SK285357B6 - Zlúčeniny na báze azabenzimidazolu modulujúce funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy - Google Patents

Zlúčeniny na báze azabenzimidazolu modulujúce funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy Download PDF

Info

Publication number
SK285357B6
SK285357B6 SK415-2000A SK4152000A SK285357B6 SK 285357 B6 SK285357 B6 SK 285357B6 SK 4152000 A SK4152000 A SK 4152000A SK 285357 B6 SK285357 B6 SK 285357B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
pyridine
group
imidazo
compound
alkyl
Prior art date
Application number
SK415-2000A
Other languages
English (en)
Other versions
SK4152000A3 (en
Inventor
Gerald Mcmahon
Heinz Weinberger
Bernhard Kutscher
Harald App
Original Assignee
Zentaris Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zentaris Gmbh filed Critical Zentaris Gmbh
Publication of SK4152000A3 publication Critical patent/SK4152000A3/sk
Publication of SK285357B6 publication Critical patent/SK285357B6/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

Azabenzimidazolová zlúčenina všeobecného vzorca (I), (II) alebo (III), kde všeobecné symboly majú význam uvedený v nárokoch, spôsob jej syntézy a použitie na výrobu liečiva na liečenie stavov spojených s moduláciou funkcie serín/treonín proteín kinázy, nádorového ochorenia, fibrotickej poruchy a iných proliferačných porúch, ako aj stavov spojenýchs aberáciou v dráhe signálovej transdukcie, ktoráje charakterizovaná interakciou medzi serín/treonín proteín kinázou RAF a prirodzeným väzbovým partnerom. Farmaceutická kompozícia s obsahom tejto zlúčeniny.

