판독한다.
표 3에 나타난 바와 같이 RAS를 과도하게 발현하는 세포의 성장 속도를 억제 하는 화합물을 선택한다.
화합물 IC50(μM) RAS/NIH3T3
A-3 40
A-4 20

실시예 6
A549 세포의 성장에 대한 아자벤즈이미다졸계 화합물의 효과를 측정하는 분석
다음 분석은 A549 세포에 대한 성장 속도를 측정한다. 분석의 목적은 A549 사람의 폐암 세포의 성장에 대한 화합물의 효과를 측정하는 것이다. A549 세포는 일반적 공급원, 예를 들어, ATCC(CCL185)로부터 쉽게 입수할 수 있다.
물질
96웰 평저 멸균 플레이트
96웰 환저 멸균 플레이트
멸균 25ml 또는 100ml 저장기
피펫, 다수 채널의 피펫맨
멸균 피펫 팁
멸균 15ml 및 50ml 튜브
시약
1% 아세트산중의 0.4% SRB
10mM 트리스 염기
10% TCA
1% 아세트산
멸균 DMSO(Sigma)
DMSO중의 화합물(100mM 이하의 모액)
트립신-EDTA(GIBCO BRL)
세포주 및 성장 배지
A549 사람의 폐 암종 세포(ATCC CCL185)
Ham의 F12-K중의 10% 태아 송아지 혈청
프로토콜
0일: 세포 평판배양
본 분석 부분은 층류 후드에서 수행한다.
1. 세포를 트립신화한다. 세포 현탁액 200μl를 이소톤 10ml로 옮긴다. 세포를 쿨터 계수기로 계수한다.
2. 세포를 20,000개 세포/ml로 성장 배지에 희석시킨다. 세포 100μl를 96웰 평저 플레이트의 각 웰로 옮겨서 2000개 세포/웰을 수득한다.
3. 각 화합물에 대해서는 플레이트의 반(4줄)을, 각 화합물 농도에 대해서는 4배 웰을 사용하고 배지 대조군에 대해서는 4웰 세트를 사용한다.
4. 플레이트를 약하게 교반시켜 세포를 균질하게 부착시킨다.
5. 37℃에서 10% CO2 배양기에서 상기 플레이트를 배양한다.
1일: 화합물의 첨가
본 분석 부분은 층류 후드에서 수행한다.
1. 96웰 환저 플레이트에서, 화합물의 최고 선별 농도에서 밝혀진 2x 최종 DMSO(%)를 함유하는 성장 배지 120μl를 컬럼 1 내지 11에 가한다. 예를 들어, 최고 농도가 100μM이고 100mM 모액으로부터 제조될 경우, 1X DMSO는 0.1%이며, 따라서 2X DMSO는 0.2%이다. 상기 플레이트는 화합물당 4줄씩 화합물의 역가를 측정하는데 사용한다.
2. 멸균 15ml 튜브에서, 성장 배지중의 화합물의 최고 선별 농도 + 2X DMSO의 2X 용액을 제조한다. 세포주당 1ml가 필요하다. 화합물의 출발 농도는 일반적으로 100μM이지만, 이 농도는 화합물의 용해도에 따라서 변할 수 있다.
3. 2X 출발 화합물 용액 240μl를 96웰 환저 플레이트의 컬럼 12내의 4배 웰로 옮긴다. 우측에서 좌측으로 플레이트를 횡단하는 1:2 일련의 희석을, 120μl를 컬럼 12에서 컬럼 11로, 컬럼 11에서 컬럼 10 등으로 컬럼 2를 통해서 옮김으로써 행한다. 화합물 희석액 100μl 및 컬럼 1내의 배지 100μl를 96웰 평저 플레이트의 상응하는 웰의 세포상의 배지 100μl로 옮긴다. 웰에 대한 총 용적은 200μl이다.
4. 플레이트를 배양기로 복귀시키고, 3일 동안 배양한다.
5일: 분석의 전개
본 분석 부분은 벤치상에서 수행한다.
1. 배지를 흡인시키거나, 흘려 보낸다. 차가운 10% TCA 200μL를 각 웰에 첨가하여 세포를 고정시킨다. 플레이트를 60분 이상 4℃에서 배양한다.
