NO325663B1

NO325663B1 - Azabenzimidazolbaserte forbindelser, fremgangsmater for fremstilling av forbindelsene, anvendelse av forbindelsene samt farmasoytiske sammensetninger inneholdende forbindelsene

Info

Publication number: NO325663B1
Application number: NO20001555A
Authority: NO
Inventors: Gerald Mcmahon; Heinz Weinberger; Bernhard Kutscher; Harald App
Original assignee: Zentaris Gmbh
Priority date: 1997-09-26
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2008-07-07
Also published as: KR100547929B1; CA2305370A1; HK1032206A1; JP2001517699A; US6093728A; CA2305370C; NZ503432A; PL339744A1; ES2230719T3; SK4152000A3; ATE281834T1; UA72448C2; WO1999016438A1; HUP0004024A2; DE69827516D1; IL158649A0; AU748849B2; NZ517808A; IL135109A; ZA988797B

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører azabenzimidazolbaserte forbindelser, fremgangsmåter for fremstilling av forbindelsene, anvendelse av forbindelsene samt farmasøytiske sammensetninger inneholdende forbindelsene.

Cellulær signaltransduksjon er en fundamental mekanisme hvorved eksterne stimuli som regulerer diverse cellulære prosesser bringes videre til innsiden av cellene. En av de viktigste biokjemiske mekanismene ved signaltransduksjon omfatter den reversible fosforyleringen av proteiner, som muliggjør reguleringen av aktiviteten til maturproteinene ved å forandre deres struktur og funksjon.

De best karakteriserte proteinkinasene i eukaryoter er fosforylatproteiner på alkoholdelen til serin, treonin og tyrosinresiduene. Disse kinasene faller overveiende i to grupper, de som er spesifikke for fosforylering av serin og treonin og de som er spesifikke for fosforylering av tyrosin. Noen kinaser, referert til som "dobbelspesifikke" kinaser, er i stand til å fosforylere på tyrosin så vel som serin/treoninresiduer.

Proteinkinaser kan også kjennetegnes ved deres lokalisering inne i cellen. Noen kinaser er transmembranreseptorproteiner i stand til å binde ligander eksternt til cellemembranen. Binding av ligander forandrer reseptorproteinkinasens katalytiske aktivitet. Andre er ikke-reseptorproteiner som mangler et transmembrandomene. Ikke-reseptorproteinkinaser kan finnes i et antall cellulære avdelinger fra den indre overflaten av cellemembranen til kjernen.

Mange kinaser er involvert i reguleringskaskader hvor deres substrater kan omfatte andre kinaser hvis aktivitet er regulert ved deres fosforyleringstilstand. Til sist blir aktiviteten til en nedstrømseffektor modulert ved fosforylering som resultat av aktivering av en slik vei.

Serin/treoninkinasefamilien omfatter medlemmer som regulerer mange trinn av signalkaskadene, som inkluderer kaskader som kontrollerer cellevekst, migrering, differensiering, genekspresjon, muskelkontraksjon, glukosemetabolisme, cellulær proteinsyntese og regulering av cellecyklusen.

Et eksempel på en ikke-reseptor proteinkinase som fosforylerer proteinmål på serin- og treoninresiduer er RAF. RAF modulerer den katalytiske aktiviteten til andre proteinkinaser, slik som proteinkinase som fosforylerer og dermed aktiverer mitogenaktivert proteinkinase (MAPK). RAF i seg selv aktiveres ved membranforankret protein RAF, som i sin tur blir aktivert som respons på ligandaktiverte tyrosinreseptor proteinkinaser slik som epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) og blodplateavledet vekstfaktorreseptor (PDGFR). Den biologiske viktigheten av RAF til kontroll av cellulære hendelser fremheves ved oppdagelsen av at forandrede former av RAF kan forårsake kreft i organismer. Bevis for viktigheten av RAF i maligniteter er tilveiebrakt i Monia et al., 1996, Nature Medicine 2: 668.

I et forsøk på å finne nye behandlinger for kreft og andre sykdommer har biomedisinske forskere og kjemikere designet, syntetisert og testet molekyler som inhiberer funksjonen til proteinkinaser. Noen små organiske molekyler danner en klasse av forbindelser som modulerer funksjonen til proteinkinaser. Eksempler på molekyler som er blitt rapportert å inhibere funksjonen til proteinkinaser er bis monocykliske, bicykliske eller heterocykliske arylforbindelser (PCT WO 92/20642), vinylen-azaindolderivater (PCT WO 94/14808), l-cyklopropyl-4-pyridylquinoloner (US-patent nr. 5.330.992), styrylforbindelser (US-patent nr. 5.217.999), styrylsubstituerte pyridylforbindelser (US-patent nr. 5.302.606), visse quinazolinderivater (EP-søknad nr. 0.566.266 Al), seleoindoler og selenider (PCT WO 94/03427), tricykliske polyhydroksylforbindelser (PCT WO 92/21660), og benzylfosfonsyreforbindelser (PCT WO 91/15495).

Forbindelsene som kan traversere cellemembraner og er resistente for sur hydrolyse er potentielt fordelaktige terapeutika, idet de kan bli svært biotilgjengelige etter administrasjon oralt til pasienter. Imidlertid inhiberer mange av disse proteinkinaseinhibitorene bare svakt funksjonen til proteinkinaser. I tillegg inhiberer mange et antall proteinkinaser og vil derfor forårsake mulige bivirkninger som terapeutikum for sykdommer.

Foreliggende oppfinnelse er rettet delvis mot anvendelsen av azabenzimidazolbaserte forbindelser for fremstilling av et medikament for behandling av lidelser forbundet med moduleringen av funksjonen av en serin/treonin proteinkinase, så som RAF, så vel som forbundet med et avvik i signaltransduksjonsveien RAF/MEK. Videre vedrører oppfinnelsen farmasøytiske preparater omfattende forbindelser anvendt for behandlingen av de nevnte tilstandene.

I. Fremgangsmåter for screening av forbindelser som modulerer serin/treonin

proteinkinasefunksjon

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en azabenzimidazolforbindelse, kjennetegnet ved at den har en struktur som fremsatt i formlene I, II, eller III:

hvori

(a) Ri, R2, R3 og R4 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av

(i) hydrogen; (ii) mettet eller umettet alkyl; (iii) NX2X3, hvor X2 og X3 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, mettet eller umettet alkyl, og homocykliske eller heterocykliske ringdeler; (iv) halogen eller trihalometyl; (v) et keton med formel -CO-X4, hvor X4 er utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, alkyl, og homocykliske eller heterocykliske ringdeler; (vi) en karboksylsyre med formel -(X5)n-COOH eller ester med formel -(X6)n-COO-X7, hvor X5, X6 og X7 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl og homocykliske eller heterocykliske ringdeler og hvor n er 0 eller 1; (vii) en alkohol med formel (Xg)n-OH eller en alkoksydel med formel -(XgV O-Xg, hvor Xg og X9 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, mettet eller umettet alkyl, og homocykliske eller heterocykliske ringdeler, hvori nevnte ring er valgfritt substituert med en eller flere substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, alkoksy, halogen, trihalometyl, karboksylat, nitro og ester, og hvor n er 0 eller 1; (viii) et amid med formel -NHCOXio, hvor Xio er utvalgt fra gruppen som består av alkyl, hydroksyl, og homocykliske eller heterocykliske ringdeler, hvori nevnte ring er valgfritt substituert med en eller flere substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, alkoksy, halogen, trihalometyl, karboksylat, nitro og ester;

(ix) -SO2NX11X12, hvor Xi 1 og X12 er utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, alkyl og homocykliske eller heterocykliske ringdeler;

(x) en homocyklisk eller heterocyklisk ringdel valgfritt substituert med en, to eller tre substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, alkoksy, halogen, trihalometyl, karboksylat, nitro og esterdeler;

(xi) et aldehyd med formel -CO-H; og

(xii) et sulfon med formel -SO2-X13, hvor X13 er utvalgt fra gruppen som består av mettet eller umettet alkyl og homocykliske eller heterocykliske ringdeler;:

(b) Zi og Z2 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av nitrogen, svovel, oksygen, NH og NR4, forutsatt at hvis en av Zi og Z2 er nitrogen, NH eller NR4 da er den andre av Zi og Z2 nitrogen, svovel, oksygen, NH eller NR4; og (c) Z3 og Xi er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av nitrogen, svovel og oksygen.

Azabenzimidazolforbindelsene ifølge oppfinnelsen kan anvendes i en fremgangsmåte som tilveiebringer muligheter for modulering av funksjonen til både reseptor og cytosoliske serin/treonin proteinkinaser. Disse fremgangsmåtene gir måter for modulering av enzymene både in vitro og in vivo. For in vitro anvendelser er dette delvis fremgangsmåter for identifisering av forbindelser som modulerer funksjonen til serin/treonin proteinkinaser.

Ved den nevnte fremgangsmåten bringes celler som uttrykker serin/treonin proteinkinase i kontakt med azabenzamidazolforbindelsen.

Begrepet "funksjon" refererer til den cellulære rollen til serin/treonin proteinkinase. Serin/treonin proteinkinasefamilien omfatter medlemmer som regulerer mange trinn i signalkaskader, som inkluderer kaskader som kontrollerer cellevekst, migrering, differensiering, genekspresjon, muskelkontraksjon, glukosemetabolisme, cellulær proteinsyntese og regulering av cellecyklusen.

Begrepet "modulerer" refererer til evnen en forbindelse har til å forandre funksjonen til en proteinkinase. En modulator aktiverer foretrukket den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase, mer foretrukket aktiverer eller inhiberer den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase avhengig av konsentrasjonen av forbindelsen eksponert for proteinkinasen, eller mest foretrukket inhiberer den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase.

Begrepet "katalytisk aktivitet" i foreliggende sammenheng definerer hastigheten hvorved en proteinkinase fosforylerer et substrat. Katalytisk aktivitet kan måles for eksempel ved å bestemme mengden av et substrat omdannet til et produkt som en funksjon av tiden. Fosforylering av et substrat finner sted ved det aktiverte setet til en proteinkinase. Det aktive setet er normalt et hulrom hvori substratet bindes til proteinkinasen og fosforyleres.

Begrepet "substrat" slik det anvendes heri refererer til et molekyl fosforylert av en serin/treonin proteinkinase. Substratet er foretrukket et peptid eller mer foretrukket et protein. I relasjon til proteinkinasen RAF er foretrukne substrater MEK og MEK-substratet MAPK.

Begrepet "aktiverer" refererer til økning av den cellulære funksjonen til en proteinkinase. Proteinkinasefunksjonen er interaksjonen med en naturlig bindingspartner og mest foretrukket katalytisk aktivitet.

Begrepet "inhiberer" refererer til reduksjon av den cellulære funksjonen til en proteinkinase. Proteinkinasefunksjonen er interaksjonen med en naturlig bindingspartner og mest foretrukket katalytisk aktivitet.

Begrepet "modulerer" refererer også til forandring av funksjonen til en proteinkinase ved økning eller reduksjon av muligheten som er for at et kompleks dannet mellom en proteinkinase og en naturlig bindingspartner. En modulator øker sannsynligheten til at et slikt kompleks dannet mellom proteinkinasen og den naturlige bindingspartneren, mer foretrukket øker eller reduserer den muligheten til at et kompleks dannet mellom proteinkinasen og den naturlige bindingspartneren avhenger av konsentrasjonen av forbindelsen eksponert for proteinkinasen, og mest foretrukket reduserer den muligheten for at et kompleks dannes mellom proteinkinasen og den naturlige bindingspartneren.

Begrepet "kompleks" refererer seg til en sammenstilling av minst to molekyler bundet til hverandre. Signaltransduksjonskomplekser inneholder ofte minst to proteinmolekyler bundet til hverandre. For eksempel settes en proteintyrosin reseptorkinase, GRB2, SOS, RAF og RAS sammen for å danne et signaltransduksjonskompleks som respons på en mitogen ligand.