Description

Vynález sa týka určitých azabenzimidazolových zlúčenín, ich použitia, spôsobu ich syntézy a farmaceutickej kompozície s ich obsahom.
Doterajší stav techniky
Nasledovný opis doterajšieho stavu techniky sa podáva na účely porozumenia vynálezu, ale nejde sa o súčasť vynálezu. Transdukcia bunkového signálu je základný mechanizmus, ktorého prostredníctvom sú externé stimuly regulujúce rozličné bunkové procesy prenášané dovnútra buniek. Jeden z kľúčových biochemických mechanizmov signálovej transdukcie zahŕňa reverzibilnú fosforyláciu proteínov, ktorá reguluje aktivitu vyzretých bielkovín zmenou ich štruktúry a funkcie. Najlepšie charakterizované proteínkinázy pri eukaryotoch fosforylujú bielkoviny na alkoholovej skupine serínových, treonínových a tyrozínových zvyškov. Tieto kinázy sa rozpadajú do dvoch skupín, do skupín kináz špecifických pre fosforyláciu serínu a treonínu a do skupiny kináz špecifických pre fosforyláciu tyrozínu. Niektoré kinázy majú tzv. „duálnu špecifitu“, čo znamená, že sú schopné fosforylovať zvyšky tyrozínu a taktiež zvyšky serínu/treonínu.
Proteínkinázy sa môžu charakterizovať aj svojím umiestnením v bunke. Niektoré kinázy sú transmembránové receptorové bielkoviny schopné viazať ligandy zvonku bunkovej membrány. Naviazanie ligandov narúša kinázovú katalytickú aktivitu receptorovej bielkoviny. Iné kinázy sú nereceptorové bielkoviny bez transmembránovej domény. Nereceptorové proteínkinázy sa nachádzajú v celom rade bunkových kompartmentov, od vnútorného povrchu bunkovej membrány až k jadru.
Mnoho kináz hrá úlohu v regulačných kaskádach, kde ich substráty môžu zahŕňať iné kinázy, ktorých aktivity sú regulované ich stavom fosforylácie. Napokon je efektorová aktivita modulovaná fosforyláciou rezultujúcou z aktivácie celej metabolickej dráhy.
Rodina serinových/treonínových proteínkináz zahŕňa kinázy regulujúce mnoho krokov v signálnych kaskádach, vrátane kaskád kontrolujúcich bunkový rast, migráciu, diferenciáciu, génovú expresiu, kontrakciu svalov, metabolizmus glukózy, syntézu bunkových proteínov a reguláciu bunkového cyklu.
Príkladom non-receptorovej proteínkinázy, ktorá fosforyluje cieľové bielkoviny na zvyškoch serínu a treonínu, je RAF. RAF moduluje katalytickú aktivitu ďalších proteínkináz, ako je napríklad proteínkináza, ktorá fosforyluje, a tým aktivuje mitogénom aktivovanú proteínkinázu (MAPK). RAF sama osebe je aktivovaná v membráne ukotveným proteínom RAS, ktorý je sám aktivovaný ligandom aktivovanou tyrozínovou receptore vou proteinkinázou, ako je napríklad receptor pre epidermálny rastový faktor (EGFR) a receptor pre rastový faktor derivovaný z krvných doštičiek (PDGFR). Biologická významnosť kinázy RAF je zdôraznená faktom, že pozmenené formy kinázy RAF môžu spôsobiť rozvoj rakoviny. Dôkazom poukazujúcim na dôležitosť kinázy RAF pri malignitách je práca autorov Monia et al., 1996, Náture Medicíne 2: 668, ktorá je týmto v celom svojom rozsahu vrátane všetkých obrázkov a tabuliek začlenená do predkladaného vynálezu ako referencia.
V snahe objaviť nové terapeutické postupy na liečbu nádorových a iných ochorení biomedicínski chemici a vý skumní pracovnici navrhli, syntetizovali a testovali molekuly, ktoré inhibujú funkciu proteínkináz. Niektoré malé organické molekuly vytvárajú triedu zlúčenín, ktoré modulujú funkciu proteínkináz.
Opísali sa príklady molekúl, ktoré inhibujú funkciu proteínkináz. Ide o bis monocyklické, bicyklické alebo heterocyklické arylové zlúčeniny (PCT WO 92/20642), deriváty vinylén-azaíndolu (PCT WO 94/14808), 1-cyklopropyl-4-pyridyl-chinolóny (patent US Patent č. 5330992), styrylové zlúčeniny (Levitzki et al., US Patent č. 5217999, styrylom substituované pyridylové zlúčeniny (patent US Patent č. 5302606), určité chinazolínové deriváty (prihláška EP č. 0 566 266 Al), seleno-indoly a selenidy (PCT WO 94/03427), tricyklické polyhydroxylové zlúčeniny (PCT WO 92/21660) a zlúčeniny na báze benzylfosfónovej kyseliny (PCT WO 91/15495).
Zlúčeniny, ktoré môžu prekonať bunkovú membránu a sú rezistentné proti kyslej hydrolýze, sú potenciálne výhodnými terapeutikami pre svoju biodostupnosť po perorálnom podaní pacientom. Ale mnoho z týchto inhibítorov proteínkináz inhibuje len slabo ich funkciu. Okrem toho mnoho z nich inhibuje celý rad proteínkináz a spôsobuje preto významné vedľajšie účinky pri terapeutickom použití.
Podstata vynálezu
Časť predkladaného vynálezu je zameraná na metódy modulácie funkcie serinových/treonínových proteínkináz pomocou zlúčenín na báze azabenzimidazolu. Metódy zahŕňajú bunky, ktoré exprimujú serínovú/treonínovú proteínkinázu, ako je napríklad RAF. Vynález okrem toho opisuje metódy prevencie a liečby abnormálnych stavov so vzťahom k serínovým/treonínovým proteínkinázam pomocou zlúčeniny identifikovanej v predkladanom vynáleze. Vynález sa ďalej týka farmaceutických preparátov obsahujúcich zlúčeniny identifikované pomocou metód predkladaného vynálezu.
I. Metódy detekcie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy
Metódy predkladaného vynálezu predstavujú prostriedok na moduláciu funkcie receptorových aj cytosolových serinových/treonínových proteínkináz. Tieto metódy predstavujú prostriedok na moduláciu enzýmov za podmienok in vitro aj in vivo. Na podanie in vitro sa metódy predkladaného vynálezu týkajú čiastočne metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serinových/treonínových kináz.
Z tohto dôvodu vynález po prvé uvádza metódu modulácie funkcie serínovej/treonínovej proteínkinázy pomocou azabenzimidazolovej zlúčeniny. Azabenzimidazolová zlúčenina je voliteľne substituovaná organickými skupinami. Metóda je tvorená kontaktom buniek exprimujúcich serínovú/treonínovú proteínkinázu so zlúčeninou, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu.
Termín „funkcia“ sa týka bunkovej úlohy serínovej/treonínovej proteínkinázy. Rodina serinových/treonínových proteínkináz zahŕňa kinázy, ktoré regulujú mnoho krokov v signálnych kaskádach, vrátane kaskád kontrolujúcich bunkový rast, migráciu, diferenciáciu, génovú expresiu, kontrakciu svalov, metabolizmus glukózy, syntézu bunkových proteínov a reguláciu bunkového cyklu.
Termín „moduluje“ sa týka schopnosti zlúčeniny narušiť funkciu proteínkinázy. Modulujúca látka aktivuje kata lytickú aktivitu proteínkinázy, najlepšie aktivuje alebo inhibuje katalytickú aktivitu proteínkinázy v závislosti od koncentrácie zlúčeniny vystavenej proteinkináze a úplne najlepšie inhibuje katalytickú aktivitu proteínkinázy.
Termín „katalytická aktivita“ v kontexte predkladaného vynálezu definuje stupeň fosforylácie substrátu proteínkinázou. Katalytická aktivita sa môže merať napríklad určením množstva substrátu premeneného na produkt v čase. Fosforylácia substrátu prebieha na aktívnom mieste proteínkinázy. Aktívne miesto je za normálnych okolností dutina, v ktorej je substrát naviazaný na proteínkinázu a je fosforylovaný.
Tu používaný termín „substrát“ sa týka molekuly fosforylovanej serínovou/treonínovou proteínkinázou. Substrátom je najlepšie peptid a úplne najlepšie proteín. Vo vzťahu k proteinkináze RAF sú preferovanými substrátmi MEK a substrát pre MEK MAPK.
Termín „aktivuje“ sa týka zvyšovania bunkovej funkcie proteínkinázy. Funkciou proteínkinázy je najlepšie interakcia s prirodzeným väzbovým partnerom a úplne najlepšie katalytická aktivita.
Termín „inhibuje“ sa týka znižovania bunkovej funkcie proteínkinázy. Funkciou proteínkinázy je najlepšie interakcia s prirodzeným väzbovým partnerom a úplne najlepšie katalytická aktivita.
Termín „moduluje“ sa týka zmeny funkcie proteínkinázy zvýšením alebo znížením pravdepodobnosti tvorby komplexu medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom. Modulačná látka preferovane zvyšuje pravdepodobnosť tvorby takého komplexu medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom, viac preferovane zvyšuje alebo znižuje pravdepodobnosť tvorby takého komplexu medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom v závislosti od koncentrácie zlúčeniny vystavenej proteínkináze a najviac preferovane znižuje pravdepodobnosť tvorby takého komplexu medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom.
Termín „komplex“ sa týka spojenia aspoň dvoch molekúl naviazaných na seba. Komplexy signálovej transdukcie často obsahujú aspoň dve proteínové molekuly naviazané navzájom na seba. Napríklad pri proteín tyrozínovej receptorovej proteinkináze sa spájajú zložky GRB2, SOS, RAF a RAS za vzniku signálneho transdukčného komplexu v závislosti od mitogénneho ligandu.
Termín „prirodzený väzbový partner“ sa týka polypeptidov, ktoré sa viažu na proteínkinázu v bunkách. Prirodzení väzboví partneri hrajú rolu v šírení signálu v procese proteínkinázovej signálnej transdukcie. Zmena v interakcii medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom sa môže sama manifestovať vo zvýšení alebo znížení pravdepodobnosti tvorby interakcie alebo vo zvýšení alebo znížení pravdepodobnosti koncentrácie komplexu proteínkináza/prirodzený väzbový partner. Prirodzený väzbový partner proteínkinázy sa môže s vysokou afinitou viazať na intracelulámu oblasť proteínkinázy. Vysoká afinita predstavuje rovnovážnu väzbovú konštantu rádovo 10‘6 M alebo menej. Navyše môže prirodzený väzbový partner prechodne interagovať s intracelulámou oblasťou proteínkinázy a chemicky ju modifikovať. Prirodzení väzboví partneri proteínkinázy sú vybraní zo skupiny, ktorá obsahuje, ale nie je obmedzená na SRC homológne 2 (SH2) alebo 3 (SH3) domény, iné fosforyltyrozín väzbové (PTB) domény, guanínové nukleotidové výmenné faktory, proteínfosfatázy a ďalšie kinázy. Metódy určenia zmien interakcií medzi proteínkinázami a ich prirodzenými väzbovými partnermi sú ľahko dostupné v odbore.
Termín „serínová/treonínová proteínkináza“ sa týka enzýmu s aminokyselinovou sekvenciou s aspoň 10 % aminokyselinovou identitou s inými enzýmami, ktoré fosforylujú proteíny na serínových alebo treonínových zvyškoch. Serínová/treonínová proteínkináza katalyzuje väzbu fosfátu na proteíny cez serínové alebo treonínové zvyšky. Serínové/treoninové proteínkinázy môžu existovať ako membránové väzbové alebo cytosolové proteíny.
Tu používaný termín „kontakt“ sa týka zmiešania roztoku tvoreného azabenzimidazolovou zlúčeninou, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, s tekutým médiom na inkubáciu buniek. Roztok obsahujúci zlúčeninu môže byť tvorený aj ďalšou zložkou, ako je napríklad dimetylsulfoxid (DMSO), ktorá uľahčuje vychytávanie azabenzimidazolovej zlúčeniny alebo zlúčenín do buniek, ktoré sú predmetom predkladaných metód. Roztok obsahujúci azabenzimidazolovú zlúčeninu môže byť pridaný k bunkovému inkubačnému médiu použitím transportného zariadenia, ako je napríklad zariadenie s použitím pipety alebo injekčnej striekačky.
Termín „azabenzimidazolová zlúčenina“ sa týka azabenzimidazolovej organickej zlúčeniny substituovanej chemickými substituentmi. Azabenzimidazolové zlúčeniny majú všeobecný vzorec:
Termín „substituovaný“ majúci vzťah k predkladanému vynálezu sa týka azabenzimidazolovej zlúčeniny, ktorá je derivatizovaná akýmkoľvek množstvom chemických substituentov.
V preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy modulácie funkcie serínovej/treonínovej proteínkinázy, kde proteínkinázou je RAF.
RAF proteínkináza fosforyluje cieľové proteíny na serinových alebo treonínových zvyškoch. Jedným takým cieľovým proteínom je proteínkináza (MEK), ktorá fosforyluje a následne aktivuje mitogénom aktivovanú proteínkinázu (MAPK). RAF sama osebe je aktivovaná membránovo viazaným guaníntrifosfát hydrolyzujúcim enzýmom RAS v odpovedi na mitogénom stimulované receptorové proteínové tyrozínkinázy, ako je napríklad receptor pre epidermálny rastový faktor (EGFR) a receptor pre rastový faktor derivovaný z krvných doštičiek (PDGFR).
Pomocou metód, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, možno detegovať zlúčeniny, ktoré modulujú funkciu proteínkinázy RAF v bunkách. RAF fosforyluje proteínkinázu (MEK), ktorá ďalej fosforyluje mitogénom aktivovanú proteínkinázu (MAPK). Analýzy, ktoré monitorujú len fosforyláciu MEK prostredníctvom RAF nie sú citlivé, pretože stupeň fosforylácie MEK nie je významný. Aby sa prekonal tento problém senzitivity, sleduje sa v predkladanom vynáleze fosforylácia MEK aj MAPK. MAPK fosforylačný signál násobí MEK fosforylačný signál a umožňuje sledovať RAF dependentnú fosforyláciu, napríklad pomocou enzýmovo viazanej imunosorpčnej analýzy (ELISA). Analýza, ktorá je predmetom predklada neho vynálezu sa navyše uskutočňuje vysokokapacitne, čo umožňuje rýchle monitorovanie mnohých zlúčenín v krátkom časovom úseku.
V ďalšom aspekte opisuje vynález metódu identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínových/treoninových proteínkináz. Táto metóda je tvorená krokmi kontaktu buniek exprimujúcich serínovú/treonínovú proteínkinázu so zlúčeninou a monitorovania efektu na bunkách.
Termín „monitorovanie“ sa týka pozorovania účinku po pridaní zlúčeniny k bunkám, ktoré sú predmetom predkladanej metódy. Účinok sa môže manifestovať zmenou bunkového fenotypu, bunkovej proliferácie, katalytickej aktivity proteínkinázy alebo zmenou interakcie medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom.
Termín „efekt“ opisuje zmenu alebo chýbanie zmeny v bunkovom fenotype alebo bunkovej proliferácii. „Efekt“ môže opisovať aj zmenu alebo chýbanie zmeny katalytickej aktivity proteínkinázy. „Efekt“ môže opisovať aj zmenu alebo chýbanie zmeny interakcie medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom.
Preferovaná forma predkladaného vynálezu sa týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy, kde efektom je zmena alebo absencia zmeny v bunkovom fenotype.
Termín „bunkový fenotyp“ sa týka vonkajšieho vzhľadu bunky alebo tkaniva alebo funkcie bunky alebo tkaniva. Príkladom bunkového fenotypu je veľkosť bunky (zmenšenie alebo zväčšenie), bunková proliferácia (zvýšenie alebo zníženie počtu buniek), bunková diferenciácia (zmena alebo absencia zmeny tvaru bunky), prežitie bunky, apoptóza (bunková smrť) alebo utilizácia metabolických živín (napríklad vychytávanie glukózy). Zmeny alebo absencia zmien v bunkovom fenotype je ľahko merateľná pomocou techník známych v odbore.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy, kde efektom je zmena alebo absencia zmien v bunkovej proliferácii.
Termín „bunková proliferácia“ sa týka stupňa bunkového delenia skupiny buniek. Počet buniek rastúcich v nádobke môže kvantifikovať osoba vyznajúca sa v odbore, keď táto osoba vizuálne odčíta počet buniek v definovanom objeme použitím bežného svetelného mikroskopu. Alternatívne sa môže stupeň bunkovej proliferácie kvantifikovať laboratórnym zariadením, ktoré opticky alebo kondukčne meria denzitu buniek v príslušnom médiu.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy, kde efektom je zmena alebo absencia zmeny interakcie medzi serínovou/treonínovou proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom.
Termín „interakcia“ v kontexte predkladaného vynálezu opisuje komplex vytvorený medzi intracelulámou oblasťou proteínkinázy a prirodzeným väzbovým partnerom alebo zlúčeninou. Termín „interakcia“ môže byť rozšírený aj na komplex vytvorený medzi zlúčeninou, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, a intracelulámymi a extracelulámymi oblasťami študovanej proteínkinázy. Aj keď cytosolová proteinkináza nemá extracelulámu oblasť, receptorová proteinkináza obsahuje extracelulámu aj intracelulámu oblasť.
Tu používaný termín „intraceluláma oblasť“ sa týka časti proteínkinázy, ktorá existuje vnútri bunky. Tu použí vaný termín „extraceluláma oblasť“ sa týka časti proteínkinázy, ktorá existuje mimo bunky.
V preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy. Táto metóda sa ďalej skladá z nasledovných krokov: a) lýzy buniek na získanie lyzátu obsahujúceho serínovú/treonínovú proteínkinázu; b) adsorpcie serínovej/treonínovej proteínkinázy na protilátku; c) inkubácie adsorbovanej serínovej/treonínovej proteínkinázy so substrátom alebo substrátmi; a d) adsorpcie substrátu alebo substrátov na pevnú matricu alebo protilátku. Krok monitorovania efektu na bunky sa skladá z merania koncentrácie fosfátu v substráte alebo substrátoch.
Tu používaný termín „lýza“ sa týka metódy disrupcie integrity bunky, čím dochádza k uvoľneniu vnútorného prostredia. Bunkovú lýzu možno dosiahnuť mnohými spôsobmi známymi osobám skúseným v odbore. Ide najlepšie o sonikáciu alebo iné techniky určené na rozbíjanie buniek a úplne najlepšie o detergentné techniky.
Tu používaný termín „protilátka“ sa týka bielkovinovej molekuly, ktorá sa špecificky viaže na proteínkinázu. Protilátka sa preferovane viaže na jednu triedu proteínkinázy a úplne preferovane sa viaže na RAF proteínkinázu.
Tu používaný termín „špecificky sa viaže“ sa týka protilátky, ktorá sa viaže na proteínkinázu s vyššou afinitou ako iná proteinkináza alebo bunková bielkovina. Protilátka, ktorá sa špecificky viaže na proteínkinázu, viaže väčšie množstvo špecifickej proteínkinázy ako akákoľvek iná proteinkináza alebo bunková bielkovina.
Tu používaný termín „adsorpcia“ sa týka väzby molekuly k povrchu protilátky alebo pevnej matrice. Príkladom pevných matríc je chemicky modifikovaná celulóza, ako je napríklad fosfocelulóza a nylon. Protilátky sa môžu naviazať na pevné matrice použitím techník dobre známych osobám vyznajúcim sa v odbore. Pozri napríklad Harlo a Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories.
Tu používaný termín „meranie koncentrácie fosfátu“ sa týka techník bežne známych osobám vyznajúcim sa v odbore. Tieto techniky zahŕňajú kvantifikáciu koncentrácie fosfátu v substráte alebo určenie relatívnych množstiev fosfátu v substráte. Tieto techniky môžu zahŕňať adsorpciu substrátu na membránu a detekciu množstva fosfátu v substráte pomocou merania rádioaktivity.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy. Táto metóda sa ďalej skladá z nasledovných krokov: a) lýzy buniek na získanie lyzátu obsahujúceho RAF; b) adsorpcie RAF na protilátku; c) inkubácie adsorbovanej RAF s MEK a MAPK; a d) adsorpcie MEK a MAPK pevnú matricu alebo protilátku. Krok merania efektu na bunky sa skladá z monitorovania koncentrácie fosfátu v MEK a MAPK.
V preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy. V tejto metóde má azabenzimidazolová zlúčenina štruktúru definovanú v predkladanom vynáleze vzorcami (1), (II) alebo (III) alebo v akejkoľvek podskupine zlúčenín definovaných vzorcami (I), (II) alebo (III).
Termín „zlúčenina“ sa týka zlúčeniny alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, esteru, amidu, prolieku, izoméru alebo metabolitu.
Termín „farmaceutický prijateľná soľ“ sa týka formulácie zlúčeniny, ktorá nenarúša biologickú aktivitu a vlast nosti východiskovej zlúčeniny. Farmaceutické soli sa môžu získať reakciou zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu s anorganickými alebo organickými kyselinami, ako je napríklad kyselina chlorovodíková, bromovodiková, sírová, dusičná, fosforečná, metánsulfónová, etánsulfónová, p-toluénsulfónová, salicylová a podobné.
Termín „proliek“ sa týka látky, ktorá je premenená na vlastný účinný liek za podmienok in vivo. Prolieky môžu byť v niektorých situáciách aplikované ľahšie ako vlastné účinné lieky. Proliek môže byť napríklad biodostupný po perorálnom podaní, zatiaľ čo vlastný účinný liek nie je biodostupný, alebo liek vo forme prolieku môže byť lepšie rozpustný a môže byť tak aplikovaný intravenóznou cestou.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy a kde azabenzimidazolová zlúčenina má štruktúru definovanú v predkladanom vynáleze vzorcami (I), (II) alebo (III), kde azabenzimidazolová zlúčenina je vybraná zo skupiny tvorenej zlúčeninami SABI.
Termín „zlúčeniny SABI“ sa týka skupiny azabenzimidazolových zlúčenín majúcich štruktúru definovanú v predkladanom vynáleze vzorcami (A) alebo (B) a číslovania A-l až A-198 podľa nasledovnej tabuľky:
y
Zlúčenina č. R1 R* &
A-l Fenyl 0 - -
A-2 Fenyl s -
A-3 Fenyl 0 Metyl 0
A-4 Fenyl 0 Etyl 0
Ä-5 2-nitrofenyl 0
A-6 3-nitrofenyl 0
A-7 4-nitrofenyl 0
A-B 2-chlórfenyl 0
A-9 3-chlórfenyl 0
A-1O 4-chlórfenyl 0
A-ll 2-metylfenyl 0
A-12 3-metylfenyl 0
A-13 4-metylfenyl 0
A-14 2-fluôrfenyl 0
A-15 3~fluórfenyl 0
A-16 4~flu6rfenyl 0
Ä-17 2-( trifluórmetyl) fenyl 0
A-ie 3- [ trif luórmetyl)fenyl o
A-19 4-(trifluórmetyl)íenyl o
A-20 2-metoxyfenyl o
A-21 3-roetoxyfenyl 0
A-22 4-juetoxyfenyl 0
A-23 2-karboxyfenyl 0
A-24 3-karboxyfenyl 0
A-25 4-karboxyfenyl 0
A-2 8 2-ni.trofenyl s
A-27 3-nitrofenyl 5
A-28 4-nitrofenyl 5
A-29 2-chlórfenyl S
A-30 3- chlórfenyl S
A-31 4*chlórfenyi S
A-32 2-metylfenyl s
A-33 3-metylfenyl s
A-34 4-metylfenyl s
A-35 2-fluórfenyl s
Zlúčenina č. R’ “χΐ“ R* 24
A-36 3-fluórfenyl S
A-37 <-fluórfenyl S
A-38 2~( trifluórmetyDfenyl s
A-39 3-( tri fluórmetyl) fenyl s
A-40 4 - (tri fluórmetyl Jfenyl 5
A-41 2-metoxyfenyl S
A-42 3-metcxyfenyl s
A-43 4-metoxyfenyl s
A-44 2-karboxyfenyl s
A-45 3-karboxyfenyl s
A-46 4-karboxyfenyl s
A-47 Fenyl NH
A-48 2-nitrofenyl NH
A-49 3-nitrofenyl NH
A-SO 4-nitrofenyl NH
A-51 2-chlórfenyl NH
A-52 3-chlórfenyl NH
A-53 4-chlórfenyl NH
Λ-54 2-metylfenyl NH
A-5S 3-metylfenyl NH
A-56 4-metylíenyl NH
A-57 2-fluôrfenyl NH
A-58 3fluórfenyl NH
A-59 4'fluórfenyl NH
A-60 2-[ trif luórmetyl )fenyl NR
A-61 3-{ trifluórmetyDfenyl NH
A-62 4( trifluórmetyDfenyl NH
A-63 2-metoxyfenyl NH
A-64 3-metoxyfenyl NH
A-65 4-metoxyfenyl NH
A-66 2-karboxyfenyl NH