2. TCA를 폐기하고, 웰을 수돗물로 5회 헹군다. 플레이트를 종이 타월상에서 뒤집어서 건조시킨다.
3. 세포를 100μl/웰 0.4% SRB를 사용하여 10분 동안 염색시킨다.
4. SRB를 붓고, 1% 아세트산을 사용하여 웰을 5회 헹군다. 플레이트를 종이 타월상에서 완전히 뒤집어서 건조시킨다.
5. 염료를 100μl/웰 10mM 트리스 염기로 5 내지 10분 동안 진탕기에서 용해시킨다.
6. 플레이트를 Dynatech ELISA Plate Reader상에서 630nm에서 참고하여 570nm에서 판독한다.
표 4에 나타난 바와 같이, A549 세포의 성장 속도를 억제하는 화합물을 선택한다.
화합물 IC50(μM) A549
A-3 22 65(2% FBS)
A-4 6 5.7(2% FBS)

실시예 7
생체내에서 Raf 조절물질의 생물학적 활성을 측정하는 방법
이종이식 연구는 난소, 흑색종, 전립선, 폐 및 유방 종양 세포의 억제에 대한 본 발명 화합물의 효과를 모니터링하는 데에 사용될 수 있다. 분석에 대한 프로토콜은 문헌에 상세히 기술되어 있고[참조: 1996년 6월 5일에 출원된 탱(Tang) 등의 PCT 공보 제WO9640116호, 발명의 명칭 "Indolinone Compounds for the Treatment of Disease"], 이는 도면을 포함하여 이의 전문이 본원에서 참고로 인용되어 있다.
본원에서 예시적으로 기술된 본 발명은 구성요소(들), 본원에 특정하게 기술되지 않은 제한(들)의 부재하에 수행될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되며, 나타나고 기술된 특징 또는 이의 일부에 상당하는 것을 배제하는 용어 및 표현의 사용에 있어서 의도하는 바는 없지만, 많은 변형이 특허청구된 본 발명의 범위내에서 가능함을 인식한다. 따라서, 본 발명은 바람직한 양태 및 임의 특징에 의해 특정하게 기술되었지만, 본원에 기술된 개념의 변형 및 변화는 당해 분야의 전문가에 의해 재분류될 수 있으며, 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구의 범위에 의해 정의된 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주됨을 이해한다.
당해 분야의 전문가는 본 발명이 목적을 수행하고 언급된 결과 및 잇점 뿐만 아니라 본원 본래의 것을 수득하도록 잘 적합됨을 쉽게 이해한다. 본원에 기술된 분자 착체 및 방법, 과정, 치료, 분자, 특정 화합물은 현재 대표적인 바람직한 양태이며, 이들은 예시적인 것이고 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 본원에서의 변화 및 다른 용도가 당해 분야의 전문가에게 일어나며, 이는 청구의 범위의 범위에 의해 정의된 본 발명의 취지내에 포함된다.
당해 분야의 전문가에게 많은 대체 및 변형이 본원에 기술된 본 발명에, 본 발명의 범위 및 정신을 이탈하지 않고 이루어질 수 있음이 쉽게 이해된다.
명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 본 발명이 관련된 당해 분야의 전문가의 수준에 대한 지표이다. 모든 특허 및 공보는, 각각의 개별적 공보가 참고로 인용됨을 특정하고 개별적으로 지시되는 바와 동일한 정도로 본원에서 참고로 인용된다.
본원에 예시적으로 기술된 본 발명은 구성요소(들), 본원에 특정하게 기술되지 않은 제한(들)의 부재하에 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에서 각 경우에, "포함하는", "필수적으로 이루어진" 및 "이루어진"이란 용어중의 하나는 다른 두가지 용어로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되며, 나타나고 기술된 특징 또는 이의 일부에 상당하는 것을 배제하는 용어 및 표현의 사용에 있어서 의도하는 바는 없지만, 많은 변형이 특허청구된 본 발명의 범위내에서 가능함을 인식한다. 따라서, 본 발명은 바람직한 양태 및 임의 특징에 의해 특정하게 기술되었지만, 본원에 기술된 개념의 변형 및 변화는 당해 분야의 전문가에 의해 재분류될 수 있으며, 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구의 범위에 의해 정의된 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주됨을 이해한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 양태가 마커쉬(Markush) 그룹에 의해 기술되는 경우, 당해 분야의 전문가는 본 발명이 또한 이에 의해 마커쉬 그룹의 구성원 또는 구성원의 소그룹에 의해 기술됨을 인식한다. 예를 들어, X가 브롬, 염소 및 요오드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것으로 기술되는 경우, 브롬인 X에 대한 청 구의 범위 및 브롬 및 염소인 X에 대한 청구의 범위가 충분히 기술된다.