Begrepet "naturlig bindingspartner" refererer til polypeptider som bindes til en proteinkinase i celler. Naturlig bindingspartner kan spille en rolle ved propagering av et signal i en proteinkinase signaltransduksjonsprosess. En forandring i interaksjonen mellom en proteinkinase og en naturlig bindingspartner kan manifestere seg som en økning eller reduksjon i sannsynligheten for at interaksjonen dannes eller en økning eller reduksjon i konsentrasjonen av proteinkinasen/naturlig bindingspartner-komplekset.

En proteinkinase naturlig bindingspartner kan bindes til en proteinkinases intracellulære region med høy affinitet. Høy affinitet representerer en likevektbindingskonstant i størrelsesorden IO"<6> M eller mindre. I tillegg kan en naturlig bindingspartner også forbigående reagere innbyrdes med en proteinkinase cellulær region og modifisere den kjemisk. Proteinkinase naturlig bindingspartnere velges fra en gruppe som inkluderer, SRC-homolog 2 (SH2) eller 3 (SH3) domener, andre fosforyltyrosinbindings (PTB) domener, guaninnukleotidutbytningsfaktorer, proteinfosfater og andre proteinkinaser. Fremgangsmåter for bestemming av forandringer i interaksjoner mellom proteinkinaser og deres naturlige bindingspartnere er lett tilgjengelig i litteraturen.

Begrepet "serin/treonin proteinkinase" refererer til et enzym med en aminosyresekvens med minst 10% aminosyreidentitet i forhold til andre enzymer som fosforylerer proteiner på serin- og treoninresiduer. En serin/treonin proteinkinase katalyserer addisjonen av fosfat på proteiner på serin- og treoninresiduer. Serin/treonin proteinkinaser kan eksistere som membranbundede proteiner eller cytosolproteiner.

Begrepet "bringe i kontakt" slik det anvendes heri refererer til å blande en løsning som innbefatter en azabenzimidazolforbindelse ifølge oppfinnelsen med et flytende medium som bader cellene i fremgangsmåten. Løsningen som innbefatter forbindelsen kan også innbefatte en annen komponent, slik som dimetylsulfoksid (DMSO), som letter opptak av azabenzimidazolforbindelsen eller forbindelsene inn i cellene i fremgangsmåtene. Løsningen som innbefatter azabenzimidazolforbindelsen kan tilsettes til mediet som bader cellene ved anvendelse av en avleveringsapparatur, slik som en pipettebasert anordning eller sprøytebasert anordning.

Begrepet "azabenzimidazolbasert forbindelse" refererer til en azabenzimidazolorganisk forbindelse substituert med kjemiske substituenter. Azabenzimidazolforbindelser har ofte den generelle strukturen:

Fordelaktig kan den nevnte fremgangsmåten anvendes for modulering av funksjonen til en serin/treonin proteinkinase, hvor proteinkinasen er RAF.

RAF-proteinkinasen fosforylerer proteinmålene på serin- eller treoninresiduene. Et slikt proteinmål er proteinkinasen (MEK) som fosforylerer og konsekvent aktiverer mitogenaktivitert proteinkinase (MARK). RAF i seg.selv aktiveres ved membranbundet guanintrifosfathydrolyserende enzym RAS som respons på mitogenstimulerte reseptorprotein tyrosinkinaser, slik som epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) og blodplateavledet vekstfaktorreseptor (PDGFR).

Fremgangsmåtene kan detektere forbindelser som modulerer funksjonen til RAF-proteinkinase i celler. RAF fosforylerer en proteinkinase (MEK) som i sin tur

fosforylerer mitogenaktivert proteinkinase (MAPK). Undersøkelser som overvåker kun fosforyleringen av MEK ved RAF er ikke sensitive fordi fosforyleringsniåvene av MEK ikke er signifikante. For å overvinne dette sensitivitetsdilemmaet, følger fosforyleringen av både MEK og MAPK i undersøkelsene ifølge oppfinnelsen. MAPK-fosforyleringssignalet forsterker MEK-fosforyleringssignalet og tillater RAF-avhengig fosforylering å følge i undersøkelsen, slik som enzymbundet

immunosorbantundersøkelser. I tillegg kan undersøkelsen utføres ved et høyt gjennomløpningsformat slik at mange forbindelser kan overvåkes raskt på kort tid.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i fremgangsmåter for identifisering av forbindelser som modulerer funksjonen til serin/treonin proteinkinase, som innbefatter trinnene med å bringe celler som uttrykker serin/treonin proteinkinase i kontakt med azabenzimidforbindelsen, og å overvåke effekten på cellene.

Begrepet "overvåke" refererer til å observere effekten ved å tilsette forbindelsen til celler. Effekten kan manifestere seg i en forandring i cellefenotyp, celleproliferasjon, proteinkinasekatalytisk aktivitet eller i interaksjon mellom en proteinkinase og en naturlig bindingspartner.

Begrepet "effekt" beskriver en forandring i en cellefenotyp eller celleproliferasjon. "Effekt" kan også beskrive en forandring eller et fravær av forandring i den katalytiske aktiviteten til proteinkinasen. "Effekt" kan også beskrive en forandring eller et fravær av en forandring i en interaksjon mellom proteinkinasen og en naturlig bindingspartner.

Fordelaktig kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes i den nevnte fremgangsmåten ved å identifisere forbindelser som modulerer funksjonen til serin/treonin proteinkinasen, hvor effekten kan være en forandring i cellefenotypen.

Begrepet "cellefenotyp" refererer til den utvendige fremtoningen av en celle eller vev eller funksjonen av cellen eller vevet. Eksempler på cellefenotyp er cellestørrelse (reduksjon eller økning), celleproliferasjon (økt eller nedsatt antall celler), celledifferensiering (en forandring i celleform), celleoverlevelse, apoptosis (celledød), eller anvendelsen av et metabolitisk næringsstoff (for eksempel glukoseopptak). Forandringer eller fravær av forandring i cellefenotyp kan lett måles ved teknikker kjente i litteraturen.

Fordelaktig kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes i en fremgangsmåte for å identifisere forbindelser som modulerer funksjonen til serin/treonin proteinkinase, hvor effekten er en forandring i celleproliferasjon.

Begrepet "celleproliferasjon" refererer til hastigheten hvorved en gruppe av celler deles. Antallet celler som vokser i en beholder kan kvantifiseres av en fagperson når denne personen visuelt teller antallet celler i et definert volum ved anvendelse av et vanlig lysmikroskop. Alternativt kan celleproliferasjonhastighetene kvantifiseres ved laboratorieapparater som optisk, eller i forhold til ledningsevne, måler tettheten av cellene i et hensiktsmessig medium.

Videre kan forbindelsene anvendes i en fremgangsmåte for å identifisere forbindelser som modulerer funksjonen til serin/treonin proteinkinase, hvor effekten er en forandring i interaksjonen mellom serin/treonin proteinkinasen med en naturlig bindingspartner.

Begrepet "interaksjon" i denne sammenheng beskriver et kompleks dannet mellom en proteinkinases intracellulære region og en naturlig bindingspartner eller forbindelse. Begrepet "interaksjon" kan også utvides til et kompleks dannet mellom en forbindelse ifølge oppfinnelsen med intracellulære regioner og ekstracellulære regioner av proteinkinasen som studeres. Selv om en cytosolproteinkinase ikke vil ha noen ektracellulær region, vil en reseptorproteinkinase omfatte både en ekstracellulær og en intracellulær region.

Begrepet "intracellulær region" slik det anvendes heri refererer til delen av en proteinkinase som eksisterer inne i en celle. Begrepet "ekstracellulær region" slik det anvendes heri refererer til en del av proteinkinasen som eksisterer på utsiden av cellen.

På fordelaktig måte kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes i en fremgangsmåte for å identifisere forbindelser som modulerer funksjonen til serin/treonin proteinkinasen som videre innbefatter følgende trinn: (a) lysere cellene for å gi et lysat som innbefatter serin/treonin proteinkinase; (b) adsorbere serin/treonin proteinkinasen til et antistoff; (c) inkubere den adsorberte serin/treonin proteinkinasen med et substrat eller substrater; og (d) adsorbere substratet eller substratene til en fast støtte eller antistoff. Trinnet med å overvåke effekten på cellene innbefatter måling av fosfatkonsentrasjonen til substratet eller substratene.

Begrepet "lysere" slik det anvendes heri refererer til en fremgangsmåte med å forstyrre integriteten til en celle slik at innholdet frigjøres. Cellelysering kan utføres ved mange teknikker kjente av fagfolk. Fremgangsmåten gjøres foretrukket ved lydbehandling eller celleskjæringsteknikker og mer foretrukket ved detergentteknikker.

Begrepet "antistoff slik det anvendes heri refererer til et proteinmolekyl som spesifikt binder en proteinkinase. Et antistoff binder foretrukket en klasse proteinkinase og mer foretrukket spesifikt RAF-proteinkinasen.

Begrepet "spesifikt binder" slik det anvendes heri refererer til et antistoff som bindes til en proteinkinase med høyere affinitet enn en annen proteinkinase eller cellulært protein. Et antistoff som spesifikt bindes til en proteinkinase vil binde en høyere konsentrasjon av den spesifikke proteinkinasen enn noen annen proteinkinase eller cellulært protein.

Begrepet "adsorbere" slik det anvendes heri refererer til binding av et molekyl til overflaten av et antistoff eller fast støtte. Eksempler på faste støtter er kjemisk modifisert cellulose, slik som fosfocellulose og nylon. Antistoffer kan bindes til faste støtter ved anvendelse av teknikker som er godt kjente for fagfolk. Se for eksempel Harlo & Lane, " Antibodies, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories.

Begrepet "måling av fosfatkonsentrasjonen" slik det anvendes heri refererer til teknikker som er kjente for fagfolk. Disse teknikkene kan omfatte kvantifisering av konsentrasjonen av fosfatkonsentrasjoner inne i et substrat eller bestemmelse av relative mengder fosfat inne i et substrat. Disse teknikkene kan omfatte adsorbering av substratet til en membran og detektere mengden av fosfat inne i substratet ved radioaktive målinger.

Det er også fordelaktig å anvende forbindelsene i en fremgangsmåte for identifisering av forbindelser som modulerer funksjonen til serin/treonin proteinkinase som videre innbefatter følgende trinn: (a) lysere cellene for å gi et lysat som innbefatter RAF; (b) adsorbere RAF til et antistoff; (c) inkubere den adsorberte RAF med MEK og MAPK; og (d) adsorbere MEK og MAPK til en fast støtte eller antistoff eller antistoffer. Trinnet med å måle effekten av cellene innbefatter overvåking av fosfatkonsentrasjonen av nevnte MEK og MAPK.

Det kan videre nevnes en fremgangsmåte som identifiserer forbindelser som modulerer funksjonen til serin/treonin proteinkinase, hvor den azabenimidazolbaserte forbindelsen har en struktur som fremsatt i formel I, II eller III som definert heri.

Begrepet "forbindelse" refererer til forbindelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt, ester, amid, promedikament, isomer eller metabolitt derav.

Begrepet "farmasøytisk akseptabelt salt" refererer til en formulering av en forbindelse som ikke opphever den biologiske aktiviteten og egenskapene til forbindelsen. Farmasøytiske salter kan oppnås ved å omsette en forbindelse ifølge oppfinnelsen med uorganiske eller organiske syrer slike som saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, salpetersyre, fosforsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, p-toluensulfonsyre, salicylsyre og lignende.

Begrepet "promedikament" refererer til et middel som omdannes til det ønskede legemidlet in vivo. Promedikamenter kan være enklere å administrere enn det ønskede legemidlet i noen tilfeller. For eksempel kan promedikamentet være biotilgjengelig ved oral administrasjon, men ikke det ønskede legemidlet, eller promedikamentet kan forbedre løseligheten for å gjøre det mulig med intravenøs administrasjon.

Fordelaktig er også anvendelse av forbindelsene i en fremgangsmåte for identifisering av forbindelser som modulerer funksjonen til serin/treonin proteinkinase, hvor den azabenzimidazolbaserte forbindelsen har en struktur fremsatt i formlene I, II eller III, hvor azabenzimidazolforbindelsen er utvalgt fra gruppen som består av SABI-forbindelser.

Begrepet "SABI-forbindelser" refererer til gruppen av azabenzimidazolbaserte forbindelser som har en struktur fremsatt i formel A eller B, og nummerert A-I til og med A-198 i følgende tabell:

II. Forbindelser og farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen

Som nevnt tidligere tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen azabenzimidazolforbindelser som har strukturene fremsatt i formlene I, II eller III:

hvor substituentene har de tidligere angitte betydningene.

Begrepet "mettet alkyl" refererer til en alkyldel som ikke inneholder alken eller alkyndeler. Alkyldelen kan være forgrenet eller ikke-forgrenet.

Begrepet "umettet alkyl" refererer til en alkyldel som inneholder minst en alken eller alkyndel. Alkyldelen kan være forgrenet eller ikke-forgrenet.

Begrepet "amin" refererer til en kjemisk enhet med formel NR1R2 hvor Ri og R2 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, mettet eller umettet alkyl, og homocykliske eller heterocykliske ringdeler, hvor ringen valgfritt er substituert med en eller flere substituenter utvalgt fra gruppen som består av alkyl, halogen, trihalometyl, karboksylat, nitro og esterdeler.

Begrepet "halogen" refererer til et atom utvalgt fra gruppen som består av fluor, klor, brom og jod.

Begrepet "keton" refererer til en kjemisk del med formel -(R)n-CO-R', hvor R og R' er utvalgt fra gruppen som besteår av mettet eller umettet alkyl og homocykliske eller heterocykliske ringdeler og hvor n er 0 eller 1.

Begrepet "karboksylsyre" refererer til en kjemisk enhet med formel -(R)n-COOH, hvor R er utvalgt fra gruppen som består av mettet eller umettet alkyl og homocykliske eller heterocykliske ringdeler, og hvor n er 0 eller 1.

Begrepet "ester" refererer til en kjemisk del med formel -(R)n-COOR', hvor R og R' er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av mettet eller umettet alkyl og homocykliske eller heterocykliske ringdeler og hvor n er 0 eller 1.

Begrepet "alkohol" refererer til en kjemisk substituent med formel -ROH, hvor R er utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, mettet eller umettet alkyl, og homocykliske eller heterocykliske ringdeler, hvor ringdelen er valgfritt substituert med en eller flere substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, halogen, trihalometyl, karboksylat, nitro og esterdeler.

Begrepet "amid" refererer til en kjemisk substituent med formel -NHCOR, hvor R er utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, alkyl, hydroksyl og homocykliske eller heterocykliske ringdeler, hvor ringen er valgfritt substituert med en eller flere substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, halogen, trihalometyl, karboksylat, nitro eller ester.

Begrepet "alkoksydel" refererer til en kjemisk substituent med formel -OR, hvor R er hydrogen eller en mettet eller umettet alkyldel.

Begrepet "aldehyd" refererer til en kjemisk del med formel -(R)n-CHO, hvor R er utvalgt fra gruppen som består av mettet eller umettet alkyl og homocykliske eller heterocykliske ringdeler og hvor n er 0 eller 1.

Begrepet "sulfon" refererer til en kjemisk del med formel -SO2-R, hvor R er utvalgt fra gruppen som består av mettet eller umettet alkyl og homocykliske eller heterocykliske ringdeler.

I en annen foretrukket utførelsesform angår oppfinnelsen en azabenzimidazol-basert forbindelse som har en struktur som fremsatt i formel I, II eller III, hvor Z\ og Z2 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av nitrogen og NH.

I enda en annen foretrukken utførelsesform angår oppfinnelsen en azabenzimidazol-basert forbindelse som har en struktur som fremsatt i formel I, II eller III, hvor Ri, R2, R3 og R4 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, mettet eller umettet alkyl valgfritt substituert med homocykliske eller heterocykliske ringdeler, hvor ringdelen er valgfritt substituert med en, to eller tre substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, alkoksy, halogen, trihalometyl, hydroksy, alkoksy, karboksylat, nitro og esterdeler og en homocyklisk eller heterocyklisk ringdel som er valgfritt substituert med en, to eller tre substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, alkoksy, halogen, trihalometyl, hydroksy, alkoksy, karboksylat, nitro og esterdeler.

I andre foretrukne utførelsesformer angår oppfinnelsen en azabenzimidazol-basert forbindelse som har en struktur som fremsatt i formel I, II eller III, hvor R2 og R3 er hydrogen.

I en annen foretrukken utførelsesform angår opprinnelsen en azabenzimidazol-basert forbindelse som har en struktur som fremsatt i formel I, II eller III, hvor Ri er fenyl valgfritt substituert med en, to eller tre substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, alkoksy, halogen, trihalometyl, karboksylat, nitro eller esterdeler.

I andre foretrukne utførelsesformer angår oppfinnelsen en azabenzimidazol-basert forbindelse som har en struktur som fremsatt i formel I, II eller III, hvor Xi er svovel, oksygen eller NH.

I enda en annen foretrukken utførelsesform angår oppfinnelsen en azabenzimidazol-basert forbindelse som har en struktur som fremsatt i formel I, II eller III, hvor Z3 er oksygen.

I andre foretrukne utførelsesformer angår oppfinnelsen en azabenzimidazol-basert forbindelse som har en struktur som fremsatt i formel I, II eller III, hvor R4 er utvalgt fra gruppen som består av metyl og etyl.

I et annet aspekt angår oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning som innbefatter en forbindelse ifølge oppfinnelsen, som spesifisert heri, eller dens salt, og en fysiologisk akseptabel bærer eller et fortynningsmiddel.

Begrepet "farmasøytisk sammensetning" refererer til en blanding av en azabenzimidazol-forbindelse ifølge oppfinnelsen med andre kjemiske komponenter, slik som fortynningsmidler eller bærere. Den farmasøytiske sammensetningen letter administreringen av forbindelsen til en organisme. Flere teknikker for administrering av en forbindelse er kjent i litteraturen og inkluderer oral, injeksjon, aerosol, parenteral og topisk administrasjon. Farmasøytiske sammensetninger kan også oppnås ved å omsette forbindelser med uorganiske syrer slik som saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, salpetersyre, fosforsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, jc-toluensulfonsyre, salicylsyre og lignende.

Begrepet "fysiologisk akseptabel" definerer en bærer eller et fortynningsmiddel som ikke opphever den biologiske aktiviteten og egenskapene til forbindelsen.

Begrepet 'Tjærer" definerer en kjemisk forbindelse som letter inkorporeringen av en forbindelse i celler eller vev. For eksempel er dimetylsulfoksid (DMSO) en vanlig anvendt bærer, idet den letter opptak av mange organiske forbindelser i celler og vev til en organisme.

Begrepet "fortynningsmiddel" definerer kjemiske forbindelser fortynnet i vann som vil løse forbindelsen det gjelder så vel som stabilisere den biologisk aktive formen av forbindelsen. Salter løst i bufrede løsninger anvendes som fortynningsmidler i litteraturen. Noen vanlig anvendte bufferløsninger er fosfatbufret saltvann på grunn av at det etterligner salttilstanden i menneskelig blod. Siden buffersalter kan kontrollere pF<f>en til en løsning ved lave konsentrasjoner, modifiserer en bufret diluent sjelden den biologiske aktiviteten til en forbindelse.

III. Syntetiske fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen

I et annet aspekt angår den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for syntetisering av en azabenzimidazol-forbindelse med formel I, II eller III, som innbefatter følgende trinn: (a) omsette 2-amino-6-klor-3-nitropyridin med en andre reaktant i et løsemiddel som gir det første intermediatet, hvor den andre reaktanten er en substituert arylring; (b) redusere det første intermediatet under nærvær av en katalysator og et reduksjonsmiddel som gir det andre intermediatet; (c) omsette det andre intermediatet med en tredje reaktant; og (d) rense forbindelsen ifølge oppfinnelsen.

I en foretrukken utførelsesform angår oppfinnelsen fremgangsmåten for syntese av en forbindelse ifølge oppfinnelsen hvor den substituerte arylringen er et substituert fenol, substituert tiofenol og substituert anilin.

I en foretrukken utførelsesform angår oppfinnelsen fremgangsmåten ved å syntetisere en forbindelse ifølge oppfinnelsen hvor løsemidlet er n-propanol.

I en annen foretrukken utførelsesform angår oppfinnelsen fremgangsmåten ved å syntetisere en forbindelse ifølge oppfinnelsen hvor reduksjonsmidlet er hydrogen.

I enda en annen foretrukken utførelsesform angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å syntetisere en forbindelse ifølge oppfinnelsen hvor katalysatoren er Raney-nikkel.

I enda en annen foretrukken utførelsesform angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å syntetisere en forbindelse ifølge oppfinnelsen hvor den tredje reaktanten er O-metylisourea.

I en annen foretrukken utførelsesform angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å syntetisere en forbindelse ifølge oppfinnelsen hvor den tredje reaktanten er produktet av reaksjonen mellom S-metylisotiouroniumsulfat og alkylklorformat.

I en enda en annen foretrukken utførelsesform angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for syntetisering av en forbindelse ifølge oppfinnelsen hvor alkylkloroformat er etylkloroformat.

Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av en azabenzimidazolbasert forbindelse som omtalt ovenfor, for fremstilling av et medikament for behandling av lidelser forbundet med moduleringen av funksjonen av en serin/treonin-proteinkase.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av en azabenzimidazolbasert forbindelse som omtalt ovenfor for fremstilling av et medikament for behandling av cancer eller en fibrotisk lidelse.

Endelig angår oppfinnelsen også anvendelse av en azabenzimidazolbasert forbindelse som omtalt tidligere for fremstilling av et medikament for behandling av en lidelse forbundet med en aberrasjon i en signaltransduksjonsvei, så som RAF (rapidly accelerated fibrosarcoma)/MEK (Mitogen and extracellular regulated kinase)veien, kjennetegnet ved en interaksjon mellom serin/treonin-proteinkinase RAG og en naturlig bindende partner.

RAF er en ikke-reseptor proteinkinase som rekrutteres til cellemembranen når den bindes til aktivert RAS, et guanintrifosfathydrolyserende enzym. RAS aktiveres når en aktivert reseptorproteintyrosinkinase, slik som EGFR eller PDGFR, bindes til et adaptorprotein, GRB2, og en guaninnukleotidutbytningsfaktor, SOS. SOS fjerner guanindifosfat fra RAS, erstatter den med guanintrifosfat, og derved aktiveres RAS. RAS binder RAF og som en konsekvens aktiveres RAF. RAF kan deretter fosforylere andre proteinmål på serin- og treoninresiduer, slik som kinasen (MEK) som fosforyleres og som en konsekvens av dette aktiverer mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK). Således tjener RAF som en mellomkontrollerende faktor i mitogen-aktivert signaltransduksj on.

På grunn av den viktige regulerende rollen til RAF i celler, kan modifikasjoner av aminosyresekvenser av RAF forandre dens funksjon og som en konsekvens av dette modifisere cellulær oppførsel. RAF's rolle i celleproliferasjon er understreket ved observasjonen om at mutasjoner av RAF's aminosyresekvens er blitt tilknyttet tumorer og kreftformer. Fordi mutasjonene til RAF som gir opphav til kreft i celler fører til RAF-molekyler som fremviser ikke-regulert katalytisk aktivitet, kan inhibitorer av RAF lindre og til og med oppheve celleproliferasjonen som fører til kreft i disse cellene.

Fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen kan detektere forbindelser som modulerer funksjonen til proteinkinase RAF i celler. RAF fosforylerer en proteinkinase (MEK) som i sin tur fosforylerer mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK). Undersøkelser som overvåker kun fosforyleringen av MEK ved RAF er ikke sensitive fordi fosforyleringsnivåene av MEK ikke er signifikante. For å overvinne dette sensitivitetsdilemmaet, blir fosforylering av både MEK og MAPK fulgt i undersøkelsene i forbindelse med oppfinnelsen. MAPK fosforyleringssignalet forsterker MEK fosforyleringssignalet og gjør det mulig for RAF-avhengig fosforylering å bli fulgt i enzymbundede immunosorbantundersøkelser. I tillegg blir undersøkelsen i forbindelse med oppfinnelsen foretrukket utført i et høyt gjennomstrømningsformat slik at mange forbindelser raskt kan overvåkes på kort tid.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen har identifisert forbindelser som inhiberer funksjonen til RAF proteinkinasen. Disse forbindelsene er azabenzimidazol-baserte derivater. Selv om azabenzimidazol-baserte derivater er blitt testet for deres evne til å inhibere enzymer involvert med nukleotidsynteser i bakterier, har mange av disse forbindelsene ennå ikke signifikant blitt utforsket med hensyn til proteinkinase-inhibering.

På grunn av at RAF signifikant inhiberer aminosyrehomologi til andre serin/treoninproteinkinaser, kan azabenzimidazol-baserte forbindelser ifølge oppfinnelsen trolig inhibere serin/treoninproteinkinaser forskjelllig fra RAF.

I. Biologisk aktivitet av azabenzimidazol-baserte forbindelser

Azabenzimidazol-baserte forbindelser ifølge oppfinnelsen ble testet for deres evne til å inhibere RAF proteinkinasefunksjon. De biologiske undersøkelsene og resultatene av disse inhiberingsstudiene er rapportert heri. Fremgangsmåtene som ble anvendt for å måle azabenzimidazol-basert forbindelse som modulerer proteinkinasefunksjon er tilsvarende de som er beskrevet i US patentsøknad nr. 08/702.232, til Tang et al., og med tittelen "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease", (Lyon & Lyon Docket No. 221/187), inngitt 23. august 1996, med hensyn til det høye gjennomstrømningsaspektet til fremgangsmåten.

II. Målsykdommer som kan behandles med azabenzimidazol-baserte

forbindelser

Forbindelsene og de farmasøytiske sammensetningene som er beskrevet heri er designet for å inhibere celleproliferative forstyrrelser ved å modulere funksjonen til RAF proteinkinase. Proliferative forstyrrelser resulterer i uønsket celleproliferasjon til et eller flere underseter til celler i en multicellulær organisme som resulterer i skade på organismen. Forbindelsene og de farmasøytiske sammensetningene beskrevet heri kan også være anvendelige for å behandle eller forebygge andre forstyrrelser i organismer, slike som forstyrrelser relatert til for tidlig celledød (dvs. neurologiske sykdommer) eller inflammasjon. Disse forstyrrelsene kan være et resultat av RAF-molekyler som ikke fungerer tilfredsstillende eller et resultat av RAF-relaterte proteinkinasemolekyler som ikke fungerer tilfredsstillende.

Forandringer i funksjonen til RAF proteinkinasen eller proteinkinasene relatert til RAF kan føre til økte eller reduserte celleproliferative betingelser som er klare i visse sykdommer. Abnormale cellleproliferative tilstander inkluderer kreft, fibrotiske sykdommer, mesangiale sykdommer, abnormale angiogeneser og vaskulogeneser, sårheling, psoriasis, restenose og inflammasjon.

Fibrotiske sykdommer angår abnormal dannelse av cellulær ekstracellulær matriks. Et eksempel på en fibrotisk sykdom er hepatisk cirrhose. Hepatisk cirrhose er kjennetegnet ved en øket konsentrasjon av ekstracellulære matriksbestanddeler som resulterer i dannelsen av et hepatisk arr. Hepatisk cirrhose kan forårsake sykdommer slike som cirrhose på leveren.

Mesangiale celleproliferative sykdommer finner sted på grunn av abnormal proliferasjon av mesangiale celler. Mesangiale proliferative sykdommer omfatter forskjellige humane renale sykdommer, slike som glomerulonephritis, diabetisk nefropati, malignant nefrosklerose, trombotiske mikroangiopatisyndromer, transplantatawisning og glomerulopatier.

Cancer-typer som kan behandles ved hjelp av forbindelser ifølge oppfinnelsen er lungekreft, ovarialkreft, brystkreft, hjernekreft, intraaksial hjernekreft, tarmkreft, prostatakreft, Kaposi's sarkoma, melanoma og glioma. Bevis på at forbindelsene ifølge oppfinnelsen effektivt kan anvendes for å stoppe og reversere proliferasjonen av kreftceller er tilveiebragt heri.

Angiogeniske og vaskulogeniske forstyrrelser kommer som et resultat av overdreven proliferasjon av blodkarene. Blodkarproliferasjon er nødvendig i et antall normale fysiologiske prosesser slik som embryonisk utvikling, corpus luteum dannelse, sårheling og organregenerering. Imidlertid er også blodkarproliferasjon essensielt i krefttumor-utvikling. Andre eksempler på blodkarproliferative sykdommer omfatter artritt, hvor nye kapillære blodkar invaderer leddet og ødelegger brusken. I tillegg omfatter blodkarproliferative sykdommer okulære sykdommer, slike som diabetisk retinopati, hvor nye kapillarer i retina invaderer glasslegemet, gir blødning og forårsaker blindhet. Motsatt er også forstyrrelser relatert til krymping, kontraksjon eller lukking av blodkarene, slik som restenose, implisert i uheldig regulering av proteinkinaser.

Videre er vaskulogenese og angiogenese i forbindelse med vekst av malignante faste tumorer og metastaser. En sterkt voksende krefttumor krever et næringsmiddel og oksygenrik blodtilførsel for å fortsette å vokse. Som en konsekvens, vokser ofte et unormalt stort antall kapillære blodkar sammen med tumoren og tjener som tilførselslinjer til tumoren. I tillegg, for å tilføre næringsmidler til tumoren, tilveiebringer de nye blodkarene innsetting av en port for tumorceller å komme inn i sirkulasjonen og danne metastaser på fjerne seter i organismen. Folkman, 1990, J. Nati. Cancer Inst. 82: 4-6.

Utilfredsstillende RAF-aktivitet kan stimulere celleproliferative forstyrrrelser. Molekyler som er spesifikt designet for å modulere funksjonen til RAF proteinkinasen har blitt vist å inhibere cellulær proliferasjon. Antisense nukleinsyremolekyler, som spesifikt er designet både til å binde til RNA som koder RAF proteinkinasen og blokkere translasjonen fra den messenger'en, og dermed effektivt reverserer transformeringen av A549-celler in vitro. A549-celler er humane malignante celler.

Disse RAF-målrettede antisense studiene tilveiebringer bevis på at azabenzimidazol-molekyler ifølge oppfinnelsen, som modulerer funksjonen til RAF proteinkinasen, kan stoppe og lett reversere proliferasjonen av malignante celler i en organisme. Disse azabenzimidazol-forbindelsene kan testes i in vitro fremgangsmåtene tilveiebragt heri med eksempel. Videre kan azabenzimidazol-forbindelser testes for deres effekt overfor tumorceller in vivo ved xenograft-fremgangsmåtene.

Det er minst to måter hvori ikke-tilfredsstillende RAF-aktivitet kan stimulere uønsket celleproliferasjon av en spesiell type celler: (1) direkte stimulere veksten til den bestemte cellen, eller (2) øke vaskulairseringen av et bestemt område, slik som tumorvev, og dermed bevirke vekst av vevet.

Anvendelsen ifølge oppfinnelsen blir enklere hvis det først identifiseres om celleproliferasjonsforstyrrelsen er RAF-drevet. Idet slike forstyrrelser identifiseres, kan pasienter som lider av slike forstyrrelser identifiseres ved analyse av deres symptomer ved anvendelse av fremgangsmåter godt kjente for leger og veterinærmedisinere som har kjennskap til faget. Slike pasienter kan deretter behandles som beskrevet heri.

Bestemmelse av om celleproliferasjonsforstyrrelsen er RAF-drevet kan utføres ved først å bestemme nivået til RAF-aktiviteten som finner sted i cellen eller på et bestemt sted på pasientens kropp. For eksempel, i tilfelle kreftceller kan nivået til en eller flere RAF-aktiviteter sammenlignes for ikke-RAF-drevne krefttyper og RAF-drevne krefttyper. Hvis kreftcellene har et høyere nivå av RAF-aktivitet enn RAF-drevne krefttyper, foretrukket lik med eller større enn RAF-drevne krefttyper, da er de kandidater for behandling ved anvendelse av de beskrevne RAF-modulerende fremgangsmåtene og forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

I det tilfelle celleproliferative forstyrrelser kommer på grunn av uønsket proliferasjon av ikke-kretfceller, blir nivået til RAF-aktiviteten sammenlignet med nivået som fremkommer i den generelle populasjonen (f. eks. gjennomsnittlig nivå som fremkommer i den generelle populasjonen av mennesker eller dyr som ekskluderer de menneskene eller dyrene som lider av en celleproliferativ forstyrrelse). Hvis den uønskede celleproliferasjonsforstyrrelsen kjennetegnes ved et høyere RAF-nivå enn det som fremkommer i den generelle populasjonen, da er forstyrrelsen en kandidat for behandling ved anvendelse av de beskrevne RAF-modulerende fremgangsmåtene og forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

III. Farmasøytiske sammensetninger og administrasjon av azabenzimidazol-baserte forbindelser

Fremgangsmåter for fremstilling av farmasøytiske formuleringer av forbindelsene, fremgangsmåter for bestemmelse av mengdene av forbindelsene som skal administreres til en pasient og administrasjonsmålene for forbindelsene til en organisme er fremlagt i US-søknad serie nr. 08/702.232, til Tang et al., og med tittelen "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease", (Lyon & Lyon Docket No. 221/187), inngitt 23. august 1996, og internasjonal patentpublikasjon nr. WO 96/22976, til Buzzetti et al., og med tittelen "Hydrosoluble 3-Arylidene-2-Oxindole Derivatives as Tyrosine Kinase Inhibitors", publisert 1. august 1996. Fagfolk vil vite at slike beskrivelser er anvendelige i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen og kan enkelt bli tilpasset til den.

Eksempler

Eksemplene under er representative for forskjellige aspekter og trekk ved den foreliggende oppfinnelsen. Eksemplene beskriver fremgangsmåter for syntetisering av forbindelser ifølge oppfinnelsen og fremgangsmåter for å måle en effekt av en forbindelse på funksjonen til RAF proteinkinasen.

Cellene som anvendes i fremgangsmåtene er kommersielt tilgjengelige. Nukleinsyrevektorene tilknyttet cellene er også kommersielt tilgjengelige og sekvensene av gener for de forskjellige proteinkinasene kan lett fås i sekvensdatabanker. Således kan en fagperson innenfor området enkelt gjenskape cellelinjene på en grei måte ved å kombinere de kommersielt tilgjengelige cellene, de kommersielt tilgjengelige nukleinsyrevektorene og proteinkinasegenene ved anvendelse av teknikker som er lett tilgjengelige for fagfolk.

Eksempel 1: Fremgangsmåter for syntetisering av azabenzimidazol-forbindelser ifølge oppfinnelsen

Oppfinnelsen vil nå illustreres med følgende ikke-begrensende eksempler, hvori, med mindre annet er angitt:

(i) fordampningene ble utført med rotavapor under vakuum; (ii) operasjonene ble utført under en inert atmosfære slik som nitrogen; (iii) høyytelses væskekromatografi (HPLC) ble utført på Merck LiChrosorb RP-18 omvendt fase silika oppnådd fra E. Merck, Darmstadt, Tyskland; (iv) utbyttene er gitt kun som illustrasjon og er ikke nødvendigvis det maksimalt oppnåelige; (v) smeltepunktene er ukorrigerte og ble bestemt ved anvendelse av et HWS Mainz SG 2000 digitalt smeltepunktapparat; (v) strukturene av alle forbindelsene med formel I, II og III ifølge oppfinnelsen ble bekreftet ved protonmagnetisk resonansspektroskopi på en Bruker AMX500-NMR spektrofotometer, ved elementmikroanalyse og, i noen tilfeller, ved massespektroskopi; (vi) rensing av forbindelsene ble utført på tynnsjiktkromatografi (TLC) ved anvendelse av silikagel (Merck Silica Gel 60 F254) eller ved HPLC; og (vii) intermediatene ble ikke fullt ut karakterisert og renheten ble bestemt ved

tynnsjiktkromatografi (TLC) eller ved HPLC.

Syntesefremgangsmåter

Forbindelse A- 90: 2- metoksvkarbonylamino- f6- fenvlmerkapto- 3H- imidazo|" 4. 5-fr| pyridin

2-amino-3-nitro-6-(fenylmerkapto)pyridin ble fremstilt ved å varme opp 2-amino-6-klor-3-nitropyridin (84,0 g, 0,484 mol) og natriumtiofenolat (Fluka) (72,0 g, 0,545 mol) i 2-propanol (1500 ml) under refluks i 2 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble suspensjonen fortynnet med vann (100 ml), det faste stoffet ble samlet opp ved vakuumfiltrering, vasket med vann og 2-propanol, og tørket ved 50°C under vakuum hvilket ga 109,1 g (95% utbytte) av 2-amino-3-nitro-6-(fenylmerkapto)pyridin, smp. 148-152°C).

2,3-diamino-6-(fenylmerkapto)pyridin ble fremstilt ved hydrogenering av 2-amino-3-nitro-6-(fenylmerkapto)pyridin (107,1 g, 0,433 mol) under 5 atmosfærer H2 under nærvær av 30 g Raney-Ni i 1200 ml 2-propanol ved 70°C. Etter 4 timer (29,1 L hydrogen) ble reaksjonsblandingen avkjølt til 4°C under kontinuerlig røring. Presipitatet ble samlet opp ved vakuumfiltrering, vasket med 2-propanol og tørket ved 50°C under vakuum. De kombinerte filtratene ble konsentrert under redusert trykk og rekrystallisert fra 2-propanol. Etter vasking av hydrogeneringsapparaturen to ganger med 1000 ml THF, fordampning under redusert trykk og omkrystallisering fra 2-propanol, ble presipitatet samlet opp og tørket ved 50°C under vakuum hvilket ga 80,4 g (87,1% utbytte) av 2,3-diamino-6-(fenylmerkapto)pyridin, smp. 119-122°C).

2-metoksykarbonylamino-6-fenylmerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pyridin ble fremstilt ved å tilsette metylklorformat (34 ml, 0,44 mol) dråpevis til en kald (5-15°C) løsning av S-metylisotiouroniumsulfat (53 g, 0,19 mol) (Aldrich) i 68 ml vann mens temperaturen ble holdt under 20°C. Deretter ble vandig natriumhydroksid (116 g, 25% NaOH) forsiktig tilsatt og et hvitt presipitat fremkom. Etter 20 minutter ble vann (210 ml) tilsatt og pH'en justert til 4,0 med eddiksyre (iseddiksyre, 34 ml). Til denne blandingen ble en løsning av 2,3-diamino-6-(fenylmerkapto)pyridin (37,8 g, 0,174 mol) i 210 ml etanol tilsatt dråpevis og varmet til 85-90°C i 2 timer. Etter avkjøling av reaksjonsblandingen over natten ble presipitatet isolert ved filtrering, vasket med varmt vann (1000 ml),

tørket og rekrystallisert fra eddiksyre og etanol ved 4°C. Presipitatet ble samlet opp ved filtrering, vasket med metanol og tørket ved 50°C under vakuum hvilket ga 30 g (57,4% utbytte) av 2-metoksykarbonylamino-6-fenylmerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pyridin, smp. 269-274°C (dek.).

Forbindelse A-3: 2-metoksykarbonylamino-(6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-bjpyridin

Ved å anvende natriumfenolat istedenfor natriumtiofenolat i Eksempel A-90 gir identisk fremgangsmåte 2-metoksykarbonylamino-(6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pyridin, smp.

>280°C (dek.).

Forbindelse A-4: 2-etoksykarbonylamino-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

Ved å anvende etylklorformat istedenfor metylklorformat i Eksempel A-3 gir identisk fremgangsmåte 2-etoksykarbonylamino-(6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pyridin, smp.

>280°C (dek.).

Forbindelse A-I: 2-okso-6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

Ved å omsette O-metylisourea direkte med 2,3-diamino-6-(fenylmerkapto)pyridin istedenfor produktet fra reaksjonen mellom S-metylisotiouroniumsulfat og metylklorformat i Eksempel A-3 gir identisk fremgangsmåte 2-okso-(6-fenoksy-3H-imidazo[4,5-b]pyridin, smp. 277-278°C.

Forbindelse A-2: 2-okso-6-fenylmerkapto-3H-imidazo [4,5-b] pyridin

Ved å anvende natriumtiofenolat istedenfor natriumfenolat i Eksempel A-I gir identisk fremgangsmåte 2-okso-(6-fenylmerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pyridin, smp. 253-254°C.

Forbindelser A-5 - A-25:

Ved å anvende hensiktsmessig fenolat istedenfor natriumfenolat i Eksempel A-I gir identisk fremgangsmåte følgende eksempler. For eksemplene A-23, A-24 og A-25 blir karboksygruppene beskyttet med en metyl, etyl, benzyl, t-butyl eller andre egnede estere og deretter avbeskyttet i siste trinnet hvilket gir forbindelsene.

A-5 2-okso-6-(2-nitrofenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-6 2-okso-6-(3-nitrofenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-7 2-okso-6-(4-nitrofenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-8 2-okso-6-(2-klorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-9 2-okso-6-(3-klorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-10 2-okso-6-(4-klorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-I 1 2-okso-6-(2-metylfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-12 2-okso-6-(3-metylfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-13 2-okso-6-(4-metylfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-14 2-okso-6-(2-fluorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-15 2-okso-6-(3-fluorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-16 2-okso-6-(4-fluorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-17 2-oks6-6-[2-(tirfluormetyl)fenoksy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-18 2-okso-6-[3-(tirfluormetyl)fenoksy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-19 2-okso-6-[4-(tirfluormetyl)fenoksy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-20 2-okso-6-(2-metoksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-21 2-okso-6-(3-metoksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-22 2-okso-6-(4-metoksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-23 2-okso-6-(2-karboksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-24 2-okso-6-(3-karboksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-25 2-okso-6-(4-karboksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

Forbindelser A-26 - A-46

Ved å anvende hensiktsmessig tiofenolat istedenfor natriumtiofenolat i Eksempel A-2 gir identisk fremgangsmåte følgende eksempler. For eksempel A-44, A-45 og A-46 blir karboksygruppene beskyttet med en metyl, etyl, benzyl, t-butyl eller annen egnet ester og deretter avbeskyttet i siste trinn hvilket gir forbindelsene.

A-26 2-okso-6-(2-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-27 2-okso-6-(3-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-28 2-okso-6-(4-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5 -b]pyridin

A-29 2-okso-6-(2-klorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-30 2-okso-6-(3-klorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-31 2-okso-6-(4-klorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-32 2-okso-6-(2-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-33 2-okso-6-(3-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-34 2-okso-6-(4-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-35 2-okso-6-(2-fluorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-36 2-okso-6-(3-fluorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-37 2-okso-6-(4-fluorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-38 2-okso-6-[2-(trifluormetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-39 2-okso-6-[3-(trifluormetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-40 2-okso-6-[4-(trifluormetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-41 2-okso-6-(2-metoksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-42 2-okso-6-(3-metoksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-43 2-okso-6-(4-metoksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-44 2-okso-6-(2-karboksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-45 2-okso-6-(3-karboksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-46 2-okso-6-(4-karboksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin Forbindelser A-47 - A-68

Ved å anvende det hensiktsmessige anilinsaltet istedenfor natriumfenolat i Eksempel A-I gir identisk fremgangsmåte følgende eksempler. For eksemplene A-66, A-67 og A-68 blir karboksygruppene beskyttet med en metyl, etyl, benzyl, t-butyl eller annen egnet ester og deretter avbeskyttet i det siste trinnet hvilket gir forbindelsene.

A-47 2-okso-6-fenylamino-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-48 2-okso-6-(2-nitrofenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-49 2-okso-6-(3-nitrofenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-50 2-okso-6-(4-nitrofenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-51 2-okso-6-(2-klorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-52 2-okso-6-(3-klorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-53 2-okso-6-(4-klorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-54 2-okso-6-(2-metylfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-55 2-okso-6-(3-metylfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-56 2-okso-6-(4-metylfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-57 2-okso-6-(2-fluorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-58 2-okso-6-(3-fluorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-59 2-okso-6-(4-fluorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-60 2-okso-6-[2-(tirfluormetyl)fenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-61 2-okso-6-[3-(tirfluormetyl)fenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-62 2-okso-6-[4-(trifluormetyl)fenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-63 2-okso-6-(2-metoksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-64 2-okso-6-(3-metoksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-65 2-okso-6-(4-metoksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-66 2-okso-6-(2-karboksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-67 2-okso-6-(3-karboksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-68 2-okso-6-(4-karboksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

Forbindelser A-69 - A-89

Ved å anvende det hensiktsmessige fenolatet istedenfor natriumfenolat i Eksempel A-3 gir identisk fremgangsmåte følgende eksempler. For eksemplene A-87, A-88 og A-89 blir karboksygruppene beskyttet med en metyl, etyl, benzyl, t-butyl eller annen egnet ester og deretter avbeskyttet i siste trinn hvilket gir forbindelsene.

A-69 2-metoksykarbonylamino-6-(2-nitrofenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-70 2-metoksykarbonylamino-6-(3-nitrofenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-71 2-metoksykarbonylamino-6-(4-nitrofenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-72 2-metoksykarbonylamino-6-(2-klorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-73 2-metoksykarbonylamino-6-(3-klorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-74 2-metoksykarbonylamino-6-(4-klorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-75 2-metoksykarbonylamino-6-(2-metylfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-76 2-metoksykarbonylamino-6-(3-metylfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-77 2-metoksykarbonylamino-6-(4-metylfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-78 2-metoksykarbonylamino-6-(2-fluorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-79 2-metoksykarbonylamino-6-(3-fluorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-80 2-metoksykarbonylamino-6-(4-fluorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-81 2-metoksykarbonylamino-6-[2-(trifluormetyl)fenoksy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-82 2-metoksykarbonylamino-6-[3-(trifluormetyl)fenoksy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-83 2-metoksykarbonylamino-6-[4-(trifluormetyl)fenoksy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-84 2-metoksykarbonylamino-6-(2-metoksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-85 2-metoksykarbonylamino-6-(3-metoksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-86 2-metoksykarbonylamino-6-(4-metoksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-87 2-metoksykarbonylamino-6-(2-karboksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-88 2-metoksykarbonylamino-6-(3-karboksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-89 2-metoksykarbonylamino-6-(4-karboksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin Forbindelser A-91 - A-I 11

Ved å anvende det hensiktsmessige tiofenolatet istedenfor natriumtiofenolat i Eksempel A-90 gir identisk fremgangsmåte følgende eksempler. For eksemplene A-I09, A-I 10 og A-I 11 blir karboksygruppene beskyttet ved en metyl, etyl, benzyl, t-butyl eller annen egnet ester og deretter avbeskyttet i det siste trinnet hvilket gir forbindelsene.

A-91 2-metoksykarbonylamino-6-(2-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-92 2-metoksykarbonylamino-6-(3-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-93 2-metoksykarbonylamino-6-(4-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]py^ A-94 2-metoksykarbonylamino-6-(2-klorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-95 2-metoksykarbonylamino-6-(3-klorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-96 2-metoksykarbonylamino-6-(4-klorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-97 2-metoksykarbonylamino-6-(2-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-98 2-metoksykarbonylamino-6-(3-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-99 2-metoksykarbonylamino-6-(4-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-100 2-metoksykarbonylamino-6-(2-fluorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-101 2-metoksykarbonylamino-6-(3-fluorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-102 2-metoksykarbonylamino-6-(4-fluorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyrid A-103 2-metoksykarbonylamino-6-[2-(trifl

b]pyridin

A-104 2-metoksykarbonylamino-6-[3-(trifluormetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4,5

bjpyridin

A-105 2-metoksykarbonylamino-6-[4-(trifluormetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[4

b]pyridin

A-106 2-metoksykarbonylamino-6-(2-metoksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-bjpyridin

A-107 2-metoksykarbonylamino-6-(3-metoksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-108 2-metoksykarbonylamino-6-(4-metoksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-bjpyridin

A_109 2-metoksykarbonylamino-6-(2-karboksyfenylrnerkapto)-3H-imidazo[4,5-bjpyridin

A-I 10 2-metoksykarbonylamino-6-(3-karboksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-I 11 2-metoksykarbonylamino-6-(4-karboksyfenylmerkapto)-3H-irnidazo[4,5-b]pyridin

Forbindelser A-I 12 - A-133

Ved å anvende hensiktsmessig anilinsalt istedenfor natriumfenolat i Eksempel A-3 gir identisk fremgangsmåte følgende eksempler. For eksemplene A-131, A-132 og A-133 blir karboksygruppene beskyttet med en metyl, etyl, benzyl, t-butyl eller annen egnet ester og deretter avbeskyttet i siste trinn hvilket gir forbindelsene.

A-I 12 2-metoksykarbonylamino-6-fe^

A-113 2-metoksykarbonylamino-6-(2-nitrofenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyrid^ A-I 14 2-metoksykarbonylamino-6-(3-nitrofenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyrid A-115 2-metoksykarbonylamino-6-(4-nitrofenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyri A-116 2-metoksykarbonylamino-6-(2-klorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-I 17 2-metoksykarbonylamino-6-(3-klorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-118 2-metoksykarbonylamino-6-(4-klorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-119 2-metoksykarbonylamino-6-(2-metylfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-120 2-metoksykarbonylamino-6-(3 -metylfenylamino)-3H-imidazo [4,5 -bjpyridin A-121 2-metoksykarbonylamino-6-(4-metylfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-122 2-metoksykarbonylamino-6-(2-fluorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-123 2-metoksykarbonylamino-6-(3-fluorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-124 2-metoksykarbonylamino-6-(4-fluorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-125 2-metoksykarbonylamino-6-[2-(trifluormetyl)fenylarnino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-126 2-metoksykarbonylamino-6-[3-(trifluormetyl)fenylamino]-3H-imidazo[4,5 -

bjpyridin

A-127 2-metoksykarbonylamino-6-[4-(trifluormetyl)fenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-128 2-metoksykarbonylamino-6-(2-metoksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-129 2-metoksykarbonylamino-6-(3-metoksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-130 2-metoksykarbonylamino-6-(4-metoksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-131 2-metoksykarbonylamino-6-(2-karboksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-132 2-metoksykarbonylarnino-6-(3-karboksyfenylarnino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-133 2-metoksykarbonylamino-6-(4-karboksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin Forbindelser A-134 - A-154

Ved å anvende hensiktsmessig fenolat istedenfor natriumfenolat i Eksempel A-4 gir identisk fremgangsmåte følgende eksempler. For eksemplene A-152, A-153 og A-154 blir karboksygruppene beskyttet med en metyl, etyl, benzyl, t-butylester eller annen egnet ester og deretter avbeskyttet i det siste trinnet hvilket gir forbindelsene.

A-134 2-etoksykarbonylamino-6-(2-nitrofenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-135 2-etoksykarbonylamino-6-(3-nitrofenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-136 2-etoksykarbonylamino-6-(4-nitrofenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-137 2-etoksykarbonylamino-6-(2-klorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-138 2-etoksykarbonylamino-6-(3-klorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-139 2-etoksykarbonylamino-6-(4-klorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-140 2-etoksykarbonylamino-6-(2-metylfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-141 2-etoksykarbonylamino-6-(3-metylfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-142 2-etoksykarbonylamino-6-(4-metylfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-143 2-etoksykarbonylamino-6-(2-fluorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-144 2-etoksykarbonylamino-6-(3-fluorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-145 2-etoksykarbonylamino-6-(4-fluorfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-146 2-etoksykarbonylamino-6-[2-(trifluormetyl)fenoksy]-3H-imidazo[4,5-b]pyri A-147 2-etoksykarbonylamino-6-[3-(trifluormetyl)fenoksy]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-148 2-etoksykarbonylamino-6-[4-(trifluormetyl)fenoksy]-3H-imidazo[4,5-b]pyri A-149 2-etoksykarbonylamino-6-(2-metoksyfenoksy)-3H-irnidazo[4,5-b]pyridin A-150 2-etoksykarbonylamino-6-(3-metoksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-151 2-etoksykarbonylamino-6-(4-metoksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-152 2-etoksykarbonylamino-6-(2-karboksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-153 2-etoksykarbonylamino-6-(3-karboksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-154 2-etoksykarbonylamino-6-(4-karboksyfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin Forbindelser A-155 - A-176

Ved å anvende hensiktsmessig tiofenolat istedenfor natriumfenolat i Eksempel A-4 gir identisk fremgangsmåte følgende eksempler. For eksemplene A-174, A-175 og A-176 blir karboksygruppene beskyttet med en metyl, etyl, benzyl, t-butyl eller annen egnet ester og deretter avbeskyttet i siste trinn hvilket gir forbindelsene.

A-155 2-etoksykarbonylamino-6-fenylmerkapto-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-156 2-etoksykarbonylamino-6-(2-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-157 2-etoksykarbonylamino-6-(3-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-158 2-etoksykarbonylamino-6-(4-nitrofenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-159 2-etoksykarbonylamino-6-(2-klorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-160 2-etoksykarbonylamino-6-(3-klorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-161 2-etoksykarbonylamino-6-(4-klorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-162 2-etoksykarbonylamino-6-(2-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-163 2-etoksykarbonylamino-6-(3-metylfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-164 2-etoksykarbonylamino-6-(4-metylfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-165 2-etoksykarbonylamino-6-(2-fluorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-166 2-etoksykarbonylamino-6-(3-fluorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-167 2-etoksykarbonylamino-6-(4-fluorfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyrid A-168 2-etoksykarbonylamino-6-[2-(trifluormetyl)fenylmerkapto]-3H-imidazo[

b]pyridin

A-169 2-etoksykarbonylamino-6-[3-(trifluorm^

b]pyridin

A-170 2-etoksykarbonylamino-6-[4-(trifluo

b]pyridin

A-171 2-etoksykarbonylamino-6-(2-metoksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-172 2-etoksykarbonylamino-6-(3-metoksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-173 2-etoksykarbonylamino-6-(4-metoksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-174 2-etoksykarbonylamino-6-(2-karboksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-175 2-etoksykarbonylamino-6-(3-karboksyfenylmerkapto)-3H-irnidazo[4,5-b]pyridin A-176 2-etoksykarbonylamino-6-(4-karboksyfenylmerkapto)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin Forbindelser A-I 77 - A-198

Ved å anvende hensiktsmessig anilinsalt istedenfor natriumfenolat i Eksempel A-4 gir identisk fremgangsmåte følgende eksempler. For eksemplene A-196, A-197 og A-198 blir karboksygruppene beskyttet med en metyl, etyl, benzyl, t-butyl eller annen egnet ester og deretter avbeskyttet i det siste trinnet hvilket gir forbindelsene.

A-I77 2-etoksykarbonylamino-6-fenylamino-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-178 2-etoksykarbonylamino-6-(2-nitrofenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-179 2-etoksykarbonylamino-6-(3-nitrofenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-I 80 2-etoksykarbonylamino-6-(4-nitrofenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-I 81 2-etoksykarbonylamino-6-(2-klorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-182 2-etoksykarbonylamino-6-(3-klorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-I 83 2-etoksykarbonylamino-6-(4-klorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-184 2-etoksykarbonylamino-6-(2-metylfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-I 85 2-etoksykarbonylamino-6-(3-metylfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-186 2-etoksykarbonylamino-6-(4-metylfenoksy)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-187 2-etoksykarbonylamino-6-(2-fluorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-188 2-etoksykarbonylamino-6-(3-fluorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-189 2-etoksykarbonylamino-6-(4-fluorfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-190 2-etoksykarbonylamino-6-[2-(trifluormetyl)fenylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin

A-191 2-etoksykarbonylamino-6-[3-(tri

b]pyridin

A-192 2-etoksykarbonylamino-6-[4-(trifluormetyl)fenylamino]-3H-imidazo[4,5

bjpyridin

A-193 2-etoksykarbonylamino-6-(2-metoksyfenylarnino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-194 2-etoksykarbonylamino-6-(3-metoksyfenylaniino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-195 2-etoksykarbonylamino-6-(4-metoksyfenylamino)-3H-iniidazo[4,5-bjpyridin A-196 2-etoksykarbonylamino-6-(2-karboksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-197 2-etoksykarbonylamino-6-(3-karboksyfenylamino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin A-198 2-etoksykarbonylamino-6-(4-karboksyfenylarnino)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin Eksempel 2: Undersøkelse for å måle fosforyleringsfunksionen til RAF

Følgende undersøkelse angir mengden av RAF-katalysert fosforylering av dets målprotein-MEK så vel som MEK's mål MAPK. RAF-gensekvensen er beskrevet i Bonner et al, 1985, Molec. Cell. Biol. 5: 1400-1407, og er enkel å få tak i i flere gensekvensdatabanker. Konstruksjonen av nukleinsyrevektoren og cellelinjene som anvendes for denne delen av oppfinnelsen er fullt beskrevet i Morrison et al., 1988, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85: 8855-8859.

Materialer og reagenser

1. S/ 9 ( Spodoptera frugiperda) celler; GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

2. RIPA buffer: 20 mM Tris/HCl pH 7,4,137 NaCl, 10% glycerol, 1 raM PMSF, 5 mg/L Aprotenin, 0,5% Triton X-100; 3. Thioredoksin-MEK fusjonsprotein (T-MEK): T-MEK ekspresjon og rensning ved affinitetskromatografi ble utført ifølge produsentens prosedyrer. Katalog # K

350-01 og R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.

4. His-MAPK (ERK 2); His-merket MAPK ble uttrykt i XLI Blue celler transformert med pUC18 vektor kodet His-MAPK. His-MAPK ble renset med Ni-affinitetskromatografi. Kat. # 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, som

beskrevet heri.

5. Får-antimus IgG: Jackson laboratories, West Grove, PA. Katalog, # 515-006-008, Lot #28563.

6. RAF-1 proteinkinase spesifikt antistoff: URP2653 fra UBI.

7. Bestrykningsbuffer: PBS; fosfatbufret saltvann, GIBCO-BRL, Gaithersburg,

MD.

8. Vaskebuffer: TBST - 50 raM Tris/HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100.

9. Blokkbuffer: TBST, 0,1% etanolamin pH 7,4.

10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO.

11. Kinasebuffer (KB): 20 mM Hepes/HCl pH 7,2,150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100,1 mM PMSF, 5 mg/L Aprotenin, 75 mM natrium-ortovanadat, 0,5 MM

DTT og lOmMMgCb.

12. ATP-mix: 100 mM MgCl2, 300 mM ATP, 10 mCi g-<33>P ATP (Dupont-NEN)/ml.

13. Stoppløsning: 1% fosforsyre; Fisher, Pittsburgh, PA.

14. Wallac cellulosefosfatfiltermatter; Wallac, Turku, Finland.

15. Filtervaskeløsning: 1% fosforsyre, Fisher, Pittsburgh, PA.

16. Tomtec platehøster, Wallac, Turku, Finland.

17. Wallac beta-plateleser # 1205, Wallac, Turku, Finland.

18. NUNC 96-brønn V bunn polypropylenplater for forbindelser Applied Scientific Catalog# AS-72092.

Fremgangsmåte

Alle av de følgende trinn ble utført ved romtemperatur med mindre annet er angitt.

1. ELISA platebelegg: ELISA-brønner ble belagt med 100 mLof fåre-antimus affinitetsrenset antiserum (1 mg/100 ml belegningsbuffer) over natten ved 4°C. ELISA-plater kan anvendes i to uker når de lagres ved 4°C. 2. Vend platen og fjern væske. Tilsett 100 ml blokkeringsløsning og inkuber i 30 minutter. 3. Fjern blokkeringsløsning og vask deretter fire ganger med vaskebuffer. Stryk platene på et papirhandkle for å fjerne overskudd væske. 4. Tilsett 1 mg antistoff spesifikt for RAF-1 til hver brønn og inkuber i 1 time. Vask som beskrevet i trinn 3. 5. Smelt lysatene fra RAS/RAF infiserte Sf9-celler og fortynn med TBST til 10 mg/100 ml. Tilsett 10 mg fortynnet lysat til brønnene og inkuber i 1 time. Rist platen i løpet av inkuberingen. Negative kontroller mottar ikke lysat. Lysatene

fra RAS/RAF-infiserte Sf9 insektceller fremstilles etter at cellene infiseres med rekombinante baculoviruser ved en MOI på 5 for hvert virus og høstes 48 timer senere. Cellene vaskes en gang med PBS og lyseres i RIPA-buffer. Uløselig materiale fjernes ved sentrifugering (5 minutter ved 10.000 x g). Aliquoter av lysater fryses i tørr is/etanol og lagres ved -80°C inntil de skal brukes.

6. Fjern ikke-bundet materiale og vask som angitt ovenfor (trinn 3).

7. Tilsett 2 mg T-MEK og 2 mg His-MAEPK per brønn og juster volumet til 40 ml med kinasebuffer. Fremgangsmåter for rensing av T-MEK og MAPK fra celleekstraktene er tilveiebragt heri med eksempel. 8. Forhåndsfortynn forbindelser (forrådsløsning 10 mg/ml DMSO) eller ekstraher 20 ganger i TBST pluss 1% DMSO. Tilsett 5 ml av de forhåndsfortynnede forbindelsene/ekstraktene til brønnene som beskrevet i trinn 6. Inkuber i 20 minutter. Kontroller mottar ikke legemidlet. 9. Start kinasereaksjonen ved å tilsette 5 ml ATP-mix; rist platene på en ELISA platelister i løpet av inkuberingen. 10. Stopp kinasereaksjonen etter 60 minutter ved tilsetting av 30 ml stoppløsning til hver brønn. 11. Plasser fosfocellulosematten og ELISA-platen i Tomtec-platehøsteren. Høst og vask filteret med filtervaskløsningen ifølge produsentens anbefaling. Tørk filtermattene. Forsegl filtermattene og plasser dem i beholderen. Innsett holderen i et radioaktivt deteksjonsapparat og kvantifiser den radioaktive fosforen på filtermattene.

Alternativt kan 40 ml aliquoter fra enkeltbrønnene på undersøkelsesplaten overføres til den korresponderende posisjonen på fosfocellulosefiltermatten. Etter lufttørking av filtrene, puttes filtrene i en skål. Rist forsiktig på skålen og bytt vaskeløsningen hvert kvarter i 1 time. Lufttørk filtermattene. Forsegl filtermattene og plasser dem i en holder egnet for å måle radioaktivt fosfor i prøvene. Sett inn holderen i en deteksjonsanordning og kvantifiser det radioaktive fosforet på filtermattene.

ICso-verdier ble målt ifølge fremgangsmåten for de følgende azabenzimidazol-baserte forbindelsene i RAF-1 ELISA undersøkelsen:

En IC5o-verdi er konsentrasjonen av azabenzimidazol-basert inhibitor som kreves for å redusere maksimalmengden av fosforylert målprotein eller cellevekst med 50%. IC50-verdiene som er målt i RAF-1 fosforyleringsundersøkelsen er angitt i Tabell 1:

Eksempel 3: Rensing av MAPK og MEK

MAPK og MEK proteinene uttrykkes lett i celler ved underkloning av et gen som koder disse proteinene i en kommersielt tilgjengelig vektor som uttrykker proteinene med en poly-Histidin tag. Gener som koder disse proteinene er lett tilgjengelig fra laboratorier som normalt arbeider med disse proteinene eller ved kloning av disse genene fra celler som inneholder cDNA biblioteker. Bibliotekene er lett kommersielt tilgjengelige og en fagmann innenfor området kan lett designe nukleinsyreprober homologe med cDNA-molekyler som koder MEK eller MAPK fra nukleinsyresekvensene til MEK og MAPK, tilgjengelige i flere gendatabaser, slik som Genbank. Kloningen av et gen kan gjøres i løpet av kort tid ved anvendelse av teknikker per i dag tilgjengelige for fagfolk.

Rensning av MEK og MAPK proteiner fra celleekstrakter kan utføres ved anvendelse av følgende fremgangsmåte, som er beskrevet i Robbins et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 5097-5106: 1. Cellene lyseres ved lydbehandling, osmotisk stress eller French Press teknikker lett tilgjengelige for fagfolk. En hensiktsmessig lydbehandlingsbuffer er tilveiebragt nedenfor. 2. Likevektsinnstill en fast bærer som konjugeres med nikkel eller kobolt med likevektsbufferen fremlagt nedenfor. Polyhistidin-tag'en binder spesifikt nikkel-og koboltatomer på den faste bæreren. Likevektsinnstillingen kan oppnås ved å vaske harpiksen tre ganger med et volum av likevektsbufferen som tilsvarer ti ganger volumet av den faste bæreren. Den faste bæreren er lett tilgjengelig for fagfolk. 3. Tilsett cellelysatet til den faste bæreren og la dette bli likevektsinnstilt i en kolbe i en tidsperiode. Alternativt kan den faste bæreren pakkes inne i en proteinkromatografikolonne og lysatet kan strømme gjennom den faste bæreren.

4. Vask den faste bæreren med vaskebufferen som er beskrevet nedenfor.

5. Eluer MEK eller MAPK proteinet fra den faste bæreren med en mengde av elueringsbuffer (tilveiebragt nedenfor) som fjerner en signifikant del av proteinet fra den faste bæreren.

Lydbehandlingsbuffer

50 mM natriumfosfat pH 8,0

0,3 M natriumklorid

10 mM B-merkaptoetanol

1%NP40

lOmMNaF

0,5 mM Pefablock

Likevektsbuffer

50 mM natriumfosfat pH 8,0

0,3 natriumklorid

10 mM B-merkaptoetanol

1%NP40

10 mM NaF

1 mM Imidazol

Vaskebuffer

50 mM natriumfosfat pH 8,0

0,3 M natriumklorid

10 mM B-merkaptoetanol

1%NP40

10 mM NaF

10 mM Imidazol

Elueringsbuffer

50 mM natriumfosfat pH 8,0

0,3 natriumklorid

10 mM B-merkaptoetanol

1%NP40

10 mM NaF

10-500 mM Imidazol

Eksempel 4: Undersøkelse som måler fosforyleringsfunksionen til EGF- reseptor

EGF-reseptor kinaseaktivitet (EGFR-NIH3T3 undersøkelse) i hele celler ble målt som beskrevet i detalj i PCT publikasjon WO9640116, inngitt 5. juni 1996, av Tang et al., med tittelen "Indolinone Compounds for the Treatment of Disease".

IC50-verdiene målt i EGF-reseptorfosforyleringsundersøkelsen er angitt i Tabell 2:

Eksempel 5: Undersøkelse som måler effekten av azabenzimidazol- baserte forbindelser på veksten av cellene som uttrykker Ras

Følgende undersøkelse måler veksthastighetene for NIH-3T3 celler som uttrykker RAS. Formålet med undersøkelsen er å bestemme effektene av forbindelsene på veksten av NIH 3T3 celler i forhold til å uttrykke H-Ras.

Materialer

96-brønns flatbunnede sterile plater

96-brønns rundbunnede sterile plater

Sterilt 25 ml eller 100 ml reservoar

Pipetter, multi-kanals pipetman

Sterile pipette-tips

Sterile 15 ml og 50 ml rør

Reagenser

0. 4. SRB i 1% eddiksyre

10 mM Tris-base

10% TC A

1% eddiksyre

Steril DMSO (Sigma)

Forbindelse i DMSO (100 mM eller mindre forrådsløsning)

Trypsin-EDTA (GffiO BRL)

Cellelinje:

3T3/H-Ras (NIH 3T3 klone 7 celler som uttrykker genomisk fragment av onkogenisk H-Ras).

Cellene kan konstrueres ved følgende protokoll:

1. Underklon et genfragment som koder Ras i en kommersielt tilgjengelig vektor som stabilt vil transfektere NIH-3T3 celler. Fragmentet er fra den genomiske transformerende allelen til cHa-ras. 2. Transfekter NTH-3T3 celler med den underklonede vektoren ved hjelp av en kalsiumfosfatfremgangsmåte. Velg ut celler som uttrykker Ras konsentrert i 2% serum i DMEM. Synlige fokuser observeres etter 2 uker. Foren de transformerte cellene for å generere en stabilt transformert cellelinje.

Vekstmedium:

2% kalveserum/DMEM + 2 mM glutamin, Pen/S trep.

Protokoll:

Dag 0: Celleplatelegging:

Denne delen av undersøkelsen utføres i en laminær strømningshette.

1. Trypsiniser celler. Overfør 200 ml cellesuspensjon til 10 ml isoton. Tell celler med en Coulter-teller. 2. Fortynn celler i vekstmedium til 60.000 celle/ml. Overfør 100 ml celler til hver brønn i en 96-brønns flatbunnet plate som gir 6000 celler/brønn. 3. Anvend halv plate (4 rader) for hver forbindelse og kvadruplikatbrønner for hver felles konsentrasjon og et sett av 4 brønner for mediumkontroll.

4. Rist platene forsiktig for å få en enhetlig festing av cellene.

5. Inkuber platene ved 37°C i en 10% C02-inkubator.

Dag 1: Tilsetning av forbindelse

Denne delen av undersøkelse utføres i en laminær strømningshette.

1. I en 96-brønns rundbunnet plate tilsettes 120 ml vekstmedium som inneholder 2X slutt-% DMSO funnet i høyeste screening-konsentrasjon av forbindelse til kolonne 1 til 11. For eksempel, hvis den høyeste konsentrasjonen er 100 ml, og dette gjøres fra et 100 mM forråd, er IX DMSO 0,1%, slik at 2X DMSO er 0,2%. Denne platen anvendes for å titrere ut forbindelsen, 4 rader pr.

forbindelse.

2. I et sterilt 15 ml rør fremstilles en 2X ganger løsning av den høyeste screening-konsentrasjonen av forbindelse i vekstmedium pluss 2X DMSO. 1 ml pr. cellelinje er nødvendig. Utgangskonsentrasjonen av forbindelsen er vanligvis 100 mM, men denne konsentrasjonen kan variere avhengig av løseligheten av

forbindelsen.

3. Overfør 240 ml av 2X utgangsforbindelseløsningen til kvadruplikatbrønner i kolonne 12 i den rundbunnede platen med 96 brønner. Gjør 1:2 fortynnelser i serie over platen fra høyre til venstre ved å overføre 12 ml fra kolonne 12 til kolonne 11, kolonne 11 til 10 osv. til og med kolonne 2. Overfør 100 ml forbindelsesfortynninger, og 100 ml medium i kolonne 1, i 100 ml medium på celler i korresponderende brønner av 96-brønns flatbunnet plate. Totalt volum

pr. brønn bør være 200 ml.

4. Returner platen til inkubatoren og inkuber i 3 dager.

Dag 4: Utvikling av analysen

Denne delen av undersøkelsen utføres på benken.

1. Sug av eller hell av medium. Tilsett 200 ml kald 10% TC A til hver brønn for å fiksere cellene. Inkuber platen i minst 60 minutter ved 4°C. 2. Kast TC A og rens brønnene 5 ganger med springvann. Tørk platene opp ned på papirhåndklær.

3. Beis cellene med 100 ml/brønn 0,4% SRB i 10 minutter.

4. Hell av SRB og rens brønnene 5 ganger med 1% eddiksyre. Tørk platene fullstendig opp ned på papirhåndklær. 5. Løs opp farge med 100 ml/brønn 10 mM Tris base i 5-10 minutter på en rister. 6. Avles platene på Dynatech ELISA Plate Reader ved 570 nm med referanse til 630 nm.

Utvalgte forbindelser inhiberte veksthastigheten av celler som overuttrykte RAS som illustrert i tabell 3.

Eksempel 6: Undersøkelse som måler effekten av azabenzimidazolbaserte forbindelser på vekst av A549 celler

Følgende undersøkelse måler veksthastighetene til A549 celler. Formålet med undersøkelsen er å bestemme effektene av forbindelser på veksten av A549 humane lungekarsinomceller. A549 celler kan lett oppnås fra kommersielle kilder, slik som ATCC (CCL185).

Materialer:

96-brønns flatbunnede sterile plater

96-brønns rundbunnede sterile plater

sterile 25 ml eller 100 ml reservoir

pipetter, multikanal pipetman

sterile pipett-tupper

sterile 15 ml og 50 ml rør

Reagenser:

0. 4. SRB i 1% eddiksyre

10 mM Tris-base

10% TC A

1% eddiksyre

steril DMSO (Sigma)

forbindelse i DMSO (100 mM eller mindre forrådsløsning)

Trypsin-EDTA (GTJ3CO BRL)

Cellelinje og vekstmedium:

A549 humane lungekarsinomceller (ATCC CCL185)

10% fosterkalvserum i Ham's F12-K

Protokoll:

Dag 0: Celleplatedannelse:

Denne delen av undersøkelsen utføres i en laminær strømningshette.

1. Trypsiniser cellene. Overfør 200 ul cellesuspensjon til 10 ml isoton. Tell cellene med en Coulter-teller. 2. Fortynn cellene i vekstmedium til 20.000 celle/ml. Overfør 100 ml av cellene til hver brønn i en 96-brønns flatbunnet plate som gir 2000 celler/brønn. 3. Anvend halve plater (4 rader) for hver forbindelse og kvadrupliker cellene for hver forbindelseskonsentrasjon, og et sett med 4 brønner for mediumkontroll.

4. Rist platene forsiktig for å få en enhetlig festing av cellene.

5. Inkuber platene ved 37°C i en 10% C02-inkubator.

Dag 1: Tilsetning av forbindelse:

Denne delen av undersøkelsen utføres i en laminær strømningshette.

1: I en 96-brønns rundbunnet plate tilsettes 120 ul vekstmedium som inneholder 2X slutt-% DMSO funnet i høyeste screening-konsentrasjon av forbindelse til kolonnene 1 til 11. For eksempel, hvis den høyeste screening-konsentrasjonen er

100 ul, og dette fremstilles fra et 100 mM forråd, er IX DMSO 0,1%, slik at 2X DMSO er 0,2%. Denne platen anvendes til å titrere ut forbindelsen, 4 rader pr.

forbindelse.

2. I et sterilt 15 ml rør fremstilles en 2X ganger løsning av høyeste screening-konsentrasjon av forbindelse i vekstmedium pluss 2X DMSO. 1 ml pr. cellelinje er nødvendig. Utgangskonsentrasjonen av forbindelsen er vanligvis 100 mM, men denne konsentrasjonen kan variere avhengig av løseligheten av

forbindelsen.

3. Overfør 240 ml av 2X utgangsforbindelsesløsningen til kvadruplikate brønner i kolonne 12 til den 96-brønns rundbunnede platen. Gjør 1:2 seriefortynnelser over platen fra høyre til venstre ved å overføre 120 ul fra kolonne 12 til kolonne 11, kolonne 11 til 10 osv. til og med kolonne 2. Overfør 100 ul forbindelsesfortynninger, og 100 ul medium i kolonne 1, til 100 ul medium på celler i korresponderende brønner til 96-brønns flatbunnet plate. Totalt volum pr.

brønn bør være 200 ul.

4. Returner platen til inkubatoren og inkuber i 3 dager.

Dag 5: Utvikling av undersøkelsen

Denne delen av undersøkelsen utføres på benken.

3. Beis cellene med 100 ul/brønn 0,4% SRB i 10 minutter.

4. Hell av SRB og rens brønnene 5 ganger med 1% eddiksyre. Tørk platene fullstendig opp ned på papirhåndklær.

5. Løs opp farge med 100 ul/brønn i 10 mM Tris base i 5-10 minutter på en rister.

6. Avles platene på Dynatech ELISA Plate Reader ved 570 nm med referanse til 630 nm.

Utvalgte forbindelser inhiberte veksthastigheten av A549 celler, som illustrert i tabell 4.

Eksempel 7: Fremgangsmåte for bestemmelse av den biologiske aktiviteten til Raf modulatorer in vivo

Xenograftstudier kan anvendes for å overvåke effekten av forbindelser ifølge oppfinnelsen ved inhibering av av ovarial-, melanon-, prostata-, lunge- og brysttumorceller. Protokollen for undersøkelsen er beskrevet i detalj i PCT-publikasjon WO9640116, inngitt 5. juni 1996, til Tang et al., og med tittelen "Indolinone Compounds for the Treatment of Disease".

Claims

1. En azabenzimidazolforbindelse, karakterisert ved at den har en struktur som fremsatt i formlene I, II eller III: hvori (a) Ri, R2, R3 og R4 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av (i) hydrogen; (ii) mettet eller umettet alkyl; (iii) NX2X3, hvor X2 og X3 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, mettet eller umettet alkyl, og homocykliske eller heterocykliske ringdeler; (iv) halogen eller trihalometyl; (v) et keton med formel -CO-X4, hvor X4 er utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, alkyl, og homocykliske eller heterocykliske ringdeler; (vi) en karboksylsyre med formel -(X5)n-COOH eller ester med formel -(X6)n-COO-X7, hvor X5, X6 og X7 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl og homocykliske eller heterocykliske ringdeler og hvor n er 0 eller 1; (vii) en alkohol med formel (Xg)n-OH eller en alkoksydel med formel -(Xg)n-O-X9, hvor Xg og X9 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, mettet eller umettet alkyl, og homocykliske eller heterocykliske ringdeler, hvori nevnte ring er valgfritt substituert med en eller flere substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, alkoksy, halogen, trihalometyl, karboksylat, nitro og ester, og hvor n er 0 eller 1; (viii) et amid med formel -NHCOXio, hvor Xio er utvalgt fra gruppen som består av alkyl, hydroksyl, og homocykliske eller heterocykliske ringdeler, hvori nevnte ring er valgfritt substituert med en eller flere substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, alkoksy, halogen, trihalometyl, karboksylat, nitro og ester; (ix) -SO2NX11X12, hvor Xi 1 og X12 er utvalgt fra gruppen som består av hydrogen, alkyl og homocykliske eller heterocykliske ringdeler; (x) en homocyklisk eller heterocyklisk ringdel valgfritt substituert med en, to eller tre substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, alkoksy, halogen, trihalometyl, karboksylat, nitro og esterdeler; (xi) et aldehyd med formel -CO-H; og (xii) et sulfon med formel -S02-Xi3, hvor X13 er utvalgt fra gruppen som består av mettet eller umettet alkyl og homocykliske eller heterocykliske ringdeler;: (b) Zi og Z2 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av nitrogen, svovel, oksygen, NH og NR4, forutsatt at hvis en av Z\ og Z2 er nitrogen, NH eller NR4 da er den andre av Z\ og Z2 nitrogen, svovel, oksygen, NH eller NR4; og (c) Z3 og Xi er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av nitrogen, svovel og oksygen.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte Zi og Z2 er uavhengig utvalgt fra gruppen som består av nitrogen og NH.

3. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte Ri, R2, R3 og R4 er uavhengig av gruppen som består av (i) hydrogen; (ii) mettet eller umettet alkyl valgfritt substituert med en homocyklisk eller heterocyklisk ringdel, eller en polycyklisk ringdel, hvori nevnte ringdel er valgfritt substituert med en, to eller tre substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, halogen, trihalometyl, hydroksy, alkoksy, karboksylat, nitro og esterdeler; og (iii) en homocyklisk eller heterocyklisk ringdel valgfritt substituert med en, to eller tre substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av ,alkyl, halogen, trihalometyl, hydroksy, alkoksy, karboksylat, nitro og esterdeler.

4. Forbindelse ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte R.2 og R3 er hydrogen.

5. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte R| er utvalgt fra fenyl valgfritt substituert med en, to eller tre substituenter uavhengig utvalgt fra gruppen som består av alkyl, alkoksy, halogen, trihalometyl, karboksylat, nitro eller esterdeler.

6. Forbindelse ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte X| er utvalgt fra gruppen som består av svovel, oksygen og NH.

7. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte Z3 er oksygen.

8. Forbindelse ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte R4 er utvalgt fra gruppen som består av metyl og etyl.

9. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den innbefatter en azabenzimidazolforbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, og en fysiologisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

10. Fremgangsmåte for syntetisering av en forbindelse med formel (I) ifølge krav 1, karakterisert ved at den innbefatter følgende trinn: (a) omsette 2-amino-6-klor-3-nitropyridin med en andre reaktant i et løsemiddel, som gir et første intermediat, hvori nevnte andre reaktant er en substituert arylring; (b) redusere nevnte første intermediat under nærvær av en katalysator og et reduksjonsmiddel, som gir et andre intermediat; (c) omsette det andre intermediatet med en tredje reaktant; og (d) rense nevnte forbindelse ifølge krav 1.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte løsemiddel er n-propanol.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte substituerte arylring er et substituert fenol, substituert tiofenol og substituert anilin.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte reduksjonsmiddel er hydrogen.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte katalysator er Raney-nikkel.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte tredje reaktant er O-metylisourea.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte tredje reaksjonen er S-metylisotiouroniumsulfat og alkylklorformat.

17.. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at nevnte alkyl er metyl eller etyl.

18. Anvendelse av en azabenzimidazol-basert forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, for fremstilling av et medikament for behandling av lidelser forbundet med moduleringen av funksjonen av en serin/treonin-proteinkinase.

19. Anvendelse av en azabenzimidazol-basert forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, for fremstilling av et medikament for behandling av cancer eller en fibrotisk lidelse.

20. Anvendelse ifølge krav 19, hvor medikamentet er for behandling av en cancer valgt fra gruppen bestående av lungecancer, ovariecancer, brystcancer, hjernecancer, intra-aksial hjernecancer, koloncancer, prostatacancer, Karposi's sarkom, melanom og glioma.

21. Anvendelse av en azabenzimidazol-basert forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, for fremstilling av et medikament for behandling av en lidelse forbundet med en aberrasjon i en signaltransduksjonsvei, så som RAF (rapidly accelerated fibrosarcoma)/MEK (Mitogen and extracellular regulated kinase)veien, kjennetegnet ved en interaksjon mellom serin/treonin-proteinkinase RAG og en naturlig bindende partner.