A-67 3-karboxyfenyl NH
Α-6Θ 4-karboxyfenyl NH
A-69 2-nitrofenyl 0 Metyl 0
A-70 3-nitrofenyl 0 Metyl 0
Zlúčenina e. R1 Xl —Ŕ5— Z3
A-71 4-nitrofenyl 0 Metyl 0
A-72 2-chlórfenyl 0 Metyl 0
A-73 3-chlórfenyl 0 Metyl 0
A-74 4-chlórfenyl 0 Metyl 0
A-75 2-metylfenyl 0 Metyl 0
A-76 3-metylfenyl u Metyl 0
A-77 4-raetylfenyl 0 Metyl 0
A-70 2-fluórfenyl 0 Metyl 0
A-79 3-fluórfenyl. 0 Metyl n
A-BO 4-fluórfenyl 0 Metyl 0
A-ei 2'ttrifluórmetyl jfenyl 0 Metyl 0
A-82 3~(tri fluórmetyl)fenyl 0 Metyl 0
A-83 4- (trifluórmetyDfenyl 0 Metyl 0
A-84 2-metoxyfenyl 0 Metyl 0
A-85 3-metoxyfenyl 0 Metyl 0
A-86 4-metoxyfenyl 0 Metyl 0
A-67 2-karboxyfenyl 0 Hetyl 0
A-86 3-karboxyfenyl 0 Metyl 0
A-89 4-karboxyfenyl 0 Metyl 0
A-90 Fenyl Metyl o
A-91 2-nitrofenyl Metyl 0
A-92 3-nitrofenyl Metyl 0
A-93 4-nitrofenyl s Metyl 0
A-94 2- chlórfenyl s Metyl 0
A-95 3- chlórfenyl s Metyl 0
A-96 4-chlór fenyl s Metyl 0
A-97 2-metylfenyl s Metyl 0
Α-9Θ 3-metylfenyl s Metyl □
A-99 4-metylfenyl s Metyl 0
A-100 2“fluórfenyl s Metyl 0
A-101 3- fluórfenyl s Metyl 0
A-102 4- fluórfenyl s Metyl 0
A-10 3 2· (trifluórmetyl)fenyl s Metyl 0
A-104 3- [trifluórmetyDfenyl s Metyl o
A-1O5 4-(trifluórmetyl)fenyl s Metyl o
Zlúčenina č. R’ X' R* z·*
A-106 2-metoxyfenyl S Metyl 0
A-107 3-metoxyfenyl S Metyl 0
A-108 4-metoxyfenyl S Metyl 0
A-109 2-karboxyfenyl S Metyl 0
A-110 3-karboxyfenyl S Metyl 0
A-lll 4-karboxyfenyl s Metyl 0
A-112 Fenyl NH Metyl 0
A-113 2-nitrofenyl NH Metyl o
A-114 3-nitrofenyl NH Metyl 0
A-115 4-nitrofenyl NH Metyl 0
A-116 2—chlôrfenyl NH Metyl 0
A-117 3-Chlôrfenyl NH Metyl 0
A-116 4-chlór fenyl N H Metyl 0
A-119 2-metylfenyl NH Metyl 0
A-120 3-metyltenyl· NH Metyl 0
A-121 4-metylfenyl NH Metyl 0
A-122 2-fluórfenyl NH Metyl 0
A-123 3-fluórfenyl NH Metyl 0
A-124 4-fluóííenyl NH Metyl 0
A-125 2-(trifluórmetyl)fenyl NH Metyl 0
A-126 3- (trifluórmetyl)fenyl NH Metyl 0
A-127 4-( trifluórmetyUfenyl NH Metyl 0
Α-12Θ 2-metoxyfenyl NH Metyl 0
A-129 3-metoxyfenyl NH Metyl 0
Λ-130 4-metoxyfenyl NH Metyl 0
A-131 2-karboxyfenyl NH Metyl 0
A-132 3-karboxyfenyl NH Metyl 0
A-133 4-karboxyfenyl NH Metyl o
A-134 2-r.itrofenyl O Etyl 0
A-135 3-nitrofenyl 0 Etyl 0
A-136 4-r.itrofenyl 0 Etyl 0
A-137 2-chlôrfenyl 0 Etyl 0
A-138 3chlórfenyl 0 Etyl o
A-139 4-chlôrfenyl 0 Etyl 0
A-140 2-metylfenyl 0 Etyl 0
Zlúčenina č. R’ X’ R* z·»
A-34J 3-metylfenyl 0 Etyl 0
A-14 2 4-metylfcnyl 0 Etyl 0
A-143 2-fluór fenyl ° Etyl o
A-144 3- fluór fenyl 0 Etyl 0
A-145 4-fluór fenyl 0 Etyl 0
A-146 2-(trifluór metyl)fenyl 0 Etyl 0
A-147 3- (tri fluórmetyl) fenyl 0 Etyl 0
A-148 4- (tri fluórmetyl)fenyl 0 Etyl 0
A-149 2-metoxyfenyl 0 Etyl 0
A-150 3-metoxyfenyl 0 Etyl 0
A-151 4-metcxyťenyl c Ctyl 0
A-152 Z-karboxyfer.yl 0 Etyl 0
A-1Ó3 3-karboxyfer.yl 0 Etyl 0
Ά-154 4-karboxyfer.yl o Etyl 0
Ά-155 fenyl Etyl 0
A--1Ó6 2-nitrofenyl s Etyl 0
A-1Ó7 3-nítrofenyl s F.tyl o
ft-158 4-nítrofenyl s Etyl 0
A-159 2-chlórfenyl s Etyl 0
A-160 3-chlór fenyl s Etyl 0
A-161 4-chlórfenyl s Etyl 0
A-1Ú2 2-meť/lfe.nyl Etyl. Q
A-163 3-metylfenyl Etyl 0
A-164 4-metylfenyl Etyl 0
A-155 2- fluórfenyl Etyl 0
A-156 3-fluórfenyl Etyl 0
A-167 4-tiuór fenyl ‘ Etyl 0
Λ-168 2-(tri fluórmetyljfenyl s Etyl 0
A-159 3-(trifluórmetyl)fenyl Etyl 0
A-170 4-(trifluórmetyl)fenyl s Etyl 0
Ά-171 2-metoxyfenyl s Etyl o
A-172 3-metoxyfenyl Etyl o
A-173 4-metoxyfenyl Etyl 0
Ά-174 2-ka rboxyfer.yl s Etyl 0
A-175 3-karboxyfer.yl s Etyl 0
Zlúčenina č. Ri X* R’ 23
A-176 4-karboxyfenyl S Etyl 0
A-177 Fenyl NH Etyl 0
A-178 2-nitrofenyl NH Etyl 0
A-179 3-nitrofenyl NH Etyl 0
A-ino 4-nltrofenyl NH Etyl. 0
A-101 2-chlórfenyl NH Etyl o
Α-1Θ2 3 chlôrfenyl NH Etyl 0
A-183 4-chlôrfenyl NH Etyl 0
A-184 2-metylfenyl NH Etyl 0
A-1B5 3-metylfenyl N H Etyl 0
A-1B6 4-metylfenyl N H Etyl 0
A-187 2-fluórfenyl NH Etyl 0
A-188 3·fluórfenyl NE Etyl 0
Λ-189 4-fluórfenyl NH Etyl 0
A-190 2-ttrif luóimetyDfenyl NH. Etyl 0
Ά-191 3 - (trifluórmetyl )fcnyl NH Etyl 0
A-192 4-(trifluórmetyl )fenyl NH Etyl 0
A-193 2-met.nxyfeny.l NH Etyl 0
A-194 3-metoxyfenyl NH Etyl 0 ......o
A-195 4-metoxyfenyl NE Etyl
A-196 2-karboxyfenyl N H Etyl 0
A-197 3-karboxyfenyl NH Etyl 0
A-198 4-karboxyfenyl NH Etyl 0
II. Metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov
V ďalšom aspekte sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmov. Táto metóda je tvorená podaním zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu a ktorá je tu špecifikovaná vzorcami (I), (II) a (III) týmto organizmom za dodržania tu opísaným obmedzení.
Termín „organizmus“ sa týka akejkoľvek identity tvorenej aspoň jednou bunkou. Organizmus môže byť jednoduchá eukaryotická bunka alebo komplexný organizmus, ako je napríklad cicavec. V preferovaných formách predkladaného vynálezu sa organizmus vzťahuje na človeka alebo cicavca.
Termín „prevencia“ sa týka metódy, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu a ktorá vedie k zníženiu pravdepodobnosti alebo k eliminácii možnosti rozvoja abnormálneho stavu organizmu.
Termín „liečba“ sa týka metódy, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu a ktorá má terapeutický účinok a aspoň čiastočne zmierňuje abnormálne stavy organizmu.
Termín „terapeutický efekt“ sa týka inhibície bunkového rastu spôsobujúceho alebo spolu sa podieľajúceho na abnormálnom stave. Termín „terapeutický efekt“ sa týka aj inhibície rastových faktorov spôsobujúcich alebo spolu sa podieľajúcich na abnormálnom stave (napríklad na nádorovom ochorení). Terapeutický efekt zmierňuje do určitej miery jeden alebo viac symptómov abnormálneho stavu. S ohľadom na terapiu nádorových ochorení sa terapeutický efekt týka jedného alebo viacerých z nasledovných bodov:
a) zmenšenia veľkosti nádoru; b) inhibície (t. j. spomalenia alebo zastavenia) metastáz nádorového ochorenia; c) inhibície nádorového rastu; a d) určitého zmiernenia jedného alebo viacerých príznakov spojených s abnormálnym stavom. V predkladanom vynáleze sú identifikované zlúčeniny vykazujúce účinnosť proti leukémiám, ktoré spomaľujú alebo znižujú bunkovú proliferáciu alebo bunkový rast, aj keď neinhibujú metastázovanie.
Termín „abnormálny stav“ sa týka funkcie buniek alebo tkanív organizmu, ktorá sa odchyľuje od ich normálnej funkcie v organizme. Abnormálny stav sa týka bunkovej proliferácie, bunkovej diferenciácie alebo prežívania buniek.
Aberantné stavy bunkovej proliferácie zahŕňajú nádory, ako napríklad nádory fibrotického a mezangiálneho pôvodu, abnormálnu angiogenézu a vaskulogenézu, hojenie rán, psoriázu, diabetes mellitus a zápaly.
Aberantné stavy bunkovej diferenciácie zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na neurodegeneratívne ochorenie, pomalé hojenie rán a techniky transplantácie tkanív.
Aberantné stavy prežívania buniek zahŕňajú stavy, pri ktorých je aktivovaná alebo odstránená metabolická cesta programovanej bunkovej smrti (apoptóza). S apoptózou je spojený celý rad proteínkináz. Aberácia funkcie akejkoľvek proteínkinázy môže viesť k nesmrteľnosti bunky alebo k jej predčasnému odumretiu.
Bunková proliferácia, diferenciácia a prežívanie sú fenomény, ktoré môžu byť jednoducho merané pomocou metód známych v odbore. Tieto metódy môžu zahŕňať pozorovanie počtu buniek alebo ich vzhľadu pod mikroskopom v danom čase (napríklad dni).
Termín „podanie“ sa všeobecne týka aplikácie zlúčeniny do organizmu a špecifickejšie metódy inkorporácie zlúčeniny do buniek alebo tkanív organizmu. Môže sa zabrániť rozvoju abnormálneho stavu alebo môže byť liečený za podmienky existencie buniek alebo tkanív v organizme aj mimo neho. Bunky existujúce mimo organizmu môžu byť udržiavané alebo kultivované v miskách na bunkové kultúry. Pre bunky existujúce v organizme existuje mnoho techník podania zlúčenín zahŕňajúc (ale neobmedzujúc sa na) perorálne, parenterálne, dermálne a injekčné podanie alebo aplikáciu vo forme aerosólu. Pre bunky existujúce vnútri organizmu existuje mnoho techník podania zlúčenín vrátane (ale neobmedzujúc sa na) techniky bunkovej mikroinjikácie, transformačnej a nosičovej techniky.
V preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmu, kde azabenzimidazolová zlúčenina má štruktúru definovanú v predkladanom vynáleze vzorcami (I), (II) alebo (III) alebo akoukoľvek ich podskupinou.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmu, kde azabenzimidazolová zlúčenina je vybraná zo skupiny tvorenej zlúčeninami SABI.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmu, kde organizmom je cicavec.
Termín „cicavec“ sa týka preferovane organizmov, ako sú myši, potkany, morčatá a kozy, lepšie však opič a úplne najlepšie človeka.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmu, kde abnormálnym stavom je nádorové alebo fibrotické ochorenie.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmov, kde nádorové ochorenie patrí do skupiny tvorenej nádormi pľúc, ovárií, prsníka, mozgu, intraaxiálnymi mozgovými nádormi, nádormi čreva, prostaty, sarkómami, Kaposiho sarkómami, melanómami a gliómami.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmu, kde je metóda použitá pri abnormálnych stavoch spojených s poruchou signálovej transdukcie charakterizovanej interakciou medzi serínovou/treonínovou proteinkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom.
Termín „signálová transdukcia“ sa týka šírenia signálu. Všeobecne ide o prenesenie extracelulámeho signálu cez bunkovú memmbránu tak, že sa z neho stane signál intracelulámy. Tento signál môže potom stimulovať bunkovú odpoveď. Tento termín zahŕňa aj signály, ktoré sú šírené priamo v bunke. Peptidové molekuly, ktoré účinkujú v procesoch signálovej transdukcie, sú typicky receptorové alebo non-receptorové proteínkinázy, receptorové alebo non-receptorové proteínfosfatázy, nukleotidové výmenné faktory a transkripčné faktory.
Termín „aberácia“ v spojení s procesom signálovej transdukcie sa týka proteínkinázy, ktorá je zvýšene alebo znížene exprimovaná v organizme, zmutovaná tak, že jej katalytická aktivita je nižšia alebo vyššia ako aktivita prirodzenej proteínkinázy, alebo zmutovaná tak, že nemôže dôjsť k interakcii s prirodzeným väzbovým partnerom, alebo nemôže byť modifikovaná inou proteinkinázou alebo proteínfosfatázou.
Termín „podpora alebo narušenie abnormálnej interakcie“ sa týka metódy tvorenej podaním zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, bunkám alebo do tkanív organizmu. Zlúčenina môže podporovať interakciu medzi proteinkinázou a prirodzenými väzbovými partnermi pomocou interakcii s mnohými atómami na rozhraní komplexu. Zlúčenina môže alternatívne inhibovať interakciu medzi proteinkinázou a prirodzenými väzbovými partnermi vytvorením vhodných interakcií medzi atómami na rozhraní komplexu. V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmu, kde serínovou/treonínovou proteinkinázou je RAF.
III. Zlúčeniny a farmaceutické preparáty, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu
V ďalšom aspekte sa vynález týka azabenzimidazolvých zlúčenín, ktoré majú štruktúru definovanú vzorcami (I), (II) alebo (III):
kde
a) R1, R2, R3 a R4 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) vodíkom;
(ii) nasýteným alebo nenasýteným alkylom;
(iii) NX2X3, kde X2 a X3 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom;
(iv) halogénom alebo trihalogénmetylovou skupinou;
(v) ketónom vzorca -CO-X4, kde X4 je vybraný zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom;
(vi) karboxylovou kyselinou charakterizovanou vzorcom -(X5)n-COOH, alebo esterom charakterizovaným vzorcom -(X6)n-COO-X7, kde X5, X6 a X7 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom a kde n je 0 alebo 1;
(vii) alkoholom charakterizovaným vzorcom -(X8)n-OH alebo -(X8)„-O-X9, kde X8 a X9 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom a kde kruh je voliteľne substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, alkoxyskupinou, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou a kde n je O alebo 1;
(viii) amidom charakterizovaným vzorcom -NHCOX10, kde X10 je vybraný zo skupiny tvorenej alkylom, hydroxylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom a kde kruh je voliteľne substituovaný jedným alebo dvoma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, alkoxyskupinou, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou;
(ix) -SO2NXI1X12, kde X11 a X12 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom;
(x) homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom voliteľne substituovaným jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, alkoxyskupinou, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou;
(xi) aldehydom charakterizovaným vzorcom -CÓ-H; a (xii) sulfónom charakterizovaným vzorcom -SO2X13, kde X13 je vybraný zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom;
b) Z1 a Z2 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej dusíkom, sírou, kyslíkom, NH, NR4 za predpokladu, že jeden zo Z1 a Z2 je dusík, NH alebo NR4, potom druhý Z1 a Z2 je dusík, síra, kyslík, NH alebo NR4; a
c) Z3 a X1 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej dusíkom, sírou a kyslíkom.
Termín „nasýtený alkyl“ sa týka alkylovej skupiny, ktorá neobsahuje alkénovú ani alkinovú skupinu. Alkylová skupina môže byť rozvetvená alebo nerozvetvená.
Termín „nenasýtený alkyl“ sa týka alkylovej skupiny, ktorá obsahuje aspoň jednu alkénovú alebo alkinovú skupinu. Alkylová skupina môže byť rozvetvená alebo nerozvetvená.
Termín „amin“ sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom -NR'R2, kde R1 a R2 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom, kde kruh je voliteľne substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou.
Termín „aryl“ sa týka aromatickej skupiny, ktorá má aspoň jeden kruh so systémom π elektrónov a zahŕňa karbocyklické (napríklad fenyl) aj heterocyklické arylové skupiny (napríklad pyridín). Termín karbocyklický sa týka zlúčeniny, ktorá obsahuje jednu alebo viac kovalentne uzavretých kruhových štruktúr a kde atómami tvoriacimi kostru kruhu sú vždy atómy uhlíka. Termín týmto rozlišuje karbocyklické kruhy od heterocyklických, v ktorých kostra kruhu obsahuje aspoň jeden atóm, ktorý nie atómom uhlíka. Termín „heteroaryl“ sa týka arylovej skupiny, ktorá obsahuje aspoň jeden heterocyklický kruh.
Termín „halogén“ sa týka atómu vybraného zo skupiny tvorenej fluórom, chlórom, brómom a jódom.
Termín „ketón“ sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom -(R)n-CO-R', kde R a R' sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom, kde n je O alebo 1.
Termín „karboxylová kyselina“ sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom -(R)n-C00H, kde R je vybraný zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom, kde n je O alebo 1.
Termín „ester“ sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom - (R)n-C00R', kde R a R' sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom, kde n je O alebo 1.
Termín „alkohol“ sa týka chemického substituenta charakterizovaného vzorcom -ROH, kde R je vybraný zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom, kde kruh je voliteľne substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou.
Termín „amid“ sa týka chemického substituenta charakterizovaného vzorcom -NHCOR, kde R je vybraný zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom, hydroxylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom, kde kruh je voliteľne substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou.
Termín „alkoxyskupina“ sa týka chemického substituenta charakterizovaného vzorcom -OR, kde R je vodík alebo nasýtený alebo nenasýtený alkyl.
Termín „aldehyd“ sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom -(R)n-CH0, kde R je vybraný zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom, kde n je O alebo 1.
Termín „sulfón“ sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom -SO2-R, kde R je vybraný zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka azabenzimidazolových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom (I), (II) alebo (III), kde Z1 a Z2 sú nezávisle vybrané zo skupiny obsahujúcej vodík a NH.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka azabenzimidazolových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom (I), (II) alebo (III), kde R1, R2, R3 a R4 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom voliteľne substituovaným homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom, kde kruh je voliteľne substituovaný jedným, dvoma alebo troma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, alkoxyskupinou, halogénom, trihalogénmetylom, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou, a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom voliteľne substituovaným jedným, dvoma alebo troma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, alkoxyskupinou, halogénom, trihalogénmetylom, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou.
SK 285357 Β6
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka azabenzimidazolových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom (I), (II) alebo (III), kde R2 a R3 jc vodík.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka azabenzimidazolových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom (I), (II) alebo (III), kde R1 je fenyl voliteľne substituovaný jedným, dvoma alebo troma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, alkoxyskupinou, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka azabenzimidazolových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom (I), (II) alebo (III), kde R1 je vybraný zo skupiny tvorenej substituentmi SABI.
Termín „substituenty SABI“ sa týka skupiny substituentov obsahujúcej fenyl, 2-nitrofenyl, 3-nitrofenyl, 4-nitrofenyl, 2-chlórfenyl, 3-chlórfenyl, 4-chlórfenyl, 2-metylfenyl, 3-metylfenyl, 4-metylfenyl, 2-fluórfenyl, 3-fluórfenyl, 4-fluórfenyl, 2-(trifluórmetyl)fenyl, 3-(trifluórmetyl)fenyl, 4-(trifluórmetyl)fenyl, 2-metoxyfenyl, 3-metoxyfenyl, 4-metoxyfenyl, 2-karboxyfenyl, 3-karboxyfenyl a 4-karboxyfenyl.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka azabenzimidazolových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom (I), (II) alebo (III), kde X1 je síra.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka azabenzimidazolových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom (I), (II) alebo (III), kde X1 je kyslík.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka azabenzimidazolových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom (I), (II) alebo (III), kde Z3 je kyslík.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka azabenzimidazolových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom (I), (II) alebo (III), kde R4 je vybraný zo skupiny obsahujúcej metyl a etyl.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka azabenzimidazolových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom (I), (II) alebo (III), kde azabenzimidazolová zlúčenina je vybraná zo skupiny tvorenej substituentmi SABI.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka farmaceutického preparátu tvoreného zlúčeninou, ktorá je špecifikovaná v predkladanom vynáleze, alebo jej soľou a fyziologicky prijateľným nosičom alebo diluentom.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka farmaceutického preparátu tvoreného zlúčeninou, ktorá má v predkladanom vynáleze štruktúru definovanú vzorcom (I), (II) alebo (III), alebo akoukoľvek z jej podskupín.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka farmaceutického preparátu, kde azabenzimidazolová zlúčenina je vybraná zo skupiny tvorenej zlúčeninami SABI.
Termín „farmaceutický preparát“ sa týka zmesi azabenzimidazolovej zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, s inými chemickými komponentmi, ako sú napríklad diluenty alebo nosiče. Farmaceutický preparát uľahčuje podanie zlúčeniny do organizmu. Existuje mnoho spôsobov podania zlúčeniny, vrátane podania perorálneho, injekčného, vo forme aerosólu, podania parenterálneho a topického. Farmaceutické preparáty sa môžu získať reakciou zlúčenín s anorganickými kyselinami, ako je napríklad kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina dusičná, kyselina fosforečná, kyselina metánsulfónová, kyselina etánsulfónová, kyselina p-toluénsulfónová, kyselina salicylová a podobne.
Termín „fyziologicky prijateľný“ definuje nosič alebo diluent, ktorý nenarúša biologickú aktivitu a vlastnosti zlúčeniny.
Termín „nosič“ definuje chemickú zlúčeninu, ktorá uľahčuje inkorporáciu zlúčeniny do buniek alebo tkanív. Bežne používaným nosičom je napríklad dimetylsulfoxid (DMSO), pretože uľahčuje vychytávanie mnohých organických zlúčenín do buniek alebo tkanív organizmu.
Termín „diluent“ definuje chemické zlúčeniny rozriedené vo vode, ktoré rozpúšťajú zlúčeninu, ktorá je predmetom záujmu, a súčasne stabilizujú biologicky aktívnu formu zlúčeniny. V odbore sa používajú soli rozpustené v tlmivých roztokoch. Jedným z bežne používaných tlmivých roztokov je fosfátový tlmivý roztok, pretože napodobňuje iónové podmienky v ľudskej krvi.
Pretože tlmivé roztoky kontrolujú pH roztoku pri nízkych koncentráciách, dochádza len zriedka k zmene biologickej aktivity zlúčeniny vplyvom tlmivého roztoku.
IV. Syntetické metódy, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu
V ďalšom aspekte sa vynález týka metódy syntézy azabenzimidazolovej zlúčeniny definovanej vzorcom (I), (II) alebo (III), Táto metóda je tvorená krokmi: a) reakcia 2-amino-6-chlór-3-nitropyridínu s druhým reaktantom v solvente, čo vedie k získaniu prvého medziproduktu, a kde druhý reaktant je substituovaný arylový kruh; b) redukcia prvého medziproduktu v prítomnosti katalyzátora a redukujúcej látky, čo vedie k získaniu druhého medziproduktu; c) reakcia druhého medziproduktu s tretím reaktantom; a d) purifikácia zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu.
V preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde substituovaným arylovým kruhom je substituovaný fenol, substituovaný tiofenol a substituovaný anilín.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde substituovaný substituovaný fenol, substituovaný tiofenol a substituovaný anilín sú vybrané zo skupiny tvorenej reaktantmi SABI.
Termín „reaktanty SABI“ sa týka skupiny reaktantov obsahujúcej sodné soli fenolu, 2-nitrofenolu, 3-nitrofenolu, 4-nitrofenolu, 2-chlórfenolu, 3-chlórfenolu, 4-chlórfenolu, 2-krezolu, 3-krezolu, 4-krezolu, 2-fluórfenolu, 3-flórfenolu, 4-fluórfcnolu, 2-(trifluórmetyl)fenolu, 3-(trifluórmetyl)fenolu, 4-(trifluórmetyl)fenolu, 2-metoxyfenolu, 3-metoxyfenou, 4-metoxyfenolu, kyseliny 2-hydroxybenzoovej, kyseliny 3-hydroxybenzoovej, kyseliny 4-hydroxybenzoovej, tiofenolu, 2-nitrotiofenolu, 3-nitrotiofenolu, 4-nitrotiofenolu, 2-chlórtiofenolu, 3-chlórtiofenolu, 4-chlórtiofenolu, 2-tiokrezolu, 3-tio-krezolu, 4-tiokrezolu, 2-fluórtiofenolu, 3-fluórtiofenolu, 4-fluórtiofenolu, 2-(trifluórmetyl)tiofenolu, 3-(trifluórmetyl)tiofenolu, 4-(trifluórmetyl)tiofenolu, 2-metoxybenzén-tiolu, 3-metoxybenzéntiolu, 4-metoxybenzéntiolu, kyseliny 2-merkaptobenzoovej, kyseliny 3-merkaptobenzoovej, kyseliny 4-merkaptobenzoovej, anilínu, 2-nitroanilínu, 3-nitroanilínu, 4-nitroanilínu, 2-chlór9 anilínu, 3-chlóranilínu, 4-chlóranilínu, 2-toluidínu, 3-toluidínu, 4-toluidínu, 2-fluóranilínu, 3-fluóranilínu, 4-fluóranilínu, 2-(trifluórmetyl)anilínu, 3-(trifluórmetyl)anilinu, 4-(trifluórmetyl)anilínu, 2-anizidínu, 3-anizidínu, 4-anizidínu, kyseliny 2-aminobenzoovej, kyseliny 3-aminobenzoovej a kyseliny 4-aminobenzoovej.
V preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde solventom je n-propanol.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde redukujúcou látkou je vodík.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde katalyzátorom je Raneyho nikel.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde tretím reaktantom je O-metylizotiourea.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde tretím reaktantom je produkt reakcie medzi S-metylizotiouróniumsulfátom a alkylchlórformiátom.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde alkylchlórformiátom je metylchlórformiát.
V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde alkylchlórformiátom je etylchlórformiát.
Opis predkladaného vynálezu uvedený skôr nie je limitujúci a z nasledovného opisu preferovaných foriem predkladaného vynálezu a z patentových nárokov budú zrejmé ďalšie rysy a výhody.
Opis preferovaných foriem predkladaného vynálezu
Časť predkladaného vynálezu je zameraná na metódy modulácie funkcie serínových/treonínových proteínkináz pomocou azabenzimidazolových zlúčenín. Navyše sa časť vynálezu týka metód identifikácie zlúčenín, ktoré tnodulujú funkciu serínových/treonínových proteínkináz. Metódy využívajú bunky, ktoré exprimujú serínové/treonínové proteínkinázy, ako je napríklad RAF.
RAF je non-receptorová proteínkináza, ktorá sa po naviazaní na RAS, enzým hydrolyzujúci guaníntrifosfát, premiestňuje na bunkovú membránu. RAS sa aktivuje po naviazaní aktivovanej receptorovej proteínovej tyrozínkinázy, ako je napríklad EGFR alebo PDGFR, na adaptorovú bielkovinu, GRB2 a guanínnukleotidový výmenný faktor SOS. SOS odstraňuje guaníndifosfát z RAS, nahrádza ho guaníntrifosfátom, a tým aktivuje RAS. RAS potom viaže RAF a následne ho aktivuje. RAF môže potom fosforylovať ďalšie proteíny na serínových a treonínových zvyškoch, ako je napríklad kináza MEK, ktorá fosforyluje a následne aktivuje mitogénom aktivovanú proteínkinázu (MAPK). RAF teda slúži ako intermediálny kontrolný faktor v mitogénmi aktivovanej signálovej transdukcii.
Vzhľadom na dôležitú regulačnú úlohu RAF v bunkách môžu zmeny aminokyselinovej sekvencie RAF narušiť jej funkciu a následne modifikovať správanie bunky. Úloha RAF v bunkovej proliferácii je zdôraznená pozorovaním asociácie výskytu nádorových ochorení s mutáciami v aminokyselinovej sekvencii RAF. Pretože mutácie RAF, ktoré mali za následok vznik nádorového ochorenia, viedli k tvorbe molekúl RAF, ktoré vykazovali neregulovanú katalytickú aktivitu, môžu inhibítory RAF zmierniť alebo dokonca zabrániť bunkovej proliferácii, ktorá vedie k nádorovému bujneniu v týchto bunkách.
Pomocou metód, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, sa môžu detegovať zlúčeniny, ktoré modulujú funkciu proteínkinázy RAF v bunkách. RAF fosforyluje proteínkinázu MEK, ktorá následne fosforyluje mitogénom aktivovanú proteínkinázu MAPK. Metódy, ktoré monitorujú len fosforyláciu MEK pomocou RAF, nie sú citlivé, pretože stupeň fosforylácic MEEK nie je významný. Aby sa prekonal tento problém, je monitorovaná v analýzach, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, fosforylácia MEK aj MAPK. Fosforylačný signál MAPK amplifikuje fosforylačný signál MEK a umožňuje sledovanie RAF-dependentnej fosforylácie pomocou enzýmovo viazanej imunosorpčnej analýzy (ELISA). Analýza, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, je navyše uskutočňovaná vysokokapacitne, čo umožňuje rýchle monitorovanie mnohých zlúčenín v krátkom časovom úseku.
Pomocou metód, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, boli identifikované zlúčeniny, ktoré inhibujú funkciu proteínkinázy RAF. Tieto zlúčeniny patria medzi azabenzimidazolové deriváty. Aj keď sa testovala schopnosť azabenzimidazolových derivátov inhibovať enzýmy syntetizujúce nukleotidy v baktériách, mnoho z týchto zlúčenín sa dôkladne nepreskúmalo s ohľadom na inhibíciu proteínkináz.
Pretože RAF vykazujú významnú aminokyselinovú homológiu s inými serínovými/treonínovými proteínkinázami, môžu pravdepodobne azabenzimidazolové zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, inhibovať aj iné serínové/treonínové proteínkinázy ako RAF, vrátane receptorových a non-receptorových serínových/treonínových proteínkináz.
Metódy, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, sa týkajú aj ďalších zlúčenín, ktoré modulujú funkciu RAF v bunkách, pretože opísané metódy umožňujú testovať veľké množstvo molekúl v krátkom časovom úseku. Z tohto dôvodu sa môžu pomocou metód, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, identifikovať molekuly neopísané v predkladanom vynáleze, ktoré modulujú funkciu STK.
I. Biologická aktivita azabenzimidazolových zlúčenín
Azabenzimidazolové zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, sa testovali na svoju schopnosť inhibovať funkcie proteínkinázy RAF. Biologické analýzy a výsledky týchto inhibičných štúdii sa tu uvádzajú. Metódy používané na meranie modulácie funkcie proteínkináz azabenzimidazolovými zlúčeninami sú s ohľadom na širokú použiteľnosť podobné tým, ktoré sú opísané v prihláške U.S. Application seriál No. 08/702232 Táng et al. nazvanej „Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease“ (Lyon a Lyon spis č. 221/187) zaregistrovanej 23. augusta 1996. Prihláška 08/702232 je v predkladanom vynáleze začlenená ako referencia v celom svojom rozsahu vrátane vyobrazení.
II. Cieľové ochorenia určené na liečbu azabenzimidazolovými zlúčeninami
Tu opísané metódy, zlúčeniny a farmaceutické preparáty sú navrhnuté na inhibíciu ochorení na podklade bun kovej proliferácie pomocou modulácie funkcie proteínkinázy RAF. Proliferačné ochorenia majú za následok nežiaducu bunkovú proliferáciu jednej alebo viacerých skupín buniek v multicelulámom organizme, čo vedie k jeho poškodeniu. Tu opísané metódy, zlúčeniny a farmaceutické preparáty môžu byť užitočné aj v liečbe a prevencii iných ochorení organizmu, ako sú napríklad choroby so vzťahom k predčasnému odumieraniu buniek (t. j. neurologické ochorenia) alebo zápaly. Tieto ochorenia môžu byť výsledkom nevhodnej funkcie molekúl RAF alebo nevhodnej funkcie proteínkinázových molekúl príbuzných s RAF.
Alterácia proteínkinázy RAF alebo proteínkinázových molekúl príbuzných s RAF môže viesť k zvýšeniu alebo zníženiu bunkovej proliferácie, ako je zrejmé pri určitých ochoreniach. Stavy s narušením bunkovej proliferácie zahŕňajú nádory, fibrotické ochorenia, mezangiálne choroby, abnormálnu angiognézu a vaskulogenézu, hojenie rán, psoriázu, restenózy a zápal.
Fibrotické ochorenia majú vzťah k abnormálnej tvorbe bunkovej extracelulámej matrici. Príkladom fibrotického ochorenia je pečeňová cirhóza. Pečeňová cirhóza je charakterizovaná zvýšenou koncentráciou zložiek extracelulárnej matrice vedúcou k zajazveniu tkaniva pečene. Pečeňová cirhóza môže spôsobiť ochorenie, ako je napríklad cirhóza pečene.
Poruchy proliferácie mezangiálnych buniek sa vyskytujú v dôsledku abnormálnej proliferácie mezangiálnych buniek. Tieto poruchy zahŕňajú rozličné ľudské choroby obličiek, ako sú napríklad glomerulonefritída, diabetická nefropatia, malígna nefroskleróza, trombotické mikroangiopatické syndrómy, rejekcia transplantátu a glomerulopatia.
Preferovanými typmi nádoru, ktoré môžu byť liečené pomocou metód a zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, sú pľúcne nádory, nádory vaječníkov, nádory prsníka, nádory mozgu, intraaxiálne mozgové nádory, nádory hrubého čreva, nádory prostaty, Kaposiho sarkómy, melanómy a gliómy. Dôkaz, že metódy a zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, môžu účinne zastaviť a zvrátiť proliferáciu nádorových buniek, je v predkladanom vynáleze zahrnutý ako referencia.
Angiogénne a vaskulogénne ochorenia vznikajú v dôsledku nadmernej proliferácie krvných ciev. Proliferácia krvných ciev je nevyhnutná pre celý rad normálnych fyziologických procesov, ako je napríklad embryonálny vývoj, utváranie corpus luteum, hojenie rán a regenerácia orgánov. Proliferácia krvných ciev je však nevyhnutná aj pre vývoj nádorov. Ďalšie príklady proliferačných ochorení zahŕňajú artritídu, kde novotvorené krvné cievy invadujú do kĺbu a ničia chrupavku. Proliferačné ochorenia krvných ciev navyše zahŕňajú choroby oka, ako je napríklad diabetická retinopatia, kde novotvorené kapiláry v sietnici invadujú do sklovca, krvácajú a spôsobujú slepotu. Na druhej strane ochorenie charakterizované zúžením, kontrakciou alebo uzavretím krvných ciev, ako sú napríklad restenózy, majú pôvod aj v chybnej regulácii proteínkináz.
Vaskulogenéza a angiogenéza sú okrem toho spojené s rastom malignych solídnych nádorov a metastáz. Rýchlo rastúce nádory vyžadujú zásobovanie krvou bohatou na živiny a kyslík, aby mohli pokračovať v raste. V dôsledku toho dochádza spolu s rastom nádoru k vzniku abnormálne veľkého množstva krvných kapilár, ktoré podporujú rast nádoru. Okrem zásobovania nádoru živinami, zaisťujú novotvorené krvné cievy v nádorovom tkanive bránu pre nádorové bunky na vstup do cirkulácie a na metastázovanie do vzdialených miest v organizme. Folkman, 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:4 - 6.
Nevhodná aktivita RAF môže stimulovať bunkovú proliferáciu a z nej vyplývajúce ochorenia. Dokázalo sa, že molekuly špecificky navrhnuté na moduláciu funkcie proteínkinázy RAF inhibujú bunkovú proliferáciu. Konkrétne ide o tzv. „antisense“ molekuly nukleových kyselín, ktoré viažu mRNA kódujúcu proteínkinázu RAF a blokujú tak transláciu. Pri týchto molekulách bolo dokázané, že účinne zabraňujú transformácii buniek A549 za podmienok in vitro. Monia et al., 1996, Náture Medicíne 2:688; táto referencia je týmto začlenená v celom svojom rozsahu do predkladaného vynálezu vrátane všetkých obrázkov a tabuliek. Bunky A549 sú ľudské malígne bunky.
Tieto „antisense“ štúdie zamerané proti RAF predkladajú dôkaz, že azabenzimidazolové molekuly, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu a ktoré modulujú funkciu proteínkinázy RAF, môžu zastaviť a pravdepodobne aj zvrátiť proliferáciu malignych buniek v organizme. Tieto azabenzimidazolové zlúčeniny sa môžu testovať pomocou metód in vitro, ktoré sú v predkladanom vynáleze uvedené ako príklad. Azabenzimidazolové zlúčeniny sa môžu okrem toho testovať na efekt na nádorové bunky za podmienok in vivo pomocou xenotransplantačných metód, ktoré sú v predkladanom vynáleze tiež uvedené ako príklad.
Existujú aspoň dve cesty nechcenej stimulácie bunkovej proliferácie konkrétneho typu buniek v dôsledku nevhodnej aktivity RAF: 1) priama stimulácia rastu konkrétnej bunky alebo 2) zvýšenie vaskularizácie konkrétnej oblasti, ako je napríklad nádorové tkanivo, čím dochádza k uľahčeniu rastu tkaniva.
Použitie predkladaného vynálezu je uľahčené po prvé identifikáciou, či je ochorenie na podklade bunkovej proliferácie spôsobené aktivitou RAF. Ak je také ochorenie identifikované, môžu sa pacienti postihnutí týmto ochorením identifikovať pomocou analýzy ich príznakov pomocou postupov, ktoré sú dobre známe lekárom alebo veterinárom vyznajúcim sa v odbore. Títo pacienti sa potom môžu liečiť tak, ako sa opisuje v predkladanom vynáleze.
Určenie, či je ochorenie na podklade bunkovej proliferácie spôsobené aktivitou RAF, sa môže uskutočniť po prvé určením aktivity RAF v bunkách alebo v špecifickej lokalizácii v tele pacienta. Napríklad v prípade nádorových buniek sa môže aktivita jednej alebo viacerých RAF porovnať medzi nádormi s normálnou alebo zvýšenou aktivitou RAF. Ak majú nádorové bunky rovnakú alebo vyššiu aktivitu, ako je aktivita pri nádorových ochoreniach vznikajúcich na podklade zvýšenej aktivity RAF, sú vhodnými kandidátmi na liečbu použitím opísaných RAF modulujúcich metód a zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu.
V prípade ochorenia na podklade bunkovej proliferácie, ktoré vznikajú v dôsledku nechcenej proliferácie nenádorových buniek, je aktivita RAF porovnaná s aktivitou vyskytujúcou sa v bežnej populácii (napríklad priemerná aktivita vyskytujúca sa v bežnej populácii ľudí alebo zvierat, okrem ľudí alebo zvierat trpiacich ochorením na podklade bunkovej proliferácie). Ak je nechcená porucha bunkovej proliferácie charakterizovaná vyššou aktivitou RAF, ako je aktivita vyskytujúca sa v bežnej populácii, ide o poruchu, ktorá je vhodným kandidátom na liečbu použitím opísaných RAF modulujúcich metód a zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu.
III. Farmaceutické preparáty a aplikácie azabenzimidazolových zlúčenín
Metódy prípravy farmaceutických preparátov obsahujúcich zlúčeniny, metódy určenia množstva zlúčenín, ktoré majú byť podané pacientovi, a spôsoby podania zlúčenín organizmu sú uvedené v patentovej prihláške U.S. Application Seriál No. 08/702232 autorov Táng et al., ktorá je nazvaná „Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease“ (Lyon a Lyon spis č. 221/187) zaregistrovaná 23. augusta 1996. Tieto metódy sú ďalej uvedené v medzinárodnom patente č. WO 96/22976 autorov Buzetti et al., ktorý je nazvaný „Hydrosoluble 3-Aryliden-2-Oxoinole Derivatives as Tyrosin Kinase Inhibitors“ a publikovaný L augusta 1996. Obidva dokumenty sú v predkladanom vynáleze začlenené ako referencia v celom svojom rozsahu vrátane vyobrazení. Osoby vyznajúce sa v odbore ocenia, že tento opis je aplikovateľný na predkladaný vynález a môže byť preň ľahko upravený.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Uvedené príklady nijako neobmedzujú predkladaný vynález a iba reprezentujú rozličné aspekty a rysy predkladaného vynálezu. Príklady opisujú metódy syntézy zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu a metódy merania efektu zlúčeniny na funkciu proteínkinázy RAF.
Bunky používané v metódach sú komerčne dostupné. Vektory nukleových kyselín vychytávané bunkami sú tiež komerčne dostupné a sekvencie génov rozličných proteínkináz sú ľahko dostupné v sekvenčných bankách. Preto osoba vyznajúca sa v odbore môže ľahko vytvoriť vhodných spôsobom bunkové línie pomocou komerčne dostupných buniek, komerčne dostupných vektorov nukleových kyselín a génov pre proteínkinázy použitím techník, ktoré sú ľahko dostupné osobám vyznajúcim sa v odbore.
Príklad 1: Postupy syntézy azabenzimidazoloých zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu
Predkladaný vynález bude teraz ilustrovaný pomocou nasledovných neobmedzujúcich príkladov, v ktorých, ak nie je uvedené inak:
(i) odparenie sa uskutočnilo v rotačnej odparke pod vákuom;
(ii) operácie sa uskutočnili pod atmosférou inertného plynu, ako je napríklad dusík;
(iii) vysokoúčinná kvapalinová chromatografla (HPLC) sa uskutočnila na sorbente Merck LiChrosorb RP-18 silika s reverznou fázou, ktorý bol získaný od spoločnosti E. Merck, Darmstadt, Nemecko;
(iv) výťažky sú uvedené len na ilustráciu a neznamenajú nutne najvyšší dosiahnuteľný výťažok;
(v) teploty topenia nie sú upravované a sú získané pomocou digitálneho zariadenia na určovanie teploty topenia HSW Mainz SG 2000;
(vi) Štruktúry všetkých zlúčenín, ktoré sú v predkladanom vynáleze charakterizované vzorcom (1), (II) a (III), sa potvrdili protónovou magnetickou rezonančnou spektroskopiou na spektrofotometri Bruker AMX500-NMR, ďalej pomocou elementárnej mikroanalýzy a v niektorých prípadoch pomocou hmotnostnej spektroskopie;
(vii) Čistota štruktúr sa určila pomocou tenkovrstvovej chromatografie (TLC) na silikagéli (Merck Silica Gel 60 F254) alebo pomocou HPLC; a (viii) Medziprodukty neboli všeobecne úplne charakterizované a ich čistota sa určila pomocou tenkovrstvovej chromatografie (TLC) alebo pomocou HPLC.
Syntetické postupy Zlúčenina A-90: 2-Metoxykarbonylamino-(6-fenylmerkapto-3H-imidazo[4,5-b]-pyridín
2-Amino-3-nitro-(6-fenylmerkapto)pyridín sa pripravil zohrievaním 2-amino-6-chlór-3-nitropyridínu (84,0 g, 0,484 mol) a tiofenolátu sodného (Fluka) (72,0 g, 0,545 mol) v 2-propanole (1500 ml) pod spätným chladičom počas 2 hodín. Po ochladení na izbovú teplotu sa suspenzia zriedila vodou (100 ml), tuhá látka sa zhromaždila vákuovou filtráciou, premyla vodou a 2-propanolom a vysušila pri teplote 50 °C vo vákuu, čo viedlo k vzniku 109,1 g (95 % výťažok) 2-amino-3-nitro-(6-fenylmerkapto)pyridín, teplota topenia 148 - 152 °C.
2,3-Diamino-(6-fenylmerkapto)pyridín sa pripravil hydrogenáciou 2-amino-3-nitro-(6-fenylmerkapto)pyridínu (107,1 g, 0,433 mol) pod tlakom približne 0,5 MPa H2 v prítomnosti 30 g Raneyho niklu v 1200 ml 2-propanolu pri teplote 70 °C. Po 4 hodinách (29,1 1 vodíka) sa reakčná zmes ochladila na teplotu 4 °C za kontinuálneho premiešavania. Precipitát sa pozbieral pomocou vákuovej filtrácie, premyl 2-propanolom a vysušil pri teplote 50 °C vo vákuu. Kombinované filtráty sa skoncentrovali za zníženého tlaku a prekryštali z 2-propanolu. Po premytí hydrogenačného zariadenia dvakrát 1000 ml THF, odparení za zníženého tlaku a prekryštalizovania z 2-propanolu sa precipitát pozbieral a vysušil pri teplote 50 °C vo vákuu, čo viedlo k vzniku 80,4 g (87,1% výťažok) 2,3-diamino-(6-fenylmerkapto) pyridínu, teplota topenia 119 -122 °C.
2-Metoxykarbonylamíno-(6-fenylmerkapto-3H-imidazo[4,5-b]-pyridín sa pripravil pridaním metylchlórformiátu (34 ml, 0,44 mol) po kvapkách k studenému roztoku (5 - 15 °C) S-metyluróniumsulfátu (53 g, 0,19 mol) (Aldrich) v 68 ml vody, zatiaľ čo sa teplota udržiavala pod 20 °C. Potom sa opatrne pridal hydroxid sodný (116 g, 25 % NaOH) a objavil sa biely precipitát. Po 20 minútach sa pridala voda (210 ml) a pH sa upravilo na hodnotu 4,0 pomocou ľadovej kyseliny octovej (34 ml). K tejto zmesi sa pridal po kvapkách roztok 2,3-diamino-(6-fenylmerkapto)pyridínu (37,8 g, 0,174 mol) v 210 ml etanolu a zmes sa zohrievala pri teplote 85 - 90 °C 2 hodiny. Po ochladení zmesi cez noc sa precipitát izoloval pomocou filtrácie, premyl vodou (1000 ml), vysušil a prekryštalizoval z kyseliny octovej a etanolu pri teplote 4 °C. Precipitát sa pozbieral filtráciou, premyl metanolom a vysušil pri teplote 50 °C vo vákuu, čo viedlo k získaniu 30 g ((57,4% výťažok) 2-metoxykarbonylamino-(6-fenylmerkapto-3H-imidazo[4,5-b]-pyridínu, teplota topenia 269 - 274 °C.
Zlúčenina A-3: 2-Metoxykarbonylamino-(6-fenoxy-3H-imidazo-[4,5 -bjpyridín
Substitúciou fenolátu sodného na miesto tiofenolátu sodného v príklade A-90 vedie totožný proces k vzniku 2-metoxykarbonylamino-(6-fenoxy-3H-imidazo[4,5-b]pyridínu, teplota topenia > 280 °C.
Zlúčenina A-4: 2-Etoxykarbonylamino-(6-fenoxy-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
Substitúciou etylchlórformiáu na miesto metylchlórformiátu v príklade A-3 vedie totožný proces k vzniku 2-etoxykarbonylamino-(6-fenoxy-3H-imidazo-[4,5-b]-pyridínu, teplota topenia > 280 °C.
Zlúčenina A-l: 2-Oxo-6-fenoxy-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
Reakciou O-metylizotiourey priamo s 2,3-diamino-6-(fenylmerkapto)pyridínom na miesto produktu reakcie S-metylizotiouróniumsulfátu a metylchlórformiátu v príklade A-3 vedie totožný proces k vzniku 2-oxo-6-fenoxy-3H-imidazo[4,5-b]pyridínu, teplota topenia 277 - 278 °C.
Zlúčenina A-2: 2-Oxo-6-fenylmerkapto-3H-imidazo[4,5-b]-pyridín
Substitúciou tiofenolátu sodného na miesto fenolátu sodného v príklade A-l vedie totožný proces k vzniku 2-oxo-6-fenylmerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pyridínu, teplota topenia 253 - 254 °C.
Zlúčenina A-5 až A-25:
Substitúciou príslušného fenolátu za fenolát sodný v príklade A-l vedie totožný proces k vzniku nasledujúcich príkladov. Napríklad pri zlúčeninách A-23, A-24 a A-25 sú karboxyskupiny chránené metylom, etylom, bcnzylom, terc-butylom alebo inými vhodnými estermi a potom sa z týchto zlúčenín tieto chrániace skupiny v poslednom kroku odstránia, čo vedie k vzniku zlúčenín.
A-5 2-Oxo-6-(2-nitrofenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-6 2-Oxo-6-(3-nitrofenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-7 2-Oxo-6-(4-nitrofenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-8 2-Oxo-6-(2-chlórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-9 2-Oxo-6-(3-chlórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-10 2-Oxo-6-(4-chlórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-l 1 2-Oxo-6-(2-metylfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-12 2-Oxo-6-(3-metylfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-13 2-Oxo-6-(4-metylfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-14 2-Oxo-6-(2-fluórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-15 2-Oxo-6-(3-fluórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-16 2-Oxo-6-(4-fluórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-15 2-Oxo-6-[(2-trifluórmetyl)fenoxy]-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
A-16 2-Oxo-6-[(3-trifluórmetyl)fenoxy]-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
A-l 7 2-Oxo-6-[(4-trifluórmetyl)fenoxy]-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
A-l8 2-Oxo-6-(2-metoxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-19 2-Oxo-6-(3-metoxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-20 2-Oxo-6-(4-metoxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
A-23 2-Oxo-6-(2-karboxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-24 2-Oxo-6-(3-karboxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-25 2-Oxo-6-(4-karboxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
Zlúčenina A-26 až A-46:
Substitúciou príslušného tiofenolátu za tiofenolát sodný v príklade A-2 vedie totožný proces k vzniku nasledujúcich príkladov. Napríklad pri zlúčeninách A-44, A-45 a A-46 sú karboxyskupiny chránené metylom, etylom, benzylom, terc-butylom alebo inými vhodnými estermi a potom sa z týchto zlúčenín tieto chrániace skupiny v poslednom kroku odstránia, čo vedie k vzniku zlúčenín.
A-26 2-Oxo-6-(2-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-27 2-Oxo-6-(3-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-28 2-Oxo-6-(4-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-29 2-Oxo-6-(2-chlórfenylmerkapto)-3H-imidazo [4,5-b]pyridín
A-30 2-Oxo-6-(3-chlórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-31 2-Oxo-6-(4-chlórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-32 2-Oxo-6-(2-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-bJpyridín
A-33 2-Oxo-6-(3-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-34 2-Oxo-6-(4-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-35 2-Oxo-6-(2-fluórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-36 2-Oxo-6-(3-fluórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-37 2-Oxo-6-(4-fluórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-3 8 2-Oxo-6-[(2-trifluórmetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-39 2-Oxo-6-[(3-trifluórmetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-40 2-Oxo-6-[(4-trifluórmetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
A-41 2-Oxo-6-(2-metoxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
A-42 2-Oxo-6-(3-metoxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
A-43 2-Oxo-6-(4-metoxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-bjpyridin
A-44 2-Oxo-6-(2-karboxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
A-45 2-Oxo-6-(3-karboxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
A-4 6 2-Oxo-6-(4-karboxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
Zlúčenina A-47 až A-68:
Substitúciou príslušnej anilinovej soli za fenolát sodný v príklade A-l vedie totožný proces k vzniku nasledujúcich príkladov. Napríklad v zlúčeninách A-66, A-67 a A-68 sú karboxyskupiny chránené metylom, etylom, benzylom, terc-butylom alebo inými vhodnými estermi a potom sa z týchto zlúčenín tieto chrániace skupiny v poslednom kroku odstránia, čo vedie k vzniku zlúčenín.
A-47 2-Oxo-6-fenylamino-3H-imidazo[4,5-b]pyridín A-48 2-Oxo-6-(2-nitrofenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-49 2-Oxo-6-(3-nitrofenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-50 2-Oxo-6-(4-nitrofenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-51 2-Oxo-6-(2-chlórfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-52 2-Oxo-6-(3-chlórfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-53 2-Oxo-6-(4-chlórfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-54 2-Oxo-6-(2-metylfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-55 2-Oxo-6-(3-metylfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-56 2-Oxo-6-(4-metylfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-57 2-Oxo-6-(2-fluórfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-58 2-Oxo-6-(3-fluórfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-59 2-Oxo-6-(4-fluórfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-60 2-Oxo-6-[(2-trifluórmetyl)fenylamino]-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-61 2-Oxo-6-[(3-trifluórmetyl)fenylamino]-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-62 2-Oxo-6-[(4-trifluórmetyl)fenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-63 2-Oxo-6-(2-metoxyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-64 2-Oxo-6-(3-metoxyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-65 2-Oxo-6-(4-metoxyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-66 2-Oxo-6-(2-karboxyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-bJpyridín
A-67 2-Oxo-6-(3-karboxyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-68 2-Oxo-6-(4-karboxyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
Zlúčenina A-69 až A-89:
Substitúciou príslušného fenolátu za fenolát sodný v príklade A-3 vedie totožný proces k vzniku nasledujúcich príkladov. Napríklad pri zlúčeninách A-87, A-88 a A-89 sú karboxyskupiny chránené metylom, etylom, benzylom, terc-butylom alebo inými vhodnými cstermi a potom sa z týchto zlúčenín tieto chrániace skupiny v poslednom kroku odstránia, čo vedie k vzniku zlúčenín.
A-69 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-nitrofenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-70 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-nitrofenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-71 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-nitrofenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-72 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-chlórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-73 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-chlórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-74 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-chlórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-75 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-metylfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-7 6 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-metylfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-77 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-metylfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-78 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-fluórfenoxy)-3H-imidazo [4,5 -bjpyrid ín
A-79 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-fluórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-80 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-fluórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-81 2-Metoxykarbonylamino-6-[(2-trifluórmetyl)fenoxyj-3 H-imidazo [4,5 -bjpyridín
A-82 2-Metoxykarbonylamino-6-[(3-trifluórmetyl)fenoxyj-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-83 2-Metoxykarbonylamino-6-[(4-trifluórmetyl)fenoxyj-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-84 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-metoxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-85 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-metoxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
A-86 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-metoxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-87 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-karboxyfenoxy)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-88 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-karboxyfenoxy)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-89 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-karboxyfenoxy)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
Zlúčenina A-91 až A-l 11
Substitúciou príslušného tiofeholátu za tiofenolát sodný v príklade A-90 vedie totožný proces k vzniku nasledujúcich príkladov. Napríklad pri zlúčeninách A-109, A-l 10 a A-l 11 sú karboxyskupiny chránené metylom, etylom, benzylom, terc-butylom alebo inými vhodnými cstermi a potom sa z týchto zlúčenín tieto chrániace skupiny v poslednom kroku odstránia, čo vedie k vzniku zlúčenín.
A-91 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-92 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo-[4,5-bjpyridín
A-93 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-94 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-chlórfenylmerkapto)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-95 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-chlórfenylmerkapto)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-96 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-chlórfenylmerkapto)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-97 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo- [4,5 -bjpyridín
A-9 8 2-Metoxykarbonylamino-6-(3 -metylfenylmerkapto)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-99 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-100 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-fluórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-101 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-fluórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-102 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-fluórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-103 2-Metoxykarbonylamino-6-[(2-trífluórmetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-104 2-Metoxykarbonylamino-6-[(3-triíluórmetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-l 05 2-Metoxykarbonylamino-6-[(4-trifluórmetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-106 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-metoxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-107 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-metoxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-l08 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-metoxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-109 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-karboxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-l 10 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-karboxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-ll 1 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-karboxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
Zlúčenina A-112 až A-13 3
Substitúciou príslušnej anilinovej soli za fenolát sodný v príklade A-3 vedie totožný proces k vzniku nasledujúcich príkladov. Napríklad v zlúčeninách A-l31, A-132 a A-133 sú karboxyskupiny chránené metylom, etylom, benzylom, terc-butylom alebo inými vhodnými estermi a potom sa z týchto zlúčenín tieto chrániace skupiny v poslednom kroku odstránia, čo vedie k vzniku zlúčenín.
A-l 12 2-Metoxykarbonylamino-6-fenylamino-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-l 13 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-nitrofenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-l 14 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-nitrofenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-l 15 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-nitrofenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-l 16 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-chlórfenylamino)-3H-imidazo-[4,5 -b] pyr id í n
A-l 17 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-chlórfenylamino)-3H-imidazo-[4,5 -b]pyridín
A-l 18 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-chlórfenylamino)-3H-imidazo-[4,5 -b]pyridín
A-l 19 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-metylfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-120 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-metylfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-121 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-metylfenylamino)-3 H-imidazo-[4,5 -bjpyridin
A-122 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-fluórfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-l23 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-fluórfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-124 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-fluórfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-125 2-Metoxykarbonylamino-6-[(2-trifluórmetyl)-fenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
A-126 2-Metoxykarbonylamino-6-[(3 -trifluórmetyl)-fenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-127 2-Metoxykarbonylamino-6-[(4-trifluórmetyl)-fenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-12 8 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-metoxyfenylamino)-3H-imidazo[4,5 -b] pyridín
A-129 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-metoxyfenylamino)-3 H-imidazo[4,5 -bjpyridin
A-130 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-metoxyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-131 2-Metoxykarbonylamino-6-(2-karboxyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
A-132 2-Metoxykarbonylamino-6-(3-karboxyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
A-133 2-Metoxykarbonylamino-6-(4-karboxyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin
Zlúčenina A-134 až A-154
Substitúciou príslušného fenolátu za fenolát sodný v príklade A-4 vedie totožný proces k vzniku nasledujúcich príkladov. Napríklad pri zlúčeninách A-152, A-153 a A
-154 sú karboxyskupiny chránené metylom, etylom, benzylom, terc-butylom alebo inými vhodnými estermi a potom sa z týchto zlúčenín tieto chrániace skupiny v poslednom kroku odstránia, čo vedie k vzniku zlúčenín.
A-134 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-nitrofenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-135 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-nitrofenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-136 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-nitrofenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-137 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-chlórfenoxy)-3H-imidazo [4,5 -bjpyridin
A-138 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-chlórfenoxy)-3H-imidazo [4,5-bjpyridin
A-139 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-chlórfenoxý)-3H-imidazo [4,5-bjpyridin
A-140 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-metylfenoxy)-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
A-141 2-Etoxykarbonylamino-6-(3 -metylfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-142 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-metylfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-143 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-fluórfenoxy)-3 H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-144 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-fluórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-145 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-fluórfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-146 2-Etoxykarbonylamino-6-[(2-trifluórmetyl)fenoxyj-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
A-147 2-Etoxykarbonylamino-6-[(3-trifluórmetyl)fenoxyj-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-148 2-Etoxykarbonylamino-6-[(4-trifluórmetyl)fenoxyj-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-149 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-metoxyfenoxy)-3 H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-150 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-metoxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyrídín
A-151 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-metoxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-152 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-karboxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-153 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-karboxyfenoxy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-154 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-karboxyfenoxy)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
Zlúčenina A-155 až A-176
Substitúciou príslušného tiofenolátu za fenolát sodný v príklade A-4 vedie totožný proces k vzniku nasledujúcich príkladov. Napríklad pri zlúčeninách A-174, A-175 a A-176 sú karboxyskupiny chránené metylom, etylom, benzylom, terc-butylom alebo inými vhodnými estermi a potom sa z týchto zlúčenín tieto chrániace skupiny v poslednom kroku odstránia, čo vedie k vzniku zlúčenín.
A-155 2-Etoxykarbonylamino-6-fenylmerkapto-3H-imidazo [4,5-bjpyridin
A-156 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-157 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-158 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-159 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-chlórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-160 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-chlórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-161 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-chlórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-162 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-163 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5 -bjpyridín
A-164 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-bjpyridín
A-165 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-fluórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-166 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-fluÓTfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-167 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-fluórfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-168 2-Etoxykarbonylamino-6-[(2-trifluórmetyl)fenylmcrkapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-169 2-Etoxykarbonylamino-6-[(3-trifluórmetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-170 2-Etoxykarbonylamino-6-[(4-trifluórmetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-171 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-metoxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyndín
A-172 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-metoxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-173 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-metoxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-174 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-karboxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-175 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-karboxyfcnylmcrkapto)-3 H-imidazo[4,5-b]pyridin
A-176 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-karboxyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
Zlúčenina A-177 až A-198
Substitúciou príslušnej anilínovej soli za fenolát sodný v príklade A-4 vedie totožný proces k vzniku nasledujúcich príkladov. Napríklad v zlúčeninách A-19Ž, A-197 a A-198 sú karboxyskupiny chránené metylom, etylom, benzylom, terc-butylom alebo inými vhodnými estermi a potom sa z týchto zlúčenín tieto chrániace skupiny v poslednom kroku odstránia, čo vedie k vzniku zlúčenín.
A-177 2-Etoxykarbonylamino-6-fenylamino-3H-imidazo-[4,5-bjpyridín
A-178 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-nitrofenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-179 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-nitrofenylamíno)-3H-imidazo-[4,5 -bjpyridin
A-180 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-nitrofenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-181 2-Etoxykaibonylamino-6-(2-chlórfenylamino)-3H-imidazo-[4,5 -bjpyridin
A-182 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-chlórfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridin
A-183 2-Étoxykarbonylamino-6-(4-chlórfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-184 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-metylfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-185 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-metylfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-18 6 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-metylfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-187 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-fluórfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-188 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-fluórfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-189 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-fluórfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-190 2-Etoxykarbonylamino-6-[(2-trifluórmetyl)fenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-191 2-Etoxykarbonylamino-6-[(3-trifluórmetyl)fenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-192 2-Etoxykarbonylamino-6-[(4-trifluórmetyl)fenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridín
A-193 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-metoxyfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-194 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-mctoxyfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-195 2-EtoxykarbonyIamino-6-(4-metoxyfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-196 2-Etoxykarbonylamino-6-(2-karboxyfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridin
A-197 2-Etoxykarbonylamino-6-(3-karboxyfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
A-198 2-Etoxykarbonylamino-6-(4-karboxyfenylamino)-3H-imidazo-[4,5-b]pyridín
Príklad 2: Stanovenie fosforylačnej funkcie RAF
Nasledovná metóda zaznamenáva stupeň fosforylácie cieľového proteínu MEK, ako aj cieľa proteínu MEK, proteínu MAPK, katalyzovanej pomocou RAF. Sekvencia génu pre RAF je opísaná v publikácii autorov Bonner et al., 1985, Molec. Celí. Biol. 5: 1400 -1407 a je ľahko dostupná v databankách génových sekvencii. Konštrukcia vektora nukleovej kyseliny a použitých bunkových línií využívaných v predkladanom vynáleze je úplne opísaná v publikácii autorov Morrison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 855 - 8859.
Materiál a reagencie
1. Bunky Sf9 (Spodopiera frugiperda)·, G1BCO-BRL, Gaithersburg, MD.
2. Tlmivý roztok RIPA: 20 mM Tris/HCl pH 7,4, 137 mM NaCl, 10 % glycerol, 1 mM PMSF, 5 mg/1 aprotenínu, 0,5%Tritonu X-100;
3. Tioredoxín-MEK fúzny protein (T-MEK): Expresia T-MEK a purifikácia afmitnou chromatografiou sa uskutočnila podľa postupov podľa výrobcu. Katalógové č. K 350-01 a R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.
4. His-ΜΑΡΚ (EERK 2j; MAPK s histidinovou kotvou sa exprimovala v XL1 Blue cells transformovaných vektorom pUC18 kódujúcim His-MAPK. His-ΜΑΡΚ sa purifikovala Ni-afinitnou chromatografiou. Katalógové č. 27-4949-01, Farmácie. Alameda, Kalifornia, ako sa opisuje v predkladanom vynáleze.
5. Ovčí antimyší IgG: Jackson Laboratories, West Grove, PA, Katalógové č. 515-006-008, šarža 28563
6. Špecifická protilátka proti proteínkináze RAF-1: URP2653 od UBI.
7. Poťahovací tlmivý roztok: PBS; fosfátový tlmivý roztok, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.
8. Premývací tlmivý roztok: TBST - 50 mM tris/HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100.
9. Blokujúci tlmivý roztok: TBST, 0,1 % etanolamín pH 7,4.
10. DMSO, Sigma, St. Louis, Mo.
11. Kinázový tlmivý roztok (KB): 20 mM Hepes/HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1 % triton X-100, 1 mM PMSF, 5 mg/1 aprotenínu, 75 mM ortovanadátu sodného, 0,5 MM DTT a 10 mM MgCl2.
SK 285357 Β6
12. Zmes ATP: 100 mM MgCl2, 300 mM ATP, 10 nCi g33P ATP (Dupont-NEN)/ml.
13. Zastavujúci roztok: 1 % kyselina fosforečná; Fisher, Pitsburgh, PA.
14. Celulózové filtre Wallac; Wallac, Turku, Fínsko.
15. Filtrovací premývaci roztok: 1 % kyselina fosforečná; Fisher, Pitsburgh, P A.
16. Platničkový harvester Tomtec, Wallac, Turku, Fínsko.
17. Wallac beta platničkový reader, Wallac, Turku, Fínsko.
18. Polypropylénové platničky NUNC s 96 jamkami s dnom v tvare písmena V, Applied Scientific, katalógové č. AS-72092
Postup
Všetky nasledovné kroky sa uskutočňovali pri izbovej teplote, pokiaľ nie je uvedené inak.
1. Potiahnutie platničky ELISA: Jamky ELISA sa potiahnú cez noc pri teplote 4 °C pomocou 100 mL ovčieho antimyšieho afinitne purifikovaného antiséra (1 mg/100 ml poťahovacieho tlmivého roztoku). Platničky ELISA sa môžu použiť 2 týždne, pokiaľ sa skladujú pri teplote 4 °C.
2. Platničku obráťte a odstráňte tekutú zložku. Pridajte 100 ml blokujúceho roztoku a inkubujte 30 minút.
3. Odstráňte blokujúci roztok a premyte 4-krát pomocou premývacieho tlmivého roztoku. Položte platničku na papierový obrúsok na odstránenie nadbytku tekutiny.
4. Pridajte do každej jamky 1 mg špecifickej protilátky proti RAF-1 a inkubujte 1 hodinu. Premyte tak, ako sa opisuje v kroku 3.
5. Rozmrazte lyzáty z RAS/RAF infikovaných Sf9 buniek a zried’te ich pomocou TBST na 10 mg/100 ml. Pridajte 10 mg zriedeného lyzátu do jamiek a inkubujte 1 hodinu. Pretrepávajte platničku počas inkubácie. Negatívne kontroly neobsahujú žiadny lyzát. Lyzáty z RAS/RAF infikovaných Sf9 hmyzích buniek sú pripravené po infikácii buniek rekombinantnými bakulovirusmi pri MOI 5 pre každý vírus a pozbierané o 48 hodín neskôr. Bunky sa raz premyjú pomocou PBS a lyžujú v tlmivom roztoku RIPA. Nerozpustný materiál sa odstráni centrifugovaním (5 minút pri 10000 g). Alikvóty lyzátov sa zamrazia v suchom ľade/etanole a uskladnia pri teplote -80 °C až do použitia.
6. Odstráňte nenaviazaný materiál a premyte tak, ako sa opisuje (krok 3).
7. Pridajte 2 mg T-MEK a 2 mg His-MAEPK na jamku a upravte objem na 40 ml pomocou kinázového tlmivého roztoku. Metódy purifikácie T-MEK a MAPK z bunkových extraktov sa tu uvádzajú vo forme príkladov.
8. Prcdricd’tc zlúčeniny (zásobný roztok 10 mg/ml DMSO) alebo extrakty 20-krát v TBST plus 1 % DMSO. Pridajte 5 ml predriedených zlúčenin/extraktov do jamiek opísaných v kroku 6. Inkubujte 20 minút. Kontroly neobsahujú žiadny liek.
9. Začnite kinázovú reakciu pridaním 5 ml zmesi ATP. Premiešavajte platničky v priebehu inkubácie na platničkovej pretrepávačke ELISA.
10. Začnite kinázovú reakciu po 60 minútach pridaním 30 ml zastavovacicho roztoku do každej jamky.
1L Umiestnite fosfocelulózový filter a platničku ELISA do platničkového harvestera Tomtec. Zoberte a premyte filter premývacím roztokom podľa odporučenia výrobcu. Vysušte filtre. Utesnite filtre a umiestnite ich do držiaka. Vložte držiak do zariadenia na detekciu rádioaktivity a kvantifikujte rádioaktívny fosfor na filtroch.
Alternatívne sa môžu preniesť 40 ml alikvóty z jednotlivých jamiek platničky do korešpondujúcich polôh na fos focelulózovom filtri. Po vysušení filtra vzduchom položte filtre na misku. Jemne misku premiešavajte a vymieňajte premývaci roztok v 15-minútových intervaloch 1 hodinu. Vysušte filtre vzduchom. Utesnite filtre a umiestnite ich do držiaka vhodného na meranie rádioaktívneho fosforu vo vzorkách. Vložte držiak do zariadenia na detekciu rádioaktivity a kvantifikujte rádioaktívny fosfor na filtroch.
Hodnoty IC50 sa merali podľa protokolu pre nasledovné azabenzimidazolové zlúčeniny v RAF-1 analýze ELISA:
(A—90)
H
Hodnota IC50 je koncentrácia azabenzimidazolového inhibítora požadovaného na zníženie maximálneho množstva fosforylovaného cieľového proteínu alebo bunkového rastu o 50 %. Hodnoty IC50 merané v RAF-1 fosforylačnej analýze sú uvedené v tabuľke 1.
Tabuľka 1
Zlúčenina IC50 (uM)
A-l 79
A-2 >100
A-3 6,1
A-4 6,7
A-90 0, 95
Príklad 3: Purifíkácia MAPK a MEK
Proteíny MAPK a MEK sa ľahko exprimujú v bunkách pomocou subklonovania génu kódujúceho tieto proteíny do komerčne dostupného vektora, ktorý exprimuje proteíny s polyhistidínovou kotvou. Gény kódujúce tieto proteíny sú ľahko dostupné v laboratóriách, ktoré normálne pracujú s týmito proteínmi alebo pomocou klonovania týchto génov z buniek obsahujúcich knižnice cDNA. Knižnice sú ľahko dostupné a osoba vyznajúca sa v odbore môže ľahko pripraviť próby nukleových kyselín homológnych k cDNA molekúl kódujúcich MEK alebo MAPK zo sekvencií nukleových kyselín MEK a MAPK dostupných v databázach génov, ako je napríklad Genbank. Klonovanie génu sa môže dosiahnuť v krátkom časovom úseku použitím techník bežne dostupných osobám skúseným sa v odbore.
Purifíkácia proteinov MEK a MAPK z bunkových extraktov sa môže uskutočniť použitím nasledovného protokolu, ktorý je upravený podľa Robbinsa et ak, 1993, J. Biol. Chem. 268:5097 -5106:
1. Uskutočnite lýzu buniek pomocou sonikácie, osmotického stresu alebo prešu French pomocou technik dostupných osobám vyznajúcim sa v odbore. Vhodný sonikačný tlmivý roztok je uvedený nižšie.
2. Ekvilibrujte pevnú matricu, ktorá je konjugovaná s niklom alebo kobaltom ekvilibračným tlmivým roztokom uvedeným nižšie. Polyhistidinová kotva sa špecificky viaže na atómy niklu a kobaltu na pevnej matrici. Ekvilibrácia sa môže dosiahnuť premytím živice trikrát ekvilibračným tlmivým roztokom s objemom rovnajúcim sa 10 objemom pevnej matrice. Pevná matrica je ľahko dostupná osobám vyznajúcim sa v odbore.
3. Pridajte bunkový lyzát k pevnej matrici a ekvilibrujte v nádobe určitý čas. Alternatívne sa môže pevná matrica naplniť do chromatografickej kolóny a lyzát sa môže naliať na kolónu obsahujúcu pevnú matricu.
4. Premyte pevnú matricu premývacím tlmivým roztokom uvedeným nižšie.
5. Uskutočnite elúciu proteínu MEK a MAPK z pevnej matrice elučným tlmivým roztokom (uvedený nižšie), ktorým odstránite významnú časť proteínu z pevnej matrice.
Sonikačný tlmivý roztok mM fosfát sodný, pH 8,0 0,3 M chlorid sodný mM β-merkaptoetanol % NP40 lOmMNaF 0,5 mM Pefablock
Ekvilibračný tlmivý roztok mM fosfát sodný, pH 8,0 0,3 M chlorid sodný mM β-merkaptoetanol % NP40 lOmMNaF 1 mM imidazol
Premývací tlmivý roztok mM fosfát sodný, pH 8,0 0,3 M chlorid sodný mM β-merkaptoetanol % NP40 lOmMNaF 1 mM imidazol
Elučný tlmivý roztok mM fosfát sodný, pH 8,0
0,3 M chlorid sodný lOmM β-merkaptoetanol % NP40 lOmMNaF 10-500 mM imidazol
Príklad 4: Stanovenie fosforylačnej funkcie RAF EGF receptora
Aktivita EGF receptorovej kinázy (EGFR-NIH3T3 analýza) sa merala v celých bunkách, ako sa opisuje detailne v PCT publikácii WO9640116, zaregistrovanej 5. júna 1996 autormi Táng et al., ktorá je nazvaná „Indolinone Compounds for the Treatment of Disease“ a ktorá je v predkladanom vynáleze začlenená ako referencia v celom svojom rozsahu vrátane vyobrazení.
Hodnoty IC50 merané v analýze na EGF receptorovú fosforyláciu sú uvedené v tabuľke 2.
Tabuľka 2
Zlúčenina IC50 (uM)
A-l >100
A-2 >100
A-3 >100
A-4 >100
Príklad 5: Stanovenie efektu azabenzimidazolových zlúčenín na rast buniek exprimujúcich Ras
Nasledovná metóda meria stupeň rastu buniek NIH-3T3 exprimujúcich RAS. Účelom metódy je určenie účinkov zlúčenín na rast buniek NIH-3T3 exprimujúcich H-Ras.
Materiál
96-jamkové sterilné platničky s plochým dnom
96-jamkové sterilné platničky s guľatým dnom sterilná 25 ml alebo 100 ml nádoba pipety, viackanálová pipeta sterilné pipetové špičky sterilné 15 ml a 50 ml skúmavky
Reagencie
0,4 % SRB v 1 % kyseline octovej mM Tris zásada % TCA % kyselina octová sterilný DMSO (Sigma) zlúčenina v DMSO (100 mM alebo slabší zásobný roztok) Trypsin-EDTA (GIBCO BRL)
Bunková línia
3T3/H-Ras (NIH 3T3 kloň 7 buniek exprimujúcich genomický fragment onkogénneho H-Ras)
Bunky sa môžu pripraviť použitím nasledovného protokolu:
1. Subklonujte fragment génu kódujúci Ras do komerčne dostupného vektora, ktorý bude stabilne transfekovať NIH3T3 bunky. Fragment je z genomickej transformujúcej alely cHa-ras.
2. Transfekujte NIH-3T3 bunky subklonovanýcm vektorom pomocou metódy s kalciumfosfátom. Vyberte bunky exprimujúce konštrukt Ras v 2 % sére v DMEM. Po dvoch týždňoch sa pozorujú viditeľné ložiská. Vytvorte pool transformovaných buniek, aby ste získali stabilne transformovanú bunkovú líniu.
Rastové médium % teľacie sérum/DMEM + 2mM glutamín, Pen/Strep
Protokol
Deň 0: Umiestnenie buniek
Táto časť metódy sa uskutočňuje v boxe s laminámym prúdením.
1. Trypsinizujte bunky. Preneste 200 ml bunkovej suspenzie k 10 ml izotonického roztoku. Spočítajte bunky pomocou pristroja Coulter Counter.
2. Naried’te bunky v rastovom médiu na 60 000 buniek/ml. Preneste 100 ml buniek do každej jamky v 96-jamkovej platničke s plochým dnom, aby v každej jamke bolo 6000 buniek.
3. Použite polovicu platničky (4 rady) pre každú zlúčeninu a pracujte v kvadruplete pre každú koncentráciu zlúčeniny. Pre kontrolné médium použite 4 jamky.
4. Platničky jemne premiešajte, aby došlo k jednotnému prichyteniu buniek.
5. Inkubujte platničky pri teplote 37 °C v inkubátore s 10 % CO2.
Deň 1: Pridanie zlúčeniny
Táto časť metódy sa uskutočňuje v boxe s laminámym prúdením.
1. Do 96-jamkovej platničky s plochými dnami pridajte 120 ml rastového média obsahujúceho 2x najvyššiu finálnu koncentráciu DMSO, ktorá sa našla pri skríningu koncentrácii zlúčenín v stĺpcoch 1 až 11. Napríklad, ak je najvyššia koncentrácia 100 ml a taje pripravená zo 100 mM zásobného roztoku, lx DMSO je 0,1 % a 2x DMSO je 0,2 %. Táto platnička sa použije na titrovanie zlúčeniny, 4 rady na jednu zlúčeninu.
2. V sterilnej 15 ml skúmavke pripravte 2x roztok s najvyššou skriningovou koncentráciou zlúčeniny v rastovom médiu plus 2x DMSO. Treba 1 ml na bunkovú líniu. Východisková koncentrácia zlúčeniny je obvykle 100 mM, ale táto koncentrácia sa môže líšiť v závislosti od solubility zlúčeniny.
3. Preneste v kvadruplete 240 ml 2x roztoku východiskovej zlúčeniny do jamiek v stĺpci 12 v 96-jamkovej platničke s guľatými dnami. Uskutočnite sériu riedení 1 : 2 v celej platničke sprava doľava prenesením 12 ml zo stĺpca 12 do stĺpca 11, zo stĺpca 11 do stĺpca 10 atď. až k stĺpcu 2. Preneste 100 ml zlúčeniny a 100 ml média do stĺpca 1, na 100 ml média na bunky v korešpondujúcich jamkách 96-jamkovej platničky s plochými dnami. Celkový objem na jamku by mal byť 200 ml.
4. Vráťte platničku do inkubátora a inkubujte 3 dni.
Deň 4: Vyvinutie analýzy
Táto časť analýzy sa uskutočňuje na laboratórnom stole.
1. Ašpirujte alebo vylejte médium. Pridajte 200 ml 10 % studenej TCA do každej jamky, aby ste zafixovali bunky. Inkubujte platničku aspoň 60 minút pri teplote 4 °C.
2. Odstráňte TCA a premyte jamky 5-krát tečúcou vodou. Vysušte platničky hlavou nahor na papierových obrúskoch.
3. Farbite bunky pomocou 100 ml 0,4 % SRB na jamku 10 minút.
4. Vylejte SRB a premyte jamky 5-krát pomocou 1 % kyseliny octovej. Vysušte kompletne platničky hlavou nahor na papierových obrúskoch.
5. Solubilizujte farbivo pomocou 100 ml 10 mM zásady Tris 5 až 10 minút na pretrepávačke.
6. Odčítajte platničky v zariadení Dynatech ELISA Plate Reader pri vlnovej dĺžke 570 nm s referenciou pri 630 nm.
Vybrané zlúčeniny inhibovali rast buniek overexprimujúcich RAS, ako sa ilustruje v tabuľke 3.
Zlúčenina IC50 (uM) RAS/NIH3T3
A-3 40
A-4 20
Príklad 6: Stanovenie efektu azabenzimidazolových zlúčenín na rast buniek A549
Nasledovná metóda meria stupeň rastu buniek A54 9. Účelom metódy je určenie účinkov zlúčenín na rast buniek A549 ľudského karcinómu pľúc. Bunky A54 9 sú dostupné z komerčných zdrojov, ako je napríklad ATCC (CCL185).
Materiál
96-jamkové sterilné platničky s plochým dnom
96-jamkové sterilné platničky s guľatým dnom sterilná 25 ml alebo 100 ml nádoba pipety, viackanálová pipeta sterilné pipetové špičky sterilné 15 ml a 50 ml skúmavky
Reagencie
0,4 % SRB v 1 % kyseline octovej mM Tris zásada
10% TCA % kyselina octová sterilný DMSO (Sigma) zlúčenina v DMSO (100 mM alebo slabší zásobný roztok) Trypsín-EDTA (GIBCO BRL)
Bunková línia
Bunky A549 ľudského karcinómu pľúc (ATCC CCL185).
% fetálne teľacie sérum v Ham F12-K
Protokol
Deň 0: Umiestnenie buniek
Táto časť metódy sa uskutočňuje v boxe s laminámym prúdením.
1. Trypsinizujte bunky. Preneste 200 ml bunkovej suspenzie k 10 ml izotonického roztoku. Spočítajte bunky pomocou prístroja Coulter Counter.
2. Naried’te bunky v rastovom médiu na 20 000 buniek/ml. Preneste 100 ul buniek do každej jamky v 96-jamkovej platničke s plochým dnom, aby v každej jamke bolo 2000 buniek.
3. Použite polovicu platničky (4 rady) pre každú zlúčeninu a pracujte v kvadruplete pre každú koncentráciu zlúčeniny. Pre kontrolné médium použite 4 jamky.
4. Platničky jemne premiešajte, aby došlo k jednotnému prichyteniu buniek.
5. Inkubujte platničky pri teplote 37 °C v inkubátore s 10 % CO2.
Deň 1: Pridanie zlúčeniny
Táto časť metódy sa uskutočňuje v boxe s laminámym prúdením.
1. Do 96-jamkovej platničky s plochými dnami pridajte 120 ul rastového média obsahujúceho 2x najvyššiu finálnu koncentráciu DMSO, ktorá sa našla pri skríningu koncentrácii zlúčenín v stĺpcoch 1 až 11. Napríklad, ak je najvyššia koncentrácia 100 uM a tá je pripravená zo 100 mM zásobného roztoku, lx DMSO je 0,1 % a 2x DMSO je 0,2 %.
Táto platnička sa použije na titrovanie zlúčeniny, 4 rady na jednu zlúčeninu.
2. V sterilnej 15 ml skúmavke pripravte 2x roztok s najvyššou skriningovou koncentráciou zlúčeniny v rastovom médiu plus 2x DMSO. Treba 1 ml na bunkovú líniu. Východisková koncentrácia zlúčeniny je obvykle 100 uM, ale táto koncentrácia sa môže líšiť v závislosti od solubility zlúčeniny.
3. Preneste v kvadruplete 240 ul 2x roztoku východiskovej zlúčeniny do jamiek v stĺpci 12 v 96-jamkovej platničke s guľatými dnami. Uskutočnite sériu riedení 1 : 2 v celej platničke sprava doľava prenesením 12 ml zo stĺpca 12 do stĺpca 11, zo stĺpca 11 do stĺpca 10 atď. až k stĺpcu 2. Preneste 100 ml zlúčeniny a 100 ml média do stĺpca 1, na 100 ml média a bunkách v korešpondujúcich jamkách 96-jamkovej platničky s plochými dnami. Celkový objem na jamku by mal byť 200 ml.
4. Vráťte platničku do inkubátora a inkubujte 3 dni.
Deň 4: Vyvinutie analýzy
Táto časť analýzy sa uskutočňuje na laboratórnom stole.
1. Ašpirujte alebo vylejte médium. Pridajte 200 ml 10 % studenej TCA do každej jamky, aby ste zafixovali bunky. Inkubujte platničku aspoň 60 minút pri teplote 4 °C.
2. Odstráňte TCA a premyte jamky 5-krát tečúcou vodou. Vysušte platničky hlavou nahor na papierových obrúskoch.
3. Farbite bunky pomocou 100 ml 0,4 % SRB na jamku 10 minút.
4. Vylejte SRB a premyte jamky 5-krát pomocou 1 % kyseliny octovej. Vysušte kompletne platničky hlavou nahor na papierových obrúskoch.
5. Solubilizujte farbivo pomocou 100 ml 10 mM zásady Tris 5 až 10 minút na pretrepávačke.
6. Odčítajte platničky v zariadení Dynatech ELISA Plate Rcadcr pri vlnovej dĺžke 570 nm s referenciou pri 630 nm.
Vybrané zlúčeniny inhibovali rast buniek A549, ako sa ilustruje v tabuľke 4.
Tabuľka 4
Zlúčenina IC50 (uM) A549
A-3 22 65(2% FBS)
A-4 6 5,7 (2% FBS)
Príklad 7: Metóda určenia biologickej aktivity modulátorov Raf in vivo
Na monitorovanie účinku zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, na inhibíciu nádorových buniek vaječníkov, melanómu, prostaty, pľúc a prsníka sa môžu použiť xenotransplantátové štúdie. Protokol metódy je opísaný v PCT publikácii WO9640116, zaregistrovanej 5. júna 1996 autormi Táng et al., ktorá je nazvaná „Indolinone Compounds for the Treatment of Disease“ a ktorá je v predkladanom vynáleze začlenená ako referencia v celom svojom rozsahu vrátane vyobrazení.
Tu ilustratívne opísaný predkladaný vynález sa môže použiť v neprítomnosti akýchkoľvek limitácii, ktoré tu nie sú špecificky uvedené. Uvedené termíny a výrazy sa používajú ako termíny opisné a nie obmedzujúce. Rozličné modifikácie týchto termínov a výrazov sú možné a sú zahrnuté do rozsahu predkladaného vynálezu. Preto by sa malo chápať, že aj keď predkladaný vynález bol uvedený preferovanými formami predkladaného vynálezu, sú možné aj zmeny a modifikácie konceptov tu uvedených, ktoré by mohli použiť osoby vyznajúce sa v odbore, patriace do rozsahu tohto vynálezu, ako sa definuje v pripojených patentových nárokoch.
Odborník v odbore ocení, že predkladaný vynález možno dobre prispôsobiť na uskutočnenie zámerov a získanie tu uvedených výsledkov a výhod. Molekulové komplexy a metódy, postupy, spôsoby liečby, molekuly, špecifické zlúčeniny tu opísané predstavujú súčasne preferované formy predkladaného vynálezu, slúžia ako príklady a nijako neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu. Zmeny a ďalšie použitie, ktoré bude zrejmé osobám vyznajúcim sa v odbore, ktoré sú zahrnuté do podstaty predkladaného vynálezu, sú definované rozsahom patentových nárokov.
Osobám vyznajúcim sa v odbore bude ľahko zrejmé, že sa môžu uskutočniť rozličné náhrady a modifikácie predkladaného vynálezu bez toho, aby došlo k odchýleniu od rozsahu a podstaty predkladaného vynálezu.
Všetky patenty a publikácie uvedené v špecifikáciách svedčia o úrovni osôb vyznajúcich sa v odbore, ktorých sa predkladaný vynález týka. Všetky patenty a publikácie sú tu začlenené formou referencie v rovnakom rozsahu, ako keby každá individuálna publikácia bola začlenená individuálne.
Tu ilustratívne opísaný predkladaný vynález sa môže použiť v neprítomnosti akýchkoľvek limitácií, ktoré tu nie sú špecificky uvedené. Z toho dôvodu napríklad akýkoľvek z tu uvádzaných termínov „tvorený“, „skladajúci sa v podstate z“ a „skladajúci sa“ sa môže nahradiť akýmkoľvek z ostatných dvoch výrazov. Uvedené termíny a výrazy sa používajú ako termíny opisné a nie obmedzujúce. Rozličné modifikácie týchto termínov a výrazov sú možné a sú zahrnuté do rozsahu predkladaného vynálezu. Preto by sa malo chápať, že aj keď predkladaný vynález bol špecificky uvedený preferovanými formami predkladaného vynálezu, sú možné aj zmeny a modifikácie konceptov tu uvedených, ktoré by mohli použiť osoby vyznajúce sa v odbore, považované za patriace do rozsahu tohto vynálezu, ako sa definuje v pripojených patentových nárokoch.
Okrem toho tam, kde sú rysy alebo aspekty predkladaného vynálezu opisované v termínoch Markushových skupín, rozoznajú osoby vyznajúce sa v odbore, že vynález sa opisuje aj v termínoch podskupiny členov Markushovej skupiny. Napríklad ak je X opisované ako vybrané zo skupiny tvorenej brómom, chlórom a jódom, sú uvedené úplné opisy patentových nárokov pre X, ktorý je bróm a X, ktorý je bróm a chlór.
Referencie, ktoré neboli v predkladanom vynáleze začlenené ako referencie, vrátane patentových aj nepatentových referencií, sú výslovne začlenené ako referencie na všetky účely. Ďalšie formy predkladaného vynálezu sú uvedené v nasledovných patentových nárokoch.

Claims (21)

1. Azabenzimidazolová zlúčenina definovaná vzorcami (I), (II) alebo (III):
kde
a) R1, R2, R3 a R4 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) vodíkom;
(ii) nasýteným alebo nenasýteným alkylom;
(iii) NX2X3, kde X2 a X3 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom;
(iv) halogénom alebo trihalogénmetylovou skupinou;
(v) ketónom charakterizovaným vzorcom -CO-X4, kde X4 je vybraný zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom;
(vi) karboxylovou kyselinou charakterizovanou vzorcom -(X5)n-COOH, alebo esterom charakterizovaným vzorcom -(X6)n-COO-X7, kde X5, X6 a X7 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom a kde n je 0 alebo 1;
(vii) alkoholom vzorca -(Xs)n-OH alebo alkoxylovým zvyškom vzorca -(X8)n-OR9, kde X8 a X9 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorené vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom a kde kruh je voliteľne substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, alkoxyskupinou, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou a kde n je 0 alebo 1;
(viii) amidom charakterizovaným vzorcom -NHCOX10, kde X10 je vybraný zo skupiny tvorenej alkylom, hydroxylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom a kde kruh je voliteľne substituovaný jedným alebo dvoma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, alkoxyskupinou, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou;
(ix) -802^1^12. kde X11 a X12 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom;
(x) homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom voliteľne substituovaným jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, alkoxyskupinou, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou;
(xi) aldehydom charakterizovaným vzorcom -CO-H; a (xii) sulfónom charakterizovaným vzorcom -SO2X13, kde X13 je vybraný zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom;
b) Z1 a Z2 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej dusíkom, sírou, kyslíkom, NH, NR4, pričom keď jeden zo Z1 a Z2 je dusík, NH alebo NR4, potom druhý Z1 a Z2 je dusík, síra, kyslík, NH alebo NR4; a
c) Z3 a X1 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej dusíkom, sírou a kyslíkom.
2. Zlúčenina podľa nároku 1, kde Z1 a Z2 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej dusíkom a NH.
3. Zlúčenina podľa nároku 1 alebo 2, kde R1, R2, R3, a R4 sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) vodíkom;
(ii) nasýteným alebo nenasýteným alkylom voliteľne substituovaným homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom alebo polycyklickým kruhom, kde uvedený kruh je voliteľne substituovaný jedným, dvoma alebo troma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylovou skupinu, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou; a (iii) homocyklickým alebo heterocyklickým kruhom voliteľne substituovaným jedným, dvoma alebo troma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylovou skupinu, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou.
4. Zlúčenina podľa nároku 3, kde R2 a R3 je vodík.
5. Zlúčenina podľa nároku 3, kde R1 je fenyl voliteľne substituovaný jedným, dvoma alebo troma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylskupinou, alkoxyskupinou, halogénom, trihalogénmethylovou skupinou, karboxylátovou skupinou, nitroskupinou a esterovou skupinou.
6. Zlúčenina podľa nároku 1, kde X1 je vybraný zo skupiny tvorenej sírou, kyslíkom a NH.
7. Zlúčenina podľa nároku 1, kde Z3 je kyslík.
8. Zlúčenina podľa nároku 1, kde R4 je vybraný zo skupiny tvorenej metylskupinou a etylskupinou.
9. Spôsob syntézy azabenzimidazolovej zlúčeniny všeobecného vzorca (I), (II) alebo (III) podľa nároku 1, v y značujúci sa tým, že zahŕňa kroky
a) reakciu 2-amino-6-chlór-3-nitropyridínu s druhým reaktantom v rozpúšťadle za vzniku prvého medziproduktu, pričom druhým rekatantom je substituovaný aromatický kruh;
b) redukciu medziproduktu v prítomnosti katalyzátora a redukčného činidla za vzniku druhého medziproduktu;
c) reakciu druhého medziproduktu s tretím reaktantom; a
d) purifikáciu zlúčeniny všeobecného vzorca (I).
10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že rozpúšťadlo je n-propanol.
11. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že substituovaný aromatický kruh je substituovaný fenol, substituovaný tiofenol alebo substituovaný anilín.
12. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že redukčné činidlo je vodík.
13. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že katalyzátor je Raneyho nikel.
14. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že tretím reaktantom je O-metylizomočovina.
15. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že tretím reaktantom je produkt reakcie S-metylizotiouróniumsulfátu a alkylchlórformiátu.
16. Spôsob podľa nároku 9 alebo 15, vyznačujúci sa tým, že alkyl je metyl alebo etyl.
17. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje azabenzimidazolovú zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 a fyziologicky prijateľný nosič alebo riedidlo.
18. Použitie azabenzimidazolovej zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 na výrobu liečiva na liečenie stavov spojených s moduláciou funkcie scrín/treonín proteín kinázy.
19. Použitie azabenzimidazolovej zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 na výrobu liečiva na liečenie nádorového ochorenia, fibrotickej poruchy a iných proliferačných porúch.
20. Použitie podľa nároku 19, kde nádorové ochorenie je vybrané z pľúcnych nádorov, nádorov vaječníkov, nádorov prsníka, nádorov mozgu, intraaxiálnych mozgových nádorov, nádorov hrubého čreva, nádorov prostaty, sarkómu, Kaposiho sarkómu, melanómu a gliómu.
21. Použitie azabenzimidazolovej zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 na výrobu liečiva na liečenie stavu spojeného s aberáciou v dráhe signálovej transdukcic, označovanej ako dráha RAF (rýchlo akcelerovaný fibrosarkóm)/MEK (mitogénna a extraceluláma regulovaná kináza), ktorá je charakterizovaná interakciou medzi serín/treonín proteín kinázou RAF a prirodzeným väzbovým partnerom.
SK415-2000A 1997-09-26 1998-09-23 Zlúčeniny na báze azabenzimidazolu modulujúce funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy SK285357B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6014597P 1997-09-26 1997-09-26
PCT/US1998/019973 WO1999016438A1 (en) 1997-09-26 1998-09-23 Azabenzimidazole-based compounds for modulating serine/threonine protein kinase function

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK4152000A3 SK4152000A3 (en) 2002-02-05
SK285357B6 true SK285357B6 (sk) 2006-11-03

Family

ID=22027657

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK415-2000A SK285357B6 (sk) 1997-09-26 1998-09-23 Zlúčeniny na báze azabenzimidazolu modulujúce funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy

Country Status (28)

Country Link
US (2) US6093728A (sk)
EP (1) EP1017384B1 (sk)
JP (1) JP2001517699A (sk)
KR (1) KR100547929B1 (sk)
CN (1) CN1167420C (sk)
AR (1) AR017266A1 (sk)
AT (1) ATE281834T1 (sk)
AU (1) AU748849B2 (sk)
BG (1) BG64784B1 (sk)
BR (1) BR9812682A (sk)
CA (1) CA2305370C (sk)
DE (1) DE69827516T2 (sk)
DK (1) DK1017384T3 (sk)
ES (1) ES2230719T3 (sk)
HK (1) HK1032206A1 (sk)
HU (1) HUP0004024A3 (sk)
IL (4) IL158649A0 (sk)
NO (1) NO325663B1 (sk)
NZ (2) NZ503432A (sk)
PL (1) PL191618B1 (sk)
PT (1) PT1017384E (sk)
RU (1) RU2230553C2 (sk)
SK (1) SK285357B6 (sk)
TR (1) TR200001546T2 (sk)
TW (1) TW581815B (sk)
UA (1) UA72448C2 (sk)
WO (1) WO1999016438A1 (sk)
ZA (1) ZA988797B (sk)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060142236A1 (en) * 1994-05-31 2006-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
US6919366B2 (en) * 1998-05-22 2005-07-19 Avanir Pharmaceuticals Benzimidazole derivatives as modulators of IgE
US6911462B2 (en) * 1998-05-22 2005-06-28 Avanir Pharmaceuticals Benzimidazole compounds for regulating IgE
US6384049B1 (en) * 2000-05-25 2002-05-07 The Procter & Gamble Company Cancer treatment
WO2002072090A1 (en) * 2001-03-12 2002-09-19 Avanir Pharmaceuticals Benzimidazole compounds for modulating ige and inhibiting cellular proliferation
TW200304820A (en) * 2002-03-25 2003-10-16 Avanir Pharmaceuticals Use of benzimidazole analogs in the treatment of cell proliferation
WO2004024655A2 (en) 2002-09-12 2004-03-25 Avanir Pharmaceuticals Phenyl-indole compounds for modulating ige and inhibiting cellular proliferation
TWI276631B (en) * 2002-09-12 2007-03-21 Avanir Pharmaceuticals Phenyl-aza-benzimidazole compounds for modulating IgE and inhibiting cellular proliferation
JP2007501618A (ja) * 2003-08-08 2007-02-01 アバニール・ファーマシューティカルズ タンパク質輸送の選択的薬理学的阻害、および関連した、ヒト疾患を治療する方法
GB0423554D0 (en) 2004-10-22 2004-11-24 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds
CA2630920A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-31 University Of South Florida Inhibition of cell proliferation
EP2013207B1 (en) 2006-04-26 2012-04-25 Cancer Research Technology Limited Imidazo[4,5-b]pyridin-2-one compounds and analogs thereof as cancer therapeutic compounds
ATE543819T1 (de) * 2006-10-19 2012-02-15 Signal Pharm Llc Heteroarylverbindungen, zusammensetzungen daraus und behandlungsverfahren damit
ES2662036T3 (es) * 2007-02-28 2018-04-05 Yeda Research And Development Company Limited Secuencias que se dirigen al núcleo
WO2008150015A1 (en) * 2007-06-05 2008-12-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterobicyclic compounds as kinase inhibitors
JP5270553B2 (ja) 2007-08-23 2013-08-21 武田薬品工業株式会社 複素環化合物およびその用途
EP2184285B1 (en) * 2007-08-29 2015-11-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound and use thereof
EP2229391B1 (en) 2007-12-19 2014-08-06 Cancer Research Technology Limited Pyrido[2,3-b]pyrazine-8-substituted compounds and their use
GB0807609D0 (en) 2008-04-25 2008-06-04 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds and their use
US20100184851A1 (en) * 2008-08-29 2010-07-22 University Of South Florida Inhibition of cell proliferation
US8110578B2 (en) 2008-10-27 2012-02-07 Signal Pharmaceuticals, Llc Pyrazino[2,3-b]pyrazine mTOR kinase inhibitors for oncology indications and diseases associated with the mTOR/PI3K/Akt pathway
JP5579619B2 (ja) 2008-12-01 2014-08-27 武田薬品工業株式会社 複素環化合物およびその用途
JO3101B1 (ar) 2008-12-02 2017-09-20 Takeda Pharmaceuticals Co مشتقات بنزوثيازول كعوامل مضادة للسرطان
JP2012197231A (ja) * 2009-08-06 2012-10-18 Oncotherapy Science Ltd Ｔｔｋ阻害作用を有するピリジンおよびピリミジン誘導体
MX341704B (es) 2009-10-26 2016-08-31 Signal Pharm Llc Métodos de síntesis y purificación de compuestos de heteroarilo.
PL2531502T3 (pl) 2010-02-01 2014-08-29 Cancer Research Tech Ltd 1-(5-tert-Butylo-2-fenylo-2H-pirazol-3-ilo)-3-[2-fluoro-4-(1-metylo-2-okso-2,3-dihydro-1H-imidazo[4,5-b]pirydyn-7-yloksy)-fenylo]-mocznik i związki pokrewne oraz ich zastosowanie w terapii
CN103998036B (zh) 2011-10-19 2017-05-31 西格诺药品有限公司 利用tor激酶抑制剂治疗癌症
CA2857155C (en) 2011-12-02 2021-09-21 Signal Pharmaceuticals, Llc Pharmaceutical compositions of 7-(6-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-3-yl)-1-((trans)-4-methoxycyclohexyl)-3,4-dihydropyrazino [2,3-b]pyrazin-2(1h)-one, a solid form thereof and methods of their use
JP6114317B2 (ja) 2012-02-24 2017-04-12 シグナル ファーマシューティカルズ，エルエルシー Ｔｏｒキナーゼ阻害剤の組合せ療法を用いて、非小細胞肺がんを処置する方法
AU2013203714B2 (en) 2012-10-18 2015-12-03 Signal Pharmaceuticals, Llc Inhibition of phosphorylation of PRAS40, GSK3-beta or P70S6K1 as a marker for TOR kinase inhibitory activity
WO2014113429A2 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Signal Pharmaceuticals, Llc Substituted pyrrolopyrimidine compounds, compositions thereof, and methods of treatment therewith
US9650376B2 (en) 2013-03-15 2017-05-16 Knopp Biosciences Llc Imidazo(4,5-B) pyridin-2-yl amides as KV7 channel activators
CA2908353C (en) 2013-04-17 2021-11-02 Signal Pharmaceuticals, Llc Treatment of cancer with dihydropyrazino-pyrazines
US9505764B2 (en) 2013-04-17 2016-11-29 Signal Pharmaceuticals, Llc Treatment of cancer with dihydropyrazino-pyrazines
WO2014172436A1 (en) 2013-04-17 2014-10-23 Signal Pharmaceuticals, Llc Combination therapy comprising a tor kinase inhibitor and a 5-substituted quinazolinone compound for treating cancer
UA115805C2 (uk) 2013-04-17 2017-12-26 Сігнал Фармасьютікалз, Елелсі Комбінована терапія, яка включає сполуку дигідропіразинопіразину й антагоніст рецептора андрогену, для лікування раку простати
AU2014254057A1 (en) 2013-04-17 2015-11-05 Signal Pharmaceuticals, Llc Combination therapy comprising a TOR kinase inhibitor and N-(3-(5-fluoro-2-(4-(2-methoxyethoxy)phenylamino)pyrimidin-4-ylamino)phenyl)acrylamide for treating cancer
CN105324381A (zh) 2013-04-17 2016-02-10 西格诺药品有限公司 有关1-乙基-7-(2-甲基-6-(1H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-3-基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮的药物制剂、程序、固体形式和使用方法
NZ631082A (en) 2013-04-17 2017-06-30 Signal Pharm Llc Methods for treating cancer using tor kinase inhibitor combination therapy
JP6401250B2 (ja) 2013-05-29 2018-10-10 シグナル ファーマシューティカルズ，エルエルシー ７−（６−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）ピリジン−３−イル）−１−（（ｔｒａｎｓ）−４−メトキシシクロヘキシル）−３，４−ジヒドロピラジノ［２，３−ｂ］ピラジン−２（１Ｈ）−オン、その固体形態の医薬組成物、及びその使用方法
WO2015040609A1 (en) 2013-09-17 2015-03-26 Yeda Research And Development Co. Ltd. Erk-derived peptides and uses thereof
GB201320732D0 (en) 2013-11-25 2014-01-08 Cancer Rec Tech Ltd Methods of chemical synthesis
GB201320729D0 (en) 2013-11-25 2014-01-08 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds and their use
EP3131552B1 (en) 2014-04-16 2020-07-15 Signal Pharmaceuticals, LLC Methods for treating cancer using tor kinase inhibitor combination therapy
NZ714742A (en) 2014-04-16 2017-04-28 Signal Pharm Llc Solid forms of 1-ethyl-7-(2-methyl-6-(1h-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-3-yl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1h)-one, compositions thereof and methods of their use
JP2017511367A (ja) 2014-04-16 2017-04-20 シグナル ファーマシューティカルズ，エルエルシー １−エチル−７−（２−メチル−６−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）ピリジン−３−イル）−３，４−ジヒドロピラジノ［２，３−ｂ］ピラジン−２（１Ｈ）−オン及び共形成物を含む固体形態、その組成物及び使用方法
WO2015160882A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Signal Pharmaceuticals, Llc SOLID FORMS COMPRISING 7-(6-(2-HYDROXYPROPAN-2YL) PYRIDIN-3-YL)-1-(TRANS)-4-METHOXYCYCLOHEXYL)-3, 4-DIHYDROPYRAZINO[2,3-b] PYRAZIN-2(1H)-ONE, AND A COFORMER, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
NZ629796A (en) 2014-07-14 2015-12-24 Signal Pharm Llc Amorphous form of 4-((4-(cyclopentyloxy)-5-(2-methylbenzo[d]oxazol-6-yl)-7h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl)amino)-3-methoxy-n-methylbenzamide, compositions thereof and methods of their use
JP2017520603A (ja) 2014-07-14 2017-07-27 シグナル ファーマシューティカルズ，エルエルシー 置換ピロロピリミジン化合物を使用するがんの治療方法及びその組成物
DK3191457T3 (da) 2014-09-12 2019-10-07 Knopp Biosciences Llc BENZOIMIDAZOL-1,2-YL AMIDER SOM Kv7-KANALAKTIVATORER
EP3641772B1 (en) 2017-06-22 2023-08-02 Celgene Corporation Treatment of hepatocellular carcinoma characterized by hepatitis b virus infection

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3590045A (en) * 1969-09-25 1971-06-29 Smith Kline French Lab Certain substituted imidazo (4,5-b)pyridines
BE788065A (fr) 1971-08-26 1973-02-26 Degussa Nouvelles aza-benzimidazoles et procede pour leur preparation
SE422799B (sv) 1975-05-28 1982-03-29 Merck & Co Inc Analogiforfarande for framstellning av 1,3-dihydroimidazo (4,5-b)pyridin-2-oner
ES473201A1 (es) * 1977-09-26 1979-03-16 Degussa Procedimiento para la preparacion de 7-azabencimidazoles
US5217999A (en) * 1987-12-24 1993-06-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase
EP0526488B1 (en) * 1990-04-02 1994-11-30 Pfizer Inc. Benzylphosphonic acid tyrosine kinase inhibitors
US5302606A (en) * 1990-04-16 1994-04-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
AU658646B2 (en) * 1991-05-10 1995-04-27 Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. Bis mono-and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit EGF and/or PDGF receptor tyrosine kinase
CA2108889A1 (en) * 1991-05-29 1992-11-30 Robert Lee Dow Tricyclic polyhydroxylic tyrosine kinase inhibitors
AU661533B2 (en) * 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
AU672224B2 (en) * 1992-08-06 1996-09-26 Warner-Lambert Company 2-thioindoles (selenoindoles) and related disulfides (selenides) which inhibit protein tyrosine kinases and whichhave antitumor properties
US5330992A (en) * 1992-10-23 1994-07-19 Sterling Winthrop Inc. 1-cyclopropyl-4-pyridyl-quinolinones
GB9226855D0 (en) * 1992-12-23 1993-02-17 Erba Carlo Spa Vinylene-azaindole derivatives and process for their preparation
US5582995A (en) 1993-06-11 1996-12-10 The General Hospital Corporation Methods of screening for compounds which inhibit the direct binding of Ras to Raf
US5645982A (en) * 1993-08-19 1997-07-08 Systemix, Inc. Method for screening potential therapeutically effective antiviral agents
GB9501567D0 (en) * 1995-01-26 1995-03-15 Pharmacia Spa Hydrosoluble 3-arylidene-2-oxindole derivatives as tyrosine kinase inhibitors
US5880141A (en) * 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease

Also Published As

Publication number Publication date
KR100547929B1 (ko) 2006-02-02
WO1999016438A1 (en) 1999-04-08
PL191618B1 (pl) 2006-06-30
KR20010015623A (ko) 2001-02-26
PT1017384E (pt) 2005-03-31
SK4152000A3 (en) 2002-02-05
IL135109A (en) 2007-07-04
ZA988797B (en) 1999-12-02
RU2230553C2 (ru) 2004-06-20
NZ517808A (en) 2003-07-25
TW581815B (en) 2004-04-01
JP2001517699A (ja) 2001-10-09
EP1017384A1 (en) 2000-07-12
IL135109A0 (en) 2001-05-20
TR200001546T2 (tr) 2000-10-23
CA2305370C (en) 2006-11-28
AU748849B2 (en) 2002-06-13
CN1278172A (zh) 2000-12-27
HUP0004024A3 (en) 2001-10-29
US6855723B2 (en) 2005-02-15
US20030181480A1 (en) 2003-09-25
BG104356A (en) 2000-12-29
BG64784B1 (bg) 2006-04-28
BR9812682A (pt) 2000-08-22
EP1017384B1 (en) 2004-11-10
ATE281834T1 (de) 2004-11-15
NO20001555D0 (no) 2000-03-24
NO20001555L (no) 2000-03-24
IL158649A (en) 2006-12-10
NZ503432A (en) 2002-11-26
DK1017384T3 (da) 2005-01-31
AU9578198A (en) 1999-04-23
DE69827516D1 (de) 2004-12-16
NO325663B1 (no) 2008-07-07
IL158649A0 (en) 2004-05-12
AR017266A1 (es) 2001-09-05
CA2305370A1 (en) 1999-04-08
CN1167420C (zh) 2004-09-22
HK1032206A1 (en) 2001-07-13
PL339744A1 (en) 2001-01-02
ES2230719T3 (es) 2005-05-01
DE69827516T2 (de) 2005-12-01
HUP0004024A2 (hu) 2001-04-28
UA72448C2 (en) 2005-03-15
US6093728A (en) 2000-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK285357B6 (sk) Zlúčeniny na báze azabenzimidazolu modulujúce funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy
SK4722000A3 (en) Methods of in vitro modulating serine/threonine protein kinase function, identification method of corresponding modulators, of 5-azaquinoxaline-based compounds, method for the production thereof and pharmaceutical compositions
US6204267B1 (en) Methods of modulating serine/thereonine protein kinase function with quinazoline-based compounds
CZ2000990A3 (cs) Způsob in vitro modulace funkce serin/threonin protein kinázy, způsob in vitro identifikace sloučenin pro tuto modulaci, sloučeniny na bázi azabenzimidazolu,jejich použití, způsob jejich výroby a farmaceutické kompozice
MXPA00002910A (en) Azabenzimidazole-based compounds for modulating serine/threonine protein kinase function
MXPA00003255A (en) Methods of modulating serine/threonine protein kinase function with 5-azaquinoxaline-based compounds