본원에 앞에서 참고로 인용되지 않은, 특허 및 비-특허 문헌을 포함하는 문헌이 본원에서 모든 목적에 대한 참고로 특별히 인용된다. 다른 양태가 다음 청구의 범위내에 있다.

Claims (37)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 화학식 I, II 또는 III의 아자벤즈이미다졸계 화합물 및 생리학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 포유동물의 암 또는 섬유증 장애를 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
    화학식 I
    Figure 112005034885210-pct00015
    화학식 II
    Figure 112005034885210-pct00016
    화학식 III
    Figure 112005034885210-pct00017
    상기식에서,
    R1은 페닐; 또는 C1-C6-알킬, C1-C6-알콕시, 할로겐, 할로겐으로 치환된 C1-C6-알킬, 카복시 및 니트로로 이루어진 그룹에서 선택된 치환기로 치환된 페닐이고,
    R2 및 R3 는 수소이고,
    R4는 C1-C6-알킬이며,
    X1은 황, 산소 또는 NH이고,
    Z1 및 Z2는 독립적으로 N 또는 NH이며;
    Z3은 산소이다
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서, 암이 폐암, 난소암, 유방암, 뇌암, 내축성 뇌암, 결장암, 전립선암, 육종, 카포씨(Kaposi) 육종, 흑색종 및 신경교종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암인 약제학적 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 아자벤즈이미다졸 화합물.
    화학식 I
    Figure 112005034885210-pct00018
    화학식 II
    Figure 112005034885210-pct00019
    화학식 III
    Figure 112005034885210-pct00020
    상기식에서,
    R1은 페닐; 또는 C1-C6-알킬,C1-C6-알콕시, 할로겐, 할로겐으로 치환된 C1-C6-알킬, 카복시 및 니트로로 이루어진 그룹에서 선택된 치환기로 치환된 페닐이고,
    R2 및 R3 는 수소이고,
    R4는 C1-C6-알킬이며,
    X1은 황, 산소 또는 NH이고,
    Z1 및 Z2는 독립적으로 N 또는 NH이며;
    Z3은 산소이다
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 제18항에 있어서, R1이 메틸, 메톡시, 클로로, 플루오로 및 트리플루오로메틸로 이루어진 그룹중에서 선택된 치환기로 치환된 페닐인 화합물.
  26. 제18항에 있어서, R4가 메틸 및 에틸로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. (a) 2-아미노-6-클로로-3-니트로피리딘을 치환된 아릴 환인 제2 반응물과 용매 중에서 반응시켜 제1 중간체를 수득하는 단계;
    (b) 제1 중간체를 촉매 및 환원제의 존재하에 환원시켜 제2 중간체를 수득하는 단계;
    (c) 제2 중간체를 제3 반응물과 반응시키는 단계; 및
    (d) 제18항에 따른 화합물을 정제시키는 단계를 포함하여, 제18항에 따른 화학식 I의 화합물을 합성하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 용매가 n-프로판올인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 치환된 아릴 환이 치환된 페놀, 치환된 티오페놀 및 치환된 아닐린인 방법.
  32. 삭제
  33. 제29항에 있어서, 환원제가 수소인 방법.
  34. 제29항에 있어서, 촉매가 라니(Raney) 니켈인 방법.
  35. 제29항에 있어서, 제3 반응물이 O-메틸이소우레아인 방법.
  36. 제29항에 있어서, 제3 반응물이 S-메틸이소티오우로늄 설페이트 및 알킬 클로로포르메이트의 반응 생성물인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 알킬이 메틸 또는 에틸인 방법.
KR1020007003192A 1997-09-26 1998-09-23 세린/트레오닌 단백질 키나제 기능을 조절하기 위한 아자벤즈이미다졸계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 KR100547929B1 (ko)